Способ стимуляции регенерации резецированной печени рекомбинантным эритропоэтином

СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ РЕЗЕЦИРОВАННОЙ ПЕЧЕНИ РЕКОМБИНАНТНЫМ ЭРИТРОПОЭТИНОМ Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и хирургии и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени. Для этого лабораторному животному на вторые сутки эксперимента осуществляют резекцию печени в объеме 70%, рекомбинантный эритропоэтин вводят внутрибрюшинно, в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. Способ обеспечивает эффективную стимуляцию регенерации резецированной печени, подтверждаемую снижением летальности, улучшением микроциркуляции, уменьшением выраженности цитолиза, улучшением синтетической функции печени в сравнении с контрольной группой, а также результатами морфологического исследования.Transplantation, 2010, 16, p. 631-638 КОЛЕСНИК И.М. и др. Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином при ишемии конечности. Биомедицина, 2011,4, с. 90-92 ЭПОКРИН. Инструкция по медицинскому применению препарата,[онлайн][найдено 16.04.2014]. Найдено в Интернете: URL:http://(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (RU) Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и экспериментальной хирургии, и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени. Наиболее близким к заявленному решению является "Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте" авт. С.П. Чикотеева и др. RU 2232550. В данном решении проводят предварительную ксенотрансплан-тацию криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи подкожно в переднюю брюшную стенку. Процедуру осуществляют за 48 ч до операции. Затем интраоперационно непосредственно после резекции 90% печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки. Недостатками данного метода являются сложность технического выполнения и высокая вероятность развития осложнений при ксенотрансплантации. Кроме того 100% летальность крыс контрольной группы затрудняет проведение эксперимента из-за невозможности сравнения показателей в опытной и контрольной группах животных. По данным большинства исследователей наиболее оптимальной для изучения регенерации печени у крыс является резекция 70% органа. В каждом живом организме заложены сложные механизмы самосохранения и восстановления. Задача современной медицины изучить и найти способы их активации. В этой связи феномен ишемического прекондиционирования заслуживает самого детального изучения. Эффекты прекондициониро-вания цитопротекция и неоангиогенез, лежащий в основе восстановительных процессов важны в хирургии. Внедрение в практику фармакологических средств, способствующих активации и продлению этого естественного защитного механизма позволит значительно улучшить результаты лечения. Наиболее перспективным для изучения, с нашей точки зрения, является эритропоэтин. Это гликопротеиновый гормон,синтез которого стимулирует гипоксия (Захаров Ю.М., 2007; Fantacci M., Bianciardi P., Caretti A., 2006). Период полувыведения эритропоэтина значительно выше, чем у других гуморальных агентов прекондиционирования (аденозин, брадикинин, опиоиды), следовательно, временной интервал периода толерантности к ишемии, инициируемый им, должен быть существенно шире. Кроме того, открытие рецепторов эритропоэтина на мезангиальных клетках и в миокарде, фибробластах мышечной и нервной ткани позволило изучать неэритропоэтические функции гормона (Бакшеев В.И., Коломоец Н.М., 2007;Melli G., Jack С, Lambrinos G.L. et al., 2006; Taoufik E., Petit E., Divoux D. et al., 2008). Некоторыми авторами доказано, что применение эритропоэтина в малых дозах не оказывает влияния на показатели периферической крови, в то время как неэритропоэтические функции его сохраняются (Ferrario M. et al.,2007). Доказанная способность стимулировать неоангиогенез (Колесник И.М. 2010), лежащий в основе регенераторных процессов, позволяет предположить эффективность применения рекомбинантного эритропоэтина для стимуляции процесса регенерации резецированной печени. Основным преимуществом предлагаемого способа является простота исполнения, а также применение препарата в минимальной дозе, не вызывающей побочных эффектов. Техническим результатом изобретения является разработка способа стимуляции регенерации резецированной печени с помощью рекомбинантного эритропоэтина. Технический результат достигается тем, что при резекции 70% печени на вторые сутки эксперимента лабораторному животному вводят внутрибрюшинно рекомбинантный эритропоэтин в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. Способ осуществляется следующим образом. Опыты проводят на белых крысах линии Wistar массой 210-220 г. Резекция печени производится на вторые сутки в объеме 70%. Состояние печени оценивается по показателю летальности животных, уровню микроциркуляции,выраженности цитолиза, показателям синтетической функции печени и результатам морфологического исследования в группах интактных животных, ложнооперированных, с резекцией печени и в группе животных с резекцией печени, которым вводился эритропоэтин. Показатель летальности оценивается в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции. Уровень микроциркуляции в печени определяется при помощи оборудования производства компанииBiopac systems: полиграфа МР 100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C и поверхностного датчика TSD 140. Регистрация и обработка результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производится с помощью программы AcqKnowledge версии 4.2., значения микроциркуляции выражают в перфузионных единицах (ПЕ). Запись уровня микроциркуляции осуществляют последовательно по поверхности печени, затем рассчитывают среднее значение. Регистрацию уровня микроциркуляции проводят на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции. Выраженность цитолиза оценивают по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции. Показатели определяют УФ-кинетическим методом на автоматизированной системе AU5800 (Beckman Coulter, США). Синтетичесую функцию печени оценивают по показателям коагулограммы (АЧТВ, MHO, фибриноген) на 7, 14, 21 и 28 сутки после операции на анализаторе CS-2000i (Sysmex, Япония). Морфологическое исследование выполняется на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработка материала производится по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняются с применением системы для сканирования и архивирования изображений MiraxDesk. Рекомбнантный эритропоэтин ("Эпокрин" эпоэтин альфа; ФГУП "Государственный научноисследовательский институт особо чистых препаратов" Федерального медикобиологического агентства г. Санкт-Петербург, Россия) вводят внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. При статистической обработке данных рассчитывают среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считают достоверными при р 0,05. Пример конкретного выполнения Экспериментальные животные были разделены на следующие группы: 1) интактные животные (n=20) 2) ложнооперированные животные (n=20); 3) резекция печени (n=50); 4) резекция печени + рекомбинантный эритропоэтин (n=50). Резекцию печени производили лабораторным животным на вторые сутки эксперимента в объме 70%. Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением комбинации хлоралгидрата и золетила. После наркотизации крысу фиксировали в положении на спине. Шерсть на брюшке тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70% раствором этилового спирта. Срединную лапаротомию выполняли от мечевидного отростка длиной 4 см. Печень мобилизовывали посредством пересечения связок. Удаляли левую и медиальную доли после предварительного лигирования сосудов. Лапаротомное отверстие ушивали после санации брюшной полости и контроля гемостаза послойно узловым швом. Стимуляцию регенерации печени проводили у животных 4-й группы внутрибрюшинным введением рекомбинантного эритропоэтина в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. Показатель летальности оценивали в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции. В группе животных с резекцией печени он составил 40%, в группе животных с резекцией печени и введением рекомбинантного эритропоэтина летальных исходов не было. Уровень микроциркуляции в печени определяли при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа МР 100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C и поверхностного датчика TSD 140 на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции. Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производили с помощью программы AcqKnowledge версии 4.2., значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ). Запись кривой уровня микроциркуляции осуществляли по всей поверхности печени в течение 30 с в каждой точке. Из полученных значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в печени у данного животного. Из полученных значений рассчитывали среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования. В группе интактных животных уровень микроциркуляции в печени составил 87717 ПЕ. Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных опытных групп представлены в табл. 1. Среднее значение уровеня микроциркуляции в печени ложнооперированных животных на всех сроках не имеет достоверных отличий от такового у интактных крыс. После резекции печени показатель снижается на 50% и остается на прежнем уровне первые 14 суток. К 21 суткам показатель начинает расти, однако на 28-е сутки среднее значение уровня микроциркуляции в резецированной печени крыс достоверно ниже такового у интактных животных. Введение рекомбинантного эритропоэтина способствовало сохранению кровотока в резецированной печени на довольно высоком уровне (показатель снижается на 15%) и восстановлению его на сроке до 21-х суток после резекции. Таблица 1. Результаты оценки уровня микроциркуляции в печени животных опытных групп (Мm) в перфузионных единицах на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции (соответственно 3, 8, 15, 22 и 29 сутки эксперимента) Примечание:- р 0,05 в сравнении с группой интактных животных;- р 0,05 в сравнении с группой животных с резекцией печени на соответствующем сроке; ложная операция - лапаротомия с последующим ушиванием передней брюшной стенки на вторые сутки эксперимента; резекция печени осуществля-2 024137 лась в объеме 70% на вторые сутки эксперимента; ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. Выраженность цитолиза оценивали по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2, 7, 14 21, 28 сутки после операции. Показатели определяли УФ-кинетическим методом на автоматизированной системе AU5800 (Beckman Coulter, США). АлАТ в контрольной группе на 2 сутки 1084 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 21 суткам - 382 МЕ/л, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 602 МЕ/л нормализуется на 7 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента. АсАТ в контрольной группе на 2 сутки 1847 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 21 суткам, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 823 МЕ/л нормализуется на 14 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента. ЛДГ в контрольной группе на 2 сутки 5643 МЕ/л снижается до нормальных показателей к 28 суткам - 2506 ЕД/л, в группе с эритропоэтином на 2 сутки - 3008 МЕ/л нормализуется на 7 сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента. Синтетическую функцию печени оценивали по показателям коагулограммы (АЧТВ, MHO, фибриноген) на 7, 14, 21 и 28 сутки после операции на анализаторе CS-2000i (Sysmex, Япония). На 7 сутки после резекции печени отмечено снижение синтетической функции, проявляющееся удлинением АЧТВ до 601 с, увеличением MHO до 40,2, снижением уровня фибриногена до 1,70,002 г/л; наибольшие изменения показателей выявлены на 21 сутки (АЧТВ - 751 с, MHO -60,1, фибриноген 0,90,003 г/л). На 28 сутки отмечается их некоторое восстановление (АЧТВ - 551 с, MHO - 40,1, фибриноген 1,20,002 г/л). Коррекция рекомбинантным эритропоэтином способствовала менее выраженному снижению синтетической функции печени после ее резекции. Наиболее выраженные изменения показателей были зарегистрированы на 7 сутки (АЧТВ - 391 с, MHO - 2,50,02, фибриноген 1,90,01 г/л). К 14 суткам показатели восстановились и сохранялись в пределах нормы на всех остальных сроках эксперимента. Морфологическое исследование выполняли на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала производили по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняли с применением системы для сканирования и архивирования изображений MiraxDesk. Масса печени у интактных животных составила 9,20,002 г. В группе ложнооперированных животных показатель не имеет достоверных отличий от такового у интактных животных. Масса печени непосредственно после резекции 2,80,003 г. Средняя масса печени животных опытных групп на различных сроках эксперимента представлена в табл. 2. В группе животных с резекцией печени масса печени на 2 сутки увеличивается в сравнении с массой непосредственно после резекции почти в 2 раза, к 7-м суткам несколько уменьшается, затем начинает увеличиваться, однако на 28 сутки после резекции достоверно меньше массы печени у ин-тактных крыс. В группе животных с резекцией печени и введением рекомби-нантного эритропоэтина масса печени на 2 сутки увеличивается ровно в 2 раза, продолжая расти и достигая массы у интактных животных к 21 суткам. Таблица 2. Средняя масса печени животных опытных групп (Мm) в граммах на 2, 7, 14, 21 и 28 сутки после операции (соответственно 3, 8, 15, 22 и 29 сутки эксперимента) Примечание.- р 0,05 в сравнении с группой интактных животных;- р 0,05 в сравнении с группой животных с резекцией печени на соответствующем сроке; ложная операция - лапаротомия с последующим ушиванием передней брюшной стенки на вторые сутки эксперимента; резекция печени осуществлялась в объеме 70% на вторые сутки эксперимента; ЕРО - рекомбинантный эритропоэтин внутрибрюшинно в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента. При микроскопии - на отдаленных сроках в контрольной группе сохранялось неравномерное кровенаполнение сосудов всех типов, наблюдались очаги зернистой дистрофии гепатоцитов, очаги склерозирования и воспалительной инфильтрации портальных трактов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет гипертрофии одноядерных гепатоцитов, полиплоидии и амитотического деления двуядерных гепатоцитов. В группе с введением эритропоэтина на отдаленных сроках нарушений микроцир-3 024137 куляции и признаков повреждения гепатоцитов не выявлено, определяется равномерно выраженная гипертрофия цитоплазмы и ядер гепатоцитов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет полиплоидии, амитотического деления двуядерных гепатоцитов и митотического деления одноядерных гепатоцитов, то есть были задействованы все виды регенерации печени. Основная нагрузка приходилась на одноядерные гепатоциты с размером ядра 9 мкм на 2 и 7 сутки, что свидетельствовало о стимуляции генетического аппарата клетки. Полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции регенерации резецированной печени у крыс рекомбинантным эритропоэтином. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ стимуляции регенерации резецированной печени, отличающийся тем, что резекцию печени осуществляют лабораторному животному на вторые сутки эксперимента в объеме 70%, рекомбинантный эритропоэтин вводят внутрибрюшинно, в суточной дозе 2,5 МЕ/кг на первые, четвертые и седьмые сутки эксперимента.