Полипептиды zalpha 11 рецептора цитокина человека класса i, кодирующие их полинуклеотиды и способы их применения

006501 Предпосылки изобретения Пролиферация и дифференциация клеток многоклеточных организмов регулируются гормонами и полипептидными факторами роста. Эти диффундируемые молекулы позволяют клеткам осуществлять коммуникацию друг с другом и действовать совместно для образования клеток и органов и репарации поврежденной ткани. Примеры гормонов и факторов роста включают в себя стероидные гормоны (например, эстроген, тестостерон), паратиреоидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, интерлейкины, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), эритропоэтин (ЕРО) и кальцитонин. Гормоны и факторы роста влияют на клеточный метаболизм путем связывания с рецепторами. Рецепторы могут быть интегральными мембранными белками, которые связаны с путями передачи сигналов в клетке, такими как системы вторичных мессенджеров. Другие классы рецепторов являются растворимыми молекулами, такими как факторы транскрипции. Особый интерес представляют рецепторы для цитокинов, молекул, которые стимулируют пролиферацию и/или дифференцировку клеток. Примеры цитокинов включают в себя эритропоэтин (ЕРО), который стимулирует развитие эритроцитов; тромбопоэтин (ТРО), который стимулирует развитие клеток мегакариоцитарной линии дифференцировки; и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), который стимулирует развитие нейтрофилов. Эти цитокины применимы в восстановлении нормальных уровней кровяных клеток в пациентах, страдающих от анемии, тромбоцитопении и нейтропении, или получающих химиотерапию по поводу рака. Продемонстрированные in vivo активности этих цитокинов иллюстрируют огромный клинический потенциал или потребность в отношении других цитокинов, агонистов цитокинов и антагонистов цитокинов. Данное изобретение удовлетворяет эти потребности путем обеспечения нового рецептора гемопоэтического цитокина, а также относящихся к нему композиций и способов. Данное изобретение обеспечивает такие полипептиды для этих и других применений, которые должны быть очевидны лицам с обычной квалификацией в данной области из приведенных здесь описаний. Сущность изобретения В первом аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающие последовательности аминокислот, выбранные из группы, состоящей из(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ IDNO:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным, и полученных согласно тому, как раскрыто в описании. Во втором аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающий последовательность полинуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из(a) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий полипептид полной длины);(b) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 SEQ ID NO:4 (вырожденный полинуклеотид по отношению к указанному в (а), кодирующий полипептид полной длины);(c) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 779 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен);(d) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 833 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен);(e) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 834 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1(f) полинуклеотидной последовательности от нуклеотида 126 до нуклеотида 1682 SEQ ID NO:1 (полинуклеотид, кодирующий зрелый полипептид); Кроме того, полипептид zalpha11 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(е) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ IDNO:2 (полипептид полной длины). Дополнительно полипептид содержит домен WSXWS (SEQ ID NO:3), или полипептид (а), (с), (d),(е) дополнительно содержит трансмембранный домен, который может состоять из остатков 238 (Leu)-255(Leu) SEQ ID NO:2. Кроме того, полипептид (а), (b), (е), (d) дополнительно содержит внутриклеточный домен, который может состоять из остатков 256 (Lys)-538 (Ser) SEQ ID NO:2 и содержать сайты Box I и Box II. И, дополнительно, полипептид содержит аффинную метку. В другом аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции; сегмент ДНК, кодирующий зрелый полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I,имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ IDNO:2; и терминатор транскрипции,причем промотор функционально связан с сегментом ДНК, а сегмент ДНК функционально связан с терминатором транскрипции. Кроме того, экспрессирующий вектор дополнительно содержит второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК,кодирующим зрелый полипептид zalpha11. Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, содержащая указанный экспрессирующий вектор, экспрессирующая зрелый полипептид zalpha11. В другом аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий промотор транскрипции; сегмент ДНК, кодирующий цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11 рецептора цитокина человека класса I, имеющий последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2; и терминатор транскрипции,причем промотор, сегмент ДНК и терминатор функционально связаны. Дополнительно экспрессирующий вектор может содержать второй сегмент ДНК, экспрессирующий секреторную сигнальную последовательность, функционально связанную с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11; фрагмент ДНК, кодирующий трансмембранный домен полипептида zalpha11, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида; а трансмембранный домен содержит остатки 238 (Leu)-255 (Leu) SEQ ID NO:2; фрагмент ДНК, кодирующий внутриклеточный домен полипептида zalpha11, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим цитокинсвязывающий домен указанного полипептида, а внутриклеточный домен состоит из остатков 256 (Lys)-538 (Ser) SEQ ID NO:2. Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, в которую был введен экспрессирующий вектор, экспрессирующая растворимый рецепторный полипептид, zalpha11. Кроме того, пролиферация клетки зависит от экзогенного гемопоэтического фактора роста. В другом аспекте настоящего изобретения заявляется конструкция ДНК, кодирующая слитый белок, в состав которого входит полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, содержащая первый сегмент ДНК, кодирующий полипептид, имеющий последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из(a) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 2 (Met) до аминокислоты номер 19(b) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен zalpha11);(c) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен zalpha11);(d) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Leu) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID NO:2 (трансмембранный домен zalpha11);(e) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 238 (Leu) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID NO:2 (трансмембранный домен и внутриклеточный домен zalpha11);(f) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID NO:2 (внутриклеточный домен zalpha11);(g) аминокислотной последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID NO:2 (зрелый полипептид zalpha11); и, по меньшей мере, один другой сегмент ДНК,кодирующий дополнительный полипептид,причем первый и другие сегменты ДНК соединены в рамке считывания. В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипции; конструкцию ДНК, кодирующую слитый белок; и терминатор транскрипции,причем промотор функционально связан с конструкцией ДНК, а конструкция ДНК функционально связана с терминатором транскрипции. Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется культивируемая клетка, содержащая указанный экспрессирующий вектор, причем клетка экспрессирует слитый белок. В дополнительном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения слитого белка,предусматривающий культивирование указанной клетки и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой. В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полипептид zalpha11 рецептора цитокина человека класса I полной длины или его функциональные компоненты, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из(а) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ IDNO:2 (полипептид полной длины) или последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны указанным и получены, как раскрыто в описании. Кроме того, выделенный полипептид содержит последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из(a) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ IDNO:2 (полипептид полной длины). А также полипептид zalpha11 имеет последовательность аминокислотных остатков, выбранную из группы, состоящей из(а) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID(b) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID(c) последовательности от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(d) последовательности от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) SEQ ID(e) последовательности от аминокислоты номер 1 (Met) до аминокислоты номер 538 SEQ ID NO:2(полипептид полной длины). Кроме того, полипептид дополнительно содержит домен WSXWS, как показано в SEQ ID NO:3, а полипептид (а), (с), (d), (е) дополнительно содержит трансмембранный домен, который состоит из остатков 238 (Leu)-255 (Leu) SEQ ID NO:2. Дополнительно полипептид (а), (b), (d), (е) содержит внутриклеточный домен, который может состоять из остатков 256 (Lys)-538 (Ser) SEQ ID NO:2 и дополнительно содержать сайты Box I и Box II. Кроме того, полипептид дополнительно содержит аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин, цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Fс. Дополнительно полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен) и дополнительно содержит трансмембранный домен гетерологичного рецептора циктокина, который является рецептором цитокина класса I. Также полипептид может содержать трансмембранный домен и межклеточный домен из гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса I. Кроме того, полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 255 (Leu) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязывающий домен и трансмембранный домен) и дополнительно содержит внутриклеточный домен гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса I. Полипептид дополнительно состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 256 (Lys) до аминокислоты номер 538 (Leu) SEQ ID NO:2 (внутриклеточный домен) и дополнительно содержит трансмембранный домен и цитокинсвязывающий домен гетерологичного рецептора цитокина, который является рецептором цитокина класса I. Кроме того, выделенный полипептид состоит из последовательности аминокислотных остатков от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Leu) SEQ ID NO:2 (зрелый полипептид). Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения зрелого полипептидаzalpha11, предусматривающий культивирование клетки; и выделение полипептида zalpha11, продуцируемого этой клеткой. В другом аспекте настоящего изобретения заявляется выделенный полипептид zalpha11, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен); и, по существу, не содержащий трансмембранного и внутриклеточного доменов, обычно связанных с гемопоэтическими рецепторами. Кроме того, выделенный полипептид дополнительно может содержать аффинную метку; аффинную метку, маркер биотин/авидин, радионуклид, маркер фермент/субстрат, кофактор, ингибитор, флуоресцентную индикаторную частицу, хемилюминесцентную индикаторную частицу, токсин,цитотоксичную молекулу или домен иммуноглобулина Fc. В следующем аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения цитокинсвязывающего домена полипептида zalpha11, предусматривающий культивирование клетки; и выделение полипептида, продуцируемого этой клеткой. Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется способ получения антитела к полипептидуzalpha11, предусматривающий введение животному полипептида, выбранного из группы, состоящей из(a) полипептида, содержащего любые из 9-519 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) (зрелый полипептид);(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен);(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 101 (Leu) до аминокислоты номер 122 (Gly);(d) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 141 (Asn) до аминокислоты номер 174 (Ala);(e) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 193 (Cys) до аминокислоты номер 261 (Val);(f) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 51 (Тrр) до аминокислоты номер 61 (Glu);(g) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 136 (Ilе) до аминокислоты номер 143 (Glu);(h) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 187 (Pro) до аминокислоты номер 195 (Ser);(i) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 223 (Phe) до аминокислоты номер 232 (Glu); и(j) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 360 (Glu) до аминокислоты номер 368 (Asp),причем указанный полипептид индуцирует синтез антител в организме животного, и выделение антитела, специфически связывающегося с полипептидом zalpha11, из организма животного. В другом аспекте настоящего изобретения заявляется моноклональное антитело, полученное при иммунизации животного полипептидом zalpha11, выбранным из группы, состоящей из(a) полипептида, содержащего любые из 9-519 аминокислот, которые составляют непрерывную последовательность в пределах последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) (зрелый полипептид);(b) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) (цитокинсвязывающий домен):(c) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 101 (Leu) до аминокислоты номер 122 (Gly);(d) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 141 (Asn) до аминокислоты номер 174 (Ala);(e) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 193 (Cys) до аминокислоты номер 261 (Val);(f) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 51 (Тrр) до аминокислоты номер 61 (Glu);(g) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 136 (Ilе) до аминокислоты номер 143 (Glu);(h) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты 187 (Pro) до аминокислоты номер 195 (Ser);(i) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 223 (Phe) до аминокислоты номер 232 (Glu); и(j) полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 360 (Glu) до аминокислоты номер 368 (Asp). Еще в одном аспекте настоящего изобретения заявляется антитело, которое специфически связывается с полипептидом. В дополнительном аспекте настоящего изобретения заявляется способ обнаружения в тест-пробе присутствия модулятора активности полипептида zalpha11, предусматривающий культивирование клетки, в которую был введен экспрессирующий вектор, причем эта клетка экспрессирует цитокинсвязывающий домен полипептида zalpha11, в присутствии и в отсутствие тестпробы; и сравнение уровней активности указанного домена zalpha11 в присутствии и в отсутствие тестпробы при помощи биологического или биохимического анализа; и определение по результатам сравнения присутствия модулятора активности zalpha11 в данной тестпробе. В другом аспекте настоящего изобретения заявляется способ обнаружения лиганда рецептораzalpha11 в тест-пробе, предусматривающий обеспечение контактирования тест-пробы с полипептидом zalpha11, содержащим последовательность от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 237 (His) SEQ ID NO:2 (цитокинсвязвающий домен); и выявление связывания указанного полипептида с лигандом в пробе. Кроме того, согласно способу указанный полипептид дополнительно содержит трансмембранный и внутриклеточный домены и указанный полипептид связан с мембраной культивируемой клетки, а стадия выявления предусматривает измерение биологического ответа в культивируемой клетке. А также согласно способу биологический ответ представляет собой пролиферацию клеток, активность сигнальной трансдукции или активацию транскрипции репортерного гена и полипептид иммобилизован на твердом носителе. Дополнительно согласно способу тест-проба содержит лимфоидные клетки, гемопоэтические клетки, активированные Т-клетки или раковые клетки или кондиционированную среду из лимфоидных клеток, гемопоэтических клеток, активированных Т-клеток или раковых клеток. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 представляет собой график гидрофильности Hopp-Woods zalpha11 человека. Фиг. 2 представляет собой сопоставление zalpha11 человека (zalpha) (SEQ ID NO:2) и zalpha11 мыши (muzalp) (SEQ ID NO:85).-5 006501 Подробное описание изобретения Перед подробным изложением данного изобретения может быть полезным для его понимания определение следующих терминов. Термин аффинная метка используется здесь для обозначения полипептидного сегмента, который может быть присоединен ко второму полипептиду для очистки или детектирования второго полипептида или обеспечения сайтов для присоединения второго полипептида к субстрату. В принципе, любой пептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть использован в качестве аффинной метки. Аффинные метки включают в себя полигистидиновый участок(тракт), белок A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), глутатион S-трансферазу (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), аффинную метку Glu-Glu (Grussenmeyer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), вещество Р, пептид Flag (Hopp et al., Biotechnology 6:120410, 1988), стрептавидинсвязывающий пептид или другой антигенный эпитоп или связывающий домен. См., в общем, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. ДНК, кодирующие аффинные метки, доступны от коммерческих поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Термин аллельный вариант используется здесь для обозначения любой из двух или нескольких альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариация возникает природно через мутацию и может приводить к фенотипическому полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (без изменения в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин аллельный вариант используется здесь также для обозначения белка, кодируемого аллельным вариантом гена. Термины амино-концевой и карбоксил-концевой используются здесь для обозначения положений внутри полипептидов. Там, где позволяет контекст, эти термины используются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, некоторая последовательность, расположенная карбоксил-терминально относительно ссылочной последовательности в полипептиде, расположена проксимально относительно карбоксил-конца ссылочной последовательности, но не обязательно находится при карбоксил-конце полного полипептида. Термин пара комплемент/антикомплемент обозначает неидентичные части молекулы, которые образуют нековалентно связанную, стабильную пару при подходящих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются членами-прототипами пары комплемент/антикомплемент. Другие примеры пар комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, пары антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), пары смысловой/антисмысловой полинуклеотид и т.п. В случае, когда желательна последующая диссоциация пары комплемент/антикомплемент, пара комплемент/антикомплемент предпочтительно имеет аффинность связывания 109 М-1. Термин комплементы полинуклеотидной молекулы обозначает полинуклеотидную молекулу,имеющую комплементарную последовательность оснований и обращенную ориентацию в сравнении со ссылочной последовательностью. Например, последовательность 5'-ATGCACGGG-3' комплементарна 5'CCCGTGCAT-3'. Термин контиг обозначает полинуклеотид, который имеет непрерывный отрезок идентичной или комплементарной последовательности относительно другого полинуклеотида. Говорят, что непрерывные последовательности (контиги) перекрывают конкретный отрезок полинуклеотидной последовательности либо полностью, либо вдоль частичного отрезка этого полинуклеотида. Например, характерными контигами к полинуклеотидной последовательности 5'-ATGGCTTAGCTT-3' являются 5'-TAGCTTgagtct-3' и 3'gtcgacTACCGA-5'. Термин вырожденная нуклеотидная последовательность обозначает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или более вырожденных кодонов (в сравнении со ссылочной полинуклеотидной молекулой, которая кодирует полипептид). Вырожденные кодоны содержат различные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (т.е. триплеты GAU и GAC,каждый, кодируют Asp). Термин экспрессирующий вектор используется для обозначения молекулы ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают его транскрипцию. Такие дополнительные элементы включают в себя промоторную и терминаторную последовательности и могут также включать в себя одну или несколько точек начала репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.д. Экспрессирующие векторы обычно произведены из плазмидной или вирусной ДНК или могут содержать элементы обеих. Термин выделенный, в применении к полинуклеотиду, обозначает, что этот полинуклеотид был удален из его природной генетической среды и, следовательно, не содержит других посторонних или нежелательных кодирующих последовательностей и находится в форме, подходящей для применения в генетически сконструированных системах продуцирования белков. Такие выделенные молекулы являются молекулами, которые выделены из их природного окружения, и включают в себя кДНК-клоны и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК данного изобретения не содержат других генов, с которыми они обычно связаны, но могут включать в себя природно встречающиеся 5'- и 3'-нетранслируемые-6 006501 районы, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация связанных районов будет очевидной лицу с обычной квалификацией в данной области (см., например, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985). Выделенным полипептидом или белком является полипептид или белок, который обнаруживается в условиях, иных, чем его природное окружение, например отдельно от крови и ткани животного. В предпочтительной форме выделенный полипептид является, по существу, не содержащим других полипептидов, в частности других полипептидов животного происхождения. Предпочтительно обеспечение полипептидов в высокоочищенной форме, т.е. имеющих чистоту более 90%, более предпочтительно чистоту более 99%. При использовании в этом контексте термин выделенный не исключает присутствия того же самого полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры или альтернативно гликозилированные или дериватизованные формы. Термин функционально (операбельно) связанные, при ссылке на ДНК-сегменты, указывает, что эти сегменты расположены таким образом, что они функционируют совместно для их предполагаемых целей,например транскрипция инициируется в промоторе и протекает через кодирующий сегмент до терминатора. Термин ортолог обозначает полипептид или белок, полученный из одного вида, который является функциональной копией полипептида или белка из другого вида. Различия последовательностей среди ортологов являются результатом видообразования. Паралоги являются отличающимися, но структурно родственными белками, производимыми организмом. Считается, что паралоги возникают в результате дупликации генов. Например, -глобин, глобин и миоглобин являются паралогами друг друга. Термин полинуклеотид обозначает одно- или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть изолированы из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Размеры полинуклеотидов выражаются как пары нуклеотидов (сокращенно п.н.), нуклеотиды (нт) или тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.). Там,где позволяет контекст, два последниx термина могут описывать полинуклеотиды, которые являются одноцепочечными или двухцепочечными. При применении этого термина к двухцепочечным молекулам его используют для обозначения общей длины, и должно быть понятно, что он является эквивалентным термину пары нуклеотидов. Специалистам в данной области будет понятно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут слегка отличаться по длине и что их концы могут быть расположены зигзагами в результате ферментативного расщепления; таким образом, не все нуклеотиды в двухцепочечной полинуклеотидной молекуле могут быть спаренными. Полипептид является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями,получен ли он природным путем или синтетическим путем. Полипептиды, имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков, обычно называют пептидами. Термин промотор используется здесь в его признанном в данной области значении для обозначения части гена, содержащей последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНКполимеразы и инициацию транскрипции. Промоторные последовательности обнаруживаются обычно, но не всегда, в 5'-некодирующих районах генов. Белок обозначает макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может включать в себя также непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные компоненты могут быть присоединены к белку клеткой, в которой продуцируется данный белок, и будут варьироваться в зависимости от типа клетки. Белки определены здесь в терминах их аминокислотных каркасных структур; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указаны,но, тем не менее, они могут присутствовать. Термин рецептор используется здесь для обозначения связанного с клеткой белка или полипептидной субъединицы такого белка, которые связываются с биоактивной молекулой (лигандом) и медиируют действие этого лиганда на клетку. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению в рецепторе (и, в некоторых случаях, мультимеризации рецептора, т.е. ассоциации идентичных или различных субъединиц рецептора), которое вызывает взаимодействия между эффекторным доменом (доменами) и другой молекулой (молекулами) в клетке. Эти взаимодействия, в свою очередь, приводят к изменениям в метаболизме клетки. Метаболические события, связанные с взаимодействиями рецептор-лиганд, включают в себя транскрипцию генов, фосфорилирование/дефосфорилирование,пролиферацию клеток, увеличения продуцирования циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов. Рецепторы цитокинов клеточной поверхности характеризуются мультидоменной структурой,как обсуждается более подробно ниже. Эти рецепторы закреплены в клеточной мембране трансмембранным доменом, характеризующимся последовательностью гидрофобных аминокислотных остатков(обычно приблизительно 21-25 остатков), которая обычно фланкирована положительно заряженными остатками (Lys или Аrg). Обычно рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тиреоидстимулирующего гормона, -адренергического гормона) или мультимерными (например, PDGF-рецептор, рецептор гормона роста, IL-3-рецептор, GM-CSF-7 006501 рецептор, G-CSF-рецептор, рецептор эритропоэтина и IL-6-рецептор). Термин рецепторный полипептид используется для обозначения полипептидных цепей полного рецептора и его частей, в том числе выделенных функциональных доменов (например, лигандсвязывающих доменов). Термин секреторная сигнальная последовательность обозначает последовательность ДНК, которая кодирует полипептид (секреторный полипептид), который, как компонент большего полипептида,направляет этот больший полипептид через секреторный путь клетки, в которой он синтезируется. Этот больший полипептид обычно расщепляется с удалением секреторного пептида во время прохождения через этот секреторный путь. Растворимый рецептор является рецепторным полипептидом, который не связан с клеточной мембраной. Растворимые рецепторы являются наиболее обычно лигандсвязывающими рецепторными полипептидами, которые не имеют трансмембранного и цитоплазматического доменов. Растворимые рецепторы могут содержать дополнительные аминокислотные остатки, такие как аффинные метки, которые обеспечивают очистку этого полипептида или обеспечивают сайты для присоединения этого полипептида к субстрату, или последовательности константной области иммуноглобулина. Многие рецепторы клеточной поверхности имеют природно встречающиеся, растворимые копии, которые продуцируются протеолизом. Считается, что рецепторные полипептиды являются, по существу, не содержащими трансмембранного и внутриклеточного полипептидных сегментов, когда они не имеют достаточных частей этих сегментов для обеспечения мембранного прикрепления или трансдукции (передачи) сигнала, соответственно. Термин сплайсинговый вариант используется здесь для обозначения альтернативных форм РНК,транскрибированных из гена. Сплайсинговая вариация возникает природно посредством использования альтернативных сайтов сплайсинга в транскрибируемой молекуле РНК или менее обычно между раздельно транскрибируемыми молекулами РНК и может приводить к нескольким мРНК, транскрибируемым из одного и того же гена. Сплайсинговые варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин сплайсинговый вариант используют здесь также для обозначения белка, кодируемого сплайсинговым вариантом мРНК, транскрибируемым из гена. Должно быть понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые неточными аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), являются приблизительными величинами. Когда такая величина выражается как около Х или приблизительно X, указанная величина Х должна пониматься как величина, определенная в точностью до 10%. Все цитируемые здесь ссылки включены в качестве ссылки в полном виде. Данное изобретение основано частично на открытии новой последовательности ДНК, которая кодирует белок, имеющий структуру рецептора цитокинов класса I. Расшифрованная аминокислотная последовательность показала, что кодируемый рецептор принадлежит к подсемейству рецепторов, которое включает в себя -субъединицу IL-2-рецептора и -общий рецептор (т.е. -субъединицы IL-3-, IL-5- иGM-CSF-рецепторов). Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, показал экспрессию в лимфатическом узле, лейкоцитах периферической крови (PBL), селезенке и тимусе. Кроме того, эта мРНК была обильной по количеству в клеточной линии Raij (ATCC No. CC1-86), полученной из лимфомы Беркитта. Этот полипептид был назван zalpha11. Новые полипептиды zalpha11 данного изобретения были первоначально идентифицированы запросом в базе данных EST (маркерных экспрессирующихся последовательностей). Была обнаружена EST (маркерная экспрессирующаяся последовательность), и ее соответствующая кДНК была секвенирована. Новый полипептид, кодируемый этой кДНК, обнаружил гомологию с рецепторами цитокинов класса I. Полинуклеотидная последовательность zalpha11 кодирует всю кодирующую последовательность предсказанного белка. Zalpha11 представляет собой новый рецептор цитокинов, который может быть вовлечен в апоптотический клеточный путь, может быть молекулой передачи сигнала клетка-клетка, рецептором фактора роста или связанным с внеклеточным матриксом белком с активностью гормона фактора роста или т.п. Последовательность полипептида zalpha11 была расшифрована из единственного клона, который содержал его соответствующую полинуклеотидную последовательность. Этот клон был получен из библиотеки спинного мозга. Другие библиотеки, которые также могут быть подвергнуты поиску на такие последовательности, включают в себя PBL, тимус, селезенку, лимфатический узел, клеточные линии эритролейкоза человека (например, TF-1), клетки Raij, клеточные линии острого моноцитарного лейкоза,другие линии лимфоидных и гемопоэтических клеток и т.п. Нуклеотидная последовательность репрезентативной zalpha11-кодирующей ДНК описана в SEQ IDNO:1 (от нуклеотида 69 до нуклеотида 1682), а расшифрованная последовательность zalpha11 из 538 аминокислот описана в SEQ ID NO:2. В его полном виде полипептид zalpha11 представляет полноразмерный полипептидный сегмент (остаток 1 (Met) - остаток 538 (Ser) SEQ ID NO:2). Домены и структурные признаки полипептида zalpha11 дополнительно описаны ниже. Анализ полипептида zalpha11, кодируемого ДНК-последовательностью SEQ ID NO:1, выявил открытую рамку считывания, кодирующую 538 аминокислот (SEQ ID NO:2), содержащую предсказанный секреторный сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков (остаток 1 (Met) - остаток 19 (Gly) SEQID NO:2) и зрелый полипептид из 519 аминокислотных остатков (остаток 20 (Cys) - остаток 538 (Ser)NO:2, этот рецептор содержит цитокинсвязывающий домен из приблизительно 200 аминокислотных остатков (остатки 20 (Cys) - 237 (His) SEQ ID NO:2); линкер доменов (остатки 120 (Pro) - 123 (Pro) SEQ IDNO:2); предпоследний район цепи (остатки 192 (Lys) - 202 (Ala) SEQ ID NO:2); трансмембранный домен(остатки 238 (Leu) - 255 (Leu) SEQ ID NO:2); полный внутриклеточный сигнальный домен (остатки 256(Lys) - 538 (Ser) SEQ ID NO:2), который содержит сайт передачи сигнала Box I (остатки 267 (Ilе) - 273(Pro) SEQ ID NO:2) и сайт передачи сигнала Box II (остатки 301 (Leu) - 304 (Gly) SEQ ID NO:2). Специалистам в данной области будет понятно, что эти границы доменов являются приблизительными и основаны на сопоставлениях с известными белками и предсказаниями укладки белка. Кроме этих доменов, консервативные признаки рецепторов в кодируемом рецепторе включают в себя (как показано вSEQ ID NO:2), консервативный остаток Тrр в положении 138 и консервативный остаток Аrg в положении 201. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие эти районы, домены, мотивы, остатки и последовательности полипептида zalpha11, описанные выше, представлены в SEQ ID NO:1. Присутствие трансмембранных районов и консервативных мотивов и мотивов с малой дисперсией обычно коррелирует с важными структурными районами (или определяет эти районы) в белках. Районы с малой дисперсией (например, гидрофобные кластеры) обычно присутствуют в районах структурной важности (Sheppard, P. et al., supra). Такие районы малой дисперсии часто содержат редкие или нечастые аминокислоты, такие как триптофан. Фланкирующие районы и районы между такими консервативными мотивами и мотивами малой дисперсии могут быть более вариабельными, но являются часто функционально значимыми, так как они могут относиться к важным структурам или определять важные структуры и активности, такие как связывающие домены, домены биологической и ферментативной активности,трансдукции сигнала, взаимодействия клетка-клетка, домены тканевой локализации и т.п. Районы консервативных аминокислотных остатков в zalpha11, описанные выше, могут быть использованы в качестве инструментов для идентификации новых членов семейства. Например, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) может быть использована для амплификации последовательностей, кодирующих консервативные районы, из РНК, полученной из множества источников тканей или клеточных линий. В частности, высоковырожденные праймеры, сконструированные из zalpha11, применимы для этой цели. Конструирование и использование таких вырожденных праймеров может быть легко выполнено лицами с квалификацией в данной области. Данное изобретение обеспечивает полинуклеотидные молекулы, в том числе молекулы ДНК и РНК,которые кодируют описанные здесь полипептиды zalpha11. Специалистам в данной области будет понятно, что, в связи с вырожденностью генетического кода, возможна значительная вариация среди этих полинуклеотидных молекул. SEQ ID NO:4 является вырожденной последовательностью ДНК, которая включает в себя все ДНК, которые кодируют полипептид zalpha11 SEQ ID NO:2. Специалистам в данной области будет понятно, что вырожденная последовательность SEQ ID NO:4 обеспечивает также все последовательности РНК, кодирующие SEQ ID NO:2, путем замены U (урацилом) Т (тимина). Таким образом, кодирующие полипептид zalpha11 полинуклеотиды, содержащие район от нуклеотида 1 до нуклеотида 1614 SEQ ID NO:4, и их РНК-эквиваленты рассматриваются данным изобретением. Табл. 1 дает однобуквенные коды, используемые в SEQ ID NO:4 для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. Разрешения представляют собой нуклеотиды, обозначенные кодовой буквой. Комплемент указывает код для комплементарного нуклеотида (комплементарных нуклеотидов). Например, код Y обозначает либо С, либо Т, а его комплемент R обозначает А или G, причем А является комплементарным Т, а G является комплементарным С. Таблица 1 Нуклеотид Разрешение Комплемент Разрешение А А Т Т С С-9 006501 Вырожденные кодоны, используемые в SEQ ID NO:4, включающие в себя все возможные кодоны для конкретной аминокислоты, представлены в табл. 2. Таблица 2 Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет понятно, что некоторая двусмысленность вводится в определение вырожденного кодона, представляющего все возможные кодоны, кодирующие каждую аминокислоту. Например, вырожденный кодон для серина (WSN) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать аргинин (AGR), а вырожденный кодон для аргинина (MGN) может, в некоторых обстоятельствах, кодировать серин (AGY). Сходная взаимосвязь существует между кодонами,кодирующими фенилаланин и лейцин. Таким образом, некоторые полинуклеотиды, охватываемые вырожденной последовательностью, могут кодировать вариантные аминокислотные последовательности,но специалист с обычной квалификацией в данной области может легко идентифицировать такие вариантные последовательности сравнением с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. Вариантные последовательности могут быть легко тестированы на функциональность, как описано здесь. Специалисту с обычной квалификацией в данной области будет также понятно, что различные виды могут проявлять "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов". В общем, см., Grantham,et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas, et al., Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986;Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. В применении здесь термин "предпочтительное (преферентивное) использование кодонов" или "предпочтительные (преферентивные) кодоны" является термином данной области, относящимся к кодонам трансляции белка, которые наиболее часто используются в клетках определенных видов, отдавая, следовательно, предпочтение одному или немногим представителям возможных кодонов, кодирующих каждую аминокислоту (cм. табл. 2). Например, аминокислота треонин(Thr) может кодироваться АСА, АСС, ACG или ACT, но в клетках млекопитающих наиболее обычно используемым кодоном является АСС; в других видах, например в клетках насекомых, дрожжей, вирусов или бактерий, могут быть предпочтительными другие кодоны Thr. Предпочтительные кодоны для конкретных видов могут быть введены в полинуклеотиды данного изобретения различными способами,известными в этой области. Введение предпочтительных последовательностей кодонов в рекомбинантную ДНК может, например, усиливать продуцирование этого белка, делая трансляцию белка более эффективной в конкретном типе клеток или виде. Таким образом, вырожденная последовательность кодонов, описанная в SEQ ID NO:4, служит в качестве матрицы для оптимизации экспрессии полинуклеотидов в различных типах клеток и видах, обычно используемых в данной области и описанных здесь. Последовательности, содержащие предпочтительные кодоны, могут быть тестированы и оптимизированы для экспрессии в различных видах и тестированы на функциональность, как описано здесь. В предпочтительных вариантах данного изобретения выделенные полинуклеотиды будут гибридизоваться с районами одинакового размера SEQ ID NO:1 или с комплементарной ей последовательностью при строгих условиях. Обычно строгие условия выбирают таким образом, чтобы температура была приблизительно на 5 С ниже, чем точка термического плавления (Тm) для специфической последовательности при определенных ионной силе и рН. Тm является температурой (при определенных ионной силе и- 10006501 рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуются с точно совместимым зондом. Многочисленные уравнения для расчета Тm известны в данной области и являются специфическими для ДНК, РНК и гибридов ДНК-РНК и полинуклеотидных последовательностей-зондов варьирующей длиныBerger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc. 1987); и Wetmur,Crit. Rev. Biochim. Mol. Biol. 26:227 (1990. Программное обеспечение для анализа последовательности,такое как OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) и Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto,CA), а также сайты в Интернете, являются доступными инструментами для анализа конкретной последовательности и расчета Тm на основе определенных пользователем критериях. Такие программы могут также анализировать конкретную последовательность при определенных условиях и идентифицировать подходящие зондовые последовательности. Обычно гибридизацию более длинных полинуклеотидных последовательностей (например, 50 пар оснований) выполняют при температуре приблизительно на 2025 С ниже рассчитанной Тm. Для меньших зондов (например, 50 пар оснований) гибридизацию обычно проводят при Тm или на 5-10 С ниже. Это позволяет достичь максимальной скорости гибридизации для гибридов ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Более высокие степени строгости при более низких температурах могут быть достигнуты добавлением формамида, который снижает Тm гибрида приблизительно на 1 С для каждого 1% формамида в буферном растворе. Условия гибридизации подходящей строгости эквивалентны инкубации от приблизительно 5 ч до ночи при приблизительно 42 С в растворе, содержащем приблизительно 40-50% формамида, до приблизительно 6X SSC, приблизительно 5 Х раствора Денхардта, от 0 до приблизительно 10% сульфата декстрана и приблизительно 10-20 мкг/мл денатурированной коммерчески доступной ДНК-носителя. Обычно такие строгие условия включают в себя температуры 20-70 С и гибридизационный буфер, содержащий до 6 х SSC и 0-50% формамид; затем гибридизацию сопровождают промыванием фильтров в SSC до приблизительно 2 х SSC. Например, подходящая строгость промывки эквивалентна 0,1X SSC-2X SSC при 55 С-65 С. Различные степени строгости могут быть использованы во время гибридизации и промывания для достижения максимального специфического связывания с последовательностью-мишенью. Обычно промывки после гибридизации выполняют при увеличивающихся степенях строгости для удаления негибридизовавшихся полинуклеотидных зондов из гибридизованных комплексов. Строгие условия гибридизации и промывок зависят от длины зонда, отраженной в Тm, используемых гибридизационных и промывочных растворов и рутинно определяются эмпирически специалистом в данной области. Как отмечалось ранее, выделенные полинуклеотиды данного изобретения включают в себя ДНК и РНК. Способы выделения ДНК и РНК хорошо известны в данной области. Обычно РНК выделяют из ткани или клетки, которая продуцирует большие количества РНК zalpha11. Такие ткани и клетки идентифицируют Нозерн-блоттингом (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980) и включают в себя PBL,селезенку, тимус и лимфатические ткани, клетки Raji, линии клеток эритролейкоза человека (например,TF-1), линии клеток острого моноцитарного лейкоза, другие лимфоидные и гемопоэтические клеточные линии и т.п. Тотальная РНК может быть получена с использованием экстракции изотиоцианатом гуанидиния с последующим выделением центрифугированием в градиенте CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Поли(А)+ РНК получают из тотальной РНК с использованием способа Aviv and Leder,(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412 (1972. Комплементарную ДНК (кДНК) получают из поли (А)+ РНК при помощи известных способов. Альтернативно может быть выделена геномная ДНК. Затем полинуклеотиды, кодирующие полипептиды zalpha11, идентифицируют и выделяют, например, с использованием гибридизации или полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Mullis, U.S. Patent No. 4683202). Полноразмерный клон, кодирующий zalpha11, может быть получен общепринятыми процедурами клонирования. Клоны комплементарной ДНК (кДНК) являются предпочтительными, хотя для некоторых применений (например, экспрессиии в трансгенных животных) могут быть предпочтительными использование геномного клона или модификация клона кДНК с целью включения по меньшей мере одного геномного интрона. Способы получения клонов кДНК и геномных клонов хорошо известны и находятся в пределах обычной квалификации в данной области и включают в себя использование описанной здесь последовательности или ее частей для зондирования или праймирования библиотеки. Экспрессионные библиотеки могут быть зондированы антителами к zalpha11, фрагментам рецептора или другим партнерам специфического связывания. Полинуклеотиды данного изобретения могут быть также синтезированы с использованием автоматических приборов для синтеза ДНК. В настоящее время предпочтительным способом является фосфорамидитный способ. Если химически синтезированная двухцепочечная ДНК требуется для такого применения, как синтез гена или фрагмента гена, то каждую комплементарную цепь получают отдельно. Получение коротких полинуклеотидов (60-80 п.н.) является технически простым и может быть выполнено синтезом комплементарных цепей и затем их отжигом. Однако для получения более длинных полинуклеотидов (300 п.н.) обычно используют специальные стратегии, так как эффективность связывания каждого цикла во время химического синтеза ДНК редко является 100%. Для преодоления этой пробле- 11006501 мы синтетические гены (двухцепочечные) собирают в модулярной форме из одноцепочечных фрагментов, имеющих длину 20-100 нуклеотидов. Один из способов для построения синтетического гена требует первоначального получения набора перекрывающихся, комплементарных олигонуклеотидов, каждый из которых имеет длину между 20 и 60 нуклеотидами. Каждый внутренний участок этого гена имеет комплементарные 3'- и 5'-концевые удлинения, сконструированные для образования пар нуклеотидов точно с соседним участком. Таким образом,после сборки данного гена процесс завершают заделыванием разрывов (ников) вдоль каркасов этих двух цепей с использованием ДНК-лигазы Т 4. Кроме кодирующей белок последовательности, синтетические гены могут быть сконструированы с концевыми последовательностями, которые облегчают встраивание в сайт рестрикционной эндонуклеазы (рестриктазы) клонирующего вектора. Кроме того, должны быть добавлены другие последовательности, которые содержат сигналы для правильной инициации и терминации транскрипции и трансляции. Альтернативным способом получения полноразмерного гена является синтез описанного набора перекрывающихся олигонуклеотидов (40-100 нуклеотидов). После отжига 3' и 5' коротких перекрывающихся комплементарных районов (6-10 нуклеотидов) большие промежутки (гэпы) все еще остаются, но эти короткие районы спаренных нуклеотидов являются как достаточно длинными, так и стабильными для удерживания вместе этой структуры. Гэпы заполняются, и ДНК-дуплекс завершается через ферментативный синтез ДНК ДНК-полимеразой I E. coli. После завершения ферментативного синтеза разрывы(ники) заделываются ДНК-лигазой Т 4. Двухцепочечные конструкции последовательно связывают друг с другом с образованием полной последовательности гена, которую проверяют анализом последовательности ДНК. См. Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinantal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633-7, 1990. Далее, данное изобретение обеспечивает копии полипептидов и полинуклеотидов из других видов(ортологи). Эти виды включают в себя, но не ограничиваются ими, виды млекопитающих, птиц, земноводных, пресмыкающихся, рыб, насекомых и другие виды позвоночных и беспозвоночных. Особый интерес представляют собой полипептиды zalpha11 из других видов млекопитающих, в том числе полипептиды мышей, свиньи, овцы, коровы, псовых, кошачьих, лошадиных видов и полипептиды других приматов. Ортологи zalpha11 человека могут быть клонированы с использованием информации и композиций,обеспеченных данным изобретением, в сочетании с общепринятыми способами клонирования. Например, кДНК может быть клонирована с использованием мРНК, полученной из типа ткани или клеток, которые экспрессируют этот белок. Подходящие источники мРНК могут быть идентифицированы зондированием Нозерн-блотов зондами, сконструированными из описанных здесь последовательностей. Затем готовят библиотеку из мРНК позитивной ткани или линии клеток. Затем кодирующая полипептидzalpha11 кДНК может быть выделена различными способами, такими как зондирование полной или частичной кДНК человека или одним или несколькими наборами вырожденных зондов, основанных на описанных последовательностях. Эта кДНК может быть также клонирована с использованием полимеразной цепной реакции, или ПЦР (Mullis, supra), с применением праймеров, сконструированных из описанной здесь характерной последовательности zalpha11 человека. В дополнительном способе, эта библиотека кДНК может быть использована для трансформации или трансфекции клеток-хозяев, и экспрессия представляющей интерес кДНК может быть детектирована антителом к полипептиду zalpha11. Подобные способы могут быть применены также для выделения геномных клонов. Субъединицы рецепторов цитокинов характеризуются мультидоменной структурой, содержащей внеклеточный домен, трансмембранный домен, который закрепляет этот полипептид в клеточной мембране, и внутриклеточный домен. Внеклеточный домен может быть лигандсвязывающим доменом, а внутриклеточный домен может быть эффекторным доменом, участвующим в трансдукции (передаче) сигнала, хотя лигандсвязывающая и эффекторная функции могут находиться на различных субъединицах мультимерного рецептора. Лигандсвязывающий домен сам является мультидоменной структурой. Мультимерные рецепторы включают в себя гомодимеры (например, изоформыиPDGF-рецептора,рецептор эритропоэтина, MPL и G-CSF-рецептор), гетеродимеры, каждая из субъединиц которых имеет лигандсвязывающие и эффекторные домены (например, изоформаPDGF-рецептора), и мультимеры,имеющие компоненты-субъединицы с, по существу, различными функциями (например, рецепторы IL-2,IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и GM-CSF). Некоторые субъединицы рецепторов являются общими для множества рецепторов. Например, субъединица AIC2B, которая сама не может связывать лиганд, но включает в себя домен внутриклеточной трансдукции сигнала, является компонентом рецепторов IL-3 и GM-CSF. Многие рецепторы цитокинов могут быть помещены в одно из четырех родственных семейств на основе их структуры и функции. Например, гемопоэтические рецепторы отличаются присутствием домена, содержащего консервативные остатки цистеина и мотива WSXWS (SEQ ID NO:3). Структура рецепторов цитокинов обсуждалась в обзоре Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991 и Cosman, Cytokine 5:95-106, 1993. Под селективным давлением потребности организмов в приобретении новых биологических функций новые члены семейств рецепторов, по-видимому, возникают из дупликации существую- 12006501 щих генов рецепторов, приводя к существованию мультигенных семейств. Таким образом, члены семейств содержат остатки (признаки) предкового гена (гена предков), и эти характерные признаки могут быть использованы в выделении и идентификации дополнительных членов семейств. Таким образом,суперсемейство рецепторов цитокинов подразделяется на несколько семейств, например семейство иммуноглобулинoв (в том числе рецепторы CSF-1, MGF, IL-1 и PDGF); семейство гематопоэтинов (в том числе -субъединица IL-2-рецептора, -субъединица GM-CSF-рецептора, -субъединица GM-CSFрецептора; и рецепторы G-CSF, ЕРО, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и IL-9); семейство TNF-рецепторов (в том числе рецепторы TNF (р 80), TNF (р 60), CD27, CD30, CD40, Fas и NGF). Анализ последовательности zalpha11 предполагает, что он является членом того же самого подсемейства рецепторов, что и подсемейство -субъединицы IL-2-рецептора, IL-3-, IL-4- и IL-6-рецепторов. Некоторые рецепторы в этом подсемействе (например, G-CSF) связываются с образованием гомодимеров, которые осуществляют передачу сигнала. Другие члены этого подсемейства (например, IL-6-, IL-11 и LIF-рецепторы) объединяются со второй субъединицей (называемой -субъединицей) для связывания лиганда и трансдукции сигнала. Специфические -субъединицы связываются со множеством специфических субъединиц рецепторов цитокинов. Например, -субъединица gp130 (Hibi et al., Cell 63:1149-1157,1990) связывается с субъединицами рецепторов, специфическими для IL-6, IL-11 и LIF (Gearing et al.,EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing et al., U.S. Patent No. 5284755). Онкостатин М связывается с гетеродимером LIF-рецептора и gp130. CNTF связывается с тримерными рецепторами, содержащими CNTFрецептор, LIF-рецептор и субъединицы gp130. Полинуклеотидная последовательность для мышиного ортолога zalpha11 человека была идентифицирована и показана в SEQ ID NO:84, а соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:85. Анализ мышиного полипептида zalpha11, кодируемого последовательностью ДНК SEQID NO:84, выявил открытую рамку считывания, кодирующую 529 аминокислот (SEQ ID NO:85), содержащих предсказанный секреторный сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков (остаток 1 (Met)остаток 19 (Ser) SEQ ID NO:85) и зрелый полипептид из 510 аминокислот (остаток 20 (Cys) - остаток 529NO:85, этот рецептор содержит цитокинсвязывающий домен из приблизительно 200 аминокислотных остатков (остатки 20 (Cys)-237 (His) SEQ ID NO:85); линкер доменов (остатки 120 (Pro)-123 (Pro) SEQ IDNO:85); предпоследний район цепи (остатки 192 (Lys)-202 (Ala) SEQ ID NO:85); трансмембранный домен(остатки 238 (Met)-254 (Leu) SEQ ID NO:85); полный внутриклеточный домен передачи сигнала (остатки 255 (Lys)-529 (Ser) SEQ ID NO:85), который содержит сайт передачи сигнала Box I (остатки 266 (Ilе)273 (Pro) SEQ ID NO:85) и сайт передачи сигнала Box II (остатки 301 (Ile)-304 (Val) SEQ ID NO:2). Сравнение аминокислотных последовательностей полипептидов человека и мыши выявило, что как человеческий полипептид, так и полипептид-ортолог содержат соответствующие структурные признаки,описанные выше (см., например, фиг. 2). Зрелая последовательность для мышиного zalpha11 начинается при Cys20 (как показано в SEQ ID NO:85), который соответствует Cys20 (как показано в SEQ ID NO:2) в человеческой последовательности. Существует приблизительно 63% идентичность между мышиной и человеческой последовательностями на протяжении всей аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:85. Существует приблизительно 69% идентичность между мышиной и человеческой последовательностями zalpha11 на протяжении внеклеточного цитокинсвязывающего домена, соответствующего остатками 20 (Cys)-237 (His) SEQ ID NO:2 и остаткам 20 (Cys)-237 (His)SEQ ID NO:85. Существует приблизительно 60% идентичность между мышиной и человеческой последовательностями zalpha11 на протяжении внутриклеточного домена передачи сигнала, соответствующего остаткам 256 (Lys)-538 (Ser) SEQ ID NO:2 и остаткам 255 (Lys)-529 (Ser) SEQ ID NO:85. Приведенные выше процентные идентичности определяли с использованием программы FASTA с ktup=1, penalty открывания гэпа=12, penalty удлинения гэпа=2 и матрицей замен=BLOSUM62, с другими параметрами по умолчанию. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие описанные выше районы, домены, мотивы, остатки и последовательности мышиного полипептида zalpha11, показаны в SEQ ID NO:84. Специалистам в данной области будет понятно, что последовательность, описанная в SEQ ID NO:1,представляет отдельный аллель ДНК zalpha11 человека и что ожидается существование аллельной вариации и альтернативного сплайсинга. Aллельные варианты этой последовательности могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов в соответствии со стандартными процедурами. Aллельные варианты последовательности ДНК, показанной вSEQ ID NO:1, в том числе варианты, содержащие молчащие мутации, и варианты, в которых мутации приводят к изменениям в последовательности аминокислот, находятся в объеме данного изобретения,так же как и белки, которые являются аллельными вариантами SEQ ID NO:2. кДНК, генерируемые из образованных альтернативным сплайсингом мРНК, которые сохраняют свойства полипептида zalpha11,включены в объем данного изобретения, так же как полипептиды, кодируемые такими кДНК и мРНК.Aллельные варианты и сплайсинговые варианты этих последовательностей могут быть клонированы зондированием библиотек кДНК или геномных библиотек из различных индивидуумов или тканей в соответствии со стандартными процедурами, известными в данной области.- 13006501 Данное изобретение обеспечивает также выделенные полипептиды zalpha11, которые являются, по существу, одинаковыми с полипептидами SEQ ID NO:2 и их ортологами. Термин "по существу одинаковый" используется здесь для обозначения полипептидов, имеющих по меньшей мере 70%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную идентичность последовательностям, показанным в SEQ IDNO:2, или их ортологам. Такие полипептиды будут более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% или более идентичны SEQ ID NO:2 или ее ортологам. Процентную идентичность последовательности определяют общепринятыми способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616 (1986) и Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89: 10915-10919 (1992). Вкратце, две последовательности аминокислот сопоставляют выстраиванием для оптимизации оценок сопоставления с использованием penalty открывания гэпа 10 и penalty удлинения гэпа 1 и оценочной матрицы "blosom 62" Henikoff and Henikoff (ibid.), показаной в табл. 3 (аминокислоты представлены с использованием стандартных однобуквенных кодов). Затем процентную идентичность рассчитывают как Общее число идентичных совпадений х 100[Длина более длинной последовательности плюс число гэпов, введенных в более длинную последовательность для сопоставления этих двух последовательностей] Таблица 3 Идентичность последовательности полинуклеотидных молекул определяют подобными способами с использованием отношения, описанного выше. Специалистам в данной области должно быть понятно, что имеется много установленных алгоритмов для сопоставления аминокислотных последовательностей. Алгоритм поиска сходства FASTAPearson и Lipman представляет собой подходящий способ сопоставления белков для исследования уровня идентичности, разделяемой описанной здесь аминокислотной последовательностью и аминокислотной последовательностью возможного варианта zalpha11. Алгоритм FASTA описан Pearson and Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) и Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). Вкратце, FASTA сначала характеризует сходство последовательностей путем идентификации районов, общих у запрашиваемой последовательности (например, SEQ ID NO:2) и тест-последовательности,которые имеют либо более высокую плотность идентичностей (если переменная ktup=1), либо пар идентичностей (если ktup=2), без учета консервативных аминокислотных замен, инсерций или делеций. Затем десять районов с наиболее высокой плотностью идентичностей повторно оценивают сравнением сходства всех спаренных аминокислот с использованием матрицы аминокислотных замен, а концы районов подравнивают для включения только остатков, которые способствуют наивысшей оценке. Если имеется несколько районов с оценками, большими, чем величина отсечения (рассчитанная по предварительно определенной формуле на основе длины данной последовательности и ее величины ktup), то приведенные в порядок подравниванием первоначальные районы исследуют для определения, могут ли эти районы быть соединены с образованием приближенного сопоставления с гэпами. Наконец, районы с- 14006501 наивысшей оценкой двух аминокислотных последовательностей сопоставляют с использованием модификации алгоритма Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers,SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974, который делает возможными инсерции и делеции аминокислот. Предпочтительными параметрами для анализа FASTA являются ktup=1, penalty открывания гэпа=10,penalty удлинения гэпа=1 и оценочная матрица=ВLOSUM62, с другими параметрами, установленными по умолчанию. Эти параметры могут быть введены в программу FASTA модификацией файла оценочной матрицы (SMATRIX), как объясняется в приложении 2 Pearson, Neth. Enzymol. 183:63 (1990). Программа FASTA может быть использована для определения идентичности последовательности молекул нуклеиновых кислот с использованием приведенного выше отношения. Для сравнений нуклеотидных последовательностей величина ktup может быть в диапазоне между 1 и 6, предпочтительно от 3 до 6, наиболее предпочтительно 3, с другими параметрами, установленными по умолчанию. Таблица BLOSUM62 (табл. 3) является матрицей замен аминокислот, полученной из приблизительно 2000 локальных множественных сопоставлений сегментов белковых последовательностей, представляющих высококонсервативные районы более чем 500 групп родственных белков (Henikoff and Henikoff,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992. Таким образом, частоты замен BLOSUM62 могут быть использованы для определения консервативных аминокислотных замен, которые могут быть введены в аминокислотные последовательности данного изобретения. Хотя можно сконструировать аминокислотные замены на основе лишь химических свойств (как описано ниже), выражение консервативные аминокислотные замены предпочтительно относится к замене, представленной величиной BLOSUM62,большей чем -1. Например, аминокислотная замена является консервативной, если эта замена характеризуется величиной BLOSUM62 0, 1, 2 или 3. В соответствии с этой системой предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной BLOSUM62 по меньшей мере 1 (например,1, 2 или 3), хотя более предпочтительные консервативные аминокислотные замены характеризуются величиной BLOSUM62 по меньшей мере 2 (например, 2 или 3). Вариантные полипептиды zalpha11 или, по существу, гомологичные полипептиды zalpha11 характеризуются тем, что они имеют одну или несколько аминокислотных замен, делеций или присоединений. Эти изменения предпочтительно имеют минорный характер, то есть замены консервативных аминокислот (см. табл. 4) и другие замены, которые не влияют значимо на укладку или активность полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до 30 аминокислот; и небольшие амино- или карбоксил-концевые удлинения, такие как аминоконцевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид до приблизительно 20-25 остатков, или аффинная метка. Таким образом, данное изобретение включает в себя полипептиды из приблизительно от 489 до приблизительно 568 аминокислотных остатков, которые включают в себя последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% или более идентична соответствующему району SEQ ID NO:2. Полипептиды, содержащие аффинные метки, могут дополнительно содержать сайт протеолитического расщепления между полипептидом zalpha11 и этой аффинной меткой. Подходящие сайты включают в себя сайты расщепления тромбином и сайты расщепления фактором Ха. Таблица 4 Замены консервативных аминокислот Аргинин Основные Лизин Гистидин Глутаминовая кислота Кислые Аспарагиновая кислота Глутамин Полярные Аспарагин Лейцин Гидрофобные Изолейцин Валин Фенилаланин Ароматические Триптофан Тирозин Глицин Аланин Небольшие Серин Треонин Метионин Данное изобретение дополнительно обеспечивает далее множество других слитых полипептидов и родственных мультимерных белков, содержащих один или несколько слитых полипептидов. Например,полипептид zalpha11 может быть получен в виде слитого полипептида для димеризации белка, как описано в патентах США с 5155027 и 5567584. Предпочтительная димеризация белков в этом отноше- 15006501 нии включает в себя домены константной области иммуноглобулина. Слитые белки иммуноглобулинzalpha11 могут экспрессироваться в генетически сконструированных клетках с получением множества мультимерных аналогов zalpha11. Вспомогательные домены могут быть слиты с полипептидами zalpha11 для нацеливания их на специфические клетки, ткани или макромолекулы (например, коллаген). Полипептид zalpha11 может быть слит с двумя или более частями молекулы, такими как аффинная метка для очистки белка и нацеливающий домен. Слитые (гибридные) полипептиды могут также содержать один или несколько сайтов расщепления, в частности, между доменами. См. Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996. Белки данного изобретения могут также содержать не встречающиеся природно аминокислотные остатки. Не встречающиеся природно аминокислоты включают в себя, без ограничения, транс-3 метилпролин, 2,4-метанпролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, 3,3 диметилпролин, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4 фторфенилаланин. В данной области известны несколько способов для включения природно не встречающихся аминокислотных остатков в белки. Например, может быть использована система in vitro, в которой нонсенс-мутации подавляются с использованием химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в бесклеточной системе,содержащей экстракт Е. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией (см., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al MethodsEnzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993 и Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). Во втором способе трансляцию проводят в ооцитах Xenopus микроинъекцией мутированной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). В третьем способе клетки Е. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты,которую предстоит заменить (например, фенилаланина), и в присутствии желательной природно не встречающейся аминокислоты (аминокислот) (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4 азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Природно не встречающаяся аминокислота включается в этот белок вместо ее природной копии. См. Koide et al., Biochem. 33: 7470-7476, 1994. Природно встречающиеся аминокислотные остатки могут быть превращены в природно не встречающиеся разновидности химической модификацией in vitro. Химическая модификация может комбинироваться с сайтнаправленным мутагенезом для дополнительного расширения диапазона замен (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993). Аминокислотные остатки zalpha11 могут быть заменены ограниченным числом неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, не встречающихся природно аминокислот и неприродных аминокислот. Незаменимые аминокислоты в полипептидах данного изобретения могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244:1081-5, 1989; Bass et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-502, 1991). В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность (например, на связывание лиганда и трансдукцию сигнала), как описано ниже, для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. Сайты взаимодействия лигандрецептор, белок-белок или другого биологического взаимодействия могут быть также определены физическим анализом структуры, определяемой такими способами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение, в связи с мутацией аминокислот предполагаемого сайта контакта. См., например, de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J.Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа гомологии с родственными рецепторами. Могут быть выполнены определения аминокислотных остатков, которые находятся в районах или доменах, которые являются критическими для сохранения структурной целостности. В этих районах можно определить специфические остатки, которые будут более или менее устойчивыми к изменению или сохранению общей третичной структуры молекулы. Способы анализа структуры последовательности включают в себя, но не ограничиваются ими, сопоставление множественных последовательностей с высокой идентичностью аминокислот или нуклеотидов и компьютерный анализ с использованием доступного программного обеспечения (например, программа просмотра Insight II и инструменты моделирования гомологии; MSI, San Diego, CA), склонности к образованию вторичной структуры, бинарные распределения, комплементарную упаковку и скрытые полярные взаимодействия (Barton, Current Opin.Struct. Biol. 5: 372-376, 1995 и Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996). Обычно при конструировании модификаций для молекул или идентификации специфических фрагментов определение структуры будет сопровождаться оценкой активности модифицированных молекул.- 16006501 Изменения аминокислотной последовательности выполняют в полипептидах zalpha11 таким образом, чтобы минимизировать разрушение структуры более высокого порядка, существенной для биологической активности. Например, когда полипептид zalpha11 содержит одну или несколько спиралей, изменения в аминокислотных остатках будут выполняться таким образом, чтобы не нарушить геометрию спиралей и другие компоненты молекулы, где изменения в конформации уменьшают некоторую критическую функцию, например связывание данной молекулы с ее партнерами связывания. Эффекты изменений аминокислотной последовательности могут быть прогнозированы, например, компьютерным моделированием, как описано выше, или определены анализом структуры кристалла (см., например, Lapthornet al., Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995). Другие способы, которые хорошo известны в данной области,сравнивают укладку вариантного белка со стандартной молекулой (например, нативным белком). Например, может быть сделано сравнение распределения цистеина в вариантной и стандартной молекулах. Масс-спектрометрия и химическая модификация с использованием восстановления и алкилирования обеспечивают способы для определения остатков цистеина, которые ассоциированы с дисульфидными связями или свободны от таких ассоциаций (Bean et al., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, ProteinSci. 2: 1732-1748, 1993 и Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Обычно считается, что, если модифицированная молекула не имеет такого же распределения дисульфидных связей, что и стандартная молекула, укладка может быть нарушенной. Другим хорошо известным и общепринятым способом измерения укладки является круговой дихроизм (КД). Измерение и сравнение КД-спектров, генерируемых модифицированной молекулой и стандартной молекулой, является рутиной (Johnson, Proteins 7: 205-214,1990). Кристаллография представляет собой другой хорошо известный способ для анализа укладки и структуры. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР), ферментативное пептидное картирование и картирование эпитопов также являются известными способами для анализа сходства укладки и структуры между белками и полипептидами (Schaanan et al., Science 257: 961-964, 1992). Может быть получен профиль гидрофильности Hopp/Woods белковой последовательности zalpha11,показанной в SEQ ID NO:2 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 и Triquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998). См. фиг. 1. Этот профиль основан на скольжении окна для шести остатков. Скрытые остатки G, S и Т и экспонированные (открытые) остатки Н, Y и W не принимаются во внимание. Например, в zalpha1 гидрофильные районы включают в себя аминокислотные остатки 55-60 SEQ ID NO:2, аминокислотные остатки 56-61 SEQ ID NO:2, аминокислотные остатки 139-144 SEQ ID NO:2, аминокислотные остатки 227-232 SEQ ID NO:2 и аминокислотные остатки 364-369 SEQ ID NO:2. Специалистам в данной области будет понятно, что гидрофильность или гидрофобность следует учитывать при конструировании модификаций в аминокислотной последовательности полипептидаzalpha11, так чтобы не нарушить общий структурный и биологический профиль. Особый интерес для замены представляют гидрофобные остатки, выбранные из группы, состоящей из Val, Leu и Ilе, или из группы, состоящей из Met, Gly, Ser, Ala, Туr и Тrр. Например, остатки, устойчивые к замене, могли бы включать в себя такие остатки, как показано в SEQ ID NO:2. Однако остатки цистеина могли бы быть относительно неустойчивыми к замене. Идентичности незаменимых аминокислот могут быть также выведены из анализа сходства последовательности между членами рецепторов цитокинов класса I с zalpha11. С использованием способов,таких как анализ FASTA, описанный выше, районы высокого сходства идентифицируют в семействе белков и используют для анализа аминокислотной последовательности для консервативных районов. Альтернативным подходом к идентификации вариантного полинуклеотида zalpha11 на основе структуры является определение, может ли молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая потенциальный вариантный полинуклеотид zalpha11, гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, как обсуждалось выше. Другими способами идентификации незаменимых аминокислот в полипептидах данного изобретения являются процедуры, известные в данной области, такие как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081 (1989); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci.Analysis and Design, Angeletti (ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998. В последнем способе отдельные мутации аланина вводят при каждом остатке в молекуле и полученные в результате мутантные молекулы тестируют на биологическую активность, как описано ниже, для идентификации аминокислотных остатков, которые являются критическими для активности данной молекулы. См. также Hilton etal., J. Biol. Chem. 271: 4699 (1996). Данное изобретение относится также к функциональным фрагментам полипептидов zalpha11 и молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такие функциональные фрагменты. Функциональныйzalpha11 или его фрагмент, определенный здесь, отличается его пролиферативной и дифференцирующей активностью, его способностью индуцировать или ингибировать специализированные клеточные функции или его способностью специфически связываться с антителом против zalpha11 или лигандомzalpha11 (растворимым или иммобилизованным). Как описано ранее, zalpha11 характеризуется структурой рецептора цитокина класса I. Таким образом, данное изобретение дополнительно обеспечивает сли- 17006501 тые (гибридные) белки, включающие в себя (а) полипептидные молекулы, содержащие описанные здесь внеклеточный или внутриклеточный домены; и (b) функциональные фрагменты, содержащие один или несколько из этих доменов. Другая полипептидная часть слитого белка может состоять из другого рецептора цитокина класса I, например -субъединицы IL-2-рецептора и -субъединицы, общей для ряда рецепторов (т.е. -субъединиц IL-3-, IL-5- и GM-CSF-рецепторов) или из ненативного и/или неродственного секреторного сигнального пептида, который облегчает секрецию слитого белка. Рутинный делеционный анализ молекул нуклеиновых кислот может быть проведен для получения функциональных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид zalpha11. В качестве иллюстрации, молекулы ДНК, имеющие нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или ее фрагменты, могут быть расщеплены нуклеазой Ваl31 с получением ряда вмонтированных делеций. Затем эти фрагменты ДНК вставляют в экспрессирующие векторы в правильной рамке считывания и экспрессированные полипептиды выделяют и тестируют на активность zalpha11 или на способность связываться с антителами против zalpha11 или лигандом zalpha11. Альтернативой расщеплению экзонуклеазой является использование олигонуклеотид-направленного мутагенеза для введения делеций или стопкодонов для особого определения получения желательного фрагмента zalpha11. Альтернативно, определенные фрагменты полинуклеотида zalpha11 могут быть синтезированы с использованием полимеразной цепной реакции. Стандартные способы идентификации функциональных доменов хорошо известны лицам с обычной квалификацией в данной области. Например, исследования на одном или на обоих концах укороченных интерферонов суммированы Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Кроме того, стандартные способы для функционального анализа белков описаны, например, Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993); Content et al., Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by(1995) и Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996). Многочисленные аминокислотные замены могут быть произведены и тестированы с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как описанные Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-57, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989). Вкратце, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, отбора на функциональный полипептид и затем секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают в себя способ фагового представления (например, Lowman et al., Biochem. 30: 1083210837, 1991; Ladner et al., U.S. Patent No. 5 223 409; Huse, WIPO Publication WO 92/062045) и районнаправленный мутагенез (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988). Варианты описанных последовательностей ДНК и полипептида zalpha11 могут быть образованы перетасовкой ДНК, описанной Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51, 1994 и WIPO Publication WO 97/20078. Вкратце, вариантные ДНК генерируют посредством гомологичной рекомбинации in vitro случайной фрагментацией исходной ДНК с последующей повторной сборкой при помощи ПЦР, приводящей к случайно введенным точковым мутациям. Этот способ может быть модифицирован с использованием семейства исходных ДНК, таких как аллельные варианты или ДНК из различных видов, для введения дополнительной вариабельности в этот процесс. Отбор или скрининг на желательную активность с последующими дополнительными повторениями мутагенеза и анализа обеспечивает быструю "эволюцию" последовательностей посредством отбора на желательные мутации с одновременным отбором против вредных изменений. Способы мутагенеза, описанные выше, могут комбинироваться с высокопроизводительными автоматизированными способами скрининга для обнаружения активности клонированных мутагенизированных полипептидов рецепторов zalpha11 в клетках-хозяевах. Предпочтительные анализы включают в себя анализы пролиферации и анализы связывания лиганда на основе биосенсора, которые описаны ниже. Мутагенизированные молекулы ДНК, кодирующие активные рецепторы или их части (например, лигандсвязывающие фрагменты, домены передачи сигналов и т.п.), могут быть извлечены из клеток-хозяев и быстро секвенированы с использованием современного оборудования. Эти способы делают возможным быстрое определение важности индивидуальных аминокислотных остатков в представляющем интерес полипептиде и могут применяться к полипептидам неизвестной структуры. Кроме того, белки данного изобретения (или их полипептидные фрагменты) могут быть соединены с другими биоактивными молекулами, в частности другими цитокинами, для обеспечения полифункциональных молекул. Например, одна или несколько спиралей из zalpha11 могут быть соединены с другими цитокинами для усиления их биологических свойств или эффективности получения. Таким образом, данное изобретение обеспечивает ряд новых, гибридных молекул, у которых сегмент, содержащий одну или несколько спиралей zalpha11, слит с другим полипептидом. Слияние пред- 18006501 почтительно производят сплайсингом на уровне ДНК, чтобы сделать возможной экспрессию химерных молекул в рекомбинантных системах получения. Полученные молекулы анализируют затем на такие свойства, как улучшенная растворимость, улучшенная стабильность, пролонгированный полупериод выведения, улучшенные уровни экспрессии и секреции и фармакодинамику. Такие гибридные молекулы могут, кроме того, содержать дополнительные аминокислотные остатки (например, полипептидный линкер) между компонентами-белками или компонентами-полипептидами. При помощи обсуждаемых здесь способов специалист с обычной квалификацией в данной области может идентифицировать и/или получить многочисленные полипептидные фрагменты или вариантыSEQ ID NO:2, которые сохраняют активность трансдукции сигналов или лигандсвязывающую активность. Например, можно получить растворимый рецептор zalpha11 путем получения множества полипептидов, которые являются, по существу, гомологичными цитокинсвязывающему домену (остаткам 20(Cys)-237 (His) SEQ ID NO:2 или ее аллельным вариантам или видовым ортологам) и сохраняют лигандсвязывающую активность белка zalpha11 дикого вида. Такие полипептиды могут включать в себя дополнительные аминокислоты, например, из части или полных трансмембранного и внутриклеточного доменов. Такие полипептиды могут также содержать дополнительные полипептидные сегменты, как в общем виде описано здесь, такие как метки, аффинные метки и т.п. Для любого полипептида zalpha11, в том числе вариантов, растворимых рецепторов и слитых полипептидов или белков, специалист с обычной квалификацией в данной области сможет легко получить полностью вырожденную полинуклеотидную последовательность, кодирующую такой вариант, с использованием информации, приведенной в табл. 1 и 2 выше. Полипептиды zalpha11 данного изобретения, в том числе полноразмерные полипептиды, биологически активные фрагменты и гибридные полипептиды, могут продуцироваться в генетически сконструированных клетках-хозяевах в соответствии с общепринятыми способами. Подходящими клеткамихозяевами являются те типы клеток, которые могут быть трансформированы или трансфицированы экзогенной ДНК и выращены в культуре, и они включают в себя бактерии, грибковые клетки и культивируемые высшие эукариотические клетки. Эукариотические клетки, в частности культивируемые клетки многоклеточных организмов, являются предпочтительными. Способы манипулирования клонированными молекулами ДНК и введения экзогенной ДНК в различные клетки-хозяева описаны в Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989 и Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. В общих чертах, последовательность ДНК, кодирующую полипептид zalpha11, функционально связывают с другими генетическими элементами, требующимися для ее экспрессии, обычно включающими в себя промотор и терминатор транскрипции, в экспрессирующем векторе. Этот вектор обычно будет содержать один или несколько селектируемых маркеров и одну или несколько точек инициации репликации, хотя специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых системах селектируемые маркеры могут быть обеспечены на отдельных векторах и репликация экзогенной ДНК может быть обеспечена интеграцией в геном клетки-хозяина. Выбор промоторов, терминаторов, селектируемых маркеров, векторов и других элементов является предметом рутинного конструирования в пределах обычной квалификации в данной области. Многие такие элементы описаны в литературе и являются доступными через коммерческих поставщиков. Для направления полипептида zalpha11 в секреторный путь клетки-хозяина в экспрессирующем векторе обеспечивают секреторную сигнальную последовательность (также известную как лидерная последовательность, пре-пропоследовательность или пре-последовательность). Секреторная сигнальная последовательность может быть сигнальной последовательностью zalpha11 или может быть произведена из другого секретируемого белка (например, t-PA (тканевого активатора плазминогена или синтезирована de novo. Секреторная сигнальная последовательность функционально соединена с последовательностью ДНК zalpha11, т.е. эти две последовательности соединены в правильной рамке считывания и правильно помещены для направления вновь синтезированного полипептида в секреторный путь клеткихозяина. Секреторные сигнальные последовательности обычно расположены 5' (слева) от последовательности ДНК, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые сигнальные последовательности могут быть расположены в другом месте в представляющей интерес последовательности ДНК (см., например, Welch et al., U.S. Patent No. 5 037 743; Holland et al., U.S. Patent No. 5 143 830). Альтернативно, секреторная сигнальная последовательность, содержащаяся в полипептидах данного изобретения, используется для направления других полипептидов в секреторный путь. Данное изобретение обеспечивает такие гибридные (слитые) полипептиды. Может быть изготовлен сигнальный гибридный полипептид, в котором секреторная сигнальная последовательность, полученная из аминокислотных остатков 1 (Met)-19 (Gly) SEQ ID NO:2, функционально связана с другим полипептидом с использованием способов, известных в этой области и описанных здесь. Секреторная сигнальная последовательность, содержащаяся в гибридных полипептидах данного изобретения, предпочтительно слита на амино-конце с дополнительным пептидом для направления этого дополнительного пептида в секреторный путь. Такие конструкции имеют многочисленные применения, известные в данной области. Например, эти новые гибридные конструкции с секреторной сигнальной последовательностью могут направ- 19006501 лять секрецию активного компонента обычно несекретируемого белка. Такие гибридные белки могут быть использованы in vivo и in vitro для направления пептидов через секреторный путь. Культивируемые клетки млекопитающих являются подходящими хозяевами в данном изобретении. Способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева млекопитающих включают в себя опосредованную фосфатом кальция трансфекцию (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), электропорацию (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию (Ausubel et al., ibid.) и опосредованную липосомами трансфекцию (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993) и вирусные векторы (Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2:714716, 1996). Получение рекомбинантных полипептидов в культивируемых клетках млекопитающих описано, например, Levinson et al., U.S. Patent No. 4 713 339; Hagen et al., U.S. Patent No. 4 784 950; Palmiter etal., U.S. Patent No. 4 579 821; и Ringold, U.S. Patent No. 4 656 134. Подходящие культивируемые клетки млекопитающих включают в себя клеточные линии COS-1 (АТСС No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), ВНК (АТСС No. CRL 1632), ВНК 570 (АТСС No. CRL 10314), 293 (АТСС No. CRL 1573; Graham etal., J. Gen. Virol. 36:59-72 (1977 и линии клеток яичника китайского хомячка (например, СНО-К 1; АТССNo. CCL 61). Дополнительные подходящие клеточные линии известны в данной области и доступны из общественных депозитариев, таких как American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. В общем,предпочтительны сильные промоторы транскрипции, такие как промоторы из SV-40 или цитомегаловируса. См., например, U.S. Patent No. 4 956 288. Другие подходящие промоторы включают в себя промоторы из генов металлотионеина (U.S. Patent No. 4 579 821 и U.S. Patent No. 4 601 978) и основной поздний промотор аденовируса. Отбор с лекарственным средством обычно применяют для отбора на культивируемые клетки млекопитающих, в которые была встроена чужеродная ДНК. Такие клетки обычно называют "трансфектантами". Клетки, которые культивировались в присутствии селективного агента и способны передавать представляющий интерес ген их потомству, называют "стабильными трансфектантами". Предпочтительным селектируемым маркером является ген, кодирующий устойчивость к антибиотику неомицину. Отбор проводят в присутствии лекарственного средства типа неомицина, такого как G-418 или т.п. Системы отбора могут быть также использованы для увеличения уровня экспрессии представляющего интерес гена, т.е. для способа, называемого "амплификацией". Амплификацию проводят культивированием трансфектантов в присутствии низкого уровня селективного агента и затем увеличением количества селективного агента для отбора клеток, которые продуцируют высокие уровни продуктов введенных генов. Предпочтительным амплифицируемым селектируемым маркером является дигидрофолатредуктаза, которая сообщает клеткам устойчивость к метотрексату. Другие гены устойчивости к лекарственным средствам (например, устойчивости к гигромицину, множественной устойчивости к лекарственным средствам, пуромицинацетилтрансферазе) также могут быть использованы. Альтернативные маркеры, которые вводят измененный фенотип, такие как зеленый флуоресцентный белок или белки клеточной поверхности, такие как CD4, CD8, MHC класса I, щелочная фосфатаза плаценты, могут быть использованы для сортинга трансфицированных клеток от нетрансфицированных клеток такими способами, как FACSсортинг (сортинг клеток с возбуждением флуоресценции) или способ разделения при помощи магнитных гранул. Другие высшие эукариотические клетки могут быть также использованы в качестве хозяев, в том числе клетки растений, клетки насекомых и клетки птиц. Применение Agrobacterium rhizogenes в качестве вектора для экспрессии генов в клетках растений рассмотрено Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:4758, 1987. Трансформация клеток насекомых и получение в них чужеродных полипептидов описаныGuarino et al. , U.S. Patent No. 5 162 222 и WIPO publication WO 94/06463. Клетки насекомых могут быть инфицированы рекомбинантным бакуловирусом, обычно произведенным из вируса ядерного полиэдрозаMethods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Второй способ получения рекомбинантного zalpha11-бакуловируса использует систему на основе транспозона, описанную Luckow (Luckow, V.A.,et al., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). Эта система, которая использует векторы-переносчики, продается в наборе Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD). Эта система использует вектор-переносчик, pFastBac1 (Life Technologies), содержащий транспозон Тn7, для перемещения ДНК, кодирующей полипептид zalpha11, в геном бакуловируса, поддерживаемый в Е. coli, в виде большой плазмиды, названнойGen. Virol. 75: 1551-6, 1994 и Chazenbalk, G.D., and Rapoport, В., J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. Кроме того, векторы-переносчики могут содержать в рамке считывания с ДНК, кодирующей метку эпитопа, на С- или N-конце экспрессируемого полипептида zalpha11, например, метку эпитопа Glu-Glu (Grussenmeyer, Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985). При помощи способа, известного в данной области, вектор-переносчик, содержащий zalpha11, трансформируют в Е. соli и подвергают скринингу на бакмиды, которые содержат прерванный ген lacZ, свидетельствующий о рекомбинантном бакуловирусе.- 20006501 Бакмидную ДНК, содержащую рекомбинантный геном бакуловируса, выделяют при помощи известных способов и используют для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda, например клеток Sf9. Затем получают рекомбинантный вирус, экспрессирующий zalpha11. Исходные материалы рекомбинантного вируса готовят способами, обычно используемыми в данной области. Этот рекомбинантный вирус используют для инфицирования клеток-хозяев, обычно клеточной линии, полученной из осенних "походных (ратных) червей", Spodoptera frugiperda. См., в общих чертах,Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press,Washington, D.C., 1994. Другой подходящей клеточной линией является клеточная линия High FiveO(Invitrogen), произведенная из Trichoplusia ni (U.S. Patent5 300 435). Для выращивания и поддержания этих клеток используют коммерчески доступные бессывороточные среды. Подходящими средами являются Sf900 II (Life Technologies) или ESF 921 (Expression Systems) для клеток Sf9; или Ex-cellO405(JRH Biosciences, Lenexa, KS) или Express FiveO (Life Technologies) для клеток T. ni. Используемые процедуры, в общем, описаны в доступных лабораторных руководствах (King, L.A. and Possee, R.D. ibid.;O'Reilly, D.R. et al., ibid.; Richardson, C.D., ibid.). Последующая очистка полипептида zalpha11 из супернатанта может быть достигнута с использованием описанных здесь способов. Грибковые клетки, в том числе дрожжевые клетки, могут быть также использованы в данном изобретении. Виды дрожжей, представляющие особый интерес в этом отношении, включают в себя Saccharomycescerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Способы трансформации клеток S. cerevisiae экзогенной ДНК и получения из них рекомбинантных полипептидов описаны, например, Kawasaki, U.S. Patent No. 4 599 311; Kawasaki et al., U.S. Patent No. 4 931 373; Brake, U.S. Patent No. 4 870 008; Welch et al., U.S. PatentNo. 5 037 743 и Murray et al., U.S. Patent No. 4 845 075. Трансформированные клетки отбирают по фенотипу, определяемому селектируемым маркером, обычно по устойчивости к лекарственному средству или по способности расти в отсутствие определенного питательного вещества (например, лейцина). Предпочтительной векторной системой для применения в Saccharomyces cerevisiae является векторная система РОТ 1, описанная Kawasaki et al. (U.S. Patent No. 4 931 373), которая позволяет отбирать трансформированные клетки по росту в содержащей глюкозу среде. Подходящие промоторы и терминаторы для применения в дрожжах включают в себя промоторы и терминаторы из генов гликолитических ферментовPatent No. 4 977 092) и генов алкогольдегидрогеназы. См. также патенты США с 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 и 4 661 454. Системы трансформации для других дрожжей, в том числе Hansenula polymorpha,Schizosaccharomyces роmbе, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris,Pichia methanolica, Pichia guillermondii и Candida maltosa, известны в данной области. См., например,Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 и Cregg, U.S. Patent No. 4 882 279. Клетки Aspergillus могут быть использованы в соответствии со способами McKnight et al., U.S. Patent No. 4 935 349. Способы трансформации Acremonium chrysogenum описаны Sumino et al., U.S. Patent No. 5 162 228. Способы трансформации Neurospora описаны Lambowitz, U.S. Patent No. 4 486 533. Применение Pichia methanolica в качестве хозяина для получения рекомбинантных белков описано вWIPO Publications WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 и WO 98/02565. Молекулы ДНК для применения в трансформации Р. methanolica обычно получают в виде двухцепочечных кольцевых плазмид, которые предпочтительно линеаризуют перед трансформацией. Для получения полипептидов в Р. methanolica предпочтительно, чтобы промотор и терминатор в этой плазмиде были промотором и терминатором гена Р. methanolica, таким как ген утилизации спирта Р. methanolica (AUG1 или AUG2). Другие применимые промоторы включают в себя промоторы генов дигидроксиацетонсинтазы (DHAS), формиатдегидрогеназы (FMD) и каталазы (CAT). Для облегчения интеграции этой ДНК в хромосому хозяина предпочтительно иметь весь сегмент экспрессии этой плазмиды, фланкированный на обоих концах последовательностями ДНК хозяина. Предпочтительным селектируемым маркером для применения в Pichia methanolica является ген ADE2 Р. methanolica, который кодирует фосфорибозил-5-аминоимидазолкарбоксилазу(AIRC; ЕС 4.1.1.21), который позволяет клеткам-хозяевам ade2 расти в отсутствие аденина. Для крупномасштабных, промышленных процессов, где желательно минимизировать применение метанола, предпочтительно использовать клетки-хозяева, в которых делетированы оба гена утилизации метанола(AUG1 и AUG2). Для получения секретируемых белков предпочтительны клетки-хозяева, дефектные по генам вакуолярных протеаз (РЕР 4 и PRB1). Электропорацию используют для облегчения введения плазмиды, содержащей ДНК, кодирующую представляющий интерес полипептид, в клетки Р. methanolica. Предпочтительно трансформировать клетки Р. methanolica электропорацией с использованием экспоненциально затухающего, пульсирующего электрического поля, имеющего напряженность поля от 2,5 до 4,5 кВ/см,предпочтительно примерно 3,75 кВ/см, и константу времени (t) от 1 до 40 мс, наиболее предпочтительно примерно 20 мс. Прокариотические клетки-хозяева, в том числе штаммы бактерий Escherichia coli, Bacillus и другие роды, также являются применимыми клетками-хозяевами в данном изобретении. Способы трансформации этих хозяев и экспрессии клонированных в них чужеродных ДНК хорошо известны в данной области (см, например, Sambrook et al., ibid.). При экспрессии полипептида zalpha11 в бактериях, таких как Е.coli, этот полипептид может сохраняться в цитоплазме, обычно в виде нерастворимых гранул, или может- 21006501 быть направлен в периплазматическое пространство бактериальной секреторной последовательностью. В первом случае эти клетки лизируют и гранулы извлекают и денатурируют при помощи, например, гуанидинизотиоцианата или мочевины. Затем денатурированный полипептид может быть повторно уложен и димеризован путем разведения продукта денатурации, например, диализом против раствора мочевины и комбинацией восстановленного и окисленного глутатиона, с последующим диализом против забуференного солевого раствора. В последнем случае этот полипептид может быть извлечен из периплазматического пространства в растворимой и функциональной форме путем разрушения этих клеток (например,обработкой ультразвуком или осмотическим шоком) для высвобождения содержимого периплазматического пространства и извлечения этого белка, посредством чего устраняется необходимость денатурации и повторной укладки. Трансформированные и трансфицированные клетки-хозяева культивируют в соответствии с общепринятыми процедурами в культуральной среде, содержащей питательные вещества и другие компоненты, необходимые для роста выбранных клеток-хозяев. Различные подходящие среды, в том числе среды с определенным составом среды и комплексные среды, известны в данной области и обычно включают в себя источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины и минеральные соединения. Среды могут также содержать такие компоненты, как факторы роста или сыворотка, если требуется. Среда для выращивания будет обычно производить отбор на клетки, содержащие экзогенно добавленную ДНК, посредством, например, отбора с использованием лекарственного средства или недостаточности незаменимого питательного компонента, который дополняется селектируемым маркером,имеющимся на экспрессирующем векторе или котрансфицируемым в клетку-хозяина. Клетки Р.methanolica культивируют в среде, содержащей адекватные источники углерода, азота и микроэлементов,при температуре приблизительно 25-35 С. Жидкие культуры обеспечивают достаточной аэрацией с использованием общепринятых средств, таких как встряхивание небольших колб или барботирование ферментеров. Предпочтительной культуральной средой для Р. methanolica является YEPD (2% D-глюкоза,2% Бакто пептон (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% бакто дрожжевой экстракт (Difco Laboratories),0,004% аденин и 0,006% L-лейцин). В одном аспекте данного изобретения рецептор цитокинов zalpha11 (в том числе трансмембранный и внутриклеточный домены) получают в культивируемой клетке и эту клетку используют для скрининга на лиганды для этого рецептора, в том числе природный лиганд, а также на агонисты и антагонисты природного лиганда. Для суммирования этого подхода кДНК или ген, кодирующие рецептор, объединяют с другими генетическими элементами, требующимися для их экспрессии (например, промотором транскрипции), и полученный экспрессирующий вектор встраивают в клетку-хозяина. Клетки, которые экспрессируют эту ДНК и продуцируют функциональный рецептор, отбирают и используют в разнообразных системах скрининга. Клетки млекопитающих, пригодные для экспрессии новых рецепторов данного изобретения и трансдукции опосредованного рецептором сигнала, включают в себя клетки, которые экспрессируют субъединицу, такую как gр 130, и клетки, которые коэкспрессируют gр 130 и LIF-рецептор (Gearing et al.,EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing et al., U.S. Patent No. 5284755). В этом отношении, обычно предпочтительно использовать клетку, которая является отвечающей на другие цитокины, которые связываются с рецепторами в том же самом подсемействе, такие как IL-6 или LIF, поскольку такие клетки будут содержать требующийся путь (пути) трансдукции сигнала. Предпочтительные клетки этого типа включают в себя линию клеток TF-1 человека (АТСС No. CRL-2003) и клеточную линию DA-1 (Branch et al. , Blood 69:1782, 1987; Broudy et al., Blood 75:1622-1626, 1990). Альтернативно, подходящие клетки-хозяева могут быть сконструированы для продуцирования -субъединицы или другого клеточного компонента, требующегося для желательного клеточного ответа. Например, мышиная клеточная линия BaF3 (Palaciosand Steinmetz, Cell 41:727-734, 1984; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986), клеточная линия почки детеныша хомячка (ВНК) или клеточная линия CTLL-2 (АТСС TIB-214) могут быть трансфицированы для экспрессии мышиной субъединицы gр 130 или мышиной gр 130 и рецептора LIF, кромеzalpha11. Обычно предпочтительно использовать клетку-хозяина и рецептор (рецепторы) из одного и того же вида, однако, этот подход позволяет сконструировать клеточные линии, экспрессирующие множественные субъединицы рецепторов из любого вида, преодолевая потенциальные ограничения, возникающие из видовой специфичности. Альтернативно, видовые гомологи кДНК рецептора человека могут быть клонированы и использованы в клеточных линиях из того же самого вида, например мышиная кДНК в клеточной линии BaF3. Клеточные линии, которые зависят от одного гемопоэтического фактора роста, такого как IL-3, могут быть, следовательно, сконструированы таким образом, что они становятся зависимыми от лиганда zalpha11. Клетки, экспрессирующие функциональный zalpha11, используют в тестах-скринингах. Многочисленные подходящие анализы известны в данной области. Эти анализы основаны на детектировании биологического ответа в клетке-мишени. Одним из таких анализов является анализ пролиферации. Клетки культивируют в присутствии или в отсутствие тест-соединения и пролиферацию клеток детектируют,например, измерением включения тритированного тимидина или колориметрическим анализом, осно- 22006501 ванным на метаболическом расщеплении красителя Alymar Blue (AccuMed, Chicago, IL) или 3-(4,5 диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983). Альтернативный формат анализа использует клетки, которые дополнительно конструируют для экспрессии репортерного гена. Репортерный ген связывают с промоторным элементом, который является чувствительным к связанному с данным рецептором пути, и этот анализ детектирует активацию транскрипции данного репортерного гена. Предпочтительным промоторным элементом в этой связи является сывороточный чувствительный элемент или SRE (см., например, Shaw et al., Cell 56:563-572, 1989). Предпочтительным подобным геном является ген люциферазы (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 1:125, 1987). Экспрессию гена люциферазы детектируют по люминесценции с использованием способов, известных в данной области (например, Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:19094-29101, 1994; Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Наборы для анализа с люциферазой являются коммерчески доступными, например, из Promega Corp., Madison, WI. Клеточные линии-мишени этого типа могут быть использованы для скрининга библиотек химикалиев, клеточно-кондиционированных культуральных сред, грибковых бульонов, почвенных проб, проб воды и т.п. Например, банк проб клеточно- или тканекондиционированных сред может быть анализирован на клетку-мишень для идентификации клеток, которые продуцируют лиганд. Затем положительные клетки используют для получения библиотеки кДНК в экспрессирующем векторе для клеток млекопитающих, который разделяют на два пула, трансфицируют в клетки-хозяева и экспрессируют. Затем пробы сред из трансфицированных клеток анализируют, с последующим разделением пулов, повторно трансфицируют, субкультивируют и повторно анализируют положительные клетки для выделения клональной клеточной линии, экспрессирующей лиганд. Пробы сред, кондиционированные почкой, печенью, селезенкой, тимусом, другими лимфоидными тканями или Т-клетками, являются предпочтительными источниками лиганда для использования в процедурах скрининга. Природный лиганд для zalpha11 может быть также идентифицирован мутагенизацией цитокинзависимой клеточной линии, экспрессирующей zalpha11, и культивированием ее в условиях, которые производят отбор на аутокринный рост. См. WIPO publication WO 95/21930. В типичной процедуре клетки,экспрессирующие zalpha11, мутагенизируют, например, с EMS. Затем клеткам дают придти в нормальное состояние в присутствии требуемого цитокина, затем переносят в культуральную среду, не содержащую цитокина. Выжившие клетки подвергают скринингу на продуцирование лиганда для zalpha11,например, добавлением растворимого (лигандсвязывающего) рецепторного полипептида в культуральную среду или анализом кондиционированной среды на клетки дикого типа и трансфицированные клетки, экспрессирующие zalpha11. Предпочтительные клеточные линии для применения в данном способе включают в себя клетки, которые трансфицируют для экспрессии gр 130 или gр 130 в сочетании с LIFрецептором. Предпочтительные подобные линии клеток-хозяев включают в себя трансфицированные клетки CTLL-2 (Gillis and Smith, Nature 268:154-156, 1977) и трансфицированные клетки BaF3. Кроме того, способ секреторной ловушки, использующий растворимый рецепторный полипептидzalpha11, может быть использован для выделения лиганда zalpha11 (Aldrich et al., Cell 87:1161-1169,1996). Экспрессионную библиотеку кДНК, полученную из известного или предполагаемого источника лиганда, трансфицируют в клетки COS-7. Вектор этой библиотеки кДНК обычно имеет начало репликации SV40 для амплификации в клетках COS-7 и промотор CMV для высокой экспрессии. Трансфицированные клетки COS-7 выращивают в монослое и затем фиксируют и делают проницаемыми. Затем меченый или биотин-меченый растворимый рецептор zalpha11, описанный здесь, помещают в контакт с этим слоем клеток и дают связать клетки в монослое, которые экспрессируют антикомплементарную молекулу, т.е. лиганд zalpha11. Таким образом, клетка, экспрессирующая лиганд, будет связана с рецепторными молекулами. Антитело против метки (анти-Ig для Ig-гибридов, М 2 или анти-FLAG для FLAG-меченых гибридов, стрептавидин и т.п.), которое конъюгировано с пероксидазой хрена (HRP) используют для визуализации клеток, с которыми связан меченый или биотин-меченый растворимый рецептор zalpha11.HRP катализирует депонирование тирамидного реагента, например тирамид-FITC. Коммерчески доступный набор может быть использован для этого детектирования (например, Renaissance TSA-Direct Kit;NEN Life Science Products, Boston, MA). Клетки, которые экспрессируют лиганд рецептора zalpha11,идентифицируют под флуоресцентным микроскопом в виде зеленых клеток и выскребают для последующего клонирования лиганда с использованием процедур для спасения плазмид, как описано в Aldrichet al., supra, с последующими раундами анализа с секреторной ловушкой до тех пор, пока не будут идентифицированы отдельные клоны. Рецепторная активность полипептида zalpha11 может быть измерена биосенсорным микрофизиометром на основе кремния, который измеряет скорость внеклеточного подкисления или экскрецию протонов, связанную со связыванием рецептора и последующими физиологическими клеточными ответами. Примером устройства является микрофизиометр Cytosensor, изготовляемый Molecular Devices, Sunnyvale,CA. Разнообразные клеточные ответные реакции, такие как пролиферация клеток, ионный транспорт,продуцирование энергии, воспалительный ответ, регуляторная и рецепторная активация и т.п., могут быть измерены этим способом. См., например, McConnell, H.M. et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford,S. et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde,I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. Микрофизиометр может быть использован для анализа эука- 23006501 риотических, прокариотических, прикрепленных или неприкрепленных клеток. Путем измерения изменений внеклеточного подкисления в клеточных средах во времени микрофизиометр измеряет непосредственно клеточные ответные реакции на различные стимулы, в том числе агонисты, лиганды или антагонисты полипептида zalpha11. Предпочтительно микрофизиометр используют для измерения ответов экспрессирующей zalpha11 эукариотической клетки в сравнении с контрольной эукариотической клеткой,которая не экспрессирует полипептид zalpha11. Экспрессирующие zalpha11 эукариотические клетки включают в себя клетки, в которые был трансфицирован zalpha11, как описано здесь, с образованием клетки, которая отвечает на модулирующие zalpha11 стимулы, или клетки, природно экспрессирующиеzalpha11, такие как экспрессирующие zalpha11 клетки, полученные из лимфоидной ткани, ткани селезенки, ткани тимуса или PBL. Различия, измеренные по увеличению или уменьшению во внеклеточном подкислении в ответной реакции клеток, экспрессирующих zalpha11, относительно контроля, являются прямым измерением модулируемых zalpha11 клеточных ответов. Кроме того, такие модулированныеzalpha11 ответы могут анализироваться при действии различных стимулов. С использованием микрофизиометра обеспечен также способ идентификации агонистов и антагонистов полипептида zalpha11, предусматривающий обеспечение клеток, экспрессирующих полипептид zalpha11, культивирование первой порции этих клеток в отсутствие тест-соединения, культивирование второй порции этих клеток в присутствии тест-соединения и детектирование увеличения или уменьшения в клеточной ответной реакции второй порции клеток в сравнении с первой порцией клеток. Антагонисты и агонисты, в том числе природный лиганд для полипептида zalpha11, могут быть быстро идентифицированы с использованием этого способа. Дополнительные анализы, обеспечиваемые данным изобретением, включают в себя применение гибридных рецепторных полипептидов. Эти гибридные полипептиды подразделяются на два основных класса. В первом классе внутриклеточный домен zalpha11, содержащий приблизительно остатки 256(Lys)-528 (Ser) SEQ ID NO:2, соединен с лигандсвязывающим доменом второго рецептора. Предпочтительно, чтобы второй рецептор был рецептором гемопоэтического цитокина, таким как mpl-рецептор(Souyri et al., Cell 63:1137-1147, 1990). Этот гибридный рецептор будет дополнительно содержать трансмембранный домен, который может происходить из любого рецептора. Затем конструкцию ДНК, кодирующую этот гибридный рецептор, встраивают в клетку хозяина. Клетки, экспрессирующие гибридный рецептор, культивируют в присутствии лиганда для связывающего домена и анализируют на ответную реакцию. Эта система обеспечивает средство для анализа трансдукции сигнала, опосредованнойzalpha11, с использованием легкодоступных лигандов. Эта система может быть также использована для определения, способны ли конкретные клеточные линии отвечать на сигналы, трансдуцируемые zalpha11. Второй класс гибридных рецепторных полипептидов включает в себя внеклеточный (лигандсвязывающий) домен zalpha11 (приблизительно остатки 20(Cys)-237 (His) SEQ ID NO:2) с цитоплазматическим доменом второго рецептора, предпочтительно рецептора цитокина, и трансмембранным доменом. Трансмембранный домен может происходить из любого рецептора. Гибридные рецепторы этого второго класса экспрессируются в клетках, о которых известно, что они способны отвечать на сигналы, передаваемые вторым рецептором. Вместе эти два класса гибридных рецепторов способны использовать широкий спектр клеточных типов в системах анализа на основе рецепторов. Клетки, которые, как обнаруживается, экспрессируют zalpha11, используют затем для приготовления библиотеки кДНК, из которой кодирующая лиганд кДНК может быть выделена, как описано выше. Таким образом, данное изобретение обеспечивает, кроме новых рецепторных полипептидов, способы для клонирования полипептидных лигандов для этих рецепторов. Тканеспецифичность экспрессии zalpha11 предполагает роль в раннем развитии тимоцитов и регуляции иммунного ответа. Эти процессы включают в себя стимуляцию пролиферации и дифференцировки клеток в ответ на связывание одного или нескольких цитокинов с их родственными рецепторами. Ввиду тканевого распределения, наблюдаемого для этого рецептора, агонисты (в том числе природный лиганд) и антагонисты имеют огромный потенциал в применениях как in vitro, так и in vivo. Соединения, идентифицированные в качестве агонистов рецептора, применимы для стимуляции пролиферации и развития клеток-мишеней in vitro и in vivo. Например, соединения-агонисты применимы в качестве компонентов определенных сред для культуры клеток и могут использоваться отдельно или в комбинации с другими цитокинами и гормонами для замены сыворотки, которую обычно применяют в клеточной культуре. Таким образом, агонисты применимы в специфической стимуляции роста и/или развития Т-клеток, Вклеток и других клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки и гемопоэтических клеток в культуре. Лиганды-агонисты для zalpha11 могут быть полезны в стимуляции клеточно-опосредованного иммунитета и для стимуляции пролиферации лимфоцитов, например в лечении инфекций, включающих в себя иммуносупрессию, в том числе некоторых вирусных инфекций. Дополнительные применения включают в себя супрессию опухолей, когда злокачественное превращение приводит к опухолевым клеткам, которые являются антигенными. Лиганды-агонисты могли бы использоваться для индукции цитотоксичности, которая может быть опосредована активацией эффекторных клеток, таких как Т-клет- 24006501 ки, NK-клетки (природные клетки-убийцы) или LAK-клетки (лимфоид-активируемые клетки-убийцы),или индуцирована непосредственно через апоптотические пути. Лиганды-агонисты могут быть также использованы в лечении лейкопений путем увеличения уровней пораженного клеточного типа и усиления регенерации набора Т-клеток после трансплантации костного мозга. Лиганды-антагонисты или соединения-антагонисты могут найти применение в супрессии иммунной системы, например в лечении аутоиммунных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита, множественного склероза, сахарного диабета, воспалительного заболевания пищеварительного тракта, болезни Крона и т.д. Иммуносупрессия может быть также использована для уменьшения отторжения трансплантатов и имплантатов тканей или органов и для лечения Т-клеточно-специфических лейкозов или лимфом ингибированием пролиферации пораженного клеточного типа.Zalpha11 может быть также использован в диагностических системах для обнаружения уровней лиганда в кровотоке. В родственном варианте, антитела или другие агенты, которые специфически связываются с zalpha11, могут быть использованы для детектирования рецепторных полипептидов в кровообращении. Повышенные или пониженные уровни полипептидов лиганда или рецептора могут свидетельствовать о патологических состояниях, в том числе о раке. Растворимые рецепторные полипептиды могут способствовать патологическому процессу и могут быть прямым маркером скрытого заболевания. Например, повышенные уровни растворимого IL-2-рецептора в сыворотке человека были ассоциированы с большим разнообразием воспалительных и неопластических состояний, таких как инфаркт миокарда,астма, тяжелая псевдопаралитическая миастения, ревматоидный артрит, острый Т-клеточный лейкоз, Вклеточные лимфомы, хронический лимфоцитарный лейкоз, рак ободочной кишки, рак молочной железы и рак яичника (Heaney et al., Blood 87:847-857, 1996). Лигандсвязывающий полипептид рецептора zalpha11, или растворимый рецептор, может быть получен экспрессией укороченной ДНК, кодирующей цитокинсвязывающий домен zalpha11 (приблизительно остатки 20(Cys)-237 (His) человеческого рецептора (SEQ ID NO:2 или соответствующий район рецептора не человека. Предпочтительно, чтобы внеклеточный домен был получен в форме, по существу, не содержащей полипептидных сегментов трансмембранного и внутриклеточного доменов. Кроме того, лигандсвязывающие полипептидные фрагменты в цитокинсвязывающем домене zalpha11, описанном выше, могут служить в качестве растворимых рецепторов zalpha11 для описанных здесь применений. Для направления экспорта рецепторного полипептида из клетки-хозяина ДНК рецептора связывают со вторым ДНК-сегментом, кодирующим секреторный пептид, такой как секреторный пептид t-PA или секреторный пептид zalpha11. Для облегчения очистки секретируемого рецепторного полипептида Сконцевое удлинение, такое как полигистидиновая метка, вещество Р, пептид FLAG (Hopp et al.,Bio/Technology 6:1204-1210, 1988; доступный из Eastman Kodak Co., New Haven, CT) или другой полипептид или белок, для которого доступны антитело или другой агент специфического связывания, может быть слито с рецепторным полипептидом. В альтернативном подходе, рецепторный внеклеточный домен может экспрессироваться в виде слитого белка с константными областями тяжелой цепи иммуноглобулина, обычно с Fc-фрагментом,который содержит домены двух константных областей и не содержит вариабельной области. Такие слияния обычно секретируются в виде мультимерных молекул, где Fc-части связаны друг с другом дисульфидной связью, а два рецепторных полипептида выстроены в тесной близости друг с другом. Слитые белки этого типа могут быть использованы для аффинной очистки родственного лиганда из раствора, в качестве инструмента анализа in vitro, для блокирования сигналов in vitro посредством специфического оттитровывания лиганда и в качестве антагонистов in vivo путем введения их парентерально для связывания находящегося в кровотоке лиганда и выведения его из кровотока. Для очистки лиганда химеру zalpha11-иммуноглобулин добавляют к пробе, содержащей лиганд (например, клеточно-кондиционированной культуральной среде или экстрактам тканей) в условиях, которые облегчают связывание рецептор-лиганд (обычно при почти физиологических температуре, рН и ионной силе). Затем комплекс химера-лиганд выделяют смешиванием с использованием белка А, который иммобилизован на твердом носителе (например, на нерастворимых гранулах смолы). Затем лиганд элюируют при помощи общепринятых химических способов, таких как градиент соли или рН. Альтернативно, сама химера может быть связана с твердым носителем, причем связывание и элюцию проводят, как описано выше. Собранные фракции могут быть повторно фракционированы до тех пор, пока не будет достигнут желаемый уровень чистоты. Кроме того, растворимые рецепторы zalpha11 могут быть использованы в качестве стока лиганда,т.е. антагониста, для связывания лиганда in vivo или in vitro в терапевтических или других применениях,когда присутствие лиганда является нежелательным. Например, в случае раков, которые экспрессируют большое количество биоактивного лиганда zalpha11, растворимые рецепторы zalpha11 могут быть использованы в качестве прямых антагонистов этого лиганда in vivo и могут способствовать снижению прогрессирования и симптомов, связанных с данным заболеванием. Кроме того, растворимый рецепторzalpha11 может быть использован для замедления прогрессирования раков, которые сверхэкспрессируют рецепторы zalpha11, связыванием лиганда in vivo, который в противном случае усиливал бы пролиферацию этих раков. Подобно применениям in vitro для zalpha11, растворимый рецептор может быть исполь- 25006501 зован, например, в качестве инструмента негативного отбора для отбора клеточных линий, которые растут в отсутствие лиганда zalpha11. Кроме того, растворимый рецептор zalpha11 может быть использован in vitro или в диагностических применениях для детектирования экспрессирующих лиганд zalpha11 раков in vivo или в пробах тканей. Например, растворимый рецептор zalpha11 может быть конъюгирован с радиоактивной меткой или флуоресцентной меткой, как описано выше, и использован для детектирования присутствия лиганда в пробе ткани с применением анализа связывания in vitro типа лиганд-рецептор или анализа с флуоресцентной визуализацией. Кроме того, радиоактивно меченный растворимый рецептор zalpha11 мог бы вводиться in vivo для детектирования экспрессирующих лиганд твердых опухолей при помощи способа радиотомографии, известного в данной области. Анализ тканевого распределения мРНК, соответствующей этой новой ДНК, показал экспрессию в лимфоидных тканях, в том числе в тимусе (вилочковой железе), селезенке, лимфатических узлах и лейкоцитах периферической крови. Эти данные указывают на роль рецептора zalpha11 в пролиферации,дифференцировке и/или активации иммунных клеток и предполагают роль в развитии и регуляции иммунных ответов. Эти данные предполагают также, что взаимодействие zalpha11 с его лигандом может стимулировать пролиферацию и развитие миелоидных клеток и может, подобно IL-2, IL-6, LIF, IL-11 иOSM (Baumann et al., J. Biol. Chem. 268:8414-8417, 1993), индуцировать белковый синтез острой фазы в гепатоцитах. Предпочтительно очищать полипептиды данного изобретения до 80% чистоты, более предпочтительно до 90% чистоты, еще более предпочтительно до 95% чистоты и особенно предпочтительно до фармакологически чистого состояния, т.е. до чистоты более 99,9%, в отношении загрязняющих макромолекул, в частности, других белков и нуклеиновых кислот, и инфекционных и пирогенных агентов. Предпочтительно очищенный полипептид является, по существу, не содержащим других полипептидов,в частности других полипептидов животного происхождения. Экспрессируемые рекомбинантные полипептиды zalpha11 (или химерные или слитые полипептидыzalpha11) могут быть очищены с использованием фракционирования и/или общепринятых способов и сред очистки. Для фракционирования проб могут быть использованы осаждение сульфатом аммония и кислотная или хаотропная экстракция. Примеры стадий очистки могут включать в себя применение гидроксиапатита, гель-фильтрацию, жидкостную экспресс-хроматографию белков (FPLC) и высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой. Подходящие хроматографические среды включают в себя производные декстрана, агарозу, целлюлозу, полиакриламид, специальные диоксиды кремния и т.п. Предпочтительными являются производные PEI, DEAE, QAE и Q. Примеры хроматографических сред включают в себя среды, дериватизованные фенильной, бутильной или октильной группами,такие как Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), OctylSepharose (Pharmacia) и т.п.; или полиакриловые смолы, такие как Amberchrom CG 71 (Toso Haas) и т.п. Подходящие твердые носители включают в себя стеклянные гранулы, смолы на основе диоксида кремния, целлюлозные смолы, агарозные гранулы, сшитые агарозные гранулы, полистироловые гранулы,сшитые полиакриламидные смолы и т.п., которые являются нерастворимыми в условиях, в которых они должны использоваться. Эти носители могут быть модифицированы реакционноспособными группами,позволяющими присоединение белков посредством аминогрупп, карбоксильных групп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп и/или углеводных частей молекул. Примеры химических способов связывания включают в себя активацию цианогенбромидом, активацию N-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, активацию сульфгидрильными группами, активацию гидразидом и карбоксил- и аминопроизводные для способов сочетания с использованием карбодиимида. Эти и другие твердые среды являются хорошо известными и широко используемыми в данной области и доступны из коммерческих источников. Способы связывания рецепторных полипептидов со средами-носителями хорошо известны в данной области. Выбор конкретного способа является рутинным и определяется отчасти свойствами выбранного носителя. См., например. Affinity Chromatography: PrinciplesMethods, Pharmacia LKBBiotechnology, Uppsala, Sweden, 1988. Полипептиды данного изобретения могут быть выделены путем использования их биохимических,структурных и биологических свойств. Например, адсорбционная хроматография с иммобилизованным ионом металла (IMAC) может быть использована для очистки богатых гистидином белков или белков,имеющих полигистидиновые метки. Вкратце, гель сначала загружают ионами двухвалентного металла с образованием хелата (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Богатые гистидином белки будут адсорбироваться на этом матриксе с различными аффинностями в зависимости от используемого иона металла и будут элюироваться конкурентной элюцией, понижением рН или применением сильных хелатообразователей. Другие способы очистки включают в себя очистку гликозилированных белков аффинной хроматографией с иммобилизованным лектином и ионообменной хроматографией (Methods in Enzymol., Vol. 182:529-39, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990). В дополнительных вариантах данного изобретения может быть сконструирован гибрид представляющего интерес- 26006501 полипептида и аффинной метки (например, мальтозусвязывающего белка, домена иммуноглобулина) для облегчения очистки. Кроме того, при помощи способов, описанных в данной области, слитые полипептиды или гибридные белки zalpha11 конструируют с использованием районов или доменов zalpha11 данного изобретения в комбинации с районами или доменами других белков семейства рецепторов цитокинов человека или гетерологичных белков (Sambrook et al., ibid., Altschul et al., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-5, 1994 и приведенные в них ссылки). Эти способы позволяют определить биологическую важность более крупных доменов или районов в представляющем интерес полипептиде. Такие гибриды могут изменять кинетику реакции, связывание, сужать или расширять субстратную специфичность или изменять клеточную локализацию полипептида и могут быть применены к полипептидам неизвестной структуры. Слитые полипептиды или белки могут быть получены способами, известными в данной области,посредством получения каждого компонента слитого белка и химического конъюгирования их. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий один или несколько компонентов слитого белка в правильной рамке считывания, может быть получен с использованием известных способов и экспрессирован при помощи описанных здесь способов. Например, часть домена (доменов) или весь домен, сообщающий биологическую функцию, может быть подвергнут обмену между zalpha11 данного изобретения и функционально эквивалентным доменом (доменами) из другого члена семейства цитокинов. Такие домены включают в себя, но не ограничиваются ими, секреторную сигнальную последовательность, внеклеточный связывающий цитокин домен, трансмембранный домен и внутриклеточный передающий сигнал домен, сайты Box I и Box II, как описано здесь. Можно было бы ожидать, что такие гибридные белки имеют биологические функциональные особенности, которые являются одинаковыми или подобными особенностям полипептидов данного изобретения или белков других известных семейств, в зависимости от сконструированного слитого полипептида. Кроме того, такие слитые белки могут проявлять другие свойства, как описано здесь. Стандартные способы молекулярной биологии и клонирования могут быть использованы для обмена эквивалентных доменов между полипептидом zalpha11 и полипептидами, с которыми их сливают. Обычно сегмент ДНК, который кодирует представляющий интерес домен, например описанный здесь домен zalpha11, функционально (операбельно) связывают в рамке считывания по меньшей мере c одним другим сегментом ДНК, кодирующим дополнительный полипептид (например, домен или район из рецептора другого цитокина, такого как IL-2-рецептор), и встраивают в подходящий экспрессирующий вектор, как описано здесь. Обычно конструкции ДНК конструируют таким образом, что несколько сегментов ДНК, кодирующих соответствующие районы полипептида, функционально связывают в рамке считывания для получения единой конструкции, кодирующей весь слитый белок или его функциональную часть. Например, конструкция ДНК кодировала бы от N-конца до С-конца слитый белок, содержащий сигнальный полипептид, за которым следуют цитокинсвязывающий домен, затем трансмембранный домен и внутриклеточный передающий сигнал домен. Такие слитые белки могут быть экспрессированы,выделены и тестированы на активность, как описано здесь. Полипептиды zalpha11 или их фрагменты могут быть также получены при помощи химического синтеза. Полипептиды zalpha11 могут быть мономерами или мультимерами; гликозилированными или негликозилированными; пэгилированными или непэгилированными и могут содержать или могут не содержать исходный аминокислотный остаток метионин. Полипептиды данного изобретения могут быть также синтезированы эксклюзивным (т.е. только) твердофазным синтезом, частичными твердофазными способами, конденсацией фрагментов или классическим синтезом в растворе. Способы синтеза полипептидов хорошо известны в данной области. См.,например, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595, 1970. После полного синтеза желаемого пептида на твердом носителе комплекс пептид-смола обрабатывают реагентом, который отщепляет полипептид от смолы и удаляет большую часть защитных групп боковых цепей. Такие способы хорошо разработаны в данной области. Активность молекул данного изобретения может быть измерена с использованием различных тестов, которые измеряют дифференцировку и пролиферацию клеток. Такие тесты хорошо известны в данной области. Белки данного изобретения применимы, например, в лечении лимфоидных, иммунных, воспалительных, связанных с селезенкой, кровью и костями нарушений и могут быть измерены in vitro с использованием культивируемых клеток или in vivo путем введения молекул данного изобретения подходящему животному-модели. Например, клетки-хозяева, экспрессирующие растворимый рецепторный полипептид zalpha11, могут быть заделаны в альгинатную среду и инъецированы (имплантированы) в животных-реципиентов. Микроинкапсулирование в альгинат-поли-L-лизин, инкапсулирование в мембрану с избирательной проницаемостью и диффузионные камеры являются средствами заключения в них трансфицированных клеток млекопитающих или первичных клеток млекопитающих. Эти типы неиммуногенных инкапсулирований делают возможной диффузию белков и других макромолекул, секретируемых или высвобождаемых захваченными клетками в реципиентное животное. Наиболее важно, что капсулы маскируют и защищают чужеродные заделанные в них клетки от иммунного ответа реципиентного жи- 27006501 вотного. Такие инкапсулирования могут продлевать жизнь инъецируемых клеток от нескольких часов или дней (голые клетки) до нескольких недель (заделанные клетки). Альгинатные нити обеспечивают простое и быстрое средство для получения заделанных клеток. Материалы, необходимые для получения альгинатных нитей, известны в данной области. В примерной процедуре 3% альгинат готовят в стерильной Н 2 О и стерильно фильтруют. Непосредственно перед приготовлением альгинатных нитей раствор альгината снова фильтруют. Приблизительно 50% суспензию клеток (содержащую приблизительно 5 х 105 -приблизительно 5 х 107 клеток/мл) смешивают с 3% раствором альгината. 1 мл суспензии альгинат/клетки экструдируют в 100 мМ стерильно профильтрованный раствор CaCl2 на протяжении периода времени 15 мин с образованием нити. Затем экструдированную нить переносят в раствор 50 мМ CaCl2 и затем в раствор 25 мМ CaCl2. Затем эту нить промывают деионизованной водой перед нанесением покрытия на нить инкубированием в 0,01% растворе поли-L-лизина. Наконец, нить промывают лактированным раствором Рингера и вытягивают из раствора в цилиндр шприца (без иглы). Затем к шприцу присоединяют иглу с большим отверстием и нить инъецируют внутрибрюшинно в реципиента в минимальном объеме лактированного раствора Рингера. Подход in vivo для тестирования белков данного изобретения включает в себя вирусные системы доставки. Примеры вирусов для этой цели включают в себя аденовирус, герпесвирус, ретровирусы, вирус коровьей оспы и аденоассоциированный вирус (AAV). Aденовирус, двухцепочечный ДНК-вирус,является в настоящее время наиболее исследованным вектором переноса генов для доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты (в отношении обзора см. Т.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994 и J.T. Douglas and D.T. Curiel, ScienceMedicine 4:44-53, 1997). Аденовирусная система предоставляет несколько преимуществ: (i) аденовирус может вместить относительно большие инсерционные сегменты(вставки) ДНК; (ii) может выращиваться до высокого титра; (iii) инфицирует широкий спектр типов клеток млекопитающих и (iv) может быть использован с большим числом различных промоторов, в том числе вездесущих, тканеспецифических и регулируемых промоторов. Поскольку аденовирусы являются стабильными в кровотоке, они могут вводиться также внутривенной инъекцией. С использованием аденовирусных векторов, в которых части аденовирумного генома делетированы, инсерционные сегменты (вставки) включают в вирусную ДНК прямым лигированием или гомологичной рекомбинацией с котрансфицируемой плазмидой. В приводимой в качестве примера системе основной ген Е 1 был делетирован из вирусного вектора и вирус не реплицировался, пока ген Е 1 не обеспечивался клеткой-хозяином (примером является клеточная линия 293 человека). При внутривенном введении интактным животным аденовирус, прежде всего, поражал печень. Если эта аденовирусная система доставки имеет делецию гена Е 1, этот вирус не может реплицироваться в клетках-хозяевах. Однако ткань хозяина (например, печень) будет экспрессировать и процессировать (и, если присутствует секреторная сигнальная последовательность, секретировать) гетерологичный белок. Секретированные белки будут входить в кровоток в высоковаскуляризованной печени, и могут быть определены действия на инфицированное животное. Кроме того, аденовирусные векторы, содержащие различные делеции вирусных генов, могут быть использованы в попытке уменьшения или элиминации иммунных ответов на вектор. Такие аденовирусы являются лишенными Е 1 и, кроме того, содержат делеции Е 2 А или Е 4 (Lusky, M. et al., J. Virol. 72:20222032, 1998; Raper, S.E. et al., Human Gene Therapy 9:671-679, 1998). Кроме того, сообщалось, что делеция Е 2b снижает иммунные ответы (Amalfitano, A. et al., J. Virol. 72:926-933, 1998). Кроме того, посредством делеции всего аденовирусного генома могут быть помещены очень большие инсерции гетерологичной ДНК. Генерирование так называемых безвольных аденовирусов, в которых все вирусные гены делетированы, является особенно выгодным для инсертирования больших инсерционных сегментов гетерологичной ДНК. В качестве обзора, см. Yeh, P. and Perricaudet, M. FASEB J. 11:615-623, 1997. Аденовирусная система может быть также использована для получения белков in vitro. Культивированием инфицированных аденовирусом не-293 клеток в условиях, в которых эти клетки не являются быстро делящимися, эти клетки могут продуцировать белки в течение продолжительных периодов времени. Например, клетки ВНК выращивают до конфлюэнтности в клеточных фабриках (кассетах биореакторов для крупномасштабного производства клеток), затем экспонируют аденовирусному вектору, кодирующему представляющий интерес секретируемый белок. Затем клетки выращивают в бессывороточных условиях, которые позволяют инфицированным клеткам выживать в течение нескольких недель без существенного деления клеток. Альтернативно, инфицированные аденовирусным вектором клетки 293 могут выращиваться в виде прикрепленных клеток или в виде суспензионной культуры при относительно высокой плотности клеток для продуцирования значительных количеств белка (см. Garnier et al.,Cytotechnol. 15:145-55, 1994). В случае любого протокола, экспрессируемый, секретируемый гетерологичный белок может периодически выделяться из супернатанта, лизата или мембранных фракций клеточной культуры, в зависимости от локализации экспрессируемого белка в клетке. В протоколе с продуцированием инфицированными клетками 293 также могут быть эффективно получены несекретируемые белки. Ввиду тканевого распределения, наблюдаемого для zalpha11, агонисты (в том числе природный лиганд/субстрат/кофактор и т.д.) и антагонисты имеют огромный потенциал в применениях как in vitro, так- 28006501 и in vivo. Соединения, идентифицированные в качестве агонистов zalpha11, применимы для стимуляции роста иммунных и гемопоэтических клеток in vitro и in vivo. Например, zalpha11 и соединения-агонисты применимы в качестве компонентов определенных сред для культуры клеток и могут использоваться отдельно или в комбинации с другими цитокинами и гормонами для замены сыворотки, которую обычно применяют в клеточной культуре. Таким образом, агонисты применимы в специальной стимуляции роста и/или развития Т-клеток, В-клеток и других клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки в культуре. Кроме того, растворимый рецептор zalpha11, агонист или антагонист могут быть использованы in vitro в тесте для измерения стимуляции образования колоний из первичных культур выделенного костного мозга. Такие тесты хорошо известны в данной области. Антагонисты применимы также в качестве реагентов исследования для характеристики сайтов взаимодействия лиганд-рецептор. Ингибиторы активности zalpha11 (антагонисты zalpha11) включают в себя антитела против zalpha11 и растворимых рецепторов zalpha11, а также другие пептидные и непептидные агенты (в том числе рибозимы).Zalpha11 может быть использован также для идентификации модуляторов (например, антагонистов) его активности. Тест-соединения добавляют к описанным здесь тестам для идентификации соединений,ингибирующих активность zalpha11. Кроме этих описанных здесь тестов, пробы могут быть тестированы на ингибирование активности zalpha11 в многочисленных анализах, предназначенных для измерения связывания, олигомеризации zalpha11 или стимуляции/ингибирования zalpha11-зависимых клеточных ответных реакций. Например, экспрессирующие zalpha11 клеточные линии могут быть трансфицированы конструкцией с репортерным геном, которая отвечает на стимулируемый zalpha11 клеточный путь. Конструкции с репортерным геном этого типа известны в данной области и обычно будут содержать чувствительный к zalpha11 ДНК-элемент, функционально связанный с геном, кодирующим детектируемый тестом белок, такой как люцифераза. Чувствительные ДНК-элементы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, циклический АМФ-чувствительный элемент (CRE), гормон-чувствительные элементы (HRE), инсулин-чувствительный элемент (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7,1990) и сыворотка-чувствительные элементы (SRE) (Shaw et al., Cell 56:563-72, 1989). Циклический АМФ-чувствительные элементы рассматриваются в обзоре Roestler et al., J. Biol. Chem 263 (19):9063-6; 1988 и Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-94; 1990. Гормон-чувствительные элементы рассматриваются в Beato, Cell 56:335-44; 1989. Соединения-кандидаты, растворы, смеси или экстракты или кондиционированные среды от различных типов клеток тестируют на их способность усиливать активность рецептора zalpha11, определяемую увеличением стимуляции zalpha11 экспрессии репортерного гена. Тесты этого типа будут детектировать соединения, которые непосредственно стимулируют активность трансдукции (передачи) сигнала zalpha11 через связывание рецептора или стимуляцией иным образом части каскада сигналов. Таким образом, обеспечен способ идентификации агонистов полипептидаzalpha11, предусматривающий обеспечение клеток, чувствительных к полипептиду zalpha11, культивирование первой порции этих клеток в отсутствие тест-соединения, культивирование второй порции этих клеток в присутствии тест-соединения и детектирование увеличения клеточного ответа второй порции этих клеток в сравнении с первой порцией этих клеток. Кроме того, третья клетка, содержащая конструкцию с репортерным геном, описанную выше, но не экспрессирующая рецептор zalpha11, может быть использована в качестве контрольной клетки для оценки неспецифической, или не опосредованной рецептором zalpha11, стимуляции данного репортера. Таким образом, агонисты, в том числе природный лиганд, применимы для стимуляции или увеличения функции полипептида zalpha11. Лигандсвязывающий полипептид zalpha11, такой как цитокинсвязывающий домен, описанный здесь, может быть также использован для очистки лиганда. Этот полипептид иммобилизуют на твердом носителе, таком как гранулы из агарозы, сшитой агарозы, стекла, целлюлозных смол, смол на основе диоксида кремния, полистирола, сшитого полиакриламида, или подобных материалах, которые являются стабильными в условиях использования. Способы связывания полипептидов с твердыми носителями известны в данной области и включают в себя аминную химию, активацию цианогенбромидом, активациюN-гидроксисукцинимидом, активацию эпоксидом, сульфгидрильную активацию и гидразидную активацию. Полученную среду обычно готовят в форме колонки и жидкости, содержащих лиганд, пропускают через эту колонку 1 или несколько раз, чтобы позволить лиганду связаться с рецепторным полипептидом. Затем этот лиганд элюируют при помощи изменений концентрации соли, хаотропных агентов (гуанидина-НСl) или рН для разрушения связывания лиганд-рецептор. Тест-система, которая использует лигандсвязывающий рецептор (или антитело, один член пары комплемент/антикомплемент) или его связывающий фрагмент, и коммерчески доступный биосенсорный прибор (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ; или технологию SELDI, Ciphergen, Inc., PaloAlto, CA) могут быть выгодно использованы. Такой рецептор, антитело, член пары комплемент/антикомплемент или фрагмент иммобилизуют на поверхности рецепторного кристалла. Применение этого прибора описано Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-240, 1991 и Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Такой рецептор, антитело, член пары или фрагмент присоединяют ковалентно при помощи аминной или сульфгидрильной химии к волокнам декстрана, которые присоединены к пленке золота в проточной ячейке. Тест-пробу пропускают через эту ячейку. Если лиганд, эпитоп или противопо- 29006501 ложный член пары комплемент/антикомплемент присутствует в этой пробе, он будет связываться с иммобилизованным рецептором, антителом или членом пары, соответственно, вызывая изменение в показателе преломления среды, которое детектируется как изменение в резонансе поверхностных плазмонов золотой пленки. Эта система позволяет определить скорости включения и выключения (on- и offскорости), из которых может быть рассчитана аффинность связывания и сделана оценка стехиометрии связывания. Лигандсвязывающие рецепторные полипептиды могут быть также использованы в других системах анализа, известных в данной области. Такие системы включают в себя анализ Скетчарда для определения аффинности связывания (см. Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949) и калориметрические анализы (Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991). Полипептиды zalpha11 могут быть также использованы для получения антител, которые связываются с эпитопами, пептидами или полипептидами zalpha11. Полипептид zalpha11 или его фрагмент служит в качестве антигена (иммуногена) для инокуляции животного и индукции иммунного ответа. Специалисту с квалификацией в данной области будет ясно, что антигены или иммуногенные эпитопы могут состоять из отрезков аминокислот в более длинном полипептиде, от приблизительно 10 аминокислот и до полной длины полипептида или более длинного полипептида в зависимости от конкретного полипептида. Подходящие антигены включают в себя полипептид zalpha11, кодируемый SEQ ID NO:2 от аминокислоты номер 20 (Cys) до аминокислоты номер 538 (Ser) или его фрагмент из непрерывных аминокислот 9-519. Предпочтительными пептидами для применения в качестве антигенов являются цитокинсвязывающий домен, внутриклеточный передающий сигнал домен, сайты Box I и Box II, описанные здесь, и гидрофильные пептиды zalpha11, такие как предсказанные специалистом в данной области из графика гидрофобности, определенные, например, из профиля гидрофильности Hopp/Woods на основе скользящего окна для шести остатков, со скрытыми остатками G, S и Т и экспонированными (открытыми) остатками Н, Y и W (см. фиг. 1). Гидрофильные пептиды zalpha11 включают в себя пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из (1) аминокислоты номер 51NO:2; (4) аминокислоты номер 223 (Phe) - аминокислоты номер 232 (Glu) SEQ ID NO:2 и (5) аминокислоты номер 360 (Glu) - аминокислоты номер 368 (Asp) SEQ ID NO:2. Кроме того, подходящими антигенами являются консервативные мотивы и вариабельные районы между консервативными мотивамиzalpha11. Кроме того, соответствующие районы мышиного полипептида zalpha11 (SEQ ID NO:85) могут быть использованы для генерирования антител против мышиного zalpha11. Антитела, генерированные из этого иммунного ответа, могут быть выделены и очищены, как описано выше. Способы получения и выделения поликлональных и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., напримерCurrent Protocols in Immunology, Cooligan, et al., (eds.). National Institutes of Health, John Wiley and Sons,Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor,NY, 1989 и Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press,Inc., Boca Raton, FL, 1982). Как должно быть очевидно специалисту с обычной квалификацией в данной области, поликлональные антитела могут быть получены инокуляцией различных теплокровных животных, таких как лошади,коровы, козы, овцы, собаки, куры, кролики, мыши и крысы, полипептидом zalpha11 или его фрагментом. Иммуногенность полипептида zalpha11 может быть увеличена путем применения адъюванта, такого как квасцы (гидроксид алюминия) или полный или неполный адъювант Фрейнда. Полипептиды, применимые для иммунизации, включают в себя также слитые (гибридные) полипептиды, такие как гибридыzalpha11 или его части с полипептидом иммуноглобулина или с мальтозусвязывающим белком. Полипептидный иммуноген может быть полноразмерной молекулой или ее частью. Если эта часть полипептида является "гаптен-подобной", такая часть может быть предпочтительно соединена или связана с макромолекулярным носителем (таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH), бычий сывороточный альбумин(БСА) или столбнячный токсоид) для иммунизации. В применении здесь термин "антитела" включает в себя поликлональные антитела, аффинноочищенные поликлональные антитела, моноклональные антитела и антигенсвязывающие фрагменты,такие как протеолитические F(ab')2- и Fab-фрагменты. Также включены генетически сконструированные интактные антитела или фрагменты, такие как химерные антитела, Fv-фрагменты, одноцепочечные антитела и т.п., а также синтетические антигенсвязывающие пептиды и полипептиды. Антитела не из человека могут быть "очеловечены" (гуманизированы) прививкой CDR не человека на каркасные и константные области иммуноглобулина человека или включением полных вариабельных доменов не человека(необязательно "окутыванием" их подобной человеческой поверхностью путем замены экспонированных остатков, результатом чего является "облицованное" антитело). В некоторых случаях "гуманизированные" антитела могут сохранять остатки иммуноглобулина не человека в каркасных доменах вариабельной области человека для усиления характеристик правильного связывания. Посредством "гуманизирования" антител может быть увеличен биологический полупериод существования в организме, и потенциал неблагоприятных иммунных реакций при введении людям уменьшается.