Лиганд, связывающийся с msrv-env (варианты), scfv и fab фрагменты, антитело, способ их получения, фармацевтическая композиция, нуклеиновые кислоты, вектор, клетка-хозяин, способ лечения, антилиганд и способ его определения, набор и его применение

Настоящее изобретение относится к лиганду, связывающемуся с MSRV-ENV, содержащему каждый из участков, определяющих комплементарность (CDR): CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL),представленный SEQ ID No. 1, CDR2 VL, представленный SEQ ID No. 2, CDR3 VL, представленный SEQ IDNo. 3, CDR4 вариабельной области тяжелой цепи (VH), представленный SEQ ID No. 4, CDR5 VH,представленный SEQ ID No. 5, и CDR6 VH, представленный SEQ ID No. 6. Указанный лиганд может быть использован при лечении MSRV-ассоциированных заболеваний. Кроме того, изобретение относится к вариантам указанного лиганда, ScFV, Fab фрагментам, антителу, включающим лиганды по изобретению,способу их получения, фармацевтической композиции, включающей их; нуклеиновым кислотам,кодирующим лиганды, вектору, включающему их, клетке-хозяину, содержащей нуклеиновые кислоты; к способу лечения MSRV-ассоциированных заболеваний; к антилиганду, предназначенному для получения антитела; способу и набору для определения антилиганда в образце, а также к применению набора. Объектом настоящего изобретения является лиганд, который проявляет значительное связывание с молекулой-мишенью, антилигандом. В соответствии с настоящим изобретением "антилигандом" является белок MSRV-ENV (оболочки),MSRV означает "PC (рассеянный склероз)-ассоциированный ретровирус" (Perron, et al. (1997). "MolecularResearch Group on Multiple Sclerosis". Proc Natl Acad Sci USA 94(14): 7583-8). "Белок MSRV-ENV" следует понимать как полноразмерный или частичный белковый продукт, кодируемый генами MSRV env, как определено в Komurian-Pradel, F., et al. (1999). Virology 260(1): 1-9, и Rolland A., et al. (2006) J Immunol 176(12): 7636-44, или любую молекулу, имитирующую антигенные или связывающие свойства MRSVENV (мимеотоп). "ENV-T" соответствует полноразмерному белку, который подробно описан в примере 2(остатки 1-542), a "ENV-SU", также называемый ENV-1, соответствует последовательности S30-K316,как определено в примере 2. На Env-SU также ссылаются в статье Rolland A., et al. (2006) J Immunol 176(12): 7636-44. Как обычно для ретровирусов, MSRV проявляет вариабельность в его белке оболочки ENV (Perron, H. et al. (2000) J Neurovirol 6: S67-75; Voisset, С. О. Bouton et al. (2000) AIDS Res Hum Retroviruses 16(8): 731-40). Показано, что мимеотопы, имитирующие частичные белковые фрагменты MSRVENV, существуют и избирательно связываются антителами от пациентов с рассеянным склерозом (Jolivet-Reynaud, С., Н. Perron, et al. (1999). "Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes". Clin Immunol 93(3): 283-93). Более конкретно лиганд по настоящему изобретению содержит каждый из участков, определяющих комплементарность (CDR): CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), представленный SEQ ID No. 1, CDR2 VL, представленный SEQ ID No. 2, CDR3 VL, представленный SEQ ID No. 3, CDR4 вариабельной области тяжелой цепи (VH), представленный SEQ ID No. 4, CDR5 VH, представленный SEQ ID No. 5, и CDR6 VH, представленный SEQ ID No. 6. Лиганды по настоящему изобретению обладают способностью связываться с антилигандом по настоящему изобретению. В соответствии с настоящим изобретением под выражением "связывает" или "связывающий" следует понимать, что лиганд значимо распознает антилиганд в соответствии с критериями, приведенными в примере 5. В другом аспекте изобретения указанный лиганд включает вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую участки, определяющие комплементарность(CDR), имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID No. 1, представляющую собой CDR1,SEQ ID No. 2, представляющую собой CDR2, и SEQ ID No. 3, представляющую собой CDR3, и вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID No. 4,представляющую собой CDR4, SEQ ID No. 5, представляющую собой CDR5, и SEQ ID No. 6, представляющую собой CDR6. В следующем аспекте лиганд по изобретению включает вариабельную область легкой цепи (VL),имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID No. 7, и вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ IDNo. 8. Варианты этих последовательностей VH и VL в соответствии с настоящим изобретением значимо связываются с антилигандом."Идентичность последовательности" означает, например, что в последовательности, обладающей 80% идентичности последовательности, 80% идентичных аминокислот присутствует в том же положении при выравнивании последовательностей, которое можно осуществлять известными в данной области техники способами, такими как описаны в Sequence - Evolution - Function Computational Approaches inComparative genomics. Koonon E. et al., 2003: Kluwer Academic Publishers, или в соответствии с параметрами по умолчанию руководства к программному обеспечению "Mac Vector" (UK). Лиганд по настоящему изобретению может быть также определен как включенный в рекомбинантный белок scFV. В соответствии со следующими аспектами изобретения лиганд может быть включен в Fab фрагмент, в антитело, которое может быть поликлональным, моноклональным, олигоклональным, химеризованным, сконструированным или гуманизированным антителом. В конкретном аспекте изобретения антитело, включающее лиганд, представляет собой IgG человека, и более конкретно IgG1 или IgG4. Поликлональные, олигоклональные, моноклональные антитела могут быть получены классическими способами, такими как описаны Kohler and Milstein (1975), или используя методики, описанные вSambrook et al., A Guide to Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), используя вышеописанные антилиганды. Более конкретно антилиганд по настоящему изобретению, который используют для получения антител, представляет собой антилиганд, состоящий из SEQ ID No. 20 или из SEQ ID No. 32. В частности, в форме пептида, связанного с белком-носителем, таким как сывороточный альбумин или KLH, обычно используемый для иммунизации. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей лиганд по изобрете-1 024655 нию в качестве активного ингредиента. Этот лиганд может также присутствовать в фармацевтической композиции в форме ScFv, Fab фрагмента или антитела. Фармацевтическую композицию по изобретению применяют для лечения MSRV-ассоциированных заболеваний. В пределах значения по настоящему изобретению "лечение" охватывает либо профилактическое,либо терапевтическое лечение. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в количествах, которые будут терапевтически эффективными и иммуногенными и, как известно в данной области техники, дозировка,которую вводят, зависит от индивидуума, подлежащего лечению. В следующем аспекте изобретение относится к способу лечения, включающему введение лиганда,ScFv, Fab фрагмента или антитела или лиганда в любом молекулярном или подходящем терапевтическом векторе, сохраняющем его связующие свойства, как обсуждено выше, или фармацевтической композиции, как описано выше. Способ лечения по изобретению направлен на лечение MSRV-ассоциированных заболеваний.MSRV представляет собой ретровирус человека, впервые выделенный у пациентов с рассеянным склерозом (Perron, H., В. Lalande, et al. (1991), Lancet 337(8745): 862-3; Perron, H., J. A. Garson, et al.(1997), Proc Natl Acad Sci USA 94(14): 7583-8). Ассоциированные заболевания или синдромы определяют присутствием у соответствующих пациентов либо (i) специфичной РНК MSRV или антигенов, предпочтительно обнаруженных в жидкостях организма (крови, спинномозговой жидкости, моче), либо (ii) повышенного числа копий ДНК или РНК в клетках или тканях из органов с повреждениями или дисфункциями, либо (iii) специфичных белков или антигенов MSRV в клетках или тканях, вовлеченных в процесс заболевания или клинического синдрома, либо (iv) белков или антигенов MSRV в жидкостях организма индивидуумов с заболеванием или тех, у которых выражен клинический синдром (как описано в примере 8, см. ниже, и в других ниже). Поскольку MSRV обладает генетической гомологией с семейством эндогенных ретровирусов человека типа W (HERV-W) (Blond et al., 1999; Dolei, 2005; Dolei and Perron, 2008), альтернативное или дополнительное определение MSRV-ассоциированных заболеваний может быть также получено с нуклеиновыми кислотами, антигенами или белками HERV-W, используемыми для таких же тестов на обнаружение (Antony et al., 2004; Arm et al., 2007; Karlsson et al., 2004; Mameliet al., 2007). Кроме того, экспрессия MSRV может быть обусловлена повышающей регуляцией некоторых копий HERV-W, совместно обнаруживаемых в патогенных повреждениях (Mameli et al., 2009). Таким образом, косвенное определение MSRV-ассоциированных заболеваний включает связь с HERV-W элементами.MSRV-ассоциированное заболевание выбрано из группы, включающей рассеянный склероз, шизофрению, клинически изолированный синдром (КИС, с неврологическим симптомом), хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, эпилепсию, псориаз, рак, воспалительный панкреатит и диабет, такой как диабет типа 1 или типа 2, когда он связан с воспалением или нарушением иммунной регуляции и с присутствием продуктов экспрессии MSRV, как определено выше. В конкретной форме осуществления способ лечения MSRV-ассоциированных заболеваний включает введение антитела IgG4 или IgG1 в качестве длительного лечения регулярно повторяющимися инъекциями. В другом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей каждую из последовательностей, представленных SEQ ID No. 13, кодирующей CDR1, SEQ ID No. 14, кодирующейCDR2, SEQ ID No. 15, кодирующей CDR3, SEQ ID No. 16, кодирующей CDR4, SEQ ID No. 17, кодирующей CDR5, и SEQ ID No. 18, кодирующей CDR6. В следующем аспекте нуклеиновая кислота кодирует VH цепь, и более конкретно она представленаSEQ ID No. 10 или 12. Нуклеиново-кислотная последовательность может также кодировать VL цепь, которая представлена последовательностями SEQ ID No. 9 или 11. Любые нуклеиновые кислоты, гибридизующиеся в жестких условиях с нуклеиновыми кислотами,кодирующими по меньшей мере один из пептидов в соответствии с изобретением, также охвачены изобретением. Как используют в данной заявке, термин "жесткие условия" относится к условиям, которые дают возможность гибридизации между последовательностями зонда и нуклеотидной последовательностью, которую нужно определить. Подходящие жесткие условия могут быть определены, например, концентрациями соли или формамида в растворах прегибридизации и гибридизации, или температурой гибридизации, и хорошо известны в данной области техники. В частности, жесткость можно повысить путем снижения концентрации соли, повышения концентрации формамида или повышения температуры гибридизации. Температурный интервал, соответствующий конкретному уровню жесткости, может быть дополнительно сужен путем вычисления отношения пурина к пиримидину интересующей нуклеиновой кислоты и соответствующего регулирования температуры. Вариации вышеописанных интервалов и условий хорошо известны в данной области техники. Настоящее изобретение также относится к химерному гену, содержащему в функциональном сцеплении друг с другом по меньшей мере один промотор, который является функциональным в организме-2 024655 хозяине, нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением и терминаторный элемент, который является функциональным в том же организме-хозяине. Различные элементы, которые может содержать химерный ген, представляют собой, во-первых, элементы, регулирующие транскрипцию, трансляцию и созревание белков, такие как промотор, последовательность, кодирующая сигнальный пептид или транзитный пептид, или терминаторный элемент, составляющий сигнал полиаденилирования, и, во-вторых,полинуклеотид, кодирующий белок. Выражение "в функциональном сцеплении друг с другом" означает,что указанные элементы химерного гена сцеплены друг с другом таким образом, что на функцию одного из этих элементов влияет функция другого. Например, промотор функционально сцеплен с кодирующей последовательностью, когда он способен влиять на экспрессию указанной кодирующей последовательности. Конструирование химерного гена в соответствии с изобретением и сборку различных его элементов можно осуществить, используя методики, хорошо известные специалистам в данной области техники, в частности, описанные в Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan С ed.,New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Выбор регуляторных элементов, составляющих химерный ген, существенно зависит от организма-хозяина, в котором они должны функционировать, и специалисты в данной области техники способны выбрать регуляторные элементы, которые являются функциональными в данном организме-хозяине. Термин "функциональный" подразумевают как означающий способность функционировать в данном организме-хозяине. Промоторы, которые могут содержать химерный ген в соответствии с изобретением, являются либо конститутивными, либо индуцибельными. Например, универсально эффективным промотором, используемым для экспрессии в клетках млекопитающих, является pCMV (промотор цитомегаловируса). В соответствии с изобретением химерный ген может также содержать другие регуляторные последовательности, которые локализованы между промотором и кодирующей последовательностью, такие как транскрипционные активаторы (энхансеры). Настоящее изобретение также относится к клонирующему и/или экспрессионному вектору, содержащему химерный ген в соответствии с изобретением. Вектор в соответствии с изобретением предназначен для использования для трансформации организма-хозяина и экспрессии лиганда в этом организме. Этот вектор может представлять собой плазмиду, космиду, бактериофаг или вирус. Предпочтительно вектор трансформации в соответствии с изобретением представляет собой плазмиду. Как правило, основными качествами этого вектора должна быть способность к поддержанию самого себя и самостоятельной репликации в клетках организма-хозяина, в частности, за счет присутствия точки начала репликации, и к экспрессии в них лиганда. В целях стабильной трансформации организма-хозяина вектор может также интегрировать в геном. Тогда композиция вектора может быть ограничена элементами, требующимися для синтеза лиганда в хозяевах. Выбор такого вектора, а также методики вставки химерного гена в соответствии с изобретением в этот вектор подробно описаны в Sambrook et al. (1989, MolecularCloning: A Laboratory Manual, Nolan С ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) и составляют часть общих знаний специалистов в данной области техники. Предпочтительно вектор, используемый в настоящем изобретении, также содержит, в дополнение к химерному гену в соответствии с изобретением, химерный ген, кодирующий селективный маркер. Этот селективный маркер дает возможность отобрать организмы-хозяева, которые являются эффективно трансформированными, то есть те, которые включили вектор. Можно упомянуть гены, кодирующие легко идентифицируемые ферменты, такие как фермент GUS, или гены, кодирующие пигменты или ферменты, регулирующие продуцирование пигментов в трансформированных клетках. Такие селективные маркерные гены, в частности, описаны в заявках на патенты WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 и WO 97/04103. Настоящее изобретение также относится к трансформированным организмам-хозяевам, содержащим по меньшей мере один химерный ген в соответствии с изобретением, либо интегрированный в их геном, либо переносимый на экстрахромосомном генетическом элементе, например, на плазмиде. Термин "организм-хозяин" подразумевают как означающий любой низший или высший одноклеточный или околоклеточный организм, в который можно вводить химерный ген в соответствии с изобретением с целью продуцирования лиганда в соответствии с изобретением. Предпочтительно организм-хозяин представляет собой клетки СНО (яичника китайского хомячка) или НЕК (почечного эпителия человека). Выражение "трансформированный организм-хозяин" подразумевают как означающий организмхозяин, имеющий включенный в его геном или в экстрахромосомный генетический элемент, например,плазмиду, по меньшей мере один химерный ген в соответствии с изобретением, и который, следовательно, продуцирует лиганд в своих тканях или в культуральной среде. Для получения организмов-хозяев в соответствии с изобретением специалисты в данной области техники могут использовать один из многих известных способов трансформации. Один из этих способов состоит в приведении в контакт клеток или тканей организмов-хозяев, которые нужно трансформировать, с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и с векторами в соответствии с изобретением (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4),503-517). Электропорация является другим способом, который состоит в воздействии на клетки или ткани, которые нужно трансформировать, и векторы по изобретению электрического поля (Andreason and гой способ состоит в прямой инъекции векторов в клетки или ткани путем микроинъекции (Gordon andRuddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). Предпочтительно можно использовать "биолистический" способ. Он состоит в бомбардировке клеток или тканей частицами, на которых адсорбированы векторы по изобретению (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291; U.S. Pat. No. 4945050). Изобретение также охватывает способ получения лиганда, например, ScFv, Fab фрагмента или антител, описанных выше, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, описанной выше, в условиях, которые дают возможность синтеза лиганда, Fab фрагмента или антитела. Лиганд по изобретению характеризуется его связывающими свойствами с антилигандом. В конкретной форме антилиганд по изобретению характеризуется тем, что он состоит из аминокислотной последовательности, определенной SEQ ID No. 20, где предпочтительный выбор представлен SEQ ID No. 32. Способ определения антилиганда в биологическом образце с использованием лиганда в формеScFv, Fab фрагмента или антитела в соответствии с настоящим изобретением также составляет часть настоящего изобретения. Этот способ включает стадии:(а) приведение в контакт образца с лигандом в соответствии с изобретением, ScFv, Fab фрагментом или антителом, как описано выше,(б) обнаружение специфического связывания антилиганда с указанным лигандом, ScFv, Fab фрагментом или антителом в образце. Указанный способ определения может быть выполнен с помощью дополнительной стадии приведения в контакт образца с лигандом, который специфично связывается с антигеном MSRV GAG, кодируемым геном gag MSRV, как описано в Komurian-Pradel et al. Virology, 1999; 260(1), pages 1-9. В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение также относится к набору для иммунологического анализа на определение антилиганда в биологическом образце, включающему лиганд в соответствии с изобретением, ScFV, Fab фрагмент или антитело, как описано выше, и реагенты для обнаружения специфичного связывания антилиганда с вышеописанным лигандом, Fab фрагментом или антителом, а также включающему все реагенты, необходимые для иммунологической реакции. Указанный набор может дополнительно включать лиганд, который специфично связывается с антигеном GAG, как определено выше. В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение также относится к применению указанного набора для иммунологического анализа, как описано выше, при определении MSRVассоциированного заболевания, выбранного из группы, включающей рассеянный склероз, шизофрению,клинически изолированный синдром, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию, эпилепсию, псориаз, рак, воспалительный панкреатит и диабет, и более конкретно диабет типа 1 или диабет типа 2. Биологический образец может представлять собой сыворотку, мочу, слюну, материал биопсии и тому подобное. Схема иммунологических анализов является общепринятой в данной области техники, и протоколы, такие как использование твердых носителей или иммунопреципитация, являются хорошо известными методами. Антитело может быть меченым в целях его обнаружения с использованием ферментативных, флуоресцентных, хемилюминесцентных, радиоактивных или красящих меток. Анализы, которые амплифицируют сигналы от иммунного комплекса, такие как анализы с использованием биотина и авидина или стрептавидина, и иммуноферментные анализы, такие как ELISA или сэндвич-анализы, составляют часть настоящего изобретения. Краткое описание графических материалов Фиг. 1: (А) аминокислотная последовательность VL, (В) аминокислотная последовательность VH,последовательности CDR подчеркнуты. Фиг. 2: структура полноразмерного белка ENV (ENV-T) и фрагмент расщепления внешнего покрытия (ENV 1 или ENV-SU). Фиг. 3: Измерение оптической плотности с помощью колориметрии с субстратом пероксидазы,сравнивающее лиганд, представляющий собой мышиное антитело GNbAC1 (мышиный IgG1 perox), и рекомбинантный фрагмент ScFv с одним лигандом (ScFv VH+VL biot). Концентрация покрывающего антитела и лиганда каждого определения составляла 5 мкг/мкл каждого; разведение конъюгата стрептавидин-пероксидаза составляло 1/2000. Фиг. 4: Измерение оптической плотности с помощью колориметрии с субстратом пероксидазы,сравнивающее лиганд, представляющий собой мышиное антитело GNb AC1, и Fab связывающий фрагмент с одним лигандом. Концентрация лиганда и IgG1 каждого определения составляла 10 мкг/мл +Jackson анти-Fab с пероксидазой или анти-IgG, разведенного при 1/250. Тестировали различные концентрации ENV-T. Фиг. 5: Тест GNbAC1 и химерных антител IgG1 и IgG4 в соответствии с изобретением на серийном разведении антигена ENV (ENV-T). Концентрация антител составляла 1 мг/мл, а разведение второго меченого пероксидазой антитела анти-IgG составляла 1/250. Антитело 2G5E12 представляет собой нереле-4 024655 вантное антитело, которое не связывается с антигеном ENV, используемое в качестве отрицательного контроля. Фиг. 6: Тест GNbAC1 и химерных конструкций IgG1 и IgG4 на постоянной концентрации антигена(ENV-T) на двух партиях лигандов (А) партия 1, (В) партия 2. Концентрация антигена составляла от 1 до 0,0078 исходного мышиного моноклонального антитела (GNbAC1), указанного как muIgG, конструкцийIgG1 или IgG4 человека с лигандом (указанных как huIgG1 и huIgG4), мкг/мл. Разведение второго антитела Jackson IgG против мыши или против человека составляло 1/250. Фиг. 7: GNbAC1, ScFv, химерные конструкции антитела человека IgG1 и IgG4 с лигандом: ингибирование провоспалительной активации МКПК антигеном ENV (ENV SU), которое представлено снижением IL-6. Соотношение между антителом или ScFv и антигеном ENV составляло 25/1. Фиг. 8: Результаты ApoH-ELISA. Сыворотки из европейского многоцентрового исследования по рассеянному склерозу тестировали вслепую в независимой лаборатории. Фиг. 9: Антигенемия MSRV-ENV и GAG у пациентов с шизофренией и в контролях. Использованы антитела 2 А 12 А 5 и 6 А 2 В 2 для ENV и 2G5E12 для GAG. Фиг. 10: Оптическая плотность (OD) ApoH-ELISA на определение антигена MSRV-ENV специфичным моноклональным антителом 6 А 2 В 2. Фиг. 11: Клиническое наблюдение гуманизированных мышей SCID, у которых развивается острое нервное воспаление и демиелинизация (экспериментальный аллергический энцефаломиелит, модель рассеянного склероза на животных): сравнение клинического результата групп, обработанных различными антителами, по сравнению с необработанными группами. Исходное мышиное моноклональное антитело(GNbAC1) указано как muIgG, конструкции IgG1 или IgG4 человека с лигандом указаны как huIgG1 иhuIgG4. Фиг. 12: Кривые выживаемости гуманизированных мышей SCID, у которых развивается острое нервное воспаление и демиелинизация (экспериментальный аллергический энцефаломиелит, модель рассеянного склероза на животных): сравнение клинического результата групп, обработанных различными антителами, по сравнению с необработанными группами. Исходное мышиное моноклональное антитело(GNb AC1) указано как muIgG, конструкции IgG1 или IgG4 человека с лигандом указаны как huIgG1 иhuIgG4. Фиг. 13: Кривые массы тела каждой мыши NOD-SCID, тестируемой в предшествующем эксперименте. Доза белка ENV, инъецированного каждой мыши, указана в скобках. Последняя инъекция белкаENV, эмульгированного в IFA и РТХ (Р 14), указана стрелкой. Мышей обозначили как М 1 - М 6, в соответствии с дозой ENV, которую они получили, что указано после кода между скобками (от 0 до 20 микрограммов) в графической легенде. Прерывание кривых соответствует суткам гибели животного в соответствующей категории. Фиг. 14: Концентрации глюкозы в крови (гликемия) у контрольных (контроль) и ENVинъецированных мышей NOD-SCID (ENV): сравнение между сутками первой инъекции (Р 0) и одной неделей после последней инъекции (Р 30). Гликемия, измеренная на Р 30, выражена в виде процента от измерения на Р 0 (ось Y), в инъецированных контролем и ENV-инъецированных группах (ось X: - контроли и "ENV"). Фиг. 15: Определение CDR тяжелой цепи антитела GNb AC1. 15 А: Аминокислоты, идентифицированные в соответствии с определением по Чозиа, представлены буквами меньшего размера. Аминокислоты, идентифицированные в соответствии с определением Kabat,представлены подчеркнутыми буквами. 15 В: В соответствии с предпочтительным определением, объединяющим оба определения, подчеркнуты исходные участки CDR мыши, которые нужно рассматривать для прививания функционального лиганда на вариабельную область тяжелой цепи антитела IgG4 человека. Фиг. 16: Определение CDR легкой цепи антитела GNbAC1. CDR, идентифицированные в соответствии с определением по Кэбету, подчеркнуты, CDR, идентифицированные в соответствии с определением по Контакту (нестандартным), имеют буквы меньшего размера. Фиг. 17: Связывающая активность химерного антитела GNbAC1 с иммобилизованным белком ENV. Условия описаны в тексте соответствующего примера На оси Y представлено измерение оптической плотности (OD) для каждой точки путем колориметрии и соответствие количеству антитела, связанного с белком-мишенью ENV. На оси X представлена концентрация рекомбинантного белка ENV, использованного для покрытия соответствующих лунок микропланшета, и после отмывки получают широкий количественный спектр соответствующего белка, иммобилизованного на планшете. Фиг. 18: Связывающая активность гуманизированного антитела H2/VK3 с иммобилизованнымENV. Условия описаны в тексте соответствующего примера. На оси Y представлено измерение оптической плотности (OD) для каждой точки путем колориметрии и соответствие количеству антитела, связанного с белком-мишенью ENV. На оси X представлена концентрация рекомбинантного белка ENV,использованного для покрытия соответствующих лунок микропланшета, и после отмывки получают широкий количественный спектр соответствующего белка, иммобилизованного на планшете. Фиг. 19: Связывающая активность гуманизированного антитела Н 4 А/К 3 с иммобилизованнымENV. Условия описаны в тексте соответствующего примера. На оси Y представлено измерение оптической плотности (OD) для каждой точки путем колориметрии и соответствие количеству антитела, связанного с белком-мишенью ENV. На оси X представлена концентрация рекомбинантного белка ENV,использованного для покрытия соответствующих лунок микропланшета, и после отмывки получают широкий количественный спектр соответствующего белка, иммобилизованного на планшете. Фиг. 20: Сравнение связывающей активности гуманизированного антитела Н 2 А/K3 (H2vk3) и химерного антитела (GNbAC1 IgG4) с иммобилизованным ENV. Условия описаны в тексте соответствующего примера. На оси Y представлено измерение оптической плотности (OD) для каждой точки путем колориметрии и соответствие количеству антитела, связанного с белком-мишенью ENV. На оси X представлена концентрация рекомбинантного белка ENV, использованного для покрытия соответствующих лунок микропланшета, и после отмывки получают широкий количественный спектр соответствующего белка, иммобилизованного на планшете. Фиг. 21: Очищенное антитело H2VK3 в невосстанавливающем геле. Условия описаны в тексте соответствующего примера. Слева числа кДа указывают уровни (полосы), на которые стандартные белки с определенной молекулярной массой (кДа) мигрировали в геле, как показано на левой дорожке изображения. Очищенное антитело Н 2 А/К 3 показано (стрелка) в виде одной полосы на средней дорожке изображения, где бычий сывороточный альбумин (стандарт в буферах антитела, в качестве контроля, указанного стрелкой при различной молекулярной массе), показан на правой дорожке изображения. Фиг. 22: Сравнение связывающих активностей очищенного Н 2 А/K3 (очищенного hH2+hVK3) и очищенного химерного антитела (GNbAC1 IgG4) с иммобилизованным ENV (0,5 мкг/мл). На оси X представлена концентрация химерного IgG4 или отобранного гуманизированного антитела в нанограммах/мл. На оси Y представлена оптическая плотность, измеренная путем колориметрии,соответствующая количеству антитела, связанного с иммобилизованным белком ENV постоянной концентрации в анализе. Фиг. 23: Аминокислотные последовательности тяжелой цепи Н 2 и легкой цепи VK3 гуманизированного антитела. Аминокислоты в буквах полужирным шрифтом подстрочного индекса представляют собой мышиные аминокислоты, содержащиеся в каркасной области, на основании их консенсус-положения с последовательностями человеческого антитела, проанализированными в базах данных. Фиг. 24: Провоспалительные цитокины претерпевают сильную повышающую регуляцию стимуляцией клеток-астроцитов белками, родственными HERV-W ENV. Результаты представлены в виде средних значений трех повторов. ENV: MSRV-ENV; Синцитин: HERV-W ENV из копии хромосомы 7q; X: Нерелевантное антитело (контроль изотипа); Мышиное анти-ENV: мышиное антитело GNbAC1; Химерное анти-ENV: Химерный IgG4 человека и GNbAC1; пг/мл: пикограммы на миллилитр. Фиг. 25: Культуры мононуклеарных клеток периферической крови. Результаты представлены в виде средних значений трех повторов. ENV: MSRV-ENV; Синцитин:HERV-W ENV из копии хромосомы 7q; X: Нерелевантное антитело (контроль изотипа); Мышиное антиENV: мышиное антитело GNbAC1; Химерное анти-ENV: Химерный IgG4 человека и GNbAC1; пг/мл: пикограммы на миллилитр. Фиг. 26: Определение гликозилированных белков, родственных HERV-W ENV, человека с тремя формами лиганда GNbAC1 (мышиное, химерное и гуманизированное антитело). А) Определение гликозилированных белков, родственных HERV-W ENV, человека с мышиным антителом GNbAC1. В): Определение гликозилированных белков, родственных HERV-W ENV, человека с химерным антителомENV-T 7 А); Бактериальный поверхностный фрагмент MSRV-ENV (партия ENV-SU 4A); Гликозилированный синцитин человека; Гликозилированный белок MSRV-ENV человека (партия ENV-T P1). Фиг. 27: Нейроповеденческое оценивание крыс, инъецированных интрацеребрально MSRV ENV или контрольным раствором (контроль): Горизонтальная - представленная числом пересеченных линий на оси Y-(А) и вертикальная - представленная подъемами на задние лапы на оси Y- (В) локомоторная активность после воздействия изобретения в нескольких моментах времени после интрацеребральной инъекции крысам (Р 5, Р 6, Р 7, Р 11 и Р 12) в контроле (раствор ФСБ - фосфатно-солевой буфер), ENV-icv (ENV инъецированные интрацеребральные желудочки) и ENV-hipp (гиппокамп). Фиг. 28: Нейроповеденческое оценивание крыс, инъецированных интрацеребрально MSRV ENV или контрольным раствором (контроль): Горизонтальная - представленная числом пересеченных линий на оси Y-(А) и вертикальная - представленная подъемами на задние лапы на оси Y- (В) локомоторная активность после инъекции крысам физиологического раствора в контроле, ENV-icv и ENV-hipp при Р 11. Фиг. 29: Нейроповеденческое оценивание крыс, инъецированных интрацеребрально MSRV ENV или контрольным раствором (контроль): Горизонтальная - представленная числом пересеченных линий на оси Y-(А) и вертикальная - представленная подъемами на задние лапы на оси Y- (В) локомоторная активность после стресса ограничения контрольных, ENV-icv и ENV-hipp крыс при Р 13. Фиг. 30: Нейроповеденческое оценивание крыс, инъецированных интрацеребрально MSRV ENV,показывающее терапевтический эффект лиганда IgG4 GNbAC1:(А) Горизонтальная локомоторная активность, измеренная в открытом поле, после воздействия изобретения при Р 12 и при Р 32 - как показано на оси Х- у контрольных крыс, не обработанных крыс, инъецированных ENV (ENV+), и IgG4-обработанных ENV+ крыс, как указано в легенде(В) Подтверждение терапевтического эффекта лиганда IgG4, наблюдаемого при Р 32 с горизонтальной локомоторной активностью после стресса ограничения; ее измеряли как число пересеченных линий на оси Y в открытом поле после стресса ограничения после повторной системной инъекции белка ENV у контрольных крыс, необработанных крыс ENV+ и IgG4-обработанных крыс ENV+, как указано на оси X. Фиг. 31: Исследование "ENV-положительных" бестимусных мышей с привитой лимфомой, показывающее терапевтический эффект лиганда IgG1 GNbAC1. Селезеночный индекс (ось Y), вычисленный на контрольных и IgG1-обработанных мышах (ось X) через 19 суток после инъекции клеток лимфомы. Селезеночный индекс вычисляли следующим образом:[(масса селезенки/масса тела)100]. Не перекрывающиеся границы ошибок указывают на статистическую значимость. Фиг. 32: Исследование "ENV-положительных" мышей SCID с привитой лимфомой, показывающее терапевтический эффект лиганда IgG1 GNbAC1. Соотношение массы селезенки/тела (ось Y) вычислено на необработанных и IgG1-обработанных мышах SCID через 7 суток после инъекции клеток В-лимфомы. Соотношение массы селезенки/тела вычисляли следующим образом: [(масса селезенки/масса тела)100]. Фиг. 33: Исследование "ENV-положительных" мышей SCID с привитой лимфомой, показывающее терапевтический эффект лиганда IgG1 GNbAC1. Число жизнеспособных и мертвых лимфобластоидных клеток - ось Y- (А), и других лейкоцитов (В) в перитонеальной жидкости, собранной у контрольных и IgG1-обработанных мышей - ось X -, через 7 суток после инъекции клеток лимфомы и через 6 суток после инъекции антитела. Приведенные ниже примеры служат для иллюстрации изобретения без ограничения каким-либо образом настоящего изобретения. Примеры Пример 1: Анализ мышиного специфичного антитела (GNbAC1): идентификация последовательности и структуры молекулярного лиганда, специфичного к белку MSRV ENV и его эквивалентам Гибридому мыши получали после слияния миеломы мыши и клеток селезенки от мышей Balb-C,иммунизированных рекомбинантным белком MSRV, продуцированным в Е. coli и очищенным из клонаMSRV "ENV", как описано в Komurian-Pradel, F., G. Paranhos-Baccala, et al. (1999), Virology 260(1): 1-9). ПЦР амплификацию областей VH и VL из данной гибридомы, продуцирующей IgG1/каппа(GNbAC1), проводили в соответствии с приведенным ниже протоколу. Поли(А+) РНК экстрагировали и очищали из 5107 клеток гибридомы, продуцирующих IgG1/каппа,используя набор для очистки мРНК (Amersham Bioscience) в соответствии с инструкциями изготовителя. Обратную транскрипцию проводили с 800 нг мРНК, используя набор для ОТ-ПЦР (Amersham Bioscience) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК, кодирующую последовательности генов вариабельных областей легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, получали, используя способ быстрой амплификации концов кДНК (RACE), как описано ранее (Ruberti et al., 1994, J. Immunol. Methods 173, 33-39). Прямой праймер представлял собой приведенную ниже последовательность SEQ ID No. 21 (RACEforward), обратные праймеры представляли собой приведенные ниже последовательности: SEQ ID No. 22pCR2.1-TOPO, используя набор для ТА клонирования (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Последовательности клонированных ДНК определяли путем секвенирования на автоматическом секвенаторе ABI310, используя набор Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems). В результате этих ПЦР амплификации с последующими стадиями клонирования и секвенирования получили последовательности VL и VH цепей, которые представлены SEQ ID No. 7 и 8, соответственно,по их аминокислотным последовательностям, выведенным из исходных нуклеотидных последовательностей. Кроме того, анализ этих аминокислотных последовательностей дал возможность идентификации участков, определяющих комплементарность (CDR), вовлеченных в специфичность лиганда (в соответ-7 024655Kabat et al. 1987, 1991, Sequences of proteins of immunological interest; 4th edn. US Govt. Printing Off. No. 165-492), или на основании структуры в соответствии с Chothia (Chothia and Lesk 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342: 877-883). Три последовательности CDR, идентифицированные на аминокислотной последовательности VH(фиг. 1 В), соответствуют SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 и SEQ ID No. 6, и три последовательности CDR,идентифицированные на аминокислотной последовательности VL (фиг. 1 А), соответствуют SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 и SEQ ID No. 3. Эти шесть последовательностей CDR представляют собой коровые "минимальные" последовательности, требующиеся для связывающей специфичности лиганда, и, следовательно, рассмотрены в любой композиции или молекулярной конструкции, сохраняющей активность настоящим идентифицированного специфичного лиганда. Тем не менее, специалистам в данной области техники известно, что несколько аминокислот могут быть заменены аминокислотами с эквивалентными свойствами, сохраняя, таким образом, специфичность исходных последовательностей лиганда и делая его эквивалентным лигандом. Такие вариации известны как возможные в пределах максимального диапазона 10-12%. Пример 2: Пример получения и очистки антигена MSRV ENV для иммунизации мышей с целью получения анти-ENV реактивных спленоцитов для образования специфичных гибридом Источник: плазмида pV14 из вириона MSRV (Perron, Jouvin-Marche et al. 2001), содержащего белковую последовательность, соответствующую номеру доступа базы данных (NCBI-Entrez/Genbank):AF331500.1. На фиг. 2 представлена структура полноразмерного белка ENV (ENV-T, SEQ ID No. 19) и фрагмент поверхностного отщепления (ENV 1 или ENV-SU, SEQ ID No. 24). На фиг. 2 сигнальный пептид начинается с остатка 1 (метионин) и оканчивается остатком 29 (треонин). Способ получения После лигирования кодирующей последовательности ENV-T, предоставленной Geneart (США), в экспрессионной плазмиде, экспрессионном векторе рЕТ-15b, поставляемом Novagen (EMD Chemicals,Inc., Gibbstown, NJ, США), в соответствии с инструкциями изготовителя и трансформации бактерий штамма BL21 Е. coli путем классической пермеабилизации CaCb, как описано в "DNA Isolation and Sequencing" (Essential Techniques Series) by Bruce A. Roe, Judy S. Crabtree and Akbar S. Khan Published byTechniques: An Intensive Laboratory Course (Paperback) by Katharine G. Field (Author), Walt Ream (Author),трансформированные бактерии выращивают в среде LB в присутствии 30 мкг/мл канамицина 37 С до оптической плотности. Затем экспрессию белка индуцировали 1 мМ ИПТГ (изопропилD-1-тиогалактопиранозид), и культивирование продолжали при 37 С в течение 4 ч. Способ экстракции После центрифугирования при 5000 g в течение 20 мин при 4 С бактериальный осадок ресуспендируют в 20 мл/л культуры лизирующего буфера (Трис 20 мМ рН 7,5; NaCl 0,15 М; лейпептин 1 мкг/мл,пепстатин 1 мкг/мл, PMSF 1 мМ, MgCl2 2 мМ, лизоцим 50 мкг/мл). Раствор инкубируют в течение 30 мин при 4 С при встряхивании, а затем обрабатывают ультразвуком на льду/этаноле (4 стадии по 7 мин при 80% 0,5). Добавляют ДНКазу 1 мМ, и раствор инкубируют один час при 4 С при встряхивании, суспензию центрифугируют при 40000 g в течение 30 мин при 4 С. Осадок ресуспендируют в 7,5 мл/л культуры солюбилизирующего буфера (Трис 20 мМ рН 7,5, NaCl 150 мМ, мочевина 2 М, ДСН 1,5%, -меркаптоэтанол 50 мМ). Раствор инкубируют 2 ч при 8 С при встряхивании. Затем суспензию центрифугируют при 40000 g в течение 30 мин при 10 С. Способ очистки Надосадочную жидкость мочевины разводят в 5 раз в буфере Трис 20 мМ рН 7,5, NaCl 150 мМ,ДСН 1,5%. Очистку проводят на 1 мл/л культуры с помощью аффинной хроматографии на колонке Ni Sepharose Fast Flow (Amersham BioScience). Надосадочную жидкость наносят при 2 мл/мин на смолу после уравновешивания буфером Трис 20 мМ, рН 7,5, NaCl 150 мМ, мочевина 500 мМ, ДСН 1,5%, меркаптоэтанол 10 мМ. Элюирование Env осуществляют ступенчато 30 и 50 мМ имидазола. Очистку проводят обессоливающей колонкой (Amersham BioScience, 25 мл смолы). Пул после аффинной хроматографии наносят при 2 мл/мин на смолу после уравновешивания буфером Трис 20 мМ, рН 7,5, NaCl 150 мМ, ДСН (додецилсульфат натрия) 1,5%, ДТТ 10 мМ. Белки элюируют тем же буфером. После этого белки наносят при 1 мл/мин на колонку для гель-фильтрации Superdex 200 (AmershamBioscience), уравновешенную буфером Трис 20 мМ рН 7,5, NaCl 150 мМ, ДСН 1,5%, ДТТ (дитиотреитол) 10 мМ. Белки элюируют тем же буфером. Удаление эндотоксинов Очистку проводят с помощью колонки Acticlean (Amersham Bioscience, 8 мл смолы). Пул наносят на смолу при 1 мл/мин после уравновешивания буфером Трис 20 мМ рН 7,5, NaCl 150 мМ, ДСН 1,5%,ДТТ 10 мМ. Белки элюируют тем же буфером. Контроли качества партии Масс-спектрометрия MALDI-TOFF (времяпролетный спектр с ионизацией лазерной десорбцией из матрицы): нельзя использовать в связи с ДСН.I - Задача Авторы изобретения оценили сродство лиганда к рекомбинантному антилиганду в форме рекомбинантного белка ScFv из клонированных последовательностей VH+VL или в форме Fab фрагмента, выщепленного из исходного мышиного GNbAC1 (содержащего расщепленные цепи VH+VL без функции и структуры мышиного антитела), способом иммунологического анализа (ELISA). Этот лиганд сравнивали с исходным мышиным GNbAC1 и с молекулярными конструкциями, содержащими лиганд, встроенный в константные области цепей IgG1 или IgG4 человека, и пригодные последовательности для их применения в качестве фармакологических векторов.II - Материал и способы а) Клонирование VH и VL Клонирование и нуклеотидное секвенирование вариабельной области GNb AC1 легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей Поли(А+)РНК экстрагировали и очищали из 5107 клеток гибридомы, продуцирующей антителоGNb AC1, используя набор для очистки мРНК (Amersham Bioscience) в соответствии с инструкциями изготовителя. Обратную транскрипцию проводили с 800 нг мРНК, используя набор для ОТ-ПЦР (Amersham Bioscience) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК, кодирующую последовательности генов вариабельной области легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, была получена с использованием способа быстрой амплификации концов кДНК (RACE), как описано ранее (Ruberti et a/, 1994, The use of the RACE method to clone hybridoma cDNA when V region primersfail. J. Immunol. Methods 173, 33-39). Прямой праймер был следующим: RACE прямой (SEQ ID No. 21). Обратные праймеры были следующими: CLAla130 обратный (SEQ ID No. 25) для амплификации VL и СН 1Pro119 обратный (SEQ ID No. 26) для амплификации VH, с буквенным кодом R = A/G, K = G/T, НpCR2.1-TOPO, используя набор для клонирования ТА (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Последовательности клонированных кДНК определяли путем секвенирования на автоматическом секвенаторе ABI310, используя набор Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems).II - 1 а Моноклональные антитела Лиганд, молекулярные конструкции на основе IgG человека или GNbAC1, были получены и очищены в приведенных ниже концентрациях:II - 1b Рекомбинантные белки Оба рекомбинантных белка, полноразмерный MSRV ENV (ENV-T) и фрагмент, представляющий собой поверхностный домен (ENV-SU), были получены фирмой Protein Expert в E.coli и далее очищены,как описано в примере 2. Таблица 2. Концентрация рекомбинантных белковII - 1 с Сэндвич-анализ ELISA Микропланшеты покрывали 100 мкл на лунку иммобилизованного антитела анти-ENV (3C1D5, поставляемого фирмой bioMerieux), разведенного в 50 мМ бикарбонате натрия, рН 9,6. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение ночи при 4 С. Микропланшеты промывали 3 раза 250 мкл на лунку ФСБТ 0,05% (фосфатно-солевого буфера с 0,05% Твин 20; Sigma P7949). После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера. Добавляли 200 мкл ФСБТ 0,05 и 5% молока на лунку. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при КТ при легком встряхивании. Микропланшеты промывали 3 раза 250 мкл на лунку ФСБТ 0,05%. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера. Микропланшеты инкубировали с 100 мкл на лунку антигена ENV (ENV-T или ENV-SU), разведенного в ФСБТ 0,05%. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании. Микропланшеты промывали 3 раза 250 мкл на лунку ФСБТ 0,05%. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера. Добавляли 100 мкл на лунку идентифицирующего антитела (GNbAC1 или рекомбинантного фрагмента ScFv), разведенного в ФСБТ 0,05 и 5% молока. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании. GNbAC1 было мечено пероксидазой, aScFv было мечено биотином фирмой Squarix, Германия. Микропланшеты промывали 4 раза 250 мкл на лунку ФСБТ 0,05%. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера. Добавляли 100 мкл на лунку раствора субстрата (1 таблетка ортофенилендиамина (OPD), разведенная в 10 мл 0,05 М фосфатно-цитратного буфера рН 5) и 10 мкл Н 2 О 2 30% (приготовленного в последний момент). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Добавляли 50 мкл на лунку останавливающего раствора 2 н. H2SO4. Поглощение считывали при 490 нм в пределах 30 мин после остановки реакции.II - 1d Прямой анализ ELISA на микропланшетах, покрытых антигеном ENV (ENV-T или ENV-SU,как описано выше) Микропланшеты покрывали 100 мкл/лунка антигена ENV, разведенного в 50 мМ бикарбонате натрия, рН 9,6. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 2 ч при 37 С при легком встряхивании. Микропланшеты промывали 4 раза 250 мкл/лунка ФСБ (фосфатно-солевого буфера). После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера. Добавляли 100 мкл/лунка идентифицирующего антитела в соответствии с настоящим изобретением(GNbAC1 или его Fab фрагмента), разведенного в ФСБ с БСА 1% (ФСБ с 1% бычьего сывороточного альбумина). Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании. Микропланшеты промывали 4 раза 250 мкл/лунка ФСБ. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера. Добавляли 100 мкл/лунка второго идентифицирующего антитела, разведенного в ФСБ с БСА 1%(анти-IgG Jackson - разведение 1/250; либо IgG против мыши, пероксидаза Jackson 115-035-146, либо IgG против мыши пероксидаза Jackson 115-035-062, в соответствии с первым антителом). Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при легком встряхивании. Микропланшеты промывали 6 раз 250 мкл/лунка ФСБ. После последнего планшеты переворачивали и промокали на фильтровальной бумаге для удаления какого-либо остаточного буфера. Добавляли 100 мкл на лунку раствора субстрата (1 таблетка ортофенилендиамина (OPD), разведенная в 10 мл 0,05 М фосфатно-цитратного буфера рН 5) и 10 мкл Н 2 О 2 30% (приготовленного в последний момент). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Добавляли 50 мкл на лунку останавливающего раствора 2 н. H2SO4. Поглощение считывали при 490 нм в пределах 30 мин после остановки реакции.III - 1 Сэндвич-анализ ELISA: IgG1 мыши (GNbAC1) и ScFv Таблица 3. Концентрации иммобилизованного антитела против идентифицирующего лиганда с пероксидазой или биотином для каждой концентрации антигена или контрольного буфера. Результаты соответствуют измеренным оптическим плотностям Результаты анализа ELISA, проведенного в параллели с ScFv и исходным GNbAC1, представлены при различных условиях на фиг. 3. Концентрация иммобилизованного антитела и идентифицирующего лиганда составляла 5 мкл/мл для каждого; разведение конъюгата стрептавидин-пероксидаза составляло 1/2000. Авторы изобретения анализировали GNbAC1 и рекомбинантное ScFv в качестве идентифицирующих лигандов в сэндвич-анализе ELISA против рекомбинантных белков ENV-SU и ENV-T. Как видно на фиг. 3, при одной и той же концентрации MAb и ScFv способны идентифицировать белки ENV при OD более половины от IgG для ScFv, когда IgG является двухвалентным, a ScFv является одновалентным. Следовательно, относительно числа связывающих сайтов на молекулу, изолированный лиганд дал лучшие результаты, чем полноразмерный мышиный IgG. Таким образом, функции антитела не являются необходимыми, и такие улучшенные результаты для изолированного лиганда были неожиданными.III - 2 Прямой анализ ELISA: GNbAC1 и Fab Таблица 4. Концентрации иммобилизованного антитела против меченых пероксидазой идентифицирующих лигандов (прямое мечение) для каждой концентрации антигена или контрольного буфера. Результаты соответствуют измеренным оптическим плотностям.NA: Нет доступной меры (технические неисправности) Авторы изобретения анализировали IgG1 мыши и его Fab фрагмент в качестве идентифицирующих лигандов в сэндвич-анализе ELISA против рекомбинантного белка ENV-T. Как видно на фиг. 4, при одной и той же концентрации одновалентный Fab идентифицирует белок ENV при оптической плотности,более высокой или равной двухвалентному IgG. Опять же, видно, что изолированный лиганд неожиданно дает лучшие результаты, чем полноразмерный IgG. Таким образом, можно сделать вывод, что повторно функции антитела не являлись необходимыми,и что лиганд сам более эффективен, чем природный IgG мыши. Пример 4: Схема, конструирование и анализ in vitro молекулярный конструкций с константными цепями IgG1 и IgG4 человека и лигандом После подтверждение неожиданно улучшенных характеристик изолированного лиганда, содержащего одновалентные связывающие сайты, либо с природными (Fab), либо с рекомбинантными (scFv) последовательностями VH и VL при идентификации антигена-мишени в иммунологическом анализе,авторы изобретения разработали и сконструировали рекомбинантные последовательности для получения химерных молекул IgG1 или IgG4 человека, содержащих последовательности лиганда (VH+VL). Таким образом, авторы изобретения получили полноразмерные антитела в качестве молекулярных векторов для лиганда и оценивали их с помощью иммунологических анализов в сравнении с исходным мышиным IgG. С целью получения этих рекомбинантных векторов антител со встроенным лигандом клоны были адаптированы для их экспрессии в клетках СНО, и антитела были получены и очищены фирмой Polymmun, Вена, Австрия. Технические условия для получения этих антител с соответствующими векторами суммированы ниже: Получение рекомбинантных клеточных линий СНО GNbAC1IgG1 и GNbAC1IgG4 В данном разделе описан источник генов рекомбинантного моноклонального антитела GNbAC1,экспрессируемого рекомбинантным путем в виде химерного IgG1 и IgG4 человек/мышь, где константные области являются человеческими, а вариабельные области представляют собой исходные последовательности VH и VL, как описано в SEQ ID No. 8 и SEQ ID No. 7 соответственно. Экспрессионные плазмиды Химерные легкие цепи (LC) GNbAC1 IgG1 Базовая экспрессионная плазмида представляет собой имеющуюся в продаже pClneo (Promega), которую использовали на первой стадии для вставки оптимизированной по кодонам (оптимизация использования кодонов в клетках СНО, разработанная фирмой GENEART, также включающая оптимизацию структуры мРНК) каркасной области легкой цепи каппа человека, включающей секвенированную сигнальную последовательность иммуноглобулина каппа, и константной области цепи каппа человека с промежуточными сайтами рестрикции для вставки любой вариабельной области легкой цепи. В соответствии с первичной последовательностью VL (SEQ ID No.7) GENEART AG (Регенсбург, Германия) была синтезирована синтетическая нуклеотидная вставка, включающая сайты рестрикции в 3' конце сигнальной последовательности и 5' сайте области легкой цепи каппа, для вставки оптимизированной по кодонам вариабельной области VL (SEQ ID No.27) в открытый BsiWI и AccIII эукариотический экспрессионный вектор, несущий оптимизированную по кодонам каркасную область легкой цепи каппа человека IgG1L кодоны - под контролем промотора CMV. Кроме того, вектор содержит неомицинфосфотрансферазу для селекции клеток СНО с G418. SEQ ID No.28 указывает нуклеотидную последовательность конструкции, связывающей оптимизированные IgG1 L кодоны и VL кодоны, используемой для экспрессии в клетках СНО. Химерные тяжелые цепи (НС) GNbAC1 IgG1 Клонирующий вектор для создания эукариотического экспрессионного вектора GNbAC1 IgG1 состоит из двух эукариотических экспрессионных кассет с идентичными регуляторными областями. Этот вектор уже содержит оптимизированную по кодонам (оптимизация использования кодонов в клетках СНО, разработанная фирмой GENEART, также включающая оптимизацию структуры мРНК) каркасную область IgG1 человека, включающую сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина и константную область IgG1 человека с промежуточными сайтами рестрикции для вставки любой вариабельной области тяжелой цепи. Информация по аминокислотной последовательности вариабельной области (VH) мышиного моноклонального антитела GNbAC1 представлена в SEQ ID No. 8. В соответствии с этой первичной последовательностью GENEART была синтезирована синтетическая нуклеотидная вставка, включающая сайты рестрикции (в 3' конце сигнальной последовательности и в 5' сайте области СН 1 гамма-цепи, для вставки оптимизированной вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID No.29) -VH кодоны - в открытый поAgel и Nhel эукариотический экспрессионный вектор, несущий оптимизированный по кодонам каркасIgG1 человека под контролем промотора SV40. Кроме того, вектор содержит дигидрофолатредуктазу мыши в качестве второй экспрессионной кассеты для использования в качестве маркера селекции/амплификации в культуре клеток животных. SEQ ID No.30 представляет нуклеотидную последовательность конструкции, связывающей оптимизированные кодоны IgG1H-каркас человека и оптимизированные VH кодоны, используемой для экспрессии в клетках СНО. Химерная тяжелая цепь (НС) GNbAC1 IgG4 Клонирующий вектор для создания эукариотического экспрессионного вектора GNbAC1 IgG4 состоит из двух эукариотических экспрессионных кассет с идентичными регуляторными областями и является таким же, как для конструкции IgG1 Однако поскольку константная область IgG4 человека была недоступна, полноразмерная тяжелая цепь, включающая сигнальную последовательность, вариабельная область тяжелой цепи (VH) мышиногоGNbAC1 и константная область IgG4 человека были синтезированы фирмой GENEART.SEQ ID No. 31 показывает нуклеотидную последовательность кодирующей области химерной оптимизированной тяжелой цепи GNbAC1 IgG4 (IgG4H кодоны). Затем вставку встраивали в открытый поSEQ ID No. 32, которая связывает оптимизированные кодоны IgG4H и оптимизированные кодоны VH,используемую для экспрессии в клетках СНО. Все плазмиды были клонированы в GENEART, а затем трансформированы в штамм E.coli ТОР 10. Рекомбинантные бактерии размножали в 50 мл среды LB/Amp, и плазмиды выделяли с помощью набораPromega PureYield Plasmid Midiprep Systems. Выход и чистоту плазмид контролировали фотометрическим путем и по отношению оптической плотности при 260 и 280 нм, определенному по меньшей мере как 1,5. Получение рекомбинантных клеточных линий СНО GNbAC1IgG1 и GNbAC1IgG4 Методика трансфекции Клетки яичника китайского хомячка с дефицитом по дигидрофолатредуктазе (называемые СНОdhfr-, ATCC no. CRL 9096) были выбраны в качестве родительской клеточной линии для создания конечной экспрессионной линии. Эти клетки, имеющие происхождение из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), размножали в культивационной среде, состоящей из DMEM с добавлением 4 мМ Lглутамина, 0,1 мМ гипоксантина, 0,016 мМ тимидина (НТ), 0,25 г/л соевого пептона, 0,1% Pluronic F-68 и свободной от белка добавки (Polymun Scientific) при отношении деления 1:6 дважды в неделю. Для трансфекции использовали 5106 клеток, промытых один раз базовой средой и ресуспендированных в 10 мл полной среды. Полиплексы образовали путем инкубации 900 мкл полиэтиленимина (1 мг/мл ПЭИ линейного, MW: 25000, Polysciences Inc.) с 12 мкг плазмиды НС и 12 мкг плазмиды LC в суммарном объеме 2 мл в течение 30 мин при КТ. Взаимодействие полиплексов с клетками СНО в 12 мл продолжалось в течение 4 ч, после чего их центрифугировали при 170 g, отбрасывали надосадочную жидкость и ресуспендировали клетки в культивационной среде. Через 24 полную среду заменяли 50 мл селективной среды, состоящей из DMEM с добавлением 4 мМ L-глутамина, 0,25 г/л соевого пептона,0,1% Pluronic F-68, свободной от белка добавки (Polymun Scientific) и 0,5 мкг/мл G418. Высевали 100 мкл клеточной суспензии на лунку в пять 96-луночных планшетов. В результате четырех экспериментов по трансфекции (конструкцию "IgG1H кодоны + VH кодоны" котрансфицировали с конструкцией "IgG1 L кодоны + VL кодоны" для химерного GNbAC1-IgG1; конструкцию "IgG4H кодоны + VH кодоны" котрансфицировали с конструкцией "IgG1 L кодоны + VL кодоны" для химерного GNbAC1-IgG4) получили суммарно 2096-луночных планшетов (соответствующих 1920 лункам) на подтип IgG. После 10-14 суток в образовавшиеся клоны добавляли 100 мкл среды амплификации, состоящей из 0,048 мкМ МТХ (метотрексата) в селективной среде. К растущим клонам снова добавляли еще 100 мкл среды амплификации, содержащей 0,048 мкМ МТХ, а затем анализировали в двойном сэндвич-анализеELISA. В ELISA использовали поликлональную сыворотку, специфичную против цепи гамма человека для иммобилизации и HRP-конъюгированное поликлональное антитело против цепи каппа человека для идентификации. Отобранные клоны с высоким продуцированием адаптировали к 0,19 мкМ МТХ в селективной среде. В табл. 5 описана селекция на лучшие продуценты GNbAC1 IgG1 и GNbAC1 IgG4 при 0,096 и 0,19 мкМ МТХ в колбах Ру Т 25 и роллерных сосудах. В случае GNbAC1IgG1 авторы изобретения выбрали клон 6 В 6 и в случае GNbAC1IgG4 авторы изобретения выбрали клон 7 С 1. В случае GNbAC1IgG1 провели криоконсервацию трех клонов, GNbAC1IgG16B6, GNb AC1IgG18H2 и GNbAC1IgG118A8, и в случае GNbAC1-IgG4 провели криоконсервацию двух клонов, GNb AC1IgG46C1 и GNb AC1IgG47C1. Лучший клон был субклонирован способом ограничивающих разведений, например, описанным в "Molecular Cloning: A Laboratory ManualSpring Harbour Laboratory Books". Субклонирование лучших продуцирующих трансфектантовGNbAC1IgG47C1 Субклонирование осуществляли в 96-луночных планшетах с 90, 30 и 10 клетками на лунку в среде амплификации, в случае GNbAC1IgG16B6: с 0,19 мкМ метотрексатом (Sigma, MTX) и 50% надосадочной жидкостью культуры GNbAC1IgG16B6, фильтрованной через 0,2 мкм; в случаеGNbAC1IgG47C1: с 0,19 мкМ МТХ и 50% надосадочной жидкостью культуры GNbAC1IgG47C1,фильтрованной через 0,2 мкм. Растущие лунки адаптировали к 0,38 мкМ МТХ в 96-луночных планшетах,анализировали с помощью ELISA и размножали в колбах Т 25 для дальнейшего скрининга и адаптации к 0,77 мкМ МТХ. В табл. 6 описана селекция на лучшие субклоны-продуценты GNbAC1 IgG16B6 и GNb АС 1GNbAC1IgG47C1 клон GNbAC1IgG47C115B7. Эти два клона были выбраны для дальнейшего развития клеточной линии. Провели криоконсервацию двух клоновIgG47C115B7. Субклонирование лучших субклонов-продуцентов GNbAC1-IgG16B610E4 и GNbAC1IgG47C115B7 Процедуру конечного субклонирования снова проводили в 96 в 96-луночных планшетах с 90, 30 и 10 клетками на лунку в среде амплификации, в случае GNbAC1IgG16B610E4 с 0,77 мкМ МТХ и 50% надосадочной жидкостью культуры GNbAC1IgG16B610E4, фильтрованной через 0,2 мкм, в случаеGNbAC1IgG47C115B7, фильтрованной через 0,2 мкм. Растущие лунки анализировали с помощьюELISA, лучшие продуценты размножали в колбах Т 25 и роллерных колбах (Sp125) для дальнейшего скрининга. В табл. 7 описана селекция на лучшие продуценты субклонов GNbAC1 IgG16B610E4 и GNbAC1IgG47C115B7 при 0,77 мкМ МТХ в колбах Ру Т 25 и роллерных колбах. В случае GNbAC1IgG1 проводили криоконсервацию двух клонов GNbAC1IgG16B610E418C7 и GNbAC1IgG16B610E418D12, в случае GNbAC1IgG4 двух клонов GNbAC1IgG47C115B73E4 и GNbAC1IgG47C115B75G10 после роллерных культур. Таблица 5. Лунки, отобранные после трансфекции и адаптации к различным уровням МТХ Таблица 6. Отобранные субклоны после первого субклонирования при 0,77 мкМ МТХ Таблица 7. Отобранные субклоны после второго (конечного) субклонирования при 0,77 мкМ МТХ Таким образом, были получены рекомбинантные векторы антитела IgG1 и IgG4 со встроенным лигандом, соответствующим шести последовательностям CDR, как описано в примере 1. Эти векторы, со- 15024655 держащие шесть CDR, анализировали в следующем примере, чтобы определить положительное и отрицательное влияние векторов и, таким образом, предложить селекцию и/или адекватное применение для каждого из них. Пример 5: Исследование лиганда и его химерных конструкций на основе IgG1 и IgG4 против исходного мышиного IgG1: сродство in vitro Материалы и методы были такими же, как описано в примерах 3 и 4. 5a ELISA с различными концентрациями полноразмерного белка MSRV-ENV (ENV-T) Таблица 8. Оптические плотности (OD) измеряли с помощью ELISA с различными лигандами (1 микрограмм) или нерелевантным контролем (2G5E12) на различных концентрациях (левая колонка, в микрограммах) антилиганда (ENV-T), нанесенного на лунки микротитрационного планшета. Связывание выявляют меченым пероксидазой антителом анти-Ig (1/250; Jackson-USA) и взаимодействием с субстратом пероксидазы. Среднее значение всех OD из нерелевантного контроля составляет 0,1004, и их стандартное отклонение (SD) составляет 0,0205, следовательно, можно определить пороговое значение, ниже которого все значения являются неспецифическими при 99% доверительном интервале: среднее+3SD = 0,1618. Все представленные значения с конструкциями GNbAC1, следовательно, являются значимыми для специфичного связывания с белком-мишенью. Авторы изобретения анализировали антитело GNbAC1 и химерные варианты IgG1 и IgG4 в качестве идентифицирующих антител в сэндвич-анализе ELISA против рекомбинантного белка ENV. Как видно на фиг. 5 и в табл. 8, при одинаковой концентрации мышиное и химерные MAb способны идентифицировать присутствующие концентрации белков ENV при сходной кинетике. Специфичность и относительное сродство новых конструкций (лиганд в человеческом векторе), таким образом, сохраняется и обе конструкции, как с IgG1, так и IgG4 человека, с лигандом обеспечили человеческие химерные антитела,способные идентифицировать пикограммы рекомбинантного белка ENV. Это неожиданно хорошо и подтверждает оптимизацию, достигнутую на протяжении всех условий схемы, конструирования и экспрессии. Это также подтверждает селекцию стабильной и прочной структуры лиганда, как описано в примере 1. Кроме того, данный опыт обеспечивает средства идентификации молекул, эквивалентных лиганду,посредством значимости их связывания с исходным антилигандом (ENV), как доказано здесь с лигандом(GNbAC1) против нерелевантного "несвязывающего" лиганда (2G5E12). Антиген Env-T наносят на лунки микротитрационного планшета ELISA с серийными разведениями,находящимися в диапазоне от 1 мкг/мл до примерно 0,01 мкг/мл. Стандартный лиганд (GNbAC1) и нерелевантный лиганд (2G5E12) тестируют при 1 мкг/мл и выявляют вторым антителом (здесь вторым антителом анти-IgG, меченым пероксидазой, от Jackson Ltd,США, разведенным 1/250, на которое здесь далее ссылаются как на IgG (H+L) против мыши Jackson илиIgG против человека Jackson, США). Кривая со стандартным лигандом показывает насыщение сигнала (оптическую плотность, более высокую или равную 3) при самой высокой концентрации ENV и прогрессивно снижается до оптической плотности примерно 1,0-0,5, что, таким образом, свидетельствует о кривой доза-ответ, типичной для специфической связывающей активности (выше вычисленного статистического порогового значения 0,1618; см. табл. 8). Параллельно нерелевантная молекула (2G5E12) не показывает кривую доза-ответ(средне пологая кривая) и колеблется между оптической плотностью 0,1 и 0,05 при любой концентрацииENV, ниже вычисленного статистического порогового значения 0,1618 (табл. 8). Таким образом, о любой молекуле, эквивалентной лиганду, может, таким образом, свидетельствовать либо 1) Существование кривой доза-ответ в данном тесте, в условиях настоящего примера, как показано в параграфе 5 а, и 2) Отсутствие пологой кривой, колеблющейся ниже статистического вычисленного порога (среднее+ три стандартных отклонения) значений оптической плотности, полученных с нерелевантным антителом (см. 2G5E12 в табл. 8), по сравнению со значениями выше порога, полученными со стандартным либо 3) Существование кривой доза-ответ в тесте, который описан ниже, с серийными разведениями лиганда и фиксированной концентрацией антилиганда, в параграфе 5b (табл. 9), и 4) Отсутствие пологой кривой, колеблющейся ниже статистического вычисленного порога (среднее+ три стандартных отклонения) значений оптической плотности, полученных с нерелевантным антителом (см. 2G5E12 в табл. 9), по сравнению со значениями выше порога, полученными с соответствующим стандартом GNbAC1 при концентрации 0,01 микрограмма/мл, в тех же условиях, как описано в параграфе 5b (см. табл. 9). 5b ELISA с различными концентрациями MAb Таблица 9. Оптические плотности, измеренные с помощью ELISA с серийными разведениями лиганда и фиксированной концентрацией антилиганда (ENV-T; 0,01 микрограмма/мл), нанесенного на лунки микротитрационного планшета. Связывание выявляют меченым пероксидазой антителом анти-IgG При идентификации второго антитела против мыши среднее значение всех OD из нерелевантного контроля составляет 0,0735, и их стандартное отклонение (SD) составляет 0,0057, следовательно, можно определить пороговое значение, ниже которого все значения являются неспецифическими при 99% доверительном интервале: среднее + 3SD = 0,0907. Все представленные значения с соответствующим мышиным GNbAC1, таким образом, являются значимыми для специфического связывания белка-мишени. При идентификации второго антитела против человека среднее значение всех OD из нерелевантного контроля составляет 0,0513, и их стандартное отклонение (SD) составляет 0,0094, следовательно, можно определить пороговое значение, ниже которого все значения являются неспецифическими при 99% доверительном интервале: среднее + 3SD = 0,0796. Все представленные значения с химерными конструкциями GNbAC1, таким образом, являются значимыми для специфического связывания белка-мишени. На фиг. 6 видно, что как мышиное антитело IgG GNbAC1, так и химерные варианты IgG1 и IgG4 эффективны в качестве идентифицирующих антител в сэндвич-анализе ELISA против рекомбинантного белка ENV-T в столь низких количествах, как несколько нанограммов очищенного IgG для определения менее чем нескольких нанограммов белка ENV. Кроме того, поскольку IgG против человека или мыши перекрестно не реагирует ни с исходным мышиным антителом, ни с химерными конструкциями с каркасами IgG1 или IgG4 человека, встроенный лиганд (VH+VL) не создает какую-либо нежелательную модификацию и не определяется в человеческих конструкциях в данных условиях. 5 с Сродство GNbAC1 к ENV-T Таблица 10. Определение связывающего сродства лиганда, встроенного в векторы антитела IgG4 и IgG1 5d Изоэлектрическая точка GNbAC1 Изоэлектрическую точку GNbAC1 определяли в соответствии с методами, описанными в Fractionation of complex protein mixtures by liquid-phase isoelectric focusing. Hey J., Posch A., Cohen A., Liu N., Harbers A. Methods Mol Biol. 2008; 424: 225-39. Изоэлектрическая точка конструкций IgG1 (pi 8,3) и IgG4 (pi 7,53) весьма полезна и будет определять стабильность и условия хранения для терапевтического применения. Нейтральная pi IgG4, таким образом, лучше для приготовления препарата терапевтического MAb, который можно применять в качестве длительного лечения с регулярно повторяющимися инъекциями. Таким образом, IgG4 с этой точки зрения является предпочтительной конструкцией. Пример 6: Исследование лиганда и его конструкций на основе IgG1 и IgG4 человека по сравнению сGNbAC1: ингибиторная активность в отношении провоспалительных цитокинов в культурах мононукле- 17024655 арных клеток периферической крови (МКПК) человека Материалы и методы Культуральная среда МКПК культивировали в RPMI Glutamax (Gibco) + 10% ФБС (Biowest S1810 South America) + 1% неэссенциальные аминокислоты + 1% пируват + 1% пенициллин - стрептомицин, при 37 С в атмосфере 6,5% СО 2. Приготовление препарата МКПК из лейкоцитарных пленок Лейкоцитарные пленки получены от HUG. Кровь, разведенную ФСБ-ФБС 2% (4 мл + 31 мл), осторожно наслаивают на 15 мл фиколла и центрифугируют при 2850 об/мин (1650 д)/20 мин/комнатная температура/без перерыва. Затем МКПК осторожно собирают и промывают 3 раза ФСБ-SVF 2% и центрифугируют при 1500 об/мин/10 мин. Затем клетки считают и замораживают в SVF 90% + ДМСО 10%. Приготовление препарата МКПК из замороженных клеток МКПК, хранящиеся при -80 С, оттаивают при 37 С, промывают 3 раза средой и центрифугируют при 1500 об/мин/10 мин. Затем клетки считают и разводят до концентрации обычно 1106 клеток/мл. Тест на ингибирование Смесь ENV + MAb готовят перед тем, как оттаивают МКПК. MAb (выбранное отношение с ENV) +ENV (выбранная концентрация) смешивают в каждой лунке 48-луночных планшетов в 100 мкл среды и инкубируют 1 ч при +4 С. Затем МКПК добавляют в каждую лунку для получения конечной концентрации 1106 клеток/мл(конечный объем на лунку 0,5 мл или 1 мл). Клетки инкубируют в течение 24, 48 или 72 ч при 37 С, 5% СО 2. Надосадочные жидкости собирают центрифугированием при 1400 об/мин/10 мин/КТ и хранят при 20 С.II - 2d Доза цитокинов Цитокины дозируют из наборов ДК Pharmingen ELISA для IL-6, IL-12 р 40, TNF- и IFN-. Следовали протоколу поставщика. Таблица 11. Доза цитокинов в различных надосадочных жидкостях культур МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови) с различными лигандами или без лигандов Авторы изобретения протестировали с помощью клеточных тестов МКПК потенциал антител по изобретению или ScFv в отношении ингибирования взаимодействия между белком ENV и клетками (посредством рецептора TLR4) и, следовательно, продуцирования провоспалительных цитокинов, таких какIL-6 (врожденный иммунитет) и IFN- (иммунитет, опосредованный Т-лимфоцитами). различные молекулы тестировали при одинаковом соотношении (моль/моль) с белком (25/1), так чтобы можно было сравнить их характеристики. Как видно на фиг. 7 и в табл. 11, все молекулы лиганда, как мышиного, так и рекомбинантного происхождения (scFv или конструкции IgG1 и IgG4 с лигандом) обладают ингибиторными свойствами и сохраняют их, что представлено на основании снижения провоспалительных цитокинов (IL-6), продуцируемых МКПК. Тем не менее, видно, что GNbAC1 и рекомбинантный человеческий IgG4 со встроенным лигандом эффективны при активации лимфоцитов (где оба снижают продуцирование интерферона-гамма), тогда как scFV (здесь, наиболее вероятно, в связи с одновалентностью) и конструкция на основе IgG1 человека были значительно менее эффективны в отношении ингибирования интерферона-гамма. Здесь тот факт,что область Fc IgG1 человека обладает проактивными эффектами в отношении иммунных клеток человека, ясно показывает, что это свойство может уравновешивать ингибиторные эффекты лиганда на данный тип активации лимфоцитов ENV. С тем же лигандом в векторе на основе IgG4 человека (который не является иммунологически проактивным) проявляется ингибиторный эффект двухвалентного лиганда,как в исходном мышином IgG. По этой причине, как и для описанного в разделе 5d примера, IgG4 был бы предпочтительной конструкцией, когда иммунных функций антител следует избегать. Как выявлено в данном случае, функции антитела не только являются необходимыми для ингибиторного эффекта (при условии, что продуцируется двухвалентный лиганд, поскольку моновалентный scFV обладает слабой эффективностью), но также выявлены как вредные для ингибиторного эффекта лиганда. Что касается эффекта на продуцирование IL-6 (из моноцитов/макрофагов и, возможно, также Влимфоцитов), IgG1 и IgG4 выявлены как эквивалентные и проявляют хорошее ингибирование, которое отличается от того, которое наблюдали с интерфероном-гамма. Интересно, что одновалентный scFv проявляет меньшее, но значимое ингибирование данного цитокина "врожденного иммунитета". Таким образом, некоторые иммунные активации хорошо ингибируются обоими векторами, на основе IgG1 и IgG4 человека, с лигандом, но IgG4 проявляет уникальное ингибирование как врожденного иммунитета (результаты IL-6), так и приобретенного иммунитета (результаты IFN-гамма) клеток из МКПК человека. Интересно, что вектор IgG1, тем не менее, обеспечивает более сильное ингибирование провоспалительных цитокинов врожденного иммунитета (представленных здесь примером IL-6) и запускает некоторые клоны Т-клеток (что отражено дозами интерферона-гамма), что может проявлять пользу в некоторых механизмах противовирусной защиты. Таким образом, авторы изобретения подтвердили высокое сродство и биологическую активность лиганда в форме фармацевтической доставки, состоящей из векторов антитела человека, с общим сродством связывания и специфичностями, но различающимися иммунными эффектами в зависимости от их изотипа. Пример 7: Молекулярная идентификация связывающего сайта лиганда на белке-мишени ENV (связывающей последовательности антилиганда) Эпитопное картирование исходного мышиного IgG1/каппа (GNbAC1) получено Pepscan BV., Нидерланды. На основании этих результатов идентифицирована аминокислотная последовательность связывающего сайта лиганда, которая должна быть включена в последовательность, представленную в SEQ ID No. 20. Включенный в вышеуказанную последовательность, лучший эпитоп-мишень, состоит в С-концевом участке отщепленного домена SU (ENV1) в полноразмерном белке ENV (ENV-T) и более конкретно соответствует приведенной ниже выбранной аминокислотной последовательности, представленной в SEQID No. 32. Эта последовательность антилиганда (и его выбранная последовательность) не исключительно, но также содержится внутри первичной аминокислотной последовательности белка оболочки MSRV (ENV),как описано в примере 2. Тем не менее, специалистам в данной области техники известно, что аминокислоты могут быть замещены их функциональным эквивалентом и, в данном случае, могут дать подобный связывающий сайт с другой последовательностью. Кроме того, описаны мимеотопы "MSRV ENV", которые могут эффективно связываться со специфическими антителами (Jolivet-Reynaud, С., Н. Perron, et al. 1999, "Specificitiesof multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes", Clin Immunol 93; 3: 283-93). Пример 8: Доказательства присутствия белка-мишени MSRV-ENV у пациентов с MSRVассоциированными заболеваниями: Примеры ассоциированных заболеваний или патологических синдромов при рассеянном склерозе, клинически изолированном (неврологическом) синдроме (КИС), хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатии (ХВДП), шизофрении и эпилепсии 8 а Рассеянный склероз, клинически изолированные синдромы и полиневропатии Материалы и методы Иммунологическая доза антигенемии ENV Предварительный сбор сыворотки Исследование было одобрено этическими комитетами Университетских клиник Кретея и Гренобля,Франция. Были включены неврологические пациенты из обоих центров. Все пациенты давали письменное информированное согласие перед включением. Здоровых доноров крови рекрутировали из центров переливания крови Гренобля и Монпелье. Неневрологические контроли были получены из Гренобля. Клинические данные по пациентам указаны в Результатах. Аликвоты образцов сыворотки от пациентов сPC и здоровых контролей кодировали и посылали в независимую лабораторию для слепого тестирования АроН ELISA в условиях колориметрического считывания. Европейский многоцентровой сбор сыворотки: Исследование было одобрено этическими комитетами медицинского факультета университета Вюрцбурга в Германии, университета Сассари, клиники Дона Карло Ньокки Милана в Италии, клиники университета Марселя во Франции и университета Памплона в Испании. Было включено 74 пациентов с определенным PC в соответствии с критерием Мак-Дональда (McDonald, Compston et al., 2001) и 14 с клинически изолированными синдромами (КИС). Соответствующие клинические данные и данные по лечению представлены ниже в табл. 12 (McDonald, Compston et al. 2001). В случае рецидива PC образцы крови брали до начала лечения стероидами. Аликвоты образцов сыворотки от пациентов с PC и здоровых контролей кодировали и посылали в независимую лабораторию для слепого тестирования АроНELISA в условиях колориметрического считывания. Сбор образцов: Собирали одну пробирку крови (7 мл сухая пробирка BD). Образцы обрабатывали в пределах 2 ч после сбора. После свертывания крови их центрифугировали в течение 10 мин при 2800 g при 14 С. Затем сыворотку собирали и делили на аликвоты по 250 мкл в эппендорфовские пробирки. Аликвоты хранили замороженными при -20 С. Иммунологический анализ ApoH-ELISA Колориметрический способ: На микротитрационные планшеты, покрытые АроН (АРОН Technologies, Монпелье, Франция), наносили образцы сывороток, разведенные в Трис-HCl 50 мМ рН 7,6; планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при 37 С; затем планшеты промывали четыре раза ФСБ; очищенное мышиное mAb анти-ENV разводили ФСБ, содержащим 5% БСА, до концентрации 10 мкг/мл и добавляли. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 С, а затем промывали четыре раза ФСБ. Добавляли меченый пероксидазой IgG козы против мыши (H+L; Sigma), разведенный 1:5000 в ФСБ, содержащем 5% БСА, планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 С, а затем промывали шесть раз ФСБ. Добавляли раствор субстрата OPD, и планшеты инкубировали в течение 30 мин в темноте. Цветовую реакцию останавливали 2 н. H2SO4. Поглощение считывали при 490 нм с помощью считывающего устройства Tecan. Статистическое пороговое значение (C.O., cut-off) данного теста определяли на серии отрицательных сывороток от 50 здоровых доноров крови (ДК) с получением результата от трех повторов от индивидуальных сывороток в виде оптической плотности (OD). C.O., таким образом, вычисляли на основании статистически значимой серии отрицательных контролей в виде их среднего значения плюс три стандартных отклонения (A+3SD; значимость положительности р 0,01) и подтверждали экспериментально на панели стандартов положительных и отрицательных образцов. Доверительный интервал для определения положительности теста, таким образом, представляет собой 99,9%. Люминометрический способ: Образцы, разведенные в Трис-HCl 50 мМ рН 7,6, наносили на покрытые АроН микротитрационные планшеты (АРОН Technologies, Монпелье, Франция). Микропланшеты инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37 С, промывали четыре раза ФСБ. Добавляли очищенное мышиное mAb анти-ENV (1 мкг/мл в ФСБ-БСА 5%). Микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 С и промывали четыре раза ФСБ. Добавляли меченое пероксидазой антитело козы против мыши (Jackson,разведенное 1/2000 в ФСБ-БСА 5%), микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 С и промывали шесть раз ФСБ. Добавляли раствор субстрата SuperSignal femto (Pierce) и считывали с помощью считывающего устройства TECAN. Моноклональные антитела Моноклональные антитела (Mab) были разработаны фирмой bioMerieux (Marcy I'Etoile, Франция) после иммунизации мышей рекомбинантным белком оболочки MSRV (ENV), экспрессируемым с клонированных участков, амплифицированных с помощью ОТ-ПЦР из очищенных внеклеточных вирионовMSRV. После тестирования мышиных сывороток с помощью ELISA клетки селезенки подвергали слиянию с несекретирующей клеточной линией миеломы Sp2/0-Ag14 с целью получения гибридом. Специфические клоны были отобраны путем скрининга на их продуцирование антител в таком же анализеELISA. Таким образом, было выделено примерно 40 Mab, специфичных к белку MSRV/ENV, и примерно 28 Mab было подвергнуто дальнейшей селекции, и оценена их связывающая специфичность. Используя метод ApoH-ELISA на сыворотках человека, лучшим связывающим Mab было 2 А 12 А 5. Результаты Иммунологическая доза белка MSRV ENV в сыворотке Авторы изобретения разработали оригинальный иммунологический анализ на микропланшетах, в котором фаза иммобилизации основана на особенно эффективных свойствах аполипопротеина-Н (АроН) при связывании с белками микроорганизмов при ассоциации со структурами оболочки и/или липидами(Stefas et al., 1997; Stefas et al., 2001). АроН дает возможность первого взаимодействия с низким сродством с аминокислотными участками самого белка, которое затем активирует аллостерическое взаимодействие, вызывающее ковалентно-подобное связывание С-концевого домена АроН с липидо- или мембраносвязывающими доменами. Таким образом, белки оболочки вируса или частицы вирионов могут быть обратимо иммобилизованы, и после стадий отмывки, удаляющих исходный образец, специфические антигены могут быть определены путем добавления моноклонального антитела, мишенью которого является все еще доступный эпитоп после стадии иммобилизации "АроН". Для технической оценки теста как вирион MSRV, осажденный и очищенный из надосадочных жидкостей культуры В-клеток PC в соответствии с ранее описанными условиями (Perron et al., 1997a; Perronet al., 1997b), так и очищенный рекомбинантный белок оболочки MSRV (ENV) тестировали с серийными разведениями и различными Mab анти-MSRV ENV. Сравнение проводили с хорошо известными вирусами, такими как вирус гепатита С (HCV) и вирус гепатита В (HBV), определяемыми соответствующим специфическим Mab. После дополнительных испытаний с реальными образцами сывороток было показано, что Mab 2A12A5 наиболее эффективно для диагностического иммунологического определения после стадии иммобилизации АроН, и оно было сохранено для последующих исследований. Первое слепое предварительное исследование: Рассеянный склероз (PC) и хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП). Для предварительной оценки данного иммунологического анализа в различных группах пациентов с различными заболеваниями авторы изобретения сначала анализировали сыворотки от 29 пациентов сPC, от 28 пациентов с другими неврологическими заболеваниями, от 60 пациентов с не неврологическими заболеваниями и от 50 здоровых доноров крови (всего 167 образцов сыворотки). Результаты представлены в табл. 12 для PC и других неврологических заболеваний. Таблица 12. Тест на иммунологическое определение ENV для идентификации MSRV-ассоциированных заболеваний или MSRV-ассоциированных подгрупп пациентов. Результаты АРО-Н ELISA на первой серии сывороток - пациенты с рассеянным склерозом (PC), пациенты с другими неврологическими заболеваниями (ДНЗ), пациенты с хронической воспалительной демиелинизирующей полиневропатией (ХВДП) и здоровые доноры крови (ДК). Тесты ELISA со стадией иммобилизации АРО-Н (Stefas et al,1997) проводили с моноклональным IgG (2A12A5 для MSRV ENV), полученным и подвергнутым скринингу на специфичность фирмой bioMerieux, Marcy L'Etoile, Франция. N= число пациентов, нз = не зарегистрирован, OD = оптическая плотность, П = прогрессирующая, РП = ремитирующая прогрессирующая,ВР = возвратно-ремиттирующая. СО= пороговое значение, определяющее предельное значение, ниже которого результат теста является отрицательным. Оно определено из серии здоровых доноров крови,как показано внизу, с их средним значением плюс его трехкратное стандартное отклонение (99% доверительный интервал). Отношение OD/CO = OD, деленная на СО эксперимента, позволяющая различить положительные результаты (1) и отрицательные (1). Результаты, равные 1, считают "неопределенными", и соответствующие образцы или новые образцы от тех же индивидуумов должны быть протестированы снова в отдельном эксперименте для определения. Среднее значение (среднее) и стандартное отклонение - s.d. - всех оптических плотностей определено в каждой группе и подгруппе субъектов, как указано ниже: ДК (N=50): среднее значение 0,53, s.d. 0,16.PC (N=29): среднее значение положительных PC (N=23) 1,27 s.d. 0,22, среднее отрицательных PC(N=6) 0,90 s.d. 0,25, среднее значение всех PC 1,20 s.d. 0,25. ДНЗ (N=20): среднее значение отрицательных ДНЗ 0,88 s.d. 0,10. ХВДП (N=8): среднее значение положительных ХВДП (N=5) 1,12 s.d. 0,09, среднее отрицательных ХВДП (N=3) 0,9 s.d. 0,03, среднее всех ХВДП 1,04 s.d. 0,13. Авторы изобретения проанализировали сыворотки от 29 пациентов PC из Франции (19 из Кретея,10 из Гренобля) в качестве первичной оценки данного иммунологического анализа в различных группах пациентов с различными заболеваниями. Результаты у пациентов PC представлены в табл. 12 а. Десять здоровых доноров крови использовали в качестве отрицательных стандартов для определения предела положительности (пороговое значение или СО, пороговое значение, ниже которого специфический сигнал не определяется). В соответствии со статистическим пороговым значением этих серий 23 пациентаPC имеют значимо положительную антигенемию MSRV-ENV (средняя OD = 0,88), тогда как 6 можно считать отрицательными, хотя скорее близкими к порогу (средняя OD "отрицательных PC" = 0,62). Интересно, что отрицательные случаи PC имели более длительную продолжительность вероятнее доброкачественных форм (24, 25, 28) или следовали протоколу лечения циклофосфамидом. Параллельно авторы изобретения проанализировали сыворотки от 28 пациентов с другими неврологическими заболеваниями (ДНЗ) (12 из Кретея, 16 из Гренобля). Пятеро пациентов имело положитель- 22024655 ный результат, таким образом, представляя примерно 18% протестированных пациентов с ДНЗ. Тем не менее, все положительные случаи ДНЗ имели сходный диагноз: хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия (ХВДП), тогда как пациенты с ДНЗ с другими диагнозами все были отрицательными (или "неопределенными" на пороговом пределе, как для одного случая острого синдрома Гийена-Барре). Таким образом, результаты от пациентов с ДНЗ представлены в табл. 12 б как ДНЗ без ХВДП отдельно от пациентов ХВДП (табл. 12 в). Примерно половина случаев ХВДП является положительной,но, с учетом настоящих низких чисел, авторы здесь не подразумевали исследование "воспалительных" против "невоспалительных" неврологических заболеваний. Кроме того, авторы изобретения параллельно протестировали сыворотки от других не неврологических заболеваний (ДННЗ), таких как 15 пациентов с хронической вирусной инфекцией гепатита В, а также 15 пациентов с хронической вирусной инфекцией гепатита С. Из этих 30 образцов ни один не был обнаружен как положительный. Полиреактивные сыворотки от 30 пациентов с анти-ДНК, противоядерным и противоревматоидным факторами, обычно препятствующими различным серологическим тестам,не дали никакого положительного результата. Пятьдесят сывороток от здоровых доноров крови были также параллельно протестированы. Ни одна не была обнаружена как положительная. Сравнение результатов группы PC с любой другой группой показывает значимое различие, за исключением подгруппы ХВДП. Значения оптической плотности от полных групп PC и ДНЗ (включая отрицательные PC и ХВДП) при сравнении с помощью непараметрического критерия (критерий нормальности был неудачным) достаточно значительно различаются (р = 0,001; критерий суммы рангов МаннаУитни Т = 517000). При сравнении полной группы PC со всеми случаями ХВДП статистическое различие более не обнаруживалось (р = 0,053; критерий суммы рангов Манна-Уитни Т = 99000). Никакого статистического различия не подтвердили для значений OD "положительных PC" и "положительных ХВДП" (р = 0,072; критерий суммы рангов Манна-Уитни Т = 42000). Европейская многоцентровая серия сывороток при слепом тестировании: Рассеянный склероз (PC) и клинически изолированный синдром (КИС) С целью подтверждения первых результатов с большей группой пациентов PC из различных географических областей авторы изобретения рекрутировали сыворотки в рамках многоцентрового сотрудничества с неврологическими отделениями из различных европейских стран. В этих образцах авторы изобретения использовали люминометрическое считывание с целью улучшения обнаружения сигнала и дифференциации с неспецифическим фоновым "шумом". После внутренних оценок сывороток колориметрическим способом сравнение с люминометрическим считыванием подтвердило усиленное обнаружение и динамику сигнала. Таким образом, взятие образцов сыворотки для анализа в четырех повторах проводили у случайно отобранных пациентов PC со всеми формами и продолжительностями заболевания, в основном, при продолжающемся специфическом лечении, но представляющих каждое географическое происхождение из настоящей сети клиник. Их кодировали и посылали для слепого тестирования в централизованную лабораторию (АРО-Н технологии,Монпелье, Франция). Не кодированные сыворотки (10 отрицательных контролей и 10 положительныхPC) посылали для технической оценки на определение порогового значения. Кроме того, 14 сывороток от клинически изолированного синдрома (КИС, отдельный неврологический эпизод и дополнительное проявление и/или биологические аномалии) посылали в кодированном виде на слепое тестирование в рамках данной серии. Это была первая оценка при КИС, и ожидали, что она включает большинство первых эпизодов PC. Результаты представлены на фиг. 8 (результаты ApoH-ELISA сывороток из европейского многоцентрового исследования, протестированных вслепую в независимой лаборатории). Они выражены в виде отношения люминометрических единиц (RLU), деленных на пороговое значение, определенное в таких же экспериментах, которое, таким образом, сравнимо с отношением для предшествующей серии (см. табл. 9). Действительно, диапазон отношений (1-6), полученных здесь в пределах сывороток "положительного PC" с помощью люминометрии, подтверждает техническую оптимизацию динамики сигнала по сравнению с колориметрией (от 1 до 2). Результаты ApoH-ELISA сывороток из европейского многоцентрового исследования, протестированных вслепую в независимой лаборатории Используемым способом считывания была люминометрия, и результаты представлены на оси Y в виде отношения индивидуальных люминометрических единиц (RLU), поделенных на пороговое значение, определенное на серии стандартных отрицательных сывороток в том же эксперименте. Таким образом, значения 1 являются положительными. Статистические анализы люминометрических результатов АРО-Н ELISA между группами дали следующие результаты (значения р критерия Фишера): (i) сравнение ДК против всех PC, ДК против всехPC + КИС, ДК против ВР-РС, ДК против ПП-РС, ДК против ВП-РС, ДК против КИС: р 0,001; (ii) сравнение КИС против ВР-РС: р=0,759, КИС против ПП-РС: р=0,704, КИС против ВП-РС: р=0,749, ВР-РС против ПП-РС, ВП-РС: р=1, ПП-РС против ВП-РС: р=1. В данном случае 54 из 74 неотобранных случаев PC (73%), имеющих происхождение из различных стран и регионов исследования, имели положительную антигенемию по белку MSRV ENV, но ни один из закодированных 26 ДК (как для 10 незакодированных ДК, используемых в качестве стандартных образцов для эксперимента) не имел. Присутствующее различие между PC и ДК было в высокой степени значимым (критерий Хи-квадрат: р 0,0001), но в отдельных "неслепых сериях" с большими числами (более ста) обнаружено несколько положительных здоровых или бессимптомных доноров крови (4/103; не показано). Интересно, что 9 из 14 КИС (примерно 64%) были положительными, но с более низкими значениями. Значения от различных групп (PC, ДК, КИС), а также от различных подгрупп, представляющих различные формы PC: первичную прогрессирующий (ППРС), вторичную прогрессирующий (ВПРС) и возвратно-ремиттирующий (ВРРС), сравнивали с помощью критерия Фишера. Результаты от здоровых доноров значимо отличались от всех комбинаций PC и КИС (постоянно р 0,001), тогда как никакого значимого различия в обнаружении антигенемии MSRV ENV не наблюдали между любыми подгруппами, представляющими либо возможный (КИС), либо определенный PC, или различными формами развития заболевания PC (71% были положительными при ВРРС, 78% при ППРС, 70% при ВПРС). Тем не менее, некоторая тенденция гетерогенности в подгруппах КИС по сравнению с PC проиллюстрирована более низкими значениями р: р = от 0,7 до 0,75, против р = 1 между формами PC, где последнее значение выявляет статистически идентичное распределение результатов. 8b Серия психиатрических заболеваний: Шизофрения - SCZ. Пациенты и способы Пациенты и здоровые контроли Пациенты, соответствующие критериям DSM-IV (Американская психиатрическая ассоциация: Руководство по диагностике и статистике психических расстройств, DSM-IV; 1994) для шизофрении, были случайным образом отобраны в конце госпитализации по поводу острого эпизода в филиале кафедры психиатрии Французского университета. Неврологическое расстройство, острая или хроническая инфекция и положительная серология на вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ 1+2), вирусы гепатита В и С составляли критерии исключения. Распределение по возрасту и полу в этих нормальных контролях статистически не отличалось от настоящей группы пациентов. Психотические симптомы оценивали с помощью французской версии Шкалы признаков и симптомов психотического заболевания - SSPI (Houenou et al., 2007). Симптомы настроения оценивали с помощью оценочной шкалы мании Bech and Rafaelsen и оценочной шкалы депрессии Монтгомери и Асберга - MADRS (Bech et al., 1978; Montgomery andAsberg, 1979). Протокол был одобрен местным этическим комитетом. От всех субъектов получали подписанное информированное согласие после полного описания исследования психиатром, ответственным за клинические оценки пациентов. Сбор сыворотки Одну пробирку (сухую 7 мл пробирку BD) крови обрабатывали в пределах 2 ч после сбора: после свертывания их центрифугировали в течение 10 мин при 2800 g и 14 С. Сыворотку собирали, делили на аликвоты в слабо связывающие пробирки и хранили при -80 С. Иммунологический анализ Тесты ELISA со стадией иммобилизации АРО-Н (Stefas et al., 1997) проводили с моноклональнымиIgG (2A12A5, 6 А 2 В 2 для MSRV ENV и 2G5E12 для MSRV GAG), полученными и подвергнутыми скринингу на специфичность фирмой bioMerieux, Marcy L'Etoile, Франция. 100 мкл на лунку образцов, разведенных 1/10 в Трис-HCl 50 мМ рН 7,6, наносили на микропланшеты, покрытые АроН (АРОН Technologies, Монпелье, Франция). Микропланшеты инкубировали в течение 2 ч при 37 С, промывали четыре раза 250 мкл ФСБ на лунку. Добавляли 100 мкл на лунку первого антитела (10 мкг/мл в ФСБ-БСА 2%), микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 С и промывали четыре раза ФСБТ 0,05% и дважды ФСБ. Добавляли 100 мкл на лунку меченого пероксидазой антитела(против мыши Jackson, 1/250 в ФСБ-БСА 2%), микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 С и промывали, как описано выше. Добавляли 100 мкл на лунку раствора субстрата (OPD), микропланшеты инкубировали в течение 30 мин в темноте, и реакцию останавливали H2SO4 2 н. (50 мкл на лунку). Поглощение считывали при 490 нм с помощью считывающего устройства Biotek. Статистические анализы Статистические анализы проводили с помощью программного обеспечения SigmaStat. Для сравнения серии данных был выбран непараметрический критерий суммы рангов Манна-Уитни, поскольку их распределение никогда не соответствовало нормальному распределению (критерий нормальности не выполнялся). Критерий хи-квадрат использовали для сравнения преобладания положительной антигенемии против отрицательной в каждой популяции, для каждого антигена и/или каждого используемого антитела. Пороговое значение для каждого состояния, при котором получены результаты, вычисляли на основании статистической серии отрицательных контролей как их среднее значение плюс три стандартных отклонения (M+3SD; значимость положительности: р 0,01) и подтверждали на стандартных положительных и отрицательных образцах. Включены результаты 49 пациентов с шизофренией и 49 контроля,соответствующих по возрасту (33 +/- 6,5 лет) и полу (73% мужчин, 27% женщин). Было включено восемь пациентов при первичном возникновении шизофренического расстройства, тогда как большинство (N = 41) страдало тяжелой хронической шизофренией. Они были эутимическими при включении как для депрессивных баллов (среднее MADRS = 5,6 + 6,6) и для маниакальных баллов (средний балл Бека = 4,8 + 4,5). Все пациенты, кроме одного без лечения, принимали нейролептические лекарственные средства(27% классические и 71% атипичные нейролептики). Одна треть пациентов (N = 13) были устойчивыми к лекарственным средствам согласно критерию Кена (Kane, 1996). Для антигена MSRV GAG было протестировано 49 контролей и 49 пациентов с шизофренией. ДляMSRV ENV было протестировано 30 контролей (вследствие технических ограничений) и 49 пациентов с шизофренией. Результаты иммунологического анализа выражали в виде средней оптической плотности,полученной на дубликатах сыворотки, деленной на пороговое значение, чтобы сделать все серии сравнимыми с нормализованными значениями (фиг. 22 и табл. 10). 47% (N = 23) и 43% (N = 21) субъектов с шизофренией обладали положительной антигенемиейMSRV ENV, соответственно, с антителами 2 А 12 А 5 и 6 А 2 В 2. 49% (N = 24) пациентов с шизофренией обладали положительной антигенемией MSRV GAG, где один был положительным, и один был "пограничным" только для GAG. Сравнение со здоровыми контролями выявило значимое различие в преобладании положительных (критерий хи-квадрат р 0,001 для обоих определений ENV; р 0,0001 для GAG). Сравнение значений ELISA у пациентов против контролей с помощью критерия суммы рангов МаннаУитни также подтвердило в высокой степени значимые различия (р 0,001; табл. 2). Среди контролей один субъект обладал значимо положительной антигенемией. Интересно, что присутствовала положительная корреляция между результатами для белка ENV и результатами, полученными для белка GAG. Сравнение значений ELISA, полученных с анти-ENV 6 А 2 В 2, со значениями, полученными с анти-GAG 2G5E12, с помощью критерия суммы рангов Манна-Уитни не выявило значимого различия (р = 0,744),как и для анти-ENV-2A12A5 по сравнению с aHTH-GAG-2G5E12 (p = 0,290) и для анти-ENV-6 А 2 В 2 по сравнению с aHTH-ENV-2A12A5 (p = 0,159). таким образом, эти антитела определяли эквивалентную и/или параллельную экспрессию антигенов MSRV. Значения антигенемии "ENV" no ELISA варьировали среди положительных, как показано в табл. 10 повышенными стандартными отклонениями (0,28 для антитела 2 А 12 А 5, 0,48 для 6 А 2 ВА), по сравнению с отрицательными контролями (0,09 и 0,08 соответственно). Это подтверждает обнаружение динамичного продуцирования антигенов MSRV у некоторых пациентов с шизофренией. Эмпирический коэффициент иммунологического анализа (ELISA) (ось Y) представляет собой среднюю оптическую плотность, измеренную на дублированных лунках от одной и той же сыворотки, деленную на пороговое значение соответствующей серии (см. Материалы и методы). Антиген ENV дозируют либо моноклональным антителом 2 А 12 А 5, либо моноклональным антителом 6 А 2 В 2, и антиген GAG дозируют моноклональным антителом 2G5E12, как указано в соответствующих колонках со значениями по графику. На фиг. 9 среднее значение и доверительные интервалы (0,01 и 0,001) представлены столбиками и прямоугольниками, а распределение максимальных и минимальных значений для каждого антигена и антитела (указанных сверху каждой колонки) представлено точками. Серия значений от пациентов с шизофренией указана как "SCZ" внизу соответствующих графиков, а значения от здоровых доноров крови отмечены "Контроли" (внизу оси X). Таблица 13. Дозы капсида (GAG) и оболочки (ENV) MSRV в сыворотках пациентов с шизофренией (SCZ) и контролей 8 с Другие неврологические заболевания: Эпилепсия Тесты ELISA проводили, как описано выше (8b). Пациентов с эпилепсией и нормальные контроли тестировали параллельно на присутствие белка MSRV-ENV в их сыворотках. Результаты представлены на фиг. 10. Каждый вертикальный столбик представляет среднюю OD дублированных результатов сыворотки от одного пациента с эпилепсией (38 слева) или контроля (24 справа). Горизонтальная черная полоса представляет пороговое значение теста, выше которой определенный сигнал является специфичным для присутствия антигена в сыворотке. Его определяют как среднее результатов от здоровых доноров крови (контролей) плюс три стандартных отклонения. Таким образом, здесь авторы изобретения определили подгруппу из 8 пациентов с MSRV-ENVассоциированной эпилепсией, которые могут просто соответствовать подгруппе с данной конкретной этиологией среди других случаев с другой этиологической причиной. Только MSRV-положительная эпилепсия является релевантной для лечения лигандом анти-ENV, например, в векторах антител. 8d Пациенты с псориазом Давно известно, что у пациентов с псориазом экспрессируется подобный ретровирус (Iversen, О. J.lesions" Arch Dermatol 119(12): 955-6). Поэтому их релевантность для настоящих терапевтических векторов, содержащих лиганд, очевидна для специалиста в данной области техники. Пример 9: Эффективность in vivo фармацевтических векторов, содержащих лиганд и сохраняющих сродство лиганда с характеристиками активности против GNbAC1 Данные in vivo по противовоспалительным, иммунопротективным и нейропротективным эффектам лиганда, доставляемого в форме лиганда, включенного в вектор, с соответствующим фармакологическим векторным соединением: Пример терапевтического эффекта в животных нейровоспалительных моделях, моделях демиелинизации и/или нейрональной дегенерации Материалы и методыMSRV/ENV-индуцированный ЭАЭ (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) в гуманизированной модели мышей SCID (huSCID) Свободных от патогенов мышей с SCID (тяжелый комбинированный иммунодефицит) в возрасте 68 недель покупали в Charles River, Франция. Гуманизация мышей была достигнута, используя МКПК от здоровых доноров крови (Etablissement Frangais du Sang, Лион, Франция), в соответствии с ранее описанным протоколом (Firouzi et al., 2003). В частности, мыши были облучены гамма-излучением и получали антитело анти-NK, после чего их гуманизировали 50106 МКПК человека путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции. Затем качество гуманизации контролировали путем специфичного определения иммуноглобулина человека в сыворотке мыши. Когда был нужен более чем один донор на серию, все подгруппы huSCID делали сравнимыми за счет одинаковой доли мышей, гуманизированных от каждой сдачи крови. Была необходима задержка на 2 недели перед включением в протокол ЭАЭ (перед первой инъекцией миелинового антигена). Затем группам мышей инъецировали либо основной миелиновый белок(МВР) и неполный адъювант Фрейнда (IFA, содержащий только разбавители) для "ложно-контрольных" групп, либо инъецировали МВР и очищенный, свободный от эндотоксинов белок MSRV ENV, гомогенизированный в разбавителях IFA для "ENV-индуцированного" ЭАЭ. Когда активность заболевания наблюдали клинически и по МРВ по наличию вызванных повреждений и прогрессирующих клинических нарушений, эффект отобранных лигандов анти-ENV по сравнению с исходным мышиным моноклональным антителом (GNbAC1) исследовали при инъекции больным мышам (МВР-ЭАЭ, индуцированныйENV y мышей huSCID). Для индукции или "ложной индукции" животных с ЭАЭ сначала инъецировали s.c. (подкожно) в шею на сутки 0 либо 50 мкг МВР человека + 150 мкг пептида МВР (пептида МВР 87-99) + 20 мкг рекомбинантного белка ENV + IFA (группа ENV), либо 50 мкг МВР человека + 150 мкг пептида МВР (пептида МВР 87-99) + только IFA (контрольная группа). Также инъецировали 200 нг коклюшного токсина (РТХ) на животное i.p. спустя 2 суток во всех группах. Вторую инъекцию внутрибрюшинным (i.p.) путем тех же компонентов в той же дозе (включая пептид МВР и полноразмерный белок МБР человека), соответствующей предшествующему описанию для каждой группы, проводили на указанные сутки (табл. 11). Ее также сопровождали такой же инъекцией 200 нг РТХ на животное. Третью и последнюю инъекцию тех же иммуногенных агентов проводили s.c. на противоположной стороне шеи на указанные сутки (табл. 14), сопровождая такой же инъекцией РТХ. Таблица 14. Серия доклинической оценки обработки антителом: описание различных групп и протоколов для ENV-индуцированных и контрольных "МВР-ЭАЭ" у мышей Hu-SCID Для наблюдения животных взвешивали 5 суток в неделю и оценивали клинический балл. Клинический балл оценивали по приведенному ниже критерию: 0 = нет признаков; 1 = паралич хвоста или гиперрефлексия задней конечности(ей) или односторонняя слабость задней конечности; 2 = двухсторонняя слабость задних или передних конечностей; 3 = дополнительно односторонний паралич или общее нарушение; 4 = полный паралич задних или передних конечностей; 5 = дополнительно частичный паралич или общее нарушение противоположных конечностей; 6 = агония или смерть. Общая продолжительность экспериментов с Hu-SCID не превышала двух месяцев, за исключением исследований выживаемости, включающих обработанных mAb и контрольных мышей (четыре месяца). МРВ и иммуногистохимический анализ (изображения не показаны в настоящем примере) Мониторинг животных проводили с помощью Т 2-взвешенного анализа МРВ и посмертной гистологии, которая подтвердила оба типа повреждений с воспалением и демиелинизацией в центральной нервной системе, а также визуализацию (МРВ) резкого улучшения картины воспаления у обработанных мышей с клиническим улучшением. Результаты Мыши SCID с лимфоидной системой человека (привитой, как указано выше) обеспечивают гибридных животных с функциональной иммунной системой человека. В данном случае эти животные получали три инъекции белка MSRV ENV, эмульгированного с МВР в масляных разбавителях (IFA), на сутки, указанные синими стрелками. Когда животные имели повышенный клинический балл при продолжающемся воспалении нервной системы, визуализированном с помощью МРВ (ЭАЭ), им инъецировали однократную дозу (10 мкг внутрибрюшинно) исходного мышиного моноклонального антитела(GNbAC1, указанного как muIgG на фиг. 10) или одной из конструкций на основе IgG1 или IgG4 человека с лигандом (указанной как huIgG1 и huIgG4 на фиг. 11). Группа, оставленная необработанной с целью сравнения с обработанными животными, и "ложно-контрольная" группа, инъецированная МВР в IFA безENV, оставались здоровыми, но получали инъекцию исходного мышиного антитела (GNbAC1) на те же сутки, что и обработанные больные животные. Как видно на основании результатов, проиллюстрированных на фиг. 11 и 12, все необработанные мыши погибли через 30 суток и имели тяжелое клиническое прогрессирование после последней из трех инъекций белка MSRV ENV. Тяжелые повреждения были видны на гистологии и иммуногистологии,выявляющих демиелинизацию, инфильтрацию лимфоидных клеток, гибель нейронов, разрушение гематоэнцефалического барьера и астроглиоз. Интересно, что при рассеянном склерозе разрушение гематоэнцефалического барьера также является характерным признаком активных повреждений ЦНС. Таким образом, мышиное антитело или химерный IgG1 или 4 человека, содержащий лиганд, направленный на ENV, могли диффундировать в результате внутрибрюшинной инъекции по всему организму и, в частности, в активные повреждения ЦНС у больных животных. Удивительно, что кривые выживания показали 100% выживания у животных, обработанных либоIgG1, либо IgG4 химерными антителами, по сравнению с 0% у необработанных животных на сутки 35. Неожиданно исходное мышиное антитело IgG1/каппа (GNbAC1) обладало меньшей эффективностью при инъекции в такой же дозе, поскольку одно животное погибло на сутки 28. Кроме того, клинические кривые на фиг. 11 показывают очень хорошее и длительное улучшение у животных, обработанных конструкциями на основе IgG1 или 4 человека, но только стабилизацию и слабое улучшение у животных, обработанных исходным мышиным антителом. Такое резкое улучшение у животных, обработанных лигандом в векторах IgG1 или IgG4 человека,было также доказано МРВ мониторингом по сравнению с необработанными контролями. Таким образом, клиническая эффективность химерного IgG1 или 4 человека подтверждена на животных моделях, проявляющих воспаление нервной системы, демиелинизацию, гибель нейронов, разрушение гематоэнцефалического барьера и астроглиоз в центральной нервной системе (ЦНС; см. моделиHu-SCID и С 57/Ы 6, инъецированные белком MSRV ENV). Неожиданно эффективность улучшена по сравнению с исходным мышиным IgG, содержащим тот же лиганд (VH+VL цепи). Таким образом, терапевтическая эффективность в настоящей нейровоспалительной животной модели делает ее очевидной для других применений при MSRV-ассоциированных заболеваниях или синдромах, как определено в тексте настоящего изобретения. Кроме того, неожиданный "эффект лиганда" минимальной композиции или конструкции, содержащей 6 CDR, определенной в примере 1, дает возможность применять лиганд полностью независимо от функций антитела, но также варьировать и выбирать дополнительную ценность и относительный интерес различных векторов (не исключительно относящихся к IgG изотипам) для каждого возможного терапевтического применения. Пример 10: Белок MSRV-ENV обнаруживается с большой интенсивностью в некоторых клетках из биопсий у пациентов с солидной опухолью или из биопсий у пациентов с лимфопролиферативными расстройствами или лимфоидными раками Материалы и методы: Тестируемое антителоGNbAC1, 1,0 мл, концентрация: 5,918 мг/мл Отрицательное контрольное антитело Белок миеломы мыши IgG1 каппа (МОРС-21, Sigma), 1,0 мл, концентрация: 1,0 мг/мл Данное антитело использовали одновременно с тестируемым антителом. Ингибируемый белокENV-T (MSRV ENV, GeNeuro SA), 10 мл (101 мл флаконы), концентрация: 0,05 мг/мл Этот антилиганд использовали одновременно с тестируемым антителом. Образцы тканей человека Этически собранные ткани человека при полном согласии пациента были получены из внешнего источника. Все ткани подвергали тестированию на антигенность. Перед поиском тканей, приемлемых для использования в данном исследовании, проводили оценку белка с распространенной экспрессией на срезе с иммуногистохимическим окрашиванием; S100, CD45, десмина, цитокератина или виментина, связанных с каждой тканью. Валидизация анализа Исследуемые параметры включали: 1. Сравнение окрашивания в положительной контрольной ткани с использованием фиксации нейтральным забуференным формалином, параформальдегидом и ацетоном. 2. Использование подходящего способа обнаружения иммуногистохимическим окрашиванием. 3. Определение оптимального титра тестируемого антитела, исследовали от 0 до 5,0 мкг/мл (изотипический контроль антитела ставили при тех же концентрациях). 4. Достоверность специфичности окрашивания подтверждали путем исключения тестируемого антитела, заменяя его буфером. Кроме того, антигенные связывающие сайты MSRV блокировали, используя белок ENV-T перед инкубацией ткани. 5. Использовали любое необходимое блокирование эндогенных веществ, которые могут препятствовать сигналу антигена-мишени. Способ иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания В результате полученных данных фазы валидизации каждый из образцов ткани подвергали скринингу одновременно, как описано ниже: GNbAC1 исключали из методики окрашивания антитело МОРС 21 при 1,0 мкг/мл GNbAC1 при 0,25, 1,0 и 3,0 мкг/мл. Каждый образец ткани оценивали, используя световой микроскоп. Система оценки позволяла идентифицировать тип ткани и клеток и субъективно отражать интенсивность этого окрашивания. Все окрашивание в тканях, обработанных либо отрицательным контрольным антителом, либо без антитела, и которое специфично не очерчивало индивидуальные клетки, считали неспецифическим. Специфическое окрашивание не было зарегистрировано для тканей, обработанных тестируемым антителом, когда иммуногистохимическое окрашивание в этих тканях было сходным по интенсивности и распределению с тканями, которые не были обработаны тестируемым антителом, и где индивидуальные клетки не были специфично очерчены. Положительное окрашивание регистрировали под названием тканевой структуры или типа клеток, а затем указывали интенсивность, как описано ниже Если срез не считали пригодным для оценки, в таблице результатов для него не указывали никаких данных, пока по возможности не повторяли окрашивание. При 0,25 мкг/мл было меньше мембранного окрашивания по сравнению с другими протестированными разведениями. Ткань печени была включена в качестве сравнения между известным положительным контролем и тканью, которая первоначально не была идентифицирована как положительная. Значимое окрашивание не было идентифицировано ни в отрицательном контроле с буфером, ни в контроле изотипа. Положительное окрашивание в сравнении с положительно окрашенными тканями было практически исключено, когда ENV-T взаимодействовал с антителом анти-MSRV/ENV GnbAC1. Для дальнейшей работы по скринингу тестируемых Mab использовали GNbAC1 при 1,00 мкгмл-1 в качестве оптимальной концентрации, при 3,00 мкгмл-1 в качестве концентрации на одну ступень выше нее и 0,25 мкгмл-1 в качестве низкой концентрации. В результате полученных данных приведенная ниже методика ИГХ окрашивания была адаптирована для скрининга замороженной нормальной ткани человека.