Получение рекомбинантных генов в saccharomyces cerevisiae

009443 Настоящее изобретение в целом относится к способам получения и обнаружения рекомбинантных последовательностей ДНК в Saccharomyces cerevisiae, к плазмидам и клеткам S. cerevisiae, используемым для проведения способов изобретения. Последовательности ДНК, к которым относятся эти способы, включают в себя кодирующие или не кодирующие белок последовательности; они могут также состоять из более крупных непрерывных сегментов, которые содержат более одной кодирующей последовательности, с некодирующими последовательностями интронов, таких как интроны, которые могут принадлежать к пути биосинтеза. Микробное и ферментативное получение таких веществ, как ферменты и другие белки, является важной с экономической точки зрения темой. Ферменты являются биокаталитически активными белками, не только ответственными за метаболизм природных соединений и организмов, но также используемыми для промышленного производства природных и неприродных соединений. Ферменты или соединения, продуцируемые при помощи ферментов, могут быть использованы для получения лекарственных средств, косметических средств, пищевых продуктов и т.д. Однако промышленное применение ферментов в значительной степени затруднено из-за их специфичности в отношении мишени и специфических условий, при которых они могут функционировать. Другие белки имеют терапевтические применения в области здравоохранения и ветеринарии. Важные классы важных для медицины белков включают в себя цитокины и факторы роста. Белки, ферменты и пути метаболизма с новыми или улучшенными функциями и свойствами могут быть получены либо поиском среди в значительной степени неизвестных природных разновидностей,либо улучшением известных в настоящее время природных белков или ферментов. Последний подход может быть более подходящим для создания свойств, на которые вряд ли были направлены природные эволюционные процессы. Одним из многообещающих подходов создания таких новых желательных свойств и реконструкции ферментов, других белков, некодирующих последовательностей или путей метаболизма является направленная молекулярная эволюция. Обычно такая прямая эволюция ДНК-последовательностей достигалась с помощью способов, таких как сайт-направленный мутагенез, сайт-направленный множественный мутагенез или кассетный мутагенез, случайный мутагенез и ПЦР с ошибающейся полимеразой. Недавно большое внимание привлекли подходы перетасовки генов для оптимизации тонкой настройки свойств ферментов или белков. Благодаря этим направленным эволюционным способам могут быть получены ферменты, которые могут улучшать существующую технологию, продуцировать новые продукты и расширять способности синтетической химии. Существует ряд различных способов мутагенеза, таких как случайный мутагенез, сайтнаправленный мутагенез, кассетный мутагенез с использованием олигонуклеотидов или точковый мутагенез с использованием ПЦР с ошибающейся полимеразой. Случайный мутегенз, например, влечет за собой получение большого количества случайным образом распределенных мутаций в виде замены нуклеотидов в клонируемых ДНК-фрагментах в результате обработки химическими веществами, такими как азотистая кислота, гидразин и т.д. ПЦР с ошибающейся полимеразой была разработана для введения случайных точковых мутаций в клонированные гены. Модификации, которые уменьшают точность ПЦРреакции, включают в себя увеличение концентрации MgCl2, добавление MnCl2 или изменение относительных концентраций четырех dNTP. Эти обычно используемые способы мутагенеза сконцентрированы на оптимизации индивидуальных генов, имеющих дискретные и селектируемые фенотипы. Обычная стратегия заключается в клонировании гена, идентификации дискретной функции этого гена, установлении анализа, при помощи которого он может контролироваться, мутирование выбранных положений в этом гене и отбор вариантов этого гена для улучшения известной функции гена. Затем вариант, имеющий улучшенную функцию, может быть экспрессирован в желаемом типе клеток. Повторяемые циклы способов мутагенеза могут проводиться для получения желаемых свойств фермента. Каждый из этих общепринятых подходов имеет свой подход для поиска последовательностей. Стратегии, используемые в описанных выше способах поиска последовательностей, очень различны. Проведение поиска в насыщающем сайт-направленном мутагенезе включает в себя процесс помещения каждой возможной пермутации в интересующий сайт. Для белка эта процедура заключается в замене аминокислоты в интересующем сайте на 19 других аминокислот и поиск в полученной библиотеке улучшенных мутантов. На основе расстояния последовательности это означает, что очень малый район был подвергнут очень тщательному поиску. В сравнении с этим, при кассетном мутагенезе происходит встраивание случайной пептидной последовательности в конкретный район белка, обеспечивая менее тщательную выборку (отбор проб) большего, определенного района расстояния последовательности. ПЦР с ошибающейся полимеразой включает в себя повторяемое копирование последовательности с введением низкого, но существенного количества ошибок. В этом случае достигается редкая выборка менее определенного района расстояния последовательности. В каждой из этих стратегий наилучший мутант,полученный в каждом раунде отбора, используют для инициации следующего раунда. Однако обычные подходы мутагенеза для эволюции новых свойств ферментов имеют ряд недостатков. Во-первых, они применимы только к генам или последовательностям, которые были клонированы и-1 009443 функционально охарактеризованы. Во-вторых, эти подходы можно использовать в отношении генов,которые имеют дискретную функцию. Таким образом, множественные гены, которые вместе придают единый фенотип, обычно не могут быть оптимизированы таким образом. Наконец, с помощью этих подходов можно исследовать только очень ограниченное количество из общего числа пермутации, даже для единственного гена. Ввиду этих недостатков общепринятые подходы мутагенеза являются недостаточными для улучшения клеточных геномов в отношении многих полезных свойств. Например, для улучшения способности клетки экспрессировать белок могут требоваться изменения эффективности транскрипции, модификаций трансляции и посттрансляционных модификаций, секреции или протеолитической деградации продукта гена. Таким образом, может быть необходимой модификация дополнительных генов, играющих роль в одном или нескольких клеточных механизмах, для экспрессии белка с новыми свойствами. Попытки индивидуальной оптимизации всех этих генов, имеющих такую функцию, были бы фактически невозможной задачей. Большинство проблем, связанных с общепринятыми подходами мутагенеза, могут быть преодолены подходами перетасовки генов. Перетасовка генов влечет за собой случайным образом рекомбинирующиеся различные последовательности функциональных генов, делая возможным молекулярное смешивание природно сходных или случайным образом мутированных генов. Перетасовку ДНК или генов,или вариации этих способов, использовали для улучшения активности, стабильности, укладки и свойств узнавания ферментов. В сравнении с общепринятыми подходами мутагенеза с перетасовкой генов, вероятность получения мутантов с улучшенным фенотипом является значимо более высокой. Перетасовка генов фундаментально отличается от общепринятых стратегий тем, что она рекомбинирует благоприятные мутации комбинаторным образом. Таким образом, с помощью перетасовки ДНК можно производить поиск гораздо больших районов расстояния последовательности гораздо более разреженно и со смещением в сторону продуцирования функциональных последовательностей. Таким образом, она позволяет сохранять более полезные мутации из каждого раунда отбора в следующем раунде, так как позволяет вносить информацию последовательности из более чем одного источника. В то время как общепринятые стратегии позволяют также фиксировать отрицательные мутации, это не происходит для подходов с перетасовкой генов. Таким образом, неудивительно, что стратегии перетасовки генов дают гораздо более поразительные результаты. Подходы перетасовки ДНК или генов основаны на событиях рекомбинации между районами с определенной гомологией или между сегментами идентичности. Ключевым организмом, используемым в экспериментах для испытания генетической рекомбинации в эукариотах, были почкующиеся дрожжиSaccharomyces cerevisiae. Преимуществом исследования этих процессов в простом одноклеточном организме является легкость манипуляции ДНК-последовательностями и возможность исследования специфических событий рекомбинации, индуцируемых синхронно в большой доле клеток. Кроме того, на протяжении нескольких последних десятилетий были накоплены знания как в отношении технологии ферментации, так и в отношении основной генетики этого организма, который является в настоящее время наиболее изученным эукариотическим организмом на молекулярном уровне. Вследствие своей непатогенной природы, способности секреции и возможности гликозилирования S. cerevisiae является предпочтительным организмом-хозяином для клонирования генов и экспрессии генов. Таким образом, технической проблемой, лежащей в основе данного изобретения, является получение способов и средств для получения рекомбинантных мозаичных генов Saccharomyces cerevisiae. Настоящее изобретение решает эту основную техническую проблему благодаря способу получения и обнаружения рекомбинантных ДНК-последовательностей в Saccharomyces cerevisiae, предусматривающего стадии:a) получения первых диплоидных клеток Saccharomyces cerevisiae, несущих в определенном локусе генома первую рекомбинационную кассету, содержащую первую, подлежащую рекомбинации ДНКпоследовательность, которая фланкирована по меньшей мере первой и второй маркерными последовательностями, и в аллельном положении вторую рекомбинационную кассету, содержащую вторую рекомбинируемую ДНК-последовательность, которая фланкирована по меньшей мере третьей и четвертой маркерными последовательностями,b) индукции споруляции первых диплоидных клеток, полученных в а), иc) выделения гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых первые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы первой и четвертой маркерными последовательностями, и гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых вторые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы второй и третьей маркерными последовательностями. Настоящее изобретение относится к системе, основанной на дрожжах для скрининга событий рекомбинации между по меньшей мере двумя дивергентными ДНК-последовательностями. Эта система основана на половом репродуктивном цикле Saccharomyces cerevisiae, который чередует гаплоидную фазу и диплоидную фазу. В первой стадии способа изобретения получают диплоидные клетки S. cerevisiae, которые являются гетерозиготными в отношении этих субстратов рекомбинации. Подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности интегрируют в геном этих диплоидных клеток S. cerevisiae в-2 009443 аллельных положениях. Каждую подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность интегрируют в форме рекомбинационной кассеты, которая содержит, наряду с этой ДНК-последовательностью, по меньшей мере две маркерные последовательности, которые фланкируют эту ДНК-последовательность,посредством чего эти две рекомбинационные кассеты содержат по меньшей мере четыре различные маркерные последовательности. Затем полученные таким образом гетерозиготные диплоидные клетки выращивают в условиях, которые индуцируют процессы мейоза и спорообразование. Мейоз обычно отличается повышенными частотами генетической рекомбинации, которая инициируется через образование и последующую репарацию двухцепочечных разрывов (DSB), индуцированных в профазе I мейоза. Таким образом, дрожжевые мейотические клетки представляют особенный интерес, так как они испытывают высокие уровни рекомбинации как результат индукции DSB по всему геному. Таким образом, продукты первого раунда мейоза, которыми являются четыре гаплоидные клетки или споры для каждого события мейоза, продуцируемые родительской диплоидной клеткой, могут содержать рекомбинированные ДНК-последовательности вследствие рекомбинации двух дивергированных ДНК-последовательностей. Рекомбинация двух дивергентных ДНК-последовательностей во время мейоза может также приводить к обмену фланкирующих маркерных последовательностей. Таким образом, этот способ обеспечивает быструю и простую идентификацию рекомбинированных ДНК-последовательностей посредством отбора индивидуальных клеток или молекул, в которых имел место обмен маркерных последовательностей, фланкирующих субстрат рекомбинации. Таким образом, рекомбинанты, полученные после первого раунда мейоза, отличаются тем, что они содержат и/или экспрессируют по меньшей мере первую маркерную последовательность первой рекомбинационной кассеты и по меньшей мере одну маркерную последовательность второй рекомбинационной кассеты. В частности, рекомбинантные споры могут содержать первую маркерную последовательность первой рекомбинационной кассеты и четвертую маркерную последовательность второй рекомбинационной кассеты или вторую маркерную последовательность первой рекомбинационной кассеты и третью маркерную последовательность второй рекомбинационной кассеты, посредством чего оба типа рекомбинантных спор, наряду с этой различной комбинацией маркеров,содержат также различные рекомбинантные ДНК-последовательности. Оба типа спор, содержащие рекомбинантные последовательности, можно легко отобрать и отличить друг от друга в условиях, которые обеспечивают отбор в отношении новых рекомбинантных конфигураций маркеров, получаемых рекомбинацией во время мейоза. Способ по изобретению может проводиться либо в клетках дикого типа, либо в дефектных по репарации ошибочных спариваний клетках S. cerevisiae. Процессы, при помощи которых происходит репарация поврежденной ДНК, и механизмы генетической рекомбинации тесно связаны, и известно, что аппарат репарации ошибочного спаривания оказывает ингибирующие действия на частоту рекомбинации между дивергентными последовательностями, т.е. гомологичной рекомбинации. Таким образом, мутации системы репарации ошибочного спаривания в значительной степени усиливают общую частоту событий рекомбинации в дрожжах. С другой стороны, известно, что клетки S. cerevisiae дикого типа имеют зависимый от репарации ошибочного спаривания механизм рекомбинации, который основан на отдаленно находящихся ошибочных спариваниях в двух субстратах рекомбинации. В зависимости от подлежащих рекомбинации ДНК-последовательностей, либо клетки дикого типа, либо дефектные по репарации ошибочных спариваний клетки S. cerevisiae могут быть использованы для получения рекомбинированных последовательностей. Преимущества способа по изобретению заключаются в том, что способ является итеративным (повторяющимся), т.е. возможны дополнительные раунды рекомбинации. Продукты первого раунда мейоза,т.е. гаплоидные клетки противоположных типов спаривания, которые содержат различным образом рекомбинированные ДНК-последовательности, спаривают опять для получения диплоидных клеток, которые являются гетерозиготными в отношении рекомбинированных ДНК-последовательностей. В полученных таким образом диплоидных клетках опять индуцируют мейоз, посредством чего рекомбинированные ДНК-последовательности еще раз рекомбинируются, приводя опять к обмену двух маркеров,фланкирующих каждый из субстратов рекомбинации. Новые гаплоидные рекомбинанты, полученные после второго мейоза, могут быть теперь легко идентифицированы по совместной экспрессии либо маркерных генов, которые фланкировали первую ДНК-последовательность в исходной рекомбинационной кассете, либо маркерных генов, которые фланкировали вторую ДНК-последовательность в исходной второй рекомбинационной кассете. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения гаплоидные клетки, содержащие рекомбинантную кассету с первыми рекомбинированными ДНК-последовательностями, полученными в первом раунде способа по изобретению, спаривают с гаплоидными клетками, содержащими рекомбинационные кассеты со вторыми рекомбинированными ДНК-последовательностями, полученными в первом раунде способа по изобретению, для получения вторых диплоидных клеток. В полученной таким образом второй диплоидной клетке индуцируют споруляцию, что приводит к получению гаплоидных клеток. В следующих стадиях выделяют гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты, в которых третьи рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы по меньшей мере-3 009443 первой и второй маркерными последовательностями, и гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты, в которых четвертые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы по меньшей мере третьей и четвертой маркерными последовательностями. Дополнительные рекомбинированные ДНК-последовательности могут быть получены, если гаплоидные клетки, содержащие третью и четвертую рекомбинированные ДНК-последовательности, подвергать одному или нескольким дополнительным циклам спаривания и мейоза/споруляции. После каждого раунда рекомбинации рекомбинанты либо идентифицируют по совместному присутствию по меньшей мере одной маркерной последовательности, которая фланкирует первый субстрат рекомбинации, и по меньшей мере одной маркерной последовательности, которая фланкирует второй субстрат рекомбинации, либо по совместному присутствию двух маркеров, которые фланкируют первую или вторую ДНКпоследовательность в исходных субстратах рекомбинации. Таким образом, предпочтительным признаком способа является то, что он является повторяющимся: рекомбинантное гаплоидное потомство отбирают индивидуально или в массе и спаривают одно с другим, полученные диплоиды снова спорулируют, и их споры-потомство подвергают соответствующим условиям отбора для идентификации новых событий рекомбинации. С использованием способа по изобретению можно легко получить большую библиотеку рекомбинированных, мутированных последовательностей, и затем могут быть идентифицированы варианты, которые приобрели желаемую функцию, с использованием подходящей системы отбора или скрининга. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения первую диплоидную клеткуS. cerevisiae получают одновременной или последовательной трансформацией диплоидной клетки S. cerevisiae ДНК-молекулой, содержащей первую рекомбинационную кассету, и ДНК-молекулой, содержащей вторую рекомбинационную кассету, и, необязательно, интеграцией этих двух рекомбинационных кассет в аллельные положения природных хромосом генома S. cerevisiae. Используемыми ДНКмолекулами могут быть, например, дрожжевые искусственные хромосомы (YAC). YAC отличаются тем,что они являются линейными ДНК-молекулами, которые содержат все последовательности, необходимые для стабильного сохранения в клетке дрожжей, такие как центромера, сайт инициации репликации ДНК и теломеры, а также селектируемые маркеры дрожжей. После введения в клетку дрожжей YAC ведут себя аналогично природным хромосомам и, следовательно, могут рассматриваться как часть генома дрожжей. В контексте данного изобретения термин геном включает в себя в целом все наследственные компоненты, присутствующие в клетке, которые стабильно сохраняются и наследуются. В случае использования YAC в качестве ДНК-молекул для введения первой и второй рекомбинационных кассет в диплоидные клетки S. cerevisiae, необязательно интегрировать эти две рекомбинационные кассеты в аллельные положения в природных хромосомах. В случае, когда рекомбинационные кассеты вводят в природные хромосомы, можно использовать клонирующий вектор, например, плазмиду, из которого может быть высвобожден фрагмент, несущий рекомбинационную кассету. Предпочтительно, две соответствующие маркерные последовательности этих двух рекомбинационных кассет фланкированы нацеливающими последовательностями, которые являются гомологичными определенному локусу генома 5.cerevisiae. Альтернативно, может использоваться ДНК-молекула, которая не содержит сайта инициации репликации. В этом случае ДНК-молекулы должны быть способны интегрироваться в компонент генома и, следовательно, содержать нацеливающие последовательности, которые являются гомологичными определенному локусу генома S. cerevisiae. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первые диплоидные клетки S.cerevisiae получают слиянием гаплоидных клеток, несущих в локусе их генома первую рекомбинационную кассету, с гаплоидными клетками S. cerevisiae, несущими в аллельном положении их генома вторую рекомбинационную кассету. Еще в одном варианте осуществления изобретения первые диплоидные клетки S. cerevisiae получают спариванием гаплоидных клеток, несущих в локусе их генома первую рекомбинационную кассету, с гаплоидными клетками S. cerevisiae типа противоположного спаривания, несущими в аллельном положении их генома вторую рекомбинационную кассету. В контексте данного изобретения термины "спаривание" и "слияние" обозначают либо преднамеренную, либо случайную комбинацию двух гаплоидных клеток, содержащих различные рекомбинационные кассеты. Преднамеренное спаривание или слияние двух гаплоидных клеток имеет место, когда две выбранные и/или выделенные гаплоидные клетки противоположного типа спаривания с желаемыми свойствами приводят в контакт в условиях, стимулирующих спаривание или слияние, соответственно. Эти две гаплоидные клетки могут быть получены из одной и той же библиотеки клеток, которые, например, содержат ДНК-последовательности, подлежащие рекомбинации, или уже рекомбинированные ДНКпоследовательности, или из различных библиотек клеток, которые, например, содержат ДНКпоследовательности,подлежащие рекомбинации,или уже рекомбинированные ДНКпоследовательности. Случайное спаривание или слияние двух гаплоидных клеток может происходить, когда множество различных гаплоидных клеток приводят в контакт в условиях, стимулирующих спаривание или слияние,соответственно. Это множество гаплоидных клеток может быть получено из одной и той же библиотеки-4 009443 клеток, которые, например, содержат ДНК-последовательности, подлежащие рекомбинации, или уже рекомбинированные ДНК-последовательности, или из различных библиотек клеток, которые, например,содержат ДНК-последовательности, подлежащие рекомбинации, или уже рекомбинированные ДНКпоследовательности. Преимущества способа по изобретению для получения и обнаружения рекомбинированных ДНКпоследовательностей заключаются в том, что могут быть рекомбинированы более чем две дивергентные последовательности. Если, например, должны быть рекомбинированы четыре дивергентные ДНКпоследовательности, то в первой стадии данного способа могут быть генерированы два набора (две популяции) диплоидных клеток S. cerevisiae. Например, первый набор диплоидных клеток может быть получен спариванием или слиянием гаплоидных клеток, содержащих первую и вторую подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности, а второй набор диплоидных клеток может быть генерирован спариванием или слиянием гаплоидных клеток, содержащих третью и четвертую подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности. После споруляции этих двух наборов диплоидных клеток гаплоидные клетки,полученные из первого набора диплоидных клеток, которые содержат рекомбинированные ДНКпоследовательности вследствие рекомбинации между первой и второй ДНК-последовательностями, спаривают с подходящими гаплоидными клетками, полученными из второго набора диплоидных клеток,которые содержат рекомбинированные ДНК-последовательности вследствие рекомбинации между третьей и четвертой ДНК-последовательностями. Продуктами этого спаривания являются диплоидные клетки, которые после споруляции дают гаплоидные клетки, несущие рекомбинированные ДНКпоследовательности, которые содержат районы первой ДНК-последовательности, второй ДНКпоследовательности, третьей ДНК-последовательности и четвертой ДНК-последовательности. Если, например, должны быть рекомбинированы три дивергентные ДНК-последовательности, в первой стадии данного способа генерируют диплоидные клетки S. cerevisiae, например, спариванием или слиянием гаплоидных клеток, содержащих первую и вторую подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности. После споруляции этих диплоидных клеток, полученные таким образом гаплоидные клетки, которые содержат рекомбинированные ДНК-последовательности вследствие рекомбинации между первой и второй ДНК-последовательностями, могут быть слиты или спарены с гаплоидными клетками, содержащими третью, подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность. Продуктами этого спаривания являются диплоидные клетки, которые после споруляции дают гаплоидные клетки, несущие рекомбинированные ДНК-последовательности, которые содержат районы первой ДНК-последовательности, второй ДНКпоследовательности и третьей ДНК-последовательности. Таким путем могут быть также рекомбинированы пять, шесть или более дивергентных ДНК-последовательностей. В предпочтительном варианте осуществления гаплоидные клетки S. cerevisiaer несущие первую или вторую рекомбинационную кассету, получают:a) встраиванием первой, подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности между первой и второй маркерными последовательностями, расположенными смежно на первом клонирующем векторе, и встраиванием второй, подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности между третьей и четвертой маркерными последовательностями, расположенными смежно на втором клонирующем векторе, посредством чего соответствующие две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, которые гомологичны определенному локусу генома S. cerevisiae,b) вырезанием из клонирующих векторов, полученных в а), первой рекомбинационной кассеты и второй рекомбинационной кассеты с фланкирующими нацеливающими последовательностями, соответственно, посредством чего каждый вырезанный фрагмент содержит подлежащую рекомбинации ДНКпоследовательность, которая фланкирована соответствующими двумя маркерными последовательностями и нацеливающими последовательностями,c) трансформацией вырезанных фрагментов, полученных в b), по отдельности в диплоидные клеткиS. cerevisiae, посредством чего нацеливающие последовательности направляют интеграцию этих кассет в тот локус, в отношении которого они являются гомологичными, для получения диплоидных клеток, гетерозиготных в отношении первой кассеты или второй кассеты,d) индуцированием по отдельности споруляции гетерозиготных диплоидных клеток, полученных в с), иe) выделением гаплоидных клеток, содержащих первую кассету, фланкированную первой и второй маркерными последовательностями, и отдельно гаплоидных клеток, содержащих вторую кассету, фланкированную третьей и четвертой маркерными последовательностями. В предпочтительном варианте осуществления изобретения соответствующие две маркерные последовательности в первом и втором клонирующих векторах фланкированы нацеливающими последовательностями, которые гомологичны локусу BUD31-HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae и которые направляют интеграцию вырезанных кассет в этот локус. В предпочтительном варианте осуществления изобретения клонирующим вектором, используемым для клонирования рекомбинационных кассет, является плазмида. Плазмида обозначает внехромосомный элемент, который может автономно реплицироваться. Эта плазмида физически не связана с геномом-5 009443 клетки, в которой она содержится. Большинство плазмид является двухцепочечными кольцевыми молекулами ДНК. В другом варианте осуществления клонирующим вектором является YAC. В частности, предпочтительным является использование в качестве первого клонирующего вектора,в котором клонируют первую рекомбинационную кассету, плазмиды pMXY9. Плазмида pMXY9 содержит маркерный ген URA3 и маркерный ген CAN1. В этой плазмиде эти два маркерных гена расположены смежно. Между этими двумя маркерными генами размещено несколько сайтов рестрикции, в частности, сайты рестрикции для рестриктаз SmaI, XbaI, BgIII и PacI для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности. Эти две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу BUD31-HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae. Кроме того, предпочтительным является использование в качестве второго клонирующего вектора,в котором клонируют вторую рекомбинационную кассету, плазмиды pMXY12. Плазмида pMXY12 содержит маркерный ген TRP1 и маркерный ген CYH2. В этой плазмиде эти два маркерных гена расположены смежно. Между этими двумя маркерными генами размещено несколько сайтов рестрикции, в частности, сайты рестрикции для рестриктаз SpeI, SmaI и PacI для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности. Эти две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу BUD31-HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae. В предпочтительном варианте осуществления изобретения диплоидные клетки, используемые для трансформации вырезанной рекомбинационной кассеты, являются ауксотрофными в отношении по меньшей мере двух питательных факторов и устойчивыми по меньшей мере к двум антибиотикам. Предпочтительно, эти диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллеля ura3-1 и аллеля trp11, что делает эти клетки ауксотрофными в отношении урацила и триптофана, соответственно. Кроме того, предпочтительно, чтобы диплоидные клетки, используемые для трансформации, были гомозиготными в отношении аллеля can1-100 и аллеля cyh2R, что делает их устойчивыми к канаванину и циклогексимиду, соответственно. В частности, предпочтительным является использование для трансформации диплоидных клеток штамма S. cerevisiae MXY47, которые являются гомозиготными в отношении аллелей ura3-1, trp1-1,can1-100 и cyh2R и гетерозиготными в отношении мутации msh2KanMX. При использовании для трансформации диплоидных клеток штамма MXY47 с вырезанными первым или вторым фрагментами,несущими рекомбинационные кассеты и их фланкирующие нацеливающие последовательности, полученные трансформанты могут быть индуцированы для споруляции с получением гаплоида дикого типа или msh2-сегрегантов, которые несут соответствующую рекомбинационную кассету. Согласно изобретению может быть предпочтительным использование клеток S. cerevisiae, которые имеют функциональную систему репарации ошибочных спариваний, для способа данного изобретения. Система репарации ошибочных спариваний относится к наиболее сильным факторам избегания мутаций вследствие ошибок ДНК-полимеразы при репликации. Репарация ошибочных спариваний усиливает также генетическую стабильность исправлением точности генетической рекомбинации. Таким образом,известно, что аппарат репарации ошибочного спаривания оказывает некоторое ингибирующее действие на рекомбинацию между дивергентными последовательностями. Однако в нормальном диплоиде S. cerevisiae был обнаружен другой аспект репарации ошибочных спариваний, названный рекомбинацией, зависимой от репарации ошибочного спаривания (Borts and Haber, Science, 237 (1987), 1459-1465). Считается, что репарация ошибочного спаривания отдаленно размещенных ошибочных спариваний, например,в дивергентных последовательностях, приводит к новым двухцепочечным разрывам, которые могут, в свою очередь, стимулировать второй раунд (зависимой от репарации ошибочных оснований) рекомбинации. В некоторых обстоятельствах, в частности, когда известно, что два используемых субстрата рекомбинации имеют отдаленно помещенные различия оснований, полезно, следовательно, использовать клетки S. cerevisiae с функциональной системой репарации ошибочных спариваний для проведения способа данного изобретения. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения используют клетки S. cerevisiae,которые являются дефектными в отношении системы репарации ошибочных спариваний. В S. cerevisiae было идентифицировано несколько генов, продукты которых имеют гомологию с бактериальными белками репарации ошибочного спаривания, в томчисле шесть гомологов белка MutS, т.е. Msh1, Msh2p,Msh3p, Msh4, Msh5 и Msh6p, и четыре гомолога белка MutL, т.е. Msh1p, Mlh2p, Mlh3p и Pms1. Известно,что, в частности, гены PMS1 и MSH2 устанавливают барьер рекомбинации дивергентных последовательностей. Таким образом, в мутантах msh2 и pms1 мейотическая рекомбинация между дивергентными последовательностями является увеличенной относительно частоты рекомбинации в клетках дикого типа. В контексте данного изобретения термин дефектные в отношении системы репарации ошибочного спаривания означает, что система репарации ошибочного спаривания (MMR) клетки является транзиторно (временно) или перманентно нарушенной. Недостаточность MMR клетки или организма может быть получена любой стратегией, которая транзиторно или перманентно нарушает репарацию ошибочного спаривания, а том числе, но не только, мутацией одного или нескольких генов, участвующих в репарации ошибочных спариваний, обработкой агентом, таким как УФ-свет, который приводит к глобаль-6 009443 ному нарушению MMR, обработкой агентом, таким как 2-аминопурин или гетеродуплекс, содержащий избыточное количество ошибочных спариваний, для транзиторного насыщения и инактивации системыMMR и индуцируемой экспрессии или репрессии одного или нескольких генов, участвующих в репарации ошибочных спариваний, например, посредством регулируемых промоторов, которые могут делать возможной временную инактивацию, т.е. во время мейоза, но не во время вегетативного роста. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения недостаточность репарации ошибочных спариваний клетки S. cerevisiae обусловлена мутацией по меньшей мере одного гена, участвующего в MMR. В предпочтительном варианте осуществления клетки S. cerevisiae являются дефектными в отношении гена MSH2. Предпочтительно, диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллеля msh2, в котором кодирующие последовательности MSH2 заменены конструкцией KanMX. В контексте настоящего изобретения термин рекомбинационная кассета относится к ДНКпоследовательности, содержащей по меньшей мере один субстрат рекомбинации или одну подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность, которая фланкирована по меньшей мере двумя различными маркерными последовательностями. Первая и вторая рекомбинационные кассеты различаются подлежащими рекомбинации ДНК-последовательностями и фланкирующими маркерными последовательностями, так что любая пара рекомбинационных кассет содержит различные подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности и по меньшей мере четыре различные фланкирующие маркерные последовательности. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения как первую, так и вторую рекомбинационные кассеты получают встраиванием соответствующих подлежащих рекомбинации ДНКпоследовательностей между двумя маркерными последовательностями, которые расположены смежно на клонирующем векторе и которые, в свою очередь, окружены нацеливающими последовательностями,которые гомологичны определенному локусу генома S. cerevisiae. Таким образом, эти нацеливающие последовательности могут направлять интеграцию вырезанного фрагмента, содержащего рекомбинационную кассету, в этот определенный локус. Встраивание подлежащей рекомбинации ДНК между этими двумя маркерными последовательностями предпочтительно выполняют способами генной инженерии. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти две маркерные последовательности в клонирующем векторе фланкированы нацеливающими последовательностями, которые являются гомологичными локусу BUD31-HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae. Таким образом, нацеливающие последовательности направляют интеграцию вырезанных фрагментов, содержащих рекомбинационные кассеты, в этот локус. В контексте настоящего изобретения термины подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности и субстрат рекомбинации обозначают любые две ДНК-последовательности, которые могут быть рекомбинированными в результате мейотических процессов рекомбинации, посредством чего рекомбинация между этими последовательностями может быть обусловлена гомологичной или негомологичной рекомбинацией. События нескольких типов гомологичной рекомбинации отличаются спариванием оснований поврежденной нити ДНК с гомологичным партнером, где степень взаимодействия может включать в себя сотни почти точно спаренных пар оснований. Термин гомология обозначает степень идентичности,существующую между последовательностями двух молекул нуклеиновых кислот. В противоположность этому, логически неправильная или негомологичная рекомбинация отличается соединением концов ДНК, которые не имеют или имеют лишь несколько комплементарных пар оснований. В дрожжах события негомологичной репарации и рекомбинации происходят при значимо более низких частотах, чем события гомологичной рекомбинации. Первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности являются дивергентными последовательностями, т.е. последовательностями, которые не являются идентичными, но обнаруживают определенную степень гомологии. Это означает, что эти подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности являются последовательностями, которые имеют по меньшей мере один или несколько гомологичных районов, которые могут быть очень короткими. Эти гомологичные районы должны содержать по меньшей мере 5-10 нуклеотидов, предпочтительно более чем 20 нуклеотидов 23 нуклеотида, более предпочтительно более чем 30-40 нуклеотидов и, наиболее предпочтительно более чем 50 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности отличаются (т.е. имеют дивергенцию) по меньшей мере на один нуклеотид, в частности, на более чем 0,1%, предпочтительно на более чем 5% - более чем 50%. Это означает, что первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности также отличаются на 55,60, 65%, или даже более. Субстраты рекомбинации или подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут быть природными или синтетическими. Таким образом, подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут быть получены из любого природного источника, в том числе вирусов, бактерий, грибов, в том числе S. cerevisiae, животных, растений и людей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности получены из организмов,отличных от S. cerevisiae.-7 009443 В предпочтительном варианте осуществления изобретения подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности являются кодирующими белок последовательностями, например последовательностями, кодирующими ферменты, которые могут быть использованы для промышленного получения природных и неприродных соединений. Ферменты или соединения, получаемые с использованием ферментов, могут быть использованы для получения лекарственных средств, косметических средств, пищевых продуктов и т.д. Кодирующие белок последовательности могут быть также последовательностями, которые кодируют белки, имеющие терапевтические применения в области здравоохранения человека и животных. Важные классы важных для медицины белков включают в себя цитокины и факторы роста. Рекомбинация кодирующих белок последовательностей делает возможным получение новых мутированных последовательностей, которые кодируют белки с измененными, предпочтительно улучшенными функциями и/или новыми приобретенными функциями. Таким путем можно, например, достигать улучшений термостабильности белка, изменять субстратную специфичность белка, улучшать его активность,разработать новые каталитические сайты и/или домены слияния из двух различных ферментов. Кодирующие белок подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут включать в себя последовательности различных видов, которые кодируют одни и те же или сходные белки, которые имеют в их природном окружении сходные или идентичные функции. Кодирующие белок подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут включать в себя последовательности одного и того же семейства белков или ферментов. Кодирующие белок подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут быть также последовательностями, которые кодируют белки с различными функциями, например последовательностями, которые кодируют ферменты, катализирующие различные стадии конкретного метаболического пути. В предпочтительном варианте осуществления изобретения первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности выбраны из группы последовательностей генов Оха суперсемейства В-лактамаз. В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности являются некодирующими последовательностями, такими как последовательности, которые, например, участвуют в их природном клеточном окружении в регуляции экспрессии кодирующей белок последовательности. Примеры некодирующих последовательностей включают в себя, но не ограничиваются ими, последовательности промоторов, последовательности, содержащие сайты связывания рибосом, последовательности интронов, последовательности полиаденилирования и т.д. Посредством рекомбинации таких некодирующих последовательностей можно получить мутированные последовательности, которые в клеточном окружении приводят к измененной регуляции клеточного процесса, - например, измененной экспрессии гена. В соответствии с настоящим изобретением субстрат рекомбинации или подлежащая рекомбинации ДНК-последовательность может, конечно, содержать кодирующую более чем один белок, последовательность и/или более чем одну некодирующую последовательность. Например, субстрат рекомбинации может содержать одну кодирующую белок последовательность плюс одну некодирующую последовательность или комбинацию различных кодирующих белок последовательностей и различных некодирующих последовательностей. В другом варианте осуществления данного изобретения подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут, следовательно, состоять из одной или нескольких цепей кодирующих последовательностей с интронами и/или фланкирующими некодирующими последовательностями. Это означает, что подлежащая рекомбинации ДНК-последовательность может быть, например,последовательностью гена с регуляторными последовательностями на ее 5'-конце и/или нетранслируемым 3'-районом или последовательностью гена млекопитающего с экзон-интронной структурой. Еще в одном варианте осуществления изобретения подлежащие рекомбинации ДНК-последовательности могут состоять из более крупных непрерывных отрезков, которые содержат более чем единственную кодирующую последовательность, с некодирующими последовательностями интронов, например, таких, которые могут относиться к биосинтетическому пути или оперону. Подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности могут быть последовательностями, которые уже испытали одно или несколько событий рекомбинации, например, событий гомологичной и/или негомологичной рекомбинации. Субстраты рекомбинации могут содержать немутированные ДНК-последовательности дикого типа и/или мутированные ДНК-последовательности. В предпочтительном варианте осуществления можно,следовательно, рекомбинировать последовательности дикого типа с уже существующими мутированными последовательностями для развития новых мутированных последовательностей. В контексте изобретения термин маркерные последовательности относится к уникальным ДНКпоследовательностям, которые расположены слева или справа от субстрата рекомбинации или уже рекомбинированной ДНК-последовательности в клетках Saccharomyces cerevisiae. Присутствие маркерной последовательности на той же самой ДНК-молекуле, что и субстрат рекомбинации или уже рекомбинированная ДНК-последовательность, предпочтительно в сочетании с другой маркерной последовательностью, расположенной на другой стороне от субстрата рекомбинации, позволяет распознать субстрат рекомбинации или уже рекомбинированную ДНК-последовательность и произвести ее отбор молекулярными или генетическими способами. Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения должны быть одна или несколько маркерных последовательностей слева от каждого-8 009443 субстрата рекомбинации и одна или несколько маркерных последовательностей справа от каждого субстрата рекомбинации, так что в клетке, гетерозиготной в отношении двух различных субстратов рекомбинации, имеются вместе по меньшей мере четыре различные маркерные последовательности. Это расположение делает возможным отбор кроссоверов, включающих в себя субстраты рекомбинации. Также возможно проведение дополнительных раундов рекомбинации повторяющимся образом. В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения более чем один маркер может быть расположен на каждой стороне субстрата рекомбинации. Например, для увеличения строгости отбора могут быть введены дополнительные маркеры. Маркерные последовательности могут содержать кодирующие белок или некодирующие ДНКпоследовательности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кодирующие белок маркерные последовательности выбраны из группы, состоящей из маркеров питания, пигментных маркеров,маркеров устойчивости к антибиотикам и последовательностей, которые кодируют различные субъединицы фермента, которые функционируют только в том случае, если обе субъединицы или большее количество субъединиц экспрессируются в одной и той же клетке. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения молекулярные некодирующие маркерные последовательности включают в себя, но не ограничиваются ими, сайты узнавания праймеров, т.е. последовательности, с которыми отжигаются праймеры ПЦР и которые делают возможной амплификацию рекомбинантов, экзон-интронные сочленения (границы сплайсинга), промоторные последовательности, находящиеся 3'(справа) регуляторные последовательности гена или сайты рестрикционных ферментов. Маркер питания обозначает маркерную последовательность, которая кодирует продукт гена, который может компенсировать ауксотрофию организма или клетки и, следовательно, может сообщать прототрофию ауксотрофному организму или ауксотрофной клетке. В контексте изобретения термин ауксотрофия означает, что организм или клетки должны расти в среде, содержащей необходимый питательный элемент, который не может быть синтезирован самим ауксотрофным организмом. Продукт гена маркера питания стимулирует синтез этого необходимого питательного элемента в ауксотрофной клетке. Таким образом, после экспрессии гена маркера питания не требуется добавления этого необходимого питательного элемента к среде, в которой выращивают этот организм или эту клетку, так как эти организм или клетка стали прототрофными. Пигментный маркер является маркерным геном, причем продукт этого гена участвует в синтезе пигмента, который после экспрессии будет окрашивать клетку, в которой экспрессируется этот пигментный маркер. Клетка без пигментного маркера не синтезирует этот пигмент и, следовательно, является неокрашенной. Таким образом, пигментный маркер делает возможным быстрое фенотипическое обнаружение клетки, содержащей пигментный маркер. Маркер устойчивости к антибиотику является маркерным геном, причем продукт этого гена после экспрессии сообщает клетке, в которой имеет место экспрессия этого маркерного гена устойчивости к антибиотику, способность расти в присутствии конкретного антибиотика при конкретной концентрации, тогда как клетка без маркера устойчивости к антибиотику не имеет такой способности. Маркер чувствительности к антибиотику обозначает маркерный ген, причем продукт этого гена разрушает после экспрессии способность клетки расти в присутствии конкретного антибиотика при конкретной концентрации. В предпочтительном варианте осуществления изобретения каждый из генных продуктов первой и третьей маркерных последовательностей может компенсировать ауксотрофию клетки S. cerevisiae. Предпочтительно первой маркерной последовательностью является URA3, генный продукт которой может придавать прототрофию в отношении урацила ауксотрофной в отношении урацила клетке S. cerevisiae. Предпочтительно, третьей маркерной последовательностью является TRP1, генный продукт которой может придавать прототрофию в отношении триптофана ауксотрофной в отношении триптофана клетке S.cerevisiae. В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения генные продукты второй и четвертой маркерных последовательностей придают чувствительность к антибиотику клетке S.cerevisiae, которая является устойчивой к этому антибиотику. Предпочтительно второй маркерной последовательностью является CAN1, генный продукт которой придает устойчивость к канаванину клеткеS. cerevisiae чувствительность к канаванину. Предпочтительно, четвертой маркерной последовательностью является CYH2, генный продукт которой придает устойчивость к циклогексимиду клетке S. cerevisiae чувствительность к циклогексимиду. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения маркерные последовательности содержат сайты отжига для праймеров ПЦР. Предпочтительно, первая, вторая, третья и четвертая маркерные последовательности узнаются праймерами KNS11, KNS28, KNS16 и KNS29. В предпочтительном варианте осуществления способа изобретения гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты с первой, второй, третьей или четвертой рекомбинированными ДНКпоследовательностями, могут быть идентифицированы способами ПЦР для обнаружения присутствия соответствующей комбинации маркеров.-9 009443 В другом предпочтительном варианте осуществления способа изобретения гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты с первой, второй, третьей или четвертой рекомбинированными ДНК-последовательностями, идентифицируют высевом этих гаплоидных клеток на среды, которые отбирают на присутствие на одной и той же ДНК-молекуле соответствующей комбинации маркеров. Это означает, что гаплоидные клетки, содержащие первые рекомбинированные ДНК-последовательности,высевают на среду, которая отбирает на присутствие первой и четвертой маркерных последовательностей. Гаплоидные клетки, содержащие вторые рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на присутствие второй и третьей маркерных последовательностей. Гаплоидные клетки, содержащие третьи рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на присутствие первой и второй маркерных последовательностей. Гаплоидные клетки,содержащие четвертые рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на присутствие третьей и четвертой маркерных последовательностей. Другой аспект данного изобретения относится к способу получения новых белков, ферментов, метаболических путей и некодирующих последовательностей с новыми или улучшенными функциями и свойствами, посредством которого известные кодирующие белок последовательности или известные некодирующие последовательности подвергают одному или нескольким раундам рекомбинации с использованием способа данного изобретения для генерирования и обнаружения рекомбинантных ДНКпоследовательностей в S. cerevisiae. Другой аспект данного изобретения относится к плазмиде pMXY9. Плазмида рМХУ 9 содержит маркерный ген URA3 и маркерный ген САN1, которые расположены рядом. Между этими двумя маркерными генами помещают полилинкерную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности. Эти два маркера фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу BUD31-HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae. Эта полилинкерная последовательность между двумя маркерными генами содержит сайты рестрикции для рестриктаз SmaI, XbaI, BglII и PacI. Другой аспект данного изобретения относится к плазмиде pMXY12. Плазмида pMXY12 содержит маркерный ген TRP1 и маркерный ген CYH2, которые расположены смежно. Между этими двумя маркерными генами помещают полилинкерную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности. Эти два маркера фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу BUD31-HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae. Эта полилинкерная последовательность между двумя маркерными генами содержит сайты рестрикции для рестриктаз SpeI, SmaI и PacI. Настоящее изобретение относится также к штамму S. cerevisiae MXY47, отличающемуся тем, что его диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллелей ura3-l, trp1-1, can1-100 и cyh2R и гетерозиготными в отношении мутации msh2KanMX. Данное изобретение относится также к штамму Е. coli JM101, содержащему плазмиду pMXY9, и к штамму Е. coli DH5a, содержащему плазмиду pMXY12. Плазмиды pMXY9 и pMXY12, и штамм Saccharomyces cerevisiae MXY47 были депонированы 3 января 2005 г. в SSMZ (Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b,38124 Braunschweig, Germany) под номерами доступа DSM 17010, DSM 17011 и DSM 17026, соответственно. Другой аспект изобретения относится к набору, который может быть использован для осуществления способа по изобретению для получения и обнаружения рекомбинированных ДНКпоследовательностей в Saccharomyces cerevisiae. В первом варианте осуществления этот набор содержит по меньшей мере первый контейнер, который содержит клетки штамма S. cerevisiae MXY47, второй контейнер, который содержит клетки штамма Е. coli JM101, несущие плазмиду pMXY9, и третий контейнер,содержащий клетки штамма Е. coli DH5 , несущие плазмиду pMXY12. Во втором варианте осуществления этот набор содержит по меньшей мере первый контейнер, содержащий клетки штамма S. cerevisiae MXY47, второй контейнер, содержащий ДНК плазмиды pMXY9,и третий контейнер, содержащий ДНК плазмиды pMXY12. Изобретение проиллюстрировано следующим списком последовательностей, фигурами и примером. На фиг. 1 показана схема отбора рекомбинантов на определенных средах. Диплоидные родительские клетки, гетерозиготные в отношении рекомбинационных кассет - здесь, субстрат рекомбинации А,фланкированный генами URA3 и CAN1, и субстрат рекомбинации В, фланкированный генами TRP1 иCYH2 - индуцируются для подвергания мейозу. Споры высевают на среду, лишенную урацила и содержащую канаванин (-URA+Can), и на среду, лишенную триптофана и содержащую циклокесимид (TRP+Cyh), для отбора рекомбинантных клеток 3 и 4, в которых имел место кроссинговер с участием субстратов рекомбинации А и В, показанный как (+). Родительские диплоиды и нерекомбинантные гаплоиды 1 и 2 не могут расти ни на одной из этих сред, что показано как (-). Последующий раунд мейоза может использовать рекомбинанты 3 и 4 для конструирования нового диплоида, который при споруляции дает новые рекомбинантные клетки, несущие те же самые фланкирующие маркерные конфигурации, что- 10009443 и конфигурации, показанные в клетках 1 и 2. Колонии рекомбинантных спор с этими конфигурациями могут быть отобраны на среде, лишенной урацила и содержащей циклогексимид (-Ura+Cyh), и на среде,лишенной триптофана и содержащей канаванин (-Тrр+Can), соответственно. На фиг. 2 показаны плазмиды pMXY9 и pMXY12 (сверху), которые являются векторами, использованными для нацеливания рекомбинационных кассет на локус BUD21-HCM1 на хромосоме III генома дрожжей. Обе плазмиды несут последовательности, гомологичные этому локусу (показанную как 5' и 3'),которые фланкируют маркеры URA3 и CAN1 (pMXY9) или маркеры TRP1 и CYH2 (pMXY12). Короткая последовательность, несущая сайты рестрикции, которые делает возможным клонирование субстратов рекомбинации, расположена между каждой парой маркерных последовательностей. Внизу показана интеграция рекомбинационных кассет в локус BUD21-HCM1. Производное pMXY9, несущее субстрат рекомбинации А, расщепляют NotI для высвобождения рекомбинационной кассеты, фланкированной 5'- и 3'-нацеливающими последовательностями, и продукты трансформации трансформируют в клеткиMXY47. Ura+ производные, которые содержат точно нацеленный инсерт, идентифицируют для последующего использования в конструировании штаммов, гетерозиготных в отношении рекомбинационных кассет. Рекомбинационные кассеты, несущие маркеры TRP1 и CYH2, конструируют сходным образом вpMXY12 и трансформируют в MXY47 с последующим отбором на прототрофию в отношении триптофана. На фиг. 3 показана частота рекомбинации между генами Оха как функция идентичности последовательности в штаммах дикого типа и msh2. Сверху дается среднеестандартное отклонение (n) независимых экспериментов. Внизу - представление в виде графиков этих данных. Использовали следующие штаммы: MXY60, MXY62, MXY64, MXY66, MXY99 и MXY102. На фиг. 4 показан эффект гиперрекомбинации msh2. Отношение msh2/wt рассчитывали для каждого независимого эксперимента (общее число = n) для пар штаммов с конкретным процентом гомологии Оха и для каждого условия отбора, и показаны среднеестандартное отклонение этих суммированных величин. Эти данные представлены в виде диаграммы ниже. Использовали следующие пары штаммов:MXY60 и MXY62, MXY64 и MXY66, MXY99 и MXY102. На фиг. 5 показан ПЦР-анализ рекомбинации последовательностей Оха, имеющих 78% гомологию. Колонии спор получали из диплоидов дикого типа (MXY99) и mxh2 (MXY102) отбором на среде, лишенной урацила и содержащей канаванин, или на среде, лишенной триптофана и содержащей циклогексимид. ПЦР колоний выполняли на отобранных колониях спор, которые обнаруживали фенотипы, согласующиеся с фенотипами, ожидаемыми для рекомбинантов-кроссоверов. Сверху две реакции проводили для каждого дикого типа и кандидата msh1 Ura+CanR, одного - со специфической для родителя парой праймеров (KNS16 + KNS28, продукты показаны в первой из каждой пары дорожек для каждого кандидата), и другого - с рекомбинант-специфической парой праймеров (KNS16 + KNS29, вторая дорожка). Внизу аналогичные реакции проводили для каждого дикого типа и кандидата msh2 Trp+CyhR, одного со специфической для родителя парой праймеров (KNS11 + KNS29, первая дорожка), и другого - с рекомбинант-специфической парой праймеров (KNS11 + KNS28, вторая дорожка). Контрольные реакции проводили на подходящих матрицах геномной ДНК, содержащей известные конфигурации фланкирующих маркерных последовательностей, либо родительских (Р), либо рекомбинантных (R). (-) контроль без ДНК. На фиг. 6 показана частота рекомбинации для рекомбинации второго раунда. Гаплоиды дикого типа и msh2, полученные после первого раунда рекомбинации с MXY64 и MXY66, спаривали для получения диплоидов дикого типа (MXY81, MXY82 и MXY83) и msh2 (MXY86, MXY87 и MXY88) с мозаичными рекомбинационными кассетами Оха 7-0 ха 11. Диплоиды дикого типа (MXY90) и msh2 (MXY92), гомозиготные в отношении субстрата рекомбинации Oxa11, конструировали также из рекомбинантного потомства MXY60 и MXY62. Все диплоиды спорулировали и споры высевали на среды для отбора на рекомбинанты Ura+CanR и Trp+CyhR. Список последовательностей содержит следующие последовательности:SEQ ID NO:1 и 2 представляют последовательности праймеров MSH2UP и MSH2DN, соответственно, для амплификации MSH2.SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:6 представляют последовательности праймеров MSH2A1, MSH2A2,MSH2A3 и MSH2A4, соответственно, которые являются MSH2-специфическими аналитическими праймерами.SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8 представляют последовательности праймеров K2KANMX иSEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 представляют последовательности праймеров LEU2UP и LEU2DN,соответственно, которые используют для амплификации LEU2.SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 представляют последовательности праймеров HIS3UP и HIS3DN,соответственно, которые используют для амплификации HIS3.SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:14 представляют последовательности праймеров KNS1 и KNS2, соответственно, которые используют для амплификации 3'- нацеливающей последовательности.SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:17 представляют последовательности праймеров KNS3, KNS4 и KNS6,соответственно, которые используют для амплификации 5'- нацеливающей последовательности.SEQ ID NO:18 и SEQ ID NO:19 представляют последовательности праймеров KNS7 и KNS8, соответственно, которые используют для амплификации Оха 7.SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 представляют последовательности праймеров KNS9 и KNS10, соответственно, которые используют для амплификации Oxa11.SEQ ID NO:22 представляет последовательность праймера KNS12, который является правымSEQ ID NO:23 представляет последовательность праймера KNS13, который является левым (upstream) аналитическим праймером BUD31.SEQ ID NO:24 представляет последовательность праймера KNS14, который является TRP1 специфическим аналитическим праймером.SEQ ID NO:25 представляет последовательность праймера KNS15, который является URА 3 специфическим аналитическим праймером.SEQ ID NO:26 и SEQ ID NO:27 представляют последовательности праймеров KNS17 и KNS18, соответственно, которые используют для амплификации CYH2.SEQ ID NO:28 представляет последовательность праймера KNS30, который является TRP1 специфическим прямым праймером, используемым в качестве праймера секвенирования.SEQ ID NO:29 представляет последовательность праймера KNS31, который является CAN1 специфическим обратным праймером, используемым в качестве праймера секвенирования.SEQ ID NO:30 представляет последовательность праймера KNS33, который является CYH2 специфическим обратным праймером, используемым в качестве праймера секвенирования.SEQ ID NO:31 и SEQ ID NO:32 представляют последовательности праймеров KNS36 и KNS37, соответственно, которые используют для амплификации Оха 5.SEQ ID NO:33 представляет последовательность праймера KNS38, который является URA3 специфическим прямым праймером, используемым в качестве праймера секвенирования. Пример. Генерирование мозаичных генов в мутантах с репарацией ошибочных спариваний Saccharomyces cerevisiae 1. Материалы и способы 1.1. Среды Стандартную богатую среду YPD (Bio101) использовали для рутинного выращивания, и синтетическую недостаточную среду (Bio101) использовали для мониторинга генетических маркеров и для отбора рекомбинантов. Для споруляции клетки предварительно культивировали в течение ночи в SPS (50 мМ фталат калия, рН 5,0, 0,5% дрожжевой экстракт (Difco), 1% бактопептон (Difco), 0,17% дрожжевое азотистое основание, 1% ацетат калия, 0,5% сульфат аммония) плюс требуемые питательные добавки, промывали и инкубировали при встряхивании в течение двух дней. Все манипуляции проводили при 30 С. Для анализа тетрад сумки расщепляли В-глюкуронидазой Helix pomatia (Sigma) и препарировали с использованием микроскопа Nikon Eclipse E400, оборудованного микроманипулятором TDM400 (Micro VideoInstruments, Inc.). Другие генетические способы проводили, как описано Ausubel et al. Current Protocols inMolecular Biology (1998), John Wiley and Sons, Inc., New York. Все трансформации дрожжей выполняли с использованием LiAc-способа в соответствии с Agatep et al., Technical Tips On-line (http://tto.trends.com). 1.2. Штаммы дрожжей Все штаммы дрожжей, использованные или созданные в данном исследовании, перечислены в таблице 1 и таблице 2. Все штаммы дрожжей являются изогенными производными легко спорулирующего фенотипа W303. Диплоид MXY47, который служит в качестве хозяина для трансформации рекомбинационными кассетами, конструировали с использованием трансформации и генетических скрещиваний следующим образом. Гаплоид D184-1B (подарок S. Gangoff, CEA, France) трансформировали фрагментом LEU2 (полученным препаративной ПЦР штамма W303 U474 с парой праймеров LEU2UP/LEU2DN,которые находятся в списке последовательностей, с получением Leu+ гаплоида MXY13. Гаплоид D1841B (подарок S. Gangloff, CEA, France) трансформировали фрагментом HIS3 (полученным препаративной ПЦР ORD4369-25D с парой праймеров HIS3UP/HIS3DN), с получением His+ гаплоида MXY25. Гаплоиды MXY18 и MXY22 являются рецессивными циклогексимид-устойчивыми (Cyh2R) производнымиD184-1B и D184-1C, соответственно, отобранными на 10 мкг/мл циклогексимиде; присутствие мутаций,картирующихся в локусе CYH2, которые придают устойчивость к циклогексимиду, подтверждали секвенированием (два различных нуклеотидных изменения, приводящие к замене глутамина 38 на лизин) и анализом расщепления. MXY18 и MXY25 скрещивали с получением диплоида MXY29; MXY13 иMXY22 скрещивали с получением диплоида MXY33. Гаплоидные сегреганты MXY29-6D и MXY33-8C скрещивали с получением MXY38, который является гетерозиготным в отношении маркеров leu2-3, 112 и his3-11, 15, и гомозиготным в отношении мутации cyhR. MXY38 трансформировали кассетойmsh2KanMX, амплифицированной при помощи ПЦР из RBT348 (подарок R. Borts, University of Leicester) с праймерами MSHUP и MSHDN, с получением MXY47. Трансформанты отбирали на 200 мкг/млG418 (Invitrogen) и подтверждали с использованием ПЦР колоний (см. ниже) с праймерами MSH2A1,- 12009443MSH2A3 и MSH2A4 и анализа тетрад, т.е. анализа четырех спор, для подтверждения расщепления маркеров. Таблица 1. Гаплоидные штаммы дрожжей 1.3. Конструирование плазмид Бактериальные штаммы XL1-Blue MRF' (mcrA)183 (mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1ara tonA tsx dam dcm supE44[lac-proAB] [Ff traD36 proAB laclqZM15]) использовали в качестве хозяев для клонирования. Для конструирования плазмид использовали стандартные способы (Ausubel et al.). Все плазмиды, использованные или созданные в данном исследовании, находятся в списке в табл. 3. Рестрикционные ферменты (рестриктазы), ДНК-лигазу Т 4 и другие ферменты, использованные в клонировании, покупали из New England Biolabs. ДНК-фрагменты и плазмиды очищали с использованием наборов, поставляемых Qiagen и Macherey-Nagel. Последовательности слева (5'-мишень), соответствующие локусу BUD31, амплифицировали препаративной ПЦР из геномной ДНК W303 с парой праймеров KNS3/KNS4 и клонировали в видеKpnI/XhoI-фрагмента в KpnI/XhoI-расщепленную pKSII(+) (Stratagene) с получением pMXY1; нацеливающие последовательности справа ("3'-мишень") амплифицировали подобным образом с парой праймеров KNS1/KNS2 и клонировали в виде XbaI/NotI-фрагмента в XbaI/NotI-расщепленную pKSII(+)SmaI-фрагмента и лигировали с Hpa1-расщепленной pMXY2 с получением pMXY5. 5'-нацеливающие последовательности в pMXY3 и pMXY4 заменяли последовательностями, повторно амплифицированными из геномной ДНК, с парой праймеров KNS4/KNS6 и лигировали в виде KpnI/XhoI-фрагментов в соответствующие KpnI/XhoI-расщепленные плазмиды с получением pMXY7 и pMXY6. Эту стадию предпринимали для коррекции отсутствия из праймера KNS3 сайтов рестрикции, требующихся в более поздних фазах клонирования. KpnI/SmaI-фрагмент pMXY6, содержащий 5'-мишень и маркер URA3, лигировали с KpnI/SmaI-расщепленной pMXY5 с получением вектора pMXY9 рекомбинационной кассетыKpnI/SpeI-расщепленной pMXY2 с получением pMXY11. Наконец, маркер CYH2 амплифицировали препаративной ПЦР из геномной ДНК W303 с парой праймеров KNS17/KNS18, расщепляли BamHI и PvuI и лигировали с BglII/PacI-расщепленной pMXY11 с получением вектора pMXY12 рекомбинационной кассеты TRP1-CYH2. Все плазмидные конструкции вводили в бактериальных хозяев электропорацией и подтверждали рестрикционным анализом, и pMXY9, и pMXY12 дополнительно подтверждали секвенированием всех сочленений клонирования. Субстраты рекомбинации В-лактамазы амплифицировали препаративной ПЦР из плазмид-хозяев(предоставленных W. Schoenfeld) с использованием пары праймеров KNS36/KNS37 для Оха 5 (номер доступа Х 58272), KNS7/KNS8 для Оха 7 (номер доступа Х 75562)и KNS9/KNS10 для Oxa11 (номер доступа Z22590). Продукты ПЦР Оха 7 и Oxa11 расщепляли PacI и лигировали со SmaI/PacI-расщепленнойpMXY9 с получением pMXY13 и pMXY14, соответственно, и продукт ПЦР Oxa11 также расщепляли специфически и РасI и лигировали со специфически/PacI-расщепленной pMXY12 с получениемpMXY22. Продукты ПЦР Оха 5 расщепляли BamHI и PacI и лигировали с BglII/PacI-расщепленнойpMXY9 с получением pMXY24. Все конструкции подтверждали рестрикционным анализом. Таблица 3. Плазмиды 1.4. Отбор и характеристика рекомбинантов Для рекомбинации первого раунда плазмиды, несущие рекомбинационные кассеты, расщеплялиNotI, и все продукты расщепления использовали для трансформации MXY47. Отбирали прототрофы в отношении урацила (для pMXY9-производных) или в отношении триптофана (для pMXY12 производных) и нацеливание на одну из двух хромосомных копий локуса BUD31-HCM1 введенной конструкции подтверждали с использованием ПЦР колоний с применением праймеровKNS12/KNS13/KNS15 для URA3-CAN1-производных и праймеров KNS12/KNS13/KNS14 для TRP1CYH2-производных, которые позволяют амплифицировать фрагменты из интактных и из разрушенных локусов BUD21-HCV1. Трансформированные гетерозиготы спорулировали и проводили анализ тетрад для идентификации гаплоидов дикого типа и msh2, несущих рекомбинационные кассеты. Подходящие гаплоиды противоположного типа спаривания наносили в виде пятен на чашки YPD, давали им расти в течение ночи, смешивали вместе на одной и той же чашке YPD и давали спариваться в течение ночи. Чашку для спаривания использовали для перепечатывания колоний на другую чашку (метод отпечатков(реплик на среду -Ura, -Trp для отбора диплоидов, которые инокулировали на следующий день в виде всей массы в SPS с добавками и культивировали в течение ночи. Эту предварительную культуру откручивали и промывали и эти клетки ресуспендировали в 1% ацетате калия с добавками и инкубировали в течение двух дней. Спорулированные клетки собирали, определяли их количество и в некоторых случаях препарировали для подтверждения подходящего расщепления всех маркеров. Сумки расщепляли зимолиазой-20 Т(ICN Biomedicals) для высвобождения спор, суспензию спор обрабатывали ультразвуком (Branson Model 250 Digital Sonifier) и подходящие разведения высевали на YPD для определения жизнеспособности клеток, на среду, лишенную урацила, содержащую 60 мкг/мл канаванина (Sigma), для отбора рекомбинантовUra+CanR и на среду, лишенную триптофана, содержащую 3 мкг/мл циклогексимида (Sigma), для отбора рекомбинантов Trp+CyhR. Колонии спор, возникающие на каждой среде, культивировали и подвергали фенотипическим и молекулярным тестам для определения, представляют ли они истинные рекомбинанты. Для фенотипического анализа репрезентативное количество кандидатных рекомбинантов высевали повторно штриховой разводкой на ту же самую среду, использованную для отбора, и затем высевали перепечатыванием колоний на тест-чашки -Ura, -Trp, содержащие циклогексимид (10 мкг/мл), канаванин(60 мкг/мл) и чашки для определения типа спаривания.- 17009443 Споры высевали также на -Ura-Trp-среды для определения частоты диплоидов для каждого препарата спор, который во всех случаях содержал менее чем 4% всех жизнеспособных клеток. Для молекулярного анализа тотальную геномную ДНК подвергали аналитической ПЦР (см. ниже) с использованием подходящих пар праймеров, которые специфически амплифицируют исходные или рекомбинантные фрагменты. Частоты рекомбинации для конкретного отбора выражали в виде частоты жизнеспособных клеток на конкретной селективной среде, корректированной на присутствие не-рекомбинантов, дающих ложно-положительный фенотип. В большинстве случаев такие ложно-положительные результаты возникают в результате мутационной инактивации маркера CAN1 или CYH2, как можно предположить на основании аналитической ПЦР. Для рекомбинации второго раунда подходящие рекомбинанты, полученные из первого раунда рекомбинации, спаривали и отбирали Ura+Trp+ диплоиды. Далее следовала та же самая процедура споруляции, что и для рекомбинации первого раунда, за исключением того, что споры высевали на YPD, на среды, лишенные урацила, содержащие циклогексимид, для отбора рекомбинантов Ura+CyhR и на среды, лишенные триптофана, содержащие канаванин, для отбора рекомбинантов Trp+CanR. Кандидатные рекомбинанты аналогичным образом подвергали фенотипическому и молекулярному анализу. 1.5. Молекулярные способы Геномную ДНК, используемую в качестве матрицы для препаративной или аналитической ПЦР,получали из ночных культур YPD стандартной минипреп-процедурой в соответствии с Ausubel et al. Препаративную ПЦР фрагментов, используемых в клонировании или для секвенирования, выполняли с Оха-плазмидной ДНК (приблизительно 50 пг) или геномной ДНК дрожжей (приблизительно 0,5 мкг) в качестве матрицы в объемах реакции 50 мкл, содержащих 2,5 Е полимеразы Геркулазы (Stratagene), 1 х реакционный буфер для Геркулазы, 0,2 мМ каждого из dNTP и 100 нг каждого праймера. Амплификацию проводили следующим образом: 94 С 2 мин; 30 циклов 94 С 10 с, 55 С 30 с, 72 С 30 с; 68 С 10 мин. Модифицированную процедуру ПЦР колоний использовали для подтверждения интеграции рекомбинантных кассет в локусе BUD31 (http://www.fhcrc.org/labs/hahn/methods/molbiometh/pcr yeast colony.html), с использованием следующих условий амплификации: 95 С 5 мин; 35 циклов 95 С 1 мин, 55 С 1 мин,68 С 1 мин; 72 С 10 мин. Аналитическую ПЦР для характеристики Оха-инсертов проводили в реакционных объемах 100 мкл, содержащих приблизительно 0,5 мкл геномной ДНК, полученной из кандидатных рекомбинантов и контрольных штаммов, 1,5 Е полимеразы Taq (Roche), 1 х реакционный буфер, 0,2 мМ каждого из dNTP и 100 нг 100 нг каждого праймера, при тех же самых условиях амплификации, что и для ПЦР колоний, за исключением того, что удлинение проводили при 68 С в течение 2 мин. Все реакции амплификации выполняли с использованием Mastercycler gradient 5331 (Eppendorf). Для анализа последовательности рекомбинантных Оха-инсертов проводили препаративную ПЦР с парами праймеров KNS16/KNS29 (для рекомбинантов Ura+CanR) или KNS11/KNS28 (для Trp+CyhR) с последующей очисткой с использованием набора Qiaquick PCR (Qiagen). Продукты ПЦР секвенировали с использованием Genome Express (Meylan, FR) с праймерами KNS30, KNS31, KNS33 или KNS38, в зависимости от целесообразности. Рекомбинантные последовательности сопоставляли и анализировали с использованием программы Clone Manager (Sci Ed Central). Олигонуклеотиды, используемые в ПЦР и секвенировании (таблица 3), покупали из Proligo France. 2. Результаты 2.1. Разработка системы мейотической гомеологичной рекомбинации дрожжей Была разработана стратегия, которая использует дрожжи Saccharomyces cerevisiae для стимуляции рекомбинации in vivo между дивергированными ДНК-последовательностями. Решающие признаки этой стратегии включают в себя использование мейотических клеток, в которых имеют место высокие уровни рекомбинации по всему геному, и инактивацию системы репарации ошибочных спариваний (MMR), которая обычно ограничивает рекомбинацию между дивергированными последовательностями. Подлежащие рекомбинации последовательности, т.е. субстраты рекомбинации, вводят в один из двух векторов,который также несет фланкирующие маркерные последовательности таким образом, чтобы создать рекомбинационные кассеты. Эти рекомбинационные кассеты вводят в геном дрожжей, в локусе на хромосоме III (интервал BUD31-HCM1), который находится в районе, о котором известно, что он является рекомбинационно активным в мейозе. Диплоиды, гетерозиготные в отношении рекомбинационных кассет,спорулируют, и споры высевают на среды, которые отбирают на клетки со специфическими конфигурациями фланкирующих маркеров, что позволяет проводить отбор рекомбинантов, в которых имел место кроссовер с участием субстратов рекомбинации (фиг. 1). Были сконструированы два обычных содержащих рекомбинационные кассеты вектора, pMXY9 иpMXY12, которые содержат маркеры URA3 и CAN1 и маркеры TRP1 и CYH2, соответственно, фланкирующие сайты рестрикции, которые могут быть использованы для введения субстратов рекомбинации(фиг. 2). Маркер URA3 придает прототрофию в отношении урацила, а маркер CAN1 придает чувствительность к канаванину. В отсутствие этого маркера клетки являются устойчивыми к этому лекарственному средству. Маркер TRP1 придает прототрофию в отношении триптофана, а маркер CYH2 придает чувствительность к циклогексимиду. В отсутствие этого маркера клетки являются устойчивыми к этому лекарственному средству. Каждая из этих двух рекомбинационных кассет, в свою очередь, фланкирована- 18009443 последовательностями, которые делают возможным нацеливание всего инсерта на локус BUD31-HCM1 посредством трансформации компетентных клеток (фиг. 2). Был также сконструирован штамм, который служит в качестве первичного хозяина для трансформации, MXY47 (табл. 2). Этот диплоид является гетерозиготным в отношении мутации msh2KanMX и является фенотипически диплоидом дикого типа в отношении MMR. Он является также гомозиготным в отношении маркеров ura3-l, trp1-1, can1-100 иcyh2R, что делает возможным мониторинг присутствия маркеров рекомбинационной кассеты, и гетерозиготным в отношении маркеров his3-11,15 и leu2-3, 112. MXY47 трансформируют фрагментами, несшими рекомбинационные кассеты, первичные трансформанты отбирают в виде прототрофов Ura+ илиTrp+ (для производных MXY9 и MXY12, соответственно) и нацеливание подтверждают аналитической ПЦР с использованием праймеров, которые узнают последовательности внутри введенной конструкции и снаружи от нее. Первичные трансформанты спорулируют и тетрады препарируют и высевают перепечатыванием колоний (методом отпечатков (реплик для идентификации сегрегантов дикого типа илиmsh2, которые несут рекомбинационную кассету. Подходящие гаплоиды спаривают один с другим с получением диплоидов MSH2/MSH2 (дикого типа) и msh2/msh2, гетерозиготных в отношении субстратов рекомбинации. В первом раунде мейотической рекомбинации для генерирования рекомбинантов эти диплоиды спорулируют, и свободные споры высевают на среды, лишенные урацила и содержащие канаванин, для отбора на рекомбинанты с URA3-CYH2-конфигурацией фланкирующих маркеров (колонии спор Ura+CanR), или на среды, лишенные триптофана и содержащие циклогексимид, для отбора наTRP1-CAN1-конфигурацию (колонии спор Trp+CyhR). Исходные диплоиды и нерекомбинантное гаплоидное потомство не могут расти на этих средах. Определяют частоту колоний спор, возникающих на селективных средах, колонии кандидатных рекомбинантных спор характеризуют фенотипически посредством перепечатывания колоний на тест-среды и молекулярно посредством ПЦР с соответствующими парами праймеров, и пробу подтвержденных рекомбинантов отбирают для секвенирования. Эта стратегия является итеративной (повторяющейся) в том смысле, что клетки, несущие рекомбинантные инсерты, могут быть идентифицированы и подвергнуты дополнительным раундам мейотической рекомбинации для увеличения разнообразия. Во втором раунде спаривают гаплоиды Ura+CanR иTrp+CyhR и процесс споруляции и отбора повторяют, за исключением того, что новые рекомбинанты отбирают на средах, лишенных урацила и содержащих циклогексимид, для отбора на рекомбинанты сURA3-CAN1-конфигурацией фланкирующих маркеров (колонии спор Ura+CyhR), или на средах, лишенных триптофана и содержащих канаванин, для отбора на TRP1-CYH2-конфигурацию (колонии спорTrp+CanR). Описанная здесь подробно стратегия может быть также модифицирована для включения дополнительных маркеров для увеличения строгости отбора. Кроме того, рекомбинанты могут также отбираться непосредственно при помощи ПЦР с использованием праймеров, специфических в отношении фланкирующих последовательностей. 2.2. Фенотипический отбор на рекомбинанты между парами генов Оха с варьирующейся дивергенцией последовательностей Гены, принадлежащие к суперсемейству Оха бета-лактамаз, были выбраны в качестве субстратов для тестирования возможности использования этой системы для отбора рекомбинантов. Рекомбинацию между следующими парами Оха оценивали в генетическом фоне дикого типа и msh2: Oxa11-Oxa11, которые имеют 100% гомологию на протяжении 800 п.н. ORF; Оха 7-Oxa11, 95%; Oxa5-Oxa11, 78%. Диплоиды, полученные скрещиваниями между соответствующими гаплоидами, индуцировали для вступления в мейоз. Из мейотических культур получали споры, и серийные разведения высевали на YPD для определения жизнеспособности клеток и на среду, лишенную урацила и содержащую канаванин (Ura+Can), и на среду, лишенную триптофана и содержащую циклогексимид (-Trp+Cyh), для отбора на рекомбинанты. 2.3. Частоты рекомбинации между генами Оха с варьирующейся гомологией последовательностей Данные, показанные на фиг. 3, демонстрируют, что в генетическом фоне дикого типа увеличенная гетерология последовательности оказывает сильное ингибирующее действие на рекомбинацию кроссоверов, и что это действие ослабляется, но не устраняется мутацией msh2. Обычно мутация msh2 вызывает увеличение частоты рекомбинации на приблизительно один порядок величин над рекомбинацией, которую наблюдают для штаммов дикого типа, при двух уровнях тестируемой дивергенции. Однако только инактивация MSH2 не компенсирует ингибирование рекомбинации между субстратами рекомбинации с более высокими степенями гетерологии. Например, частоты рекомбинации для штамма msh2 с инскертами Оха, имеющими 78% гомологию (MXY102), по меньшей мере в 10 раз (Ura+CanR) и в 25 раз(Trp+CyhR) ниже частот, обнаруживаемых для штамма дикого типа с инсертами Оха со 100% гомологией (MXY60), что свидетельствует о том, что факторы, иные, чем MSH2-зависимая репарация ошибочных спариваний, предотвращает рекомбинацию кроссоверов между более дивергированными последовательностями. Следует отметить, что появление рекомбинантов msh2 при уровне дивергенции 78%, при частотах приблизительно 210-4, свидетельствует о том, что рекомбинация может быть достигнута между даже более дивергентными субстратами.- 19009443 2.4. Эффект гиперрекомбинации msh2 Действие msh2 на гомологичную и гомеологичную рекомбинацию определяли количественно расчетом - сначала отношения рекомбинантов msh2 к рекомбинантам дикого типа для конкретного процента гомологии для конкретного отбора для каждого эксперимента и затем расчетом средних величин и стандартных отклонений группы определенных таким образом отношений. Эти результаты показаны на фиг. 4. Присутствие мутации msh2 увеличивает частоту гомеологичной рекомбинации для последовательностей 95 и 78% гомологии, и имеется менее выраженное, но все еще определяемое количественно усиление рекомбинации между идентичными на 100% последовательностями. Кроме того, степень усиления при помощи msh2 гомеологичной рекомбинации различается для двух отборов: для штаммов с гомеологичными инсертами Оха инактивация MSH2 увеличивает частоту рекомбинантов Trp+CyhR в более высокой степени, чем она увеличивает частоту рекомбинантов Ura+CanR. В принципе, частоты обоих типов рекомбинантов (Ura+CanR и Trp+CyhR) должны быть эквивалентными, но эти числа свидетельствуют о том, что имеются неоднозначности в этой системе, которые провоцируются или усиливаются мутациейmsh2, вместе с вариациями в степени дивергенции последовательности. Эксперименты для испытания относительных влияний инсертов и фланкирующих маркерных последовательностей на типы полученных рекомбинантов показывают, что эта неоднозначность является свойством фланкирующих маркеров,а влияние субстратов рекомбинации в управлении результатами событий мейотической рекомбинации не может быть ответственным за это (данные не показаны). 2.5. ПЦР-анализ отобранных рекомбинантов Пример ПЦР-анализа, примененного к колониям спор Ura+CanR и Trp+CyhR, полученных из диплоидов дикого типа и msh2, содержащих гены Оха 22% дивергенции (MXY99 и MXY102, соответственно), показан на фиг. 5. Для каждого штамма анализировали десять колоний спор, которые проявляли каждый рекомбинантный фенотип. Экстракты из каждой колонии использовали в качестве матриц для амплификации с парами праймеров, которые специфически амплифицируют исходные молекулы, и с парами праймеров, которые специфически амплифицируют рекомбинантные молекулы. В каждом случае (в случаях) амплифицировался только предсказанный рекомбинантный инсерт, что свидетельствовало о том, что отобранные колонии спор содержали последовательности, продуцируемые рекомбинацией между исходными субстратами рекомбинации Оха. Эти результаты демонстрируют также, что рекомбинантные молекулы могут быть легко извлечены из спорулированных культур, даже без привлечения стадии генетического отбора. В данном случае сайты узнавания праймеров, локализованные в генах URA3,CAN1, TRP1 и CYH2, представляют молекулярные маркерные последовательности, которые фланкируют каждый субстрат рекомбинации. 2.6. Анализ последовательности мейотических гомеологичных рекомбинантов первого раунда: 5% и 22% дивергенция Мейотические рекомбинанты Оха 7-Oxa11, произведенные из диплоидов дикого типа и msh2(MXY64 и MXY66, соответственно), которые содержат субстраты рекомбинации, имеющие 95% гомологию, которая была достаточной для фенотипических и молекулярных (ПЦР) тестов, амплифицировали с праймерами, специфическими в отношении фланкирующих маркеров, и секвенировали с использованием праймеров, близких к сайтам старта и остановки трансляции. Всего анализировали 55 рекомбинантных последовательностей, полученных из гаплоидного потомства диплоидов Оха 7-Oxa11: 14 рекомбинантов Ura+CanR и 13 рекомбинантов Trp+CyhR из MXY64 и 14 рекомбинантов Ura+CanR и 14 рекомбинантов Trp+CyhR из MXY66. Размер секвенированных проб позволяет сделать несколько наблюдений. 1) Как для рекомбинантов дикого типа, так и для рекомбинантов msh2 положение, в котором имел место кроссинговер, находится в диапазоне полного кодирующего района, без явного предпочтения в отношении конкретного интервала. Кроссоверы, которые встречались в 5'-районе, были, вероятно, такими же,как и кроссоверы в 3'-районе. Кроме того, для конкретного штамма не было видимого различия в распределении сайтов кроссовера для колоний спор, полученных отбором -Ura+Can или отбором -Trp+Cyh. 2) Длина непрерывной гомологии в интервале кроссовера также не имела значения: кроссоверы детектировали между двумя близко расположенными полиморфизмами (положения 543-552 для Trp+CyhR 7, 8 и 13 MXY66, где положение 1 представляет остаток аденина сайта инициации трансляции ATG), а также между двумя наиболее далеко расположенными один от другого полиморфизмами (положения 163-265,например, Trp+CyhR 15). 3) Рекомбинантные инсерты Оха, выделенные из обоих генетических фонов дикого типа и msh2, содержали полноразмерные рекомбинантные последовательности, потенциально способные кодировать новые функциональные белки Оха. То есть все кроссоверы появлялись таким образом, чтобы сохранить интактную рамку считывания (ORF), без инсерции или делеции нуклеотидов в интервале кроссовера или в любом другом интервале. 4) Хотя структуры большинства рекомбинантных последовательностей согласовались с простым кроссовером между двумя последовательностями Оха в локальных районах гомологии, несколько рекомбинантов, выделенных в генетическом фоне msh2, проявляли более высокую сложность. Последовательности, полученные из четырех рекомбинантов(Ura+CanR 16 и 31 MXY66 и Trp+CyhR 5 и 9 MXY66), проявляли более высокую степень мозаицизма (мозаичности), как если бы они были получены из более чем одного события кроссовера. Действительно, анализ двух из этих рекомбинантов был осложнен, так как исследование электрофореграмм вы- 20009443 явило присутствие двух перекрывающихся пиков во множественных сайтах в секвенированном районе,причем каждый сайт соответствовал полиморфизму Оха 7-Oxa11. Это наблюдение указывает на то, что популяция молекул, которые были секвенированы, была гетерогенной, наиболее вероятным объяснением чего является присутствие нерепарированной или частично репарированной гетеродуплексной ДНК,присутствующей в рекомбинантных спорах msh2. Эта интерпретация согласуется с известной увеличенной частотой постмейотической сегрегации (PMS), вызываемой мутацией msh2. В этих двух случаях,Ura+CanR 16 и 31 MXY66, один или более репарированных сайтов были фланкированы отрезками нерепарированного гетеродуплекса, что согласуется с демаскировкой активности репарации ошибочных спариваний коротких участков в генетическом фоне msh2, как предполагалось Coic, Gluck and Fabre(EMBO J. 19:3408). Несколько других случаев PMS, не ассоциированных с репарацией ошибочных спариваний коротких участков, наблюдали также для рекомбинантных последовательностей msh2, что свидетельствует о том, что эта альтернативная система репарации ошибочных спариваний не может быть высокоэффективной в коррекции ошибочных спариваний в гетеродуплексной ДНК. На основании оценки из электрофореграмм последовательности степень некорректированного гетеродуплекса варьировалась от короткого района из приблизительно 50 нуклеотидов до района, почти охватывающего полнуюORF. Доказательство для PMS или репарации ошибочных спариваний коротких участков не было обнаружено для рекомбинантных последовательностей дикого типа. В целом, эти открытия предполагают,что степень создаваемого разнообразия является более высокой в мейозе msh2, чем в мейозе дикого типа. Мейотические рекомбинанты получали также из диплоидов дикого типа и msh2, которые содержат субстраты рекомбинации, имеющие 78% гомологию (MXY99 и MXY102, соответственно). В целом, анализировали 24 рекомбинантные последовательности, полученные из рекомбинантного потомства диплоидов Оха 5-Oxa11: пять рекомбинантов Ura+CanR и три рекомбинанта Trp+CyhR из MXY99 и девять рекомбинантов Ura+CanR и семь рекомбинантов Trp+CyhR из MXY102. Исследование этих последовательностей предполагает несколько тенденций. 1) Рекомбинантные последовательности Оха, полученные как в штамме дикого типа, так и в штамме msh2 отбором на -Trp+CyhR, обнаруживали кроссоверы в различных положениях на протяжении ORF, с, возможно, легкой тенденцией в отношении среднего района из 250 п.н. (нуклеотиды 333-573) всей общей области гомологии. В противоположность этому, рекомбинанты, полученные как в штамме дикого типа, так и в штамме msh2 отбором на -Ura+CanR, обнаруживали явно выраженное смещение в положениях кроссоверов: в 3 из 5 последовательностей дикого типа, и в 8 из 9 последовательностей msh2 кроссоверы встречались в пределах последних 80 нуклеотидов района разделяемой гомологии, т.е. в последних 10% ORF. 2) Интервалы абсолютной гомологии, в которых были идентифицированы кроссоверы, находятся в диапазоне 11-20 нуклеотидов для Trp+CyhRотбора, что свидетельствует о предпочтительности в отношении этих относительно более длинных районов идентичности последовательности. В противоположность этому интервалы кроссовера были более короткими для Ura+Can-отбора, в диапазоне 3-17 нуклеотидов (13 из 14 этих интервалов составляли 13 или менее нуклеотидов). 3) Что касается рекомбинации с участием последовательностей с 95% гомологией, полученные новые последовательности также состояли из интактных ORF и потенциально кодируют новые белки суперсемейства Oха. 4) Случаи PMS, согласно оценке электрофореграмм, не были обнаружены для рекомбинантов дикого типа, но очень короткие участки нерепарированного гетеродуплекса были обнаружены для нескольких рекомбинантов msh2, в том числе в 3 из 7 Trp+CyhRрекомбинантов. Эти районы включали в себя максимально 67 нуклеотидов, т.е. были более короткими,чем некоторые из этих районов, наблюдаемых для рекомбинантов Оха 7-Oxa11. В целом, эти наблюдения свидетельствуют о том, что рекомбинантные последовательности могут быть отобраны от введенных субстратов рекомбинации, с варьированием по меньшей мере на 22%, и что эти последовательности кодируют новые белки. 2.7. Анализ последовательности рекомбинантов Оха 7-Oха 11 второго раунда Способность системы дрожжей увеличивать разнообразие итеративным образом исследовали конструированием диплоидов из рекомбинантных гаплоидов Оха 7-Oxa11, генерированных в первом раунде мейоза, и подверганием этих новых диплоидов второму раунду мейоза. Среди секвенированногоUra+CanR- и Trp+CyhR-семейства MXY64 и MXY66 были отобраны пары подходящих рекомбинантов с кроссоверами в одном и том же интервале для конструирования новых диплоидов, в которых общий уровень гомологии последовательности был опять равен 95%. Были созданы три диплоида дикого типа(MXY81, MXY82 и MXY83) и три диплоида msh2 (MXY86, MXY87 и MXY88). Были сконструированы также контрольные диплоиды дикого типа и msh2, содержащие только инсерты последовательности Оха,из подходящего рекомбинантного потомства MXY60 и MXY62, дающие MXY90 и MXY92. Эти диплоиды спорулировали и споры помещали на среду, лишенную урацила и содержащую циклогексимид (Ura+Cyh), и на среду, лишенную триптофана и содержащую канаванин (-Trp+Can), для отбора рекомбинантов второго раунда. Как показано на фиг. 6, частоты колоний спор -Ura+CyhR и -Trp+CanR, наблюдаемые для всех этих штаммов, согласуются с антирекомбинационным действием гена MSH2. Оба типа колоний были обнаружены среди потомства гомозиготного MXY90 дикого типа с частотами, большими,чем 10-3, в то время как эти частоты уменьшались в 5-10 раз среди потомства диплоидов дикого типа с гетерологией инсерта Оха (MXY81, MXY82 и MXY83). Инактивация гена MSH2 в диплоидах с дивер- 21009443 гентными инсертами Оха (MXY86, MXY87 и MXY88) приводила к 2-6-кратному увеличению частоты колоний спор Ura+CyhR и Trp+CanR, аналогично уровням, наблюдаемым для диплоида msh2, несущего идентичные инсерты Оха (MXY92). Хотя использованные среды отличаются от сред, использованных для отбора рекомбинантов первого раунда, частоты, при которых отбирали рекомбинанты дикого типа иmsh2 второго раунда, являются сравнимыми с частотами для рекомбинантов первого раунда. Колонии спор Ura+CyhR и Trp+CanR в генетических фонах как дикого типа (MXY81 и MXY83), так и msh2 (MXY86) отбирали для секвенирования. Всего секвенировали 14 инсертов Оха дикого типа и 7 инсертов Оха msh2. В большинстве случаев кроссовер происходил в новом интервале во время рекомбинации второго раунда, опять без видимого смещения в отношении положения или размера интервала: кроссоверы, включающие в себя различные интервалы, были обнаружены на протяжении ORF Оха, и они встречались в таких больших интервалах, как 101 нуклеотид, и в таких малых интервалах, как 5 нуклеотидов. В одном случае (Trp+CyhR-гаплоид MXY83) кроссовер второго раунда встречался в интервале кроссовера первого раунда, восстанавливая посредством этого полную последовательность Oxa11. Рекомбинанты, извлеченные из диплоидов msh2, были более разнообразными, чем рекомбинанты, извлеченные из штаммов дикого типа. Для диплоида msh2 MXY86 наблюдали несколько колоний спор, проявляющих интенсивную постмейотическую сегрегацию (PMS) и мозаицизм (мозаичность) последовательности, согласующиеся с образованием длинных участков гетеродуплекса в промежуточном продукте рекомбинации. Кроме того, некоторые ошибочные спаривания были репарированы в этом гетеродуплексном участке, что опять согласуется с активностью репарации ошибочных спариваний в коротких участках. В целом, рекомбинация второго раунда в генетическом фоне msh2 является такой же эффективной, как и рекомбинация первого раунда, как количественно, в отношении генерирования разнообразия последовательностей (например, распределения интервалов кроссовера и встречаемости PMS), так и качественно, в отношении увеличения общей частоты гомеологичной (с 5% дивергенцией) рекомбинации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения и обнаружения рекомбинантных ДНК-последовательностей в Saccharomycesa) получения первых диплоидных клеток Saccharomyces cerevisiae, несущих в определенном локусе их генома первую рекомбинационную кассету, содержащую первую, подлежащую рекомбинации ДНКпоследовательность, которая фланкирована, по меньшей мере, первой и второй маркерными последовательностями, и в аллельном положении вторую рекомбинационную кассету, содержащую вторую, подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность, которая фланкирована, по меньшей мере, третьей и четвертой маркерными последовательностями,b) индукции споруляции первых диплоидных клеток, полученных в а), иc) выделения гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых первые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы, по меньшей мере, первой и четвертой маркерными последовательностями, и гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых вторые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы, по меньшей мере, второй и третьей маркерными последовательностями. 2. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий стадии:a) получения вторых диплоидных клеток спариванием гаплоидных клеток, содержащих первые рекомбинированные ДНК-последовательности, полученные в 1 с), с гаплоидными клетками, содержащими вторые рекомбинированные ДНК-последовательности, полученные в 1 с),b) индукции споруляции вторых диплоидных клеток, полученных в а), иc) выделения гаплоидных клеток, содержащих рекомбинационные кассеты, в которых третьи рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы, по меньшей мере, первой и второй маркерными последовательностями, и гаплоидных клеток, содержащих четвертые рекомбинационные кассеты,в которых четвертые рекомбинированные ДНК-последовательности фланкированы, по меньшей мере,третьей и четвертой маркерными последовательностями. 3. Способ по п.1 или 2, в котором дополнительно рекомбинированные ДНК-последовательности получают, подвергая гаплоидные клетки, полученные в 2 с), по меньшей мере еще одному циклу спаривания с другими гаплоидными клетками индукции споруляции полученных диплоидных клеток, и выделением гаплоидных клеток с рекомбинированными ДНК-последовательностями на основе молекулярного сцепления между двумя маркерными последовательностями. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором первую диплоидную клетку получают одновременной или последовательной трансформацией диплоидной клетки S. cerevisiae ДНК-молекулой, содержащей первую рекомбинационную кассету, и ДНК-молекулой, содержащей вторую рекомбинационную кассету,и необязательно предоставлением возможности интеграции этих двух рекомбинационных кассет в аллельные положения генома S. cerevisiae. 5. Способ по п.4, в котором ДНК-молекулой, содержащей первую или вторую рекомбинационные кассеты, является искусственная хромосома дрожжей (YAC).- 22009443 6. Способ по п.4, в котором ДНК-молекулой, содержащей первую или вторую рекомбинационные кассеты, является клонирующий вектор, посредством которого соответствующие две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, которые являются гомологичными определенному локусу генома S. cerevisiae. 7. Способ по любому из пп.1-3, в котором первую диплоидную клетку получают слиянием гаплоидной клетки S. cerevisiae, несущей в локусе ее генома первую рекомбинационную кассету, с гаплоидной клеткой S. cerevisiae, несущей в аллельном положении вторую рекомбинационную кассету. 8. Способ по любому из пп.1-3, в котором первую диплоидную клетку получают спариванием гаплоидной клетки S. cerevisiae, несущей в локусе ее генома первую рекомбинационную кассету, с гаплоидной клеткой S. cerevisiae, несущей в аллельном положении вторую рекомбинационную кассету. 9. Способ по п.7 или 8, в котором гаплоидные клетки, несущие первую или вторую рекомбинационную кассету, получают:a) встраиванием первой, подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности между первой и второй маркерными последовательностями, расположенными смежно на первом клонирующем векторе, и встраиванием второй подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности между третьей и четвертой маркерными последовательностями, расположенными смежно на втором клонирующем векторе, посредством чего соответствующие две маркерные последовательности фланкированы нацеливающими последовательностями, которые являются гомологичными определенному локусу генома S. cerevisiae,b) вырезанием из клонирующих векторов, полученных в а), фрагментов, несущих первую рекомбинационную кассету и вторую рекомбинационную кассету соответственно, посредством чего каждая из этих кассет содержит подлежащую рекомбинации ДНК-последовательность, фланкированную соответствующими двумя маркерными последовательностями, и каждая кассета, в свою очередь, фланкирована нацеливающими последовательностями,c) трансформацией фрагментов, несущих эти рекомбинационные кассеты с фланкирующими нацеливающими последовательностями, полученных в b), по отдельности в диплоидные клетки S. cerevisiae,посредством чего нацеливающие последовательности направляют интеграцию этих кассет в тот локус, в отношении которого они являются гомологичными, для получения диплоидных клеток, гетерозиготных в отношении первой кассеты или второй кассеты,d) индукцией по отдельности споруляции гетерозиготных диплоидных клеток, полученных в с), иe) выделением гаплоидных клеток, содержащих первую кассету и экспрессирующих первую и вторую маркерные последовательности, и отдельно гаплоидных клеток, содержащих вторую кассету и экспрессирующую третью и четвертую маркерные последовательности. 10. Способ по п.9, в котором первым клонирующим вектором является плазмида pMXY9, а вторым клонирующим вектором является плазмида pMXY12. 11. Способ по любому из пп.4-6, 9 или 10, в котором диплоидные клетки S. cerevisiae, используемые для трансформации, являются ауксотрофными в отношении по меньшей мере двух факторов питания. 12. Способ по п.11, в котором эти диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллеля ura3-1 и аллеля trp1-1, которые делают их ауксотрофными в отношении урацила и триптофана соответственно. 13. Способ по любому из пп.4-6 или 9-12, в котором диплоидные клетки, используемые для трансформации, являются устойчивыми по меньшей мере к двум антибиотикам. 14. Способ по п.13, в котором эти диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллеля can1-100 и аллеля cyh2R, которые делают их устойчивыми к канаванину и циклогексимиду соответственно. 15. Способ по любому из пп.4-6 или 9-14, в котором для трансформации используют диплоидные клетки штамма S. cerevisiae MXY47, которые являются гомозиготными в отношении аллелей ura3-1, trp11, can1-100 и cyh2R и гетерозиготными в отношении мутации msh2KanMX. 16. Способ по любому из пп.1-15, в котором клетки S. cerevisiae имеют функциональную систему репарации ошибочных спариваний. 17. Способ по любому из пп.1-15, в котором клетки S. cerevisiae временно или перманентно лишены системы репарации ошибочных спариваний. 18. Способ по п.17, в котором временная или перманентная недостаточность системы репарации ошибочных спариваний обусловлена мутацией и/или индуцируемой экспрессией, или репрессией одного или нескольких генов, участвующих в системе репарации ошибочных спариваний, обработкой агентом,который насыщает систему репарации ошибочных спариваний, и обработкой агентом, который глобально ослабляет репарацию ошибочных спариваний. 19. Способ по любому из пп.1-18, в котором первая и вторая рекомбинационные кассеты интегрированы в локус BUD31-HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae. 20. Способ по любому из пп.1-19, в котором первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности имеют дивергенцию по меньшей мере в одном нуклеотиде. 21. Способ по любому из пп.1-20, в котором первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности получены из организмов, других, чем S. cerevisiae, или, в том числе, из S. cerevisiae.- 23009443 22. Способ по любому из пп.1-21, в котором первая и вторая подлежащие рекомбинации ДНКпоследовательности содержат одну или более некодирующих последовательностей и/или одну или более кодирующих белок последовательностей. 23. Способ по любому из пп.1-22, в котором маркерные последовательности выбраны из группы,состоящей из маркеров питания, пигментных маркеров, маркеров устойчивости к антибиотикам, маркеров чувствительности к антибиотикам, сайтов узнавания праймеров, интрон-экзонных сочленений (границ сплайсинга), последовательностей, кодирующих конкретную субъединицу фермента, промоторных последовательностей, расположенных 3' (справа) регуляторных последовательностей генов и сайтов рестрикционных ферментов. 24. Способ по п.23, в котором первая и третья маркерные последовательности являются маркерами питания, генные продукты которых могут компенсировать ауксотрофию клетки S. cerevisiae. 25. Способ по п.24, в котором первой маркерной последовательностью является URA3, генный продукт которой может сообщать прототрофию в отношении урацила ауксотрофной в отношении урацила клетке S. cerevisiae. 26. Способ по п.24, в котором третьей маркерной последовательностью является TRP1, генный продукт которой может сообщать прототрофию в отношении триптофана ауксотрофной в отношении триптофана клетке S. cerevisiae. 27. Способ по п.23, в котором вторая и четвертая маркерные последовательности являются маркерами чувствительности к антибиотикам, генные продукты которых могут сообщать чувствительность к антибиотику клетке S. cerevisiae, которая является устойчивой к этому антибиотику. 28. Способ по п.27, в котором второй маркерной последовательностью является CAN1, генный продукт которой может сообщать чувствительность к канаванину канаванинустойчивой клетке S. cerevisiae. 29. Способ по п.27, в котором четвертой маркерной последовательностью является CYH2, генный продукт которой может сообщать чувствительность к циклогексимиду циклогексимид-устойчивой клетке S. cerevisiae. 30. Способ по любому из пп.1-29, в котором гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты с первой, второй, третьей или четвертой рекомбинированными ДНК-последовательностями,идентифицируют с использованием способов ПЦР для детектирования присутствия соответствующей комбинации маркеров. 31. Способ по любому из пп.1-29, в котором гаплоидные клетки, содержащие рекомбинационные кассеты с первой, второй, третьей или четвертой рекомбинированными ДНК-последовательностями,идентифицируют высеванием этих гаплоидных клеток на среды, которые отбирают на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле соответствующей комбинации маркеров. 32. Способ по п.31, в котором гаплоидные клетки, содержащие первые рекомбинированные ДНКпоследовательности, высевают на среду, которая отбирает на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле первой и четвертой маркерных последовательностей. 33. Способ по п.31, в котором гаплоидные клетки, содержащие вторые рекомбинированные ДНКпоследовательности, высевают на среду, которая отбирает на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле второй и третьей маркерных последовательностей. 34. Способ по п.31, в котором гаплоидные клетки, содержащие третьи рекомбинированные ДНКпоследовательности, высевают на среду, которая отбирает на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле первой и второй маркерных последовательностей. 35. Способ по п.31, в котором гаплоидные клетки, содержащие четвертые рекомбинированные ДНК-последовательности, высевают на среду, которая отбирает на молекулярное сцепление на одной и той же ДНК-молекуле третьей и четвертой маркерных последовательностей. 36. Плазмида pMXY9, содержащая расположенные рядом маркерный ген URA3 и маркерный генCAN1, посредством чего эти две маркерные последовательности фланкируют полилинкерную последовательность для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности и посредством чего эти два маркера фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу BUD31HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae. 37. Плазмида pMXY9 по п.36, в которой полилинкерная последовательность содержит сайты для рестрикционных ферментов SmaI, XbaI, PacI и BglII. 38. Плазмида pMXY12, содержащая расположенные рядом маркерный ген TRP1 и маркерный генCYH2, посредством чего эти две маркерные последовательности фланкируют полилинкерную последовательность для встраивания подлежащей рекомбинации ДНК-последовательности и посредством чего эти два маркера фланкированы нацеливающими последовательностями, гомологичными локусу BUD31HCM1 на хромосоме III генома S. cerevisiae. 39. Плазмида pMXY12 по п.38, в которой полилинкерная последовательность содержит сайты для рестрикционных ферментов SmaI, SpeI и PacI. 40. Штамм S. cerevisiae MXY47, отличающийся тем, что его диплоидные клетки являются гомозиготными в отношении аллелей аллелей ura3-1, trp1-1, can1-100 и cyh2R и гетерозиготными в отношении мутации msh2KanMX.- 24009443 41. Штамм Е. coli JM101, содержащий плазмиду pMXY9. 42. Штамм Е. coli DH5, содержащий плазмиду pMXY12. 43. Набор, содержащий, по меньшей мере, первый контейнер, который содержит клетки штамма S.cerevisiae MXY47, второй контейнер, который содержит клетки штамма Е. coli JM101, содержащие плазмиду pMXY9, и третий контейнер, содержащий штамм Е. coli DH5, содержащий плазмиду pMXY12. 44. Набор, содержащий, по меньшей мере, первый контейнер, содержащий клетки штамма S. cerevisiae MXY47, второй контейнер, содержащий ДНК плазмиды pMXY9, и третий контейнер, содержащий ДНК плазмиды pMXY12. Список последовательностей