Производные санглиферина и способы их получения

Мосс Стивен Джеймс, Грегори Мэттью Алан, Уилкинсон Барри,Кендрю Стивен Гари, Мартин Кристин Джанет (GB) и их применение в терапии, в частности, при лечении вирусной инфекции.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: НЬЮРОУВИВ ФАРМАСЬЮТИКАЛ АБ (SE) Введение Настоящее изобретение относится к аналогам санглиферина, которые могут использоваться в качестве ингибиторов циклофилина, например, при лечении вирусной инфекции, в особенности ДНКвирусной инфекции, такой как вирус гепатита С (HCV) и ВИЧ, и/или в качестве иммуносупрессантов,например, для применения при профилактике отторжения трансплантата, и в качестве противовоспалительных агентов, например, для применения при воспалительных заболеваниях. Настоящее изобретение также обеспечивает способы их применения в медицине, в частности, при лечении HCV инфекции и для применения в качестве иммуносупрессанта или противовоспалительного агента, или в качестве промежуточных соединений для следующего поколения используемых в медицине соединений. Предпосылки создания изобретения Гепатит С. Вирус гепатита С (HCV) представляет собой положительную цепь ДНК-вируса, и инфекция является основной причиной посттрансфузионного гепатита. HCV представляет собой наиболее распространенную хроническую передающуюся через кровь инфекцию и является основной причиной смерти от заболеваний печени в США. Согласно оценке Всемирной организации здравоохранения имеется более 170 млн хронических носителей HCV инфекции, что составляет около 3% населения мира. Из не подвергнутых лечению HCV-инфицированных пациентов у около 70-85% развивается хроническая инфекция HCV, и поэтому они относятся к группам высокого риска развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. В развитых странах 50-76% случаев рака печени и две трети всех трансплантатов печени вызваны хронической инфекцией HCV (Manns et al., 2007). Помимо заболеваний печени, у хронически инфицированных пациентов могут также развиваться другие HCV хронические заболевания, и они служат в качестве источника передачи другим людям. HCV инфекция вызывает осложнения не только в печени, такие как артралгия (боль в суставах), кожная сыпь и внутренние повреждения органов, преимущественно, почек. HCV инфекция представляет собой тяжелую проблему для мирового здравоохранения, и в настоящее время не существует вакцины, пригодной для гепатита С (Strader et al., 2004; Jacobson et al. 2007; Manns et al., 2007 Pawlotsky, 2005; ZeuzemHermann, 2002). Лечение HCV. В настоящее время стандартом для лечения (SoC) являются подкожные инъекции пегилированного интерферона- (pIFN) и пероральное дозирование противовирусным препаратом рибавирином в течение 24-48 недель. Успех в лечении определяется устойчивым вирусологическим ответом (SVR), который определяется отсутствием HCV РНК в сыворотке крови в конце периода лечения и через 6 месяцев. Общая частота ответа на SoC зависит в основном от генотипа и уровней предварительной обработки HCV РНК. Пациенты с генотипами 2 и 3 более вероятно реагируют на SoC, чем пациенты, инфицированные генотипом 1 (Melnikova, 2008; Jacobson et al., 2007). Значительное число HCV пациентов неадекватно реагирует на лечение SoC или не могут переносить лечения из-за побочных эффектов, что приводит к частым проблемам с завершением полного курса. Показатель общего клинического SVR SoC составляет всего только около 50% (Melnikova, 2008). Развитие резистентности является другим основным фактором неэффективности лечения (Jacobson et al.,2007). SoC также противопоказан некоторым пациентам, которые не считаются кандидатами для лечения, такие как пациенты с прошлыми значительными эпизодами депрессии или сердечными заболеваниями. Побочные эффекты SoC, которые часто приводят к прекращению лечения, включают схожее с гриппом заболевание, лихорадку, усталость, гематологические заболевания, анемию, лейкопению, тромбоцитопению, алопецию и депрессию (Manns et al., 2007). Учитывая побочные эффекты, связанные с длительным лечением с использованием SoC, развитие резистентности и субоптимальный общий уровень успеха, крайне необходимыми являются более эффективные и безопасные новые методы лечения HCV инфекции. Задачи новых методов лечения включают повышенную эффективность, улучшенный профиль токсичности, улучшенный профиль резистентности,улучшение качества жизни и в результате соответствующее улучшение у пациента. HCV имеет короткий жизненный цикл и, следовательно, развитие лекарственной резистентности в процессе лекарственной терапии является распространенным явлением. В настоящее время разрабатываются новые препараты, в особенности, для целей противовирусной терапии гепатита С (STAT-C), также известные как препараты прямого противовирусного действия(DAA), мишенью которых являются вирусные белки, такие как вирусная РНК-полимераза NS5B или вирусная протеаза NS3 (Jacobson et al., 2007; Parfieniuk et al., 2007). Кроме того, в настоящее время разрабатываются новые соединения, мишенью которых являются белки человека (например, циклофилины), а не вирусные мишени, что, как можно было бы ожидать, приведет к уменьшению случаев резистентности в процессе лекарственной терапии (Manns et al., 2007; Pockros, 2008; Pawlotsky J.-M., 2005). Ингибиторы циклофилина. Циклофилины (СуР) представляют собой семейство клеточных белков, которые проявляют пептидилпролил цис-транс изомеразную активность, способствующую изменению конформации и свертыванию белка. СуР вовлечены в клеточные процессы, такие как регуляция транскрипции, иммунный ответ,-1 022408 секреция белка и функции митохондрий. Вирус HCV набирает СуР для своего жизненного цикла в процессе инфицирования человека. Первоначально полагали, что СуР стимулируют связывающую РНК активность HCV неструктурного белка NS5B РНК полимеразы, который промотирует репликацию РНК,хотя предлагались некоторые альтернативные гипотезы, включающие требования активности СуРPPIase. Как полагают, в жизненный цикл HCV вовлечены различные изоформы СуР, включая А и В(Yang et al., 2008; Appel et al., 2006; Chatterji et al., 2009; Gaither et al., 2010). Способность генерировать генетический нокаут в Т клетках мышей (Colgan et al., 2000) и человека (Braaten и Luban, 2001) указывает, что СурА является обязательным для роста клеток и выживания. Подобные результаты наблюдались при разрушении гомологов СуРА у бактерий (Herrler et al., 1994), Neurospora (Tropschug et al., 1989) иSaccharomyces cerevisiae (Dolinski et al., 1997). Таким образом, ингибирование СуР представляет собой новую и привлекательную главную мишень при лечении инфекции HCV, и новое возможное дополнение к существующим SoC или STAT-C/DAA лекарственным средствам, с целью повышения SVR, предотвращения возникновения резистентности и снижения побочных эффектов при лечении. Известно, что циклоспорин A (Inoue et al., 2003) ("CsA") и его ближайшие структурно связанные не подавляющие иммунитет клинические аналоги DEBIO-025 (Paehuyse et al., 2006; Flisiak et al., 2008),NIM811 (Mathy et al., 2008) и SCY-635 (Hopkins et al., 2009) связываются с циклофилинами, и в качестве ингибиторов циклофилина проявляют in vitro и клиническую эффективность при лечении инфекцииet al., 2006). Хотя более ранние исследования резистентности на CsA показали мутации в HCV NS5B РНК полимеразе, и было высказано предположение, что только циклофилин В может быть вовлечен в процесс репликации HCV (Robida et al., 2007), недавние исследования позволили предположить существенную роль циклофилина А в репликации HCV (Chatterji et al., 2009; Yang et al., 2008). Учитывая, что мутации в белках вируса NS5A также связаны с резистентностью CsA, и что NS5A взаимодействует как с СурА, так и с СурВ, из-за его специфической активности пептидилпролил цис/транс изомеразы (PPIase),далее было высказано предположение о роли обоих циклофилинов в жизненном цикле вируса (Hanoulleet al., 2009). Анти-HCV действие аналогов циклоспорина является независимым от подавляющего иммунитет свойства, которое зависит от кальциневрина. Это указывает на то, что основным требованием для HCV активности является связывание СуР, и связывание кальциневрина не требуется. DEBIO-025, наиболее клинически успешный ингибитор циклофилина для лечения HCV, показал in vitro и in vivo эффективность в отношении четырех наиболее распространенных генотипов HCV (генотипы 1, 2, 3 и 4). Исследования резистентности показали, что мутации, присущие резистентности к DEBIO-025, отличались от му-2 022408 таций, установленных для ингибиторов полимеразы и протеазы, и что не было какой-либо перекрестной резистентности с STAT-C/DAA резистентными вирусными репликонами. Что более важно, DEBIO-025 также предотвращал развитие ответвления мутации, что придает устойчивость ингибиторам как протеазы, так и полимеразы (Crabbe et al., 2009). Однако основанные на CsA ингибиторы циклофилина в клинической разработке имеют ряд проблем, которые, как полагают, связаны с их общим структурным классом, включая некоторые неблагоприятные результаты, которые могут привести к отказу от терапии и имеют ограничения в уровнях клинических доз; неустойчивые фармакокинетические свойства, что может привести к неустойчивой эффективности; и повышенный риск взаимодействий лекарство-лекарство, что может привести к проблемам при дозировании. Наиболее часто встречающиеся побочные эффекты (ПЭ) у больных, получавших DEBIO-025,включали желтуху, боли в животе, рвоту, усталость и гипертермию. Наиболее клинически важными ПЭ были гипербилирубинемия и снижение количества тромбоцитов (тромбоцитопения). Peg-IFN может вызвать глубокую тромбоцитопению, и сочетание с DEBIO-025 сможет представлять значительную клиническую проблему. Как увеличение билирубина, так и уменьшение тромбоцитов также были описаны в ранних клинических исследованиях с NIM-811 (Ke et al., 2009). Хотя гипербилирубинемия, наблюдаемая в процессе клинических исследований DEBIO-025, реверсировала после прекращения лечения, это было причиной для прекращения лечения у 4 из 16 пациентов, и снижения дозировок в последующих испытаниях. Так как противовирусное действие ингибиторов циклофилина в HCV связано с дозировкой, снижение дозировки приводило к уменьшению противовирусного эффекта, и многие более поздние исследования ингибиторов циклофилина на основе CSA показали отсутствие или слабое уменьшение противовирусного эффекта на HCV вирусную нагрузку при дозировании в виде монотерапии (Lawitz et al., 2009;Hopkins et al., 2009; Nelson et al., 2009). DEBIO-025 и циклоспорин А известны в качестве ингибиторов транспортеров желчи, таких как насосы экспорта солей желчных кислот и другие печеночные транспортеры (в особенности, MRP2/cMOAT/ABCC2) (Crabbe et al., 2009). Было высказано предположение, что взаимодействие с транспортерами желчи, в частности MRP2, может быть причиной гипербилирубинемии, наблюдаемой при высоких уровнях доз DEBIO-025 (Nelson et al., 2009, Wring et al., 2010). Связанное с CSA классом взаимодействие лекарство-лекарство (DDI) посредством ингибирования других лекарственных траспортеров, таких как ОАТ 1 В 1 и ОАТ 1 В 3 (Konig et al., 2010), также может быть явлением,возможно ограничивающим некоторые комбинации и применение у некоторых пациентов, проходящих лечение соинфекций, таких как ВИЧ (Seden et al., 2010). Кроме того, DEBIO-025 и циклоспорин А представляют собой субстраты для метаболизма путем цитохрома Р 450 (в особенности, CYP3A4) и, как известно, являются субстратами и ингибиторами Ргликобелка человека (MDR1) (Crabbe et al., 2009). Также было показано, что циклоспорин А является ингибитором CYP3A4 in vitro (Niwa et al., 2007). Это означает, что может существовать повышенный риск взаимодействия лекарство-лекарство с другими препаратами, которые являются субстратами, индукторами или ингибиторами CYP3A4, такими как, например, кетоконазол, циметидин и рифампицин. Кроме того, ожидается также взаимодействие с лекарственными средствами, которые являются объектом для транспортировки с помощью Р-гликобелка (например, дигоксин), что сможет вызвать сильное взаимодействие лекарство-лекарство у пациентов с HCV, получающих медицинское лечение других сопутствующих заболеваний (Crabbe et al., 2009). Известно также, что CsA обладает сильно изменяющимися фармакокинетическими свойствами с ранними препаратами, проявляющими пероральную биодоступность в интервале 1-89% (Kapurtzak et al., 2004). Без дорогостоящего мониторинга уровней крови пациента, это может привести к увеличению распространенности побочных эффектов из-за увеличения уровней плазмы или уменьшения клинической реакции вследствие пониженных уровней плазмы. Учитывая, что ингибирование циклофилинов представляет собой новый перспективный подход при лечении HCV, существует необходимость в обнаружении и разработке более сильных и безопасных ингибиторов СуР для применения в комбинационной терапии против инфекции HCV. Санглиферины. Санглиферин (SFA) и его природные представители относятся к классу смешанных нерибосомальных пептидов/поликетидов, производимых Streptomyces sp. A92-308110 (известный также как DSM 9954)(см. WO 97/02285), которые первоначально были обнаружены на основе их высокой аффинности в отношении циклофилина (СурА). SfA является наиболее распространенным компонентом при ферментации бульонов и проявляет приблизительно в 20 раз более высокую аффинность в отношении СурА по сравнению с CsA. Это привело к предположению, что санглиферины могут быть полезны при леченииHCV (WO 2006/138507). Также было показано, что санглиферины обладают более низкой подавляющий иммунитет активностью, чем CsA при in vitro исследовании (Sanglier et al., 1999; Fehr et al., 1999). SfA связывается с высокой аффинностью в отношении CsA с сайтом связывания СурА (Kallen et al., 2005). Биосинтез санглиферинов. Санглиферины биосинтезировали с помощью смешанной поликетид синтазы(PKS)/нерибосомальный пептид синтетаза (NRPS) (см. WO 2010/034243, Qu et al., 2011). 22-членный скелет макролида состоит из поликетидной углеродной цепи и трипептидной цепи. Пептидная цепь состоит из одной природный аминокислоты, валина и двух неприродных аминокислот: (S)-метатирозина и (S)пиперазиновой кислоты, соединенных амидной связью. Гидроксилирование фенилаланина (либо in situ на NRPS, либо перед биосинтезом), чтобы генерировать (S)-метатирозин, как полагают, происходит через генный продукт sfaA. Подавляющее иммунитет действие санглиферинов. Подавляющий иммунитет механизм действия SfA отличается от других известных иммунофилинсвязывающих подавляющих иммунитет препаратов, таких как CsA, FK506 и рапамицин. SfA не ингибирует активность фосфотазы кальциневрина, мишени CsA (Zenke et al., 2001), вместо его подавляющий иммунитет активности ему было приписано ингибирование интерлейкина-6 (Hartel et al., 2005), интерлейкина-12 (Steinschulte et al., 2003) и ингибирование интерлейкин-2-зависимой пролиферации Т-клеток(ZhangLiu, 2001). Однако молекулярная мишень и механизм, посредством которого SfA оказывает свое подавляющий иммунитет действие, до сих пор не известны. Молекулярная структура SfA является сложной, и его взаимодействие с СурА, как полагают, опосредовано в основном с помощью макроциклической части молекулы. Действительно, макроциклическое соединение (гидроксимакроцикл), полученное при окислительном расщеплении SfA, показало сильную аффинность в отношении СурА (Sedrani et al., 2003). Данные рентгеноструктурного анализа кристаллической структуры показали, что гидроксимакроцикл связывается с тем же активным сайтом СурА в видеCsA. Ранее также было показано, что у аналогов на основе макроциклической части SfA отсутствуют подавляющие иммунитет свойства (Sedrani et al., 2003), обеспечивая возможность для разработки не подавляющих иммунитет ингибиторов СуР для предполагаемого использования в терапии HCV. В противоположность этому, также имеется возможность разработать подавляющие иммунитет средства с низкой токсичностью для применения в таких областях, как профилактика отторжения трансплантата, аутоиммунные, воспалительные и дыхательные заболевания, включая, но, не ограничиваясь ими, болезнь Крона, синдром Бехчета, увеит, псориаз, атопический дерматит, ревматоидный артрит,нефротический синдром, апластическую анемию, билиарный цирроз печени, астму, легочный фиброз,хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ) и целиакию. Было показано, что санглиферины обладают новым механизмом активности подавления иммунитета (Zenke et al., 2001), возможно действуя через хемокины дендритных клеток Immecke et al., 2011), и поэтому существует возможность разработать средства с механизмом действия, которые отличаются от имеющихся в настоящее время клинических средств, таких как циклоспорин, рапамицин и FK 506. Другое терапевтическое применение ингибиторов циклофилина. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Также было показано, что ингибиторы циклофилина, такие как CsA и DEBIO-025, возможно могут быть использованы при ингибировании репликации ВИЧ. Как полагают, ингибиторы циклофилина мешают функции СурА в процессе прогрессия/завершение обратной транскрипции ВИЧ (Ptak. et al., 2008). Однако при клинических исследованиях DEBIO-025 только понизил уровни РНК ВИЧ-1 на 0,5 и 1log10 копий/мл у девяти и двух пациентов, соответственно, в то время как у 27 пациентов, проходящих лечение, не было показано понижение уровней РНК ВИЧ-1 (Steyn et al., 2006). После этого, DEBIO-025 был опробован на HCV/ВИЧ инфицированных пациентах, и он показал лучшую эффективность противHCV, и ВИЧ клинические испытания были прекращены (см. Watashi et al., 2010). Лечение ВИЧ. Более 30 млн человек по всему миру заражены ВИЧ-1, с 3 млн новых случаев каждый год. Варианты лечения значительно улучшились с внедрением высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) (Schopman et al., 2010), к 2008 году почти 25 антиретровирусных препаратов были лицензированы для лечения ВИЧ-1, включая девять нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (NRTI), четыре ненуклеозидных ингибитора обратной транскриптазы (NNRTI), девять ингибиторов протеазы (PI), один ингибитор слияния, один ингибитор CCR5 и один ингибитор интегразы (Shafer и Schapiro, 2008). Однако ни одна из этих схем в настоящее время не приводит к полной элиминации вируса, они могут привести к серьезным побочным эффектам, и противовирусная резистентность все еще вызывает серьезную озабоченность. Таким образом, до сих пор существует потребность в новых противовирусных терапевтических средствах, в особенности, по классам механизмов действия, где не существует одобренных лекарственных средств, таких как в случае ингибиторов циклофилина. Вирус гепатита В. Гепатит В представляет собой ДНК вирус семейства гепаднавирусов и является средством, вызывающим гепатит В. В отличие от случаев с HCV и ВИЧ, опубликовано очень мало отчетов об активности ингибиторов циклофилина против вируса гепатита В. Ptak et al. 2008 описали слабую активность Debio025 против HBV (IC50 4,1 мкМ), в то время как Xie et al., 2007 описали некоторую активность CsA противHBV (IC50 1,3 мкг/мл). Это отличается от ВИЧ и HCV, относительно которых имеются многочисленные сообщения о наномолярной противовирусной активности ингибиторов циклофилина. Лечение HBV.HBV заражено до 400 млн человек во всем мире, и это является одной из основных причин хронического вирусного гепатита и гепатоцеллюлярной карциномы. В 2008 году было известно шесть лицензированных препаратов для лечения HBV; интерферон-альфа и пегилированный интерферон-альфа, три аналога нуклеозидов (ламивудин, энтекавир и телбивудин) и один аналог нуклеотида (адефовир дипивоксил). Однако в связи с высокими показателями резистентности, плохой переносимостью и возможными побочными эффектами существует потребность в новых терапевтических средствах (Ferir et al.,2008). Ингибирование митохондриальных пор с транзиторной проницаемостью (mPTP). Открытие высокопроводимых пор с транзиторной проницаемостью в митохондриях инициирует начало митохондриальной транзиторной проницаемости (МРТ). Это причинное событие, которое приводит к некрозу и апоптозу гепатоцитов после окислительного стресса, токсичности Са 2+ и ишемии/реперфузии. Было показано, что ингибирование циклофилина D (известного также как циклофилинF) с помощью ингибиторов циклофилина блокируют открытие пор с транзиторной проницаемостью и предотвращает смерть клеток после этих стрессов. Поэтому ингибиторы циклофилина D могут быть использованы при симптомах, в которых вовлечено открытие mPTP, таких как дистрофия мышц, в частности врожденная дистрофия мышц Ульриха и миопатия Бетлема (Millay et al., 2008, WO 2008/084368,Palma et al., 2009), рассеянный склероз (Forte et al., 2009), сахарный диабет (Fujimoto et al., 2010), боковой амиотрофический склероз (Martin 2009), биполярное заболевание (Kubota et al., 2010), болезнь Альцгеймера (Du и Yan, 2010), болезнь Хантингтона (Perry et al., 2010), восстановление после инфаркта миокарда(Gomez et al., 2007) и хронический алкоголизм (King et al., 2010). Дополнительное терапевтическое применение. Ингибиторы циклофилина обладают потенциальной активностью при лечении инфекций другими вирусами, такими как вирус ветряной оспы (Ptak et al., 2008), вирус гриппа A (Liu et al., 2009), коронавирус, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром и другие коронавирусы человека и домашних кошек (Chen et al., 2005, Ptak et al., 2008), вирус Денге (Kaul et al., 2009), вирус желтой лихорадки(Qing et al., 2009), вирус западного Нила (Qing et al., 2009), западный лошадиный вирус энцефалита (Qinget al., 2009), цитомегаловирус (Kawasaki et al., 2007) и вирус коровьей оспы (Castro et al., 2003). Есть также сообщения о возможности использования ингибиторов циклофилина и об ингибировании циклофилина в других областях терапии, таких как при злокачественной опухоли (Han et al., 2009). Общие замечания по санглиферинам Одной из проблем, возникающих при лекарственной разработке соединений, таких как санглиферины, является быстрый метаболизм и глюкуронидация, что приводит к низкой пероральный биодоступности. Это может привести к повышенному риску пищевого действия, более частым случаям неполного высвобождения из лекарственной формы и более высокой вариабельности в зависимости от пациента. Поэтому остается потребность в определении новых ингибиторов циклофилина и противовоспалительных средств, которые могут быть использованы, в частности, при лечении инфекции HCV и противовоспалительных состояниях, а также при лечении заболеваний в других областях, при которых может быть полезным ингибирование циклофилинов, таких как ВИЧ инфекция, мышечная дистрофия, или для ускорения выздоровления после инфаркта миокарда, или когда полезной является иммуносупрессия. Предпочтительно, такие ингибиторы циклофилина обладают улучшенными свойствами по сравнению с доступными в настоящее время ингибиторами циклофилина, включая одно или более следующих свойств: более длительное время полужизни или повышенная пероральная биодоступность, возможно посредством сниженного метаболизма Р 450 и/или уменьшенной глюкуронидации, улучшенная растворимость в воде, улучшенная эффективность в отношении HCV, уменьшенная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, такой как высокое воздействие на органымишени (например, печень, в случае HCV), и/или длительное время полужизни (что позволяет избежать частого дозирования), уменьшение взаимодействий лекарство-лекарство, такое как посредством понижения уровня метаболизма CYP3A4 и ингибирование и пониженное ингибирование (PGP) (что позволяет облегчить комбинирование мультилекарственных средств), и улучшенный профиль побочных эффектов,такой как низкое связывание с MRP2, что ведет к уменьшенному шансу гипербилирубинемии, пониженное иммуносупрессивное действие, улучшенная активность против резистентных видов вируса, в частности, CsA, и резистентных видов вируса аналога CsA (например, DEBIO-025), и повышенный терапевтический индекс (и/или селективность). В настоящем изобретении описаны новые аналоги санглиферина, которые могут обладать одним или несколькими из указанных выше свойств. В частности, в настоящем изобретении описаны новые аналоги мутасинтетического санглиферина, которые, по меньшей мере,в некоторых вариантах осуществления изобретения сокращали метаболизм посредством Р 450 или глюкуронидации, например, как показано увеличением времени полужизни микросом, и/или повышенной эффективностью против HCV, например, как показано низким репликоном ЕС 50 и/или повышенным индексом селективности. Существует также потребность в разработке новых средств, подавляющих иммунитет, которые могут использоваться для профилактики отторжения трансплантата или при лечении аутоиммунных, воспалительных и респираторных заболеваний. Предпочтительно такие иммуносупрессанты должны обладать улучшенными свойствами по сравнению с известными природными санглиферинами, включая одно или более следующих свойств: более длительное время полужизни или улучшенная пероральная биодоступность, возможно посредством уменьшения метаболизма Р 450 и/или пониженной глюкуронидации,улучшенная растворимость в воде, повышенная сила подавляющей иммунитет активности, такая как можно видеть в анализах Т-клеточной пролиферации, уменьшенная токсичность (включая гепатотоксичность), улучшенный фармакологический профиль, такой как высокое воздействие на органы-мишени,и/или длительное время полужизни (что позволяет избежать частого дозирования), уменьшение взаимодействий лекарство-лекарство, такое как посредством снижения уровня метаболизма CYP3A4, и ингибирование и пониженное ингибирование (PGP) (что позволяет облегчить комбинирование мультилекарственных средств), и улучшенный профиль побочных эффектов. В настоящем изобретении описаны новые аналоги санглиферина, которые могут иметь одно или более указанных выше свойств. В частности, в настоящем изобретении описаны новые аналоги санглиферина, которые, по меньшей мере, в некоторых вариантах осуществления уменьшали метаболизм посредством Р 450 или глюкуронидацию, например,как показано повышением полужизни микросом, и могут обладать улучшенной подавляющий иммунитет силой, например, как показано низким IC50 пролиферации t-клеток. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к новым аналогам санглиферина, которые были получены путем мутасинтеза. Указанные аналоги могут быть получены с помощью подпитки аналогами метатирозина продуцирующего санглиферин организма, такого как Streptomyces sp. A92-308110 (известный также какDSM 9954), или более предпочтительно с помощью подпитки аналогами метатирозина генетически разработанного производного продуцирующего санглиферин организма, в котором sfaA или гомолог sfaA инактивирован или удален. Таким образом, настоящее изобретение относится к аналогам мутасинтетического санглиферина, способам получения указанных соединений и способам применения указанных соединений в медицине или в качестве промежуточных соединений при получении следующих соединений. Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к аналогам мутасинтетического санглиферина и их производным, соответствующим формуле (I) или формуле (II), далее, или их фармацевтически приемлемым солям где R1, R2, R3, R4 и R5 независимо представляют собой Н, F, Cl, Br, С 2-6 алкенил или C1-10 алкил, где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно заменены на гетероатом,выбранный из О, N и S(O)p, в котором р равен 0, 1 или 2, и где один или более атомов углерода указанной алкильной группы необязательно заменены на карбонил, и где алкильная группа необязательно замещена одним или более атомами галогена;X1, X2, Х 3, Х 4 и Х 5 независимо представляют собой С или N, и в случае, когда любая из указанных групп представлена N, присоединенный заместитель отсутствует; при условии, что когда R1, R3, R4 и R5 все представляют собой Н и X1, X2, Х 3, Х 4 и Х 5 все представляют собой С, тогда R2 не может представлять собой ОН; включая его таутомер; или его изомер, в котором С=C связь в положении С 26, 27 С=С (со ссылкой на структуру санглиферина А), показанная как транс, является цис; и включая его метанольный аддукт, в котором кеталь образован путем комбинации С-53 кето и С-15 гидроксильной группы и метанола. Указанная выше структура показывает характерный таутомер, и изобретение охватывает все таутомеры соединений формулы (I), например кетосоединения, где проиллюстрированы енольные соединения, и наоборот. Конкретными таутомерами, которые включены в определение формулы (I), являются такие, в которых (i) С-53 кетогруппа образует полукеталь С-15 гидроксилом, или (ii) С-15 и С-17 гидроксилы могут быть объединены с С-53 кето с образованием кеталя. При нумерации используется система первоначальной структуры санглиферин А. Определения. Форма единственного числа, используемая в данном описании, относится к одному или более чем одному (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту описания. В качестве примера, "аналог" подразумевает один аналог или более чем один аналог. Как используется в данном описании, термин "аналог(и)" относится к химическим соединениям,которые структурно подобны другому соединению, но немного отличаются по строению (как при замене одного атома на другой или наличием или отсутствием конкретной функциональной группы). Как используется в данном описании, термин "воспалительные заболевания" относится к перечню заболеваний, вызванных воспалением, включая, но, не ограничиваясь ими, юношеские угри, атеросклероз, астму, аутоиммунные заболевания (такие как острый рассеянный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, очаговую алопецию, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром (АФС),аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунные заболевания внутреннего уха, буллезный пемфигоид, целиакию, болезнь Шагаса, хроническую обструктивную болезнь легких(ХОБЛ), болезнь Крона, дерматомиозит, сахарный диабет типа 1, эндометриоз, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, болезнь Хашимото, гнойный гидраденит, болезнь Кавасаки, IgA нефропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, интерстициальный цистит, красную волчанку, смешанные заболевания соединительной ткани, кольцевидную склеродерму, рассеянный склероз (PC), миастению, нарколепсию, нейромиотонию, обыкновенную пузырчатку, пагубную анемию, псориаз, псориатический артрит, полимиозит, первичный билиарный цирроз печени, ревматоидный артрит,шизофрению, склеродермию, синдром Шегрена, синдром ригидного человека, временный артериит, язвенный колит, васкулит, витилиго, гранулематоз Вегенера), воспалительные заболевания кишечника,воспалительные заболевания органов малого таза, ревматоидный артрит и отторжение трансплантата. Как используется в данном описании, термин "санглиферин(ы)" относится к химическим соединениям, которые структурно подобны санглиферину А, но немного отличаются по составу (как при замене одного атома на другой или наличием или отсутствием конкретной функциональной группы), в частности, образуемые путем ферментации Streptomyces sp. A92-308110. Примеры включают подобные санглиферину соединения, обсуждаемые в WO 97/02285 и WO 98/07743, такие как санглиферин В. Как используется в данном описании, термин "мутасинтетический(ие) санглиферин(ы)" или "аналог(и) мутасинтетического санглиферина" относится к химическим соединениям, которые структурно подобны санглиферину А, В, С или D, но которые немного отличаются по составу (как при замене одного атома на другой или наличием или отсутствием конкретной функциональной группы), в частности,образуемые путем ферментации Streptomyces sp. A92-308110 или его мутанта, когда культура подкормлена аналогом метатирозина. Как используется в данном описании, термин "аналог(и) метатирозина" относится к химическим соединениям, которые структурно подобны метатирозину, но немного отличаются по составу (как при замене одного атома на другой или наличием или отсутствием конкретной функциональной группы), в частности, такие, которые описаны формулой (III). Как используется в данном описании, термин "HCV" относится к вирусу гепатита С, оболочечному вирусу с одноцепочечной РНК вирусного семейства Flaviviridae. Как используется в данном описании, термин "ВИЧ" относится к вирусу иммунодефицита человека,возбудителю синдрома приобретенного иммунодефицита у человека. Как используется в данном описании, термин "биодоступность" относится к степени, с которой, или скорости, при которой препарат или иное вещество поглощается или становится доступным на участке биологической активности после введения. Это свойство зависит от ряда факторов, включая растворимость соединения, скорость абсорбции в кишечнике, степень связывания белка и метаболизма т.д. В данном описании описаны различные тесты на биодоступность, которые известны специалисту в данной области техники (см. также Egorin et al., 2002). Термин "растворимость в воде", как используется в настоящем описании, относится к растворимости в водной среде, например, в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) при рН 7,4,или в 5%-ном растворе глюкозы. Исследования по растворимости в воде представлены ниже в примерах в качестве "анализ на растворимость в воде". Фармацевтически приемлемые соли соединений по изобретению, такие как соединений формулы(I), включают общеизвестные соли, образованные фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими кислотами или основаниями, а также четвертичные аммониевые соли кислот. Более конкретные примеры подходящих солей кислот включают соли хлористо-водородной, бромистоводородной, серной, фосфорной, азотной, перхлорной, фумаровой, уксусной, пропионовой, янтарной,гликолевой, муравьиной, молочной, малеиновой, винной, лимонной, пальмовой, малоновой, гидроксималеиновой, фенилуксусной, глутамовой, бензойной, салициловой, фумаровой, толуолсульфоновой, метансульфоновой, нафталин-2-сульфоновой, бензолсульфоновой гидроксинафтоевой, йодистоводородной,яблочной, стеариновой кислот, таннина и т.п. Особый интерес представляют соли хлористо-водородной кислоты. Хотя другие кислоты, такие как щавелевая, не являются сами по себе фармацевтически приемлемыми, они могут быть полезны при получении солей, используемых в качестве промежуточных соединений при получении соединений по изобретению и их фармацевтически приемлемых солей. Более конкретные примеры подходящих солей оснований включают соли натрия, лития, калия, магния, алюминия, кальция, цинка, N,N'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, N-метилгюкамина и прокаина. Ссылки в данном описании на соединение согласно изобретению включают как соединения формулы (I), так и их фармацевтически приемлемые соли. Как используется в данном описании, термин "алкил" означает прямую или разветвленную цепь алкильной группы. Примером алкила является C1-6 алкил, например С 1-4 алкил."Алкенил" относится к алкильной группе, содержащей два или более атомов углерода, которые являются ненасыщенными с одной или несколькими двойными связями. Примеры алкильных групп включают С 1-4 алкильные группы, такие как метил, этил, н-пропил, изопропил и н-бутил. Примеры алкенильных групп включают С 2-4 алкенильные группы, такие как -СН=СН 2 и -СН 2 СН=СН 2. Термин "лечение" включает профилактическое, а также терапевтическое лечение. Описание фигур На фиг. 1 представлены структуры соединений и система нумерации санглиферина А. На фиг. 2 представлен 1H ЯМР соединения 14. На фиг. 3 представлен 1H ЯМР соединения 15. На фиг. 4 представлен 1H ЯМР соединения 16. На фиг. 5 представлен 1H ЯМР соединения 17. На фиг. 6 представлен 1H ЯМР соединения 18. На фиг. 7 представлен 1 Н ЯМР соединения 19. На фиг. 8 представлен 1 Н ЯМР соединения 20. Описание изобретения Настоящее изобретение относится к аналогам мутасинтетического санглиферина, как указано выше, способам получения указанных соединений и способам применения указанных соединений в медицине. В одном варианте осуществления изобретения соединение представляет собой его метанольный аддукт, в котором кеталь образован путем комбинации С-53 кето и С-15 гидроксильных групп и метанола. В другом варианте осуществления изобретения этого нет. В некоторых вариантах осуществления изобретения атом углерода C1-10 алкильной группы (например, C1-6 алкильной группы), которая может быть представлена одним или более из R1, R2, R3, R4 и R5,может быть заменен гетероатомом. Если -СН 3 заменен на N, полученная группа представляет собой -NH2. Если -СН 2- заменен на N, полученная группа представляет собой -NH-. Если -CHR- заменен на N, полученная группа представляет собой -NR-. Следовательно, атомы азота в R1, R2, R3, R4 и R5 могут быть первичными, вторичными или третичными атомами азота. Если -СН 3 заменен на О, полученная группа представляет собой -ОН. Когда атом углерода C1-10 алкильной группы (например, C1-6 алкильной группы), которая может быть представлена одним или более из R1, R2, R3, R4 и R5, может быть заменен гетероатомом, подходящим является замена на О, S или N, в особенности, N или O, в частности О. Когда любой из R1, R2, R3, R4 и R5 содержит группу S(O)p, переменная р соответствующим образом представляет собой 0 или 1. В одном варианте осуществления изобретения р равен 0. В другом варианте осуществления изобретения р равен 1. В другом варианте осуществления изобретения р равен 2. Когда C1-10 алкильная группа (например, С 1-6 алкильная группа), которая может быть представлена одним или более из R1, R2, R3, R4 и R5, содержит более одного гетероатома, они обычно разделены двумя или более атомами углерода. Подходящим является, когда атом углерода C1-10 алкильной группы (например, C1-6 алкильной группы), которая может быть представлена одним или более из R1, R2, R3, R4 и R5, не заменен каким-либо гетероатомом или еще представляет собой ОН или NH2. Когда атом углерода C1-10 алкильной группы (например, C1-6 алкильной группы), которая может быть представлена одним или более из R1, R2, R3, R4 и R5, может быть заменен на карбонил, подходящим является, когда карбонил расположен по соседству с другим атомом углерода или атомом азота. Подходящим является, когда карбонильные группы не расположены по соседству с атомами серы или кислорода. Например, один или более из R1, R2, R3, R4 и R5 могут представлять собой -COC1-3 алкил, например-СОМе. Подходящим является, когда атом углерода C1-10 алкильной (например, C1-6 алкильной) группы, которая может быть представлена одним или более из R1, R2, R3, R4 и R5, не заменен на карбонил.C1-10 алкильная группа (например, C1-6 алкильная группа), которая может быть представлена одним или более из R1, R2, R3, R4 и R5, может быть замещена одним или более атомами галогена. Например,один или более из R1, R2, R3, R4 и R5 могут представлять собой -CF3. Альтернативно, один или более изR1, R2, R3, R4 и R5 могут представлять собой C1-10 алкил (например, C1-6 алкил), замещенный одним или более (например, одним) атомами Cl или F (например, -CH2CH2Cl). Подходящим является, когда C1-10 алкильная группа (например, C1-6 алкильная группа) из R1, R2, R3,R4 или R5 не замещена галогеном. Когда одна или более из R1, R2, R3, R4 и R5 представляют собой C1-10 алкильную группу (например,С 1-6 алкильную группу), подходящим является, когда группа(ы) представляет(ют) собой C1-4 алкил (например, C1-2 алкил, такой как метил). В варианте осуществления изобретения один или более из R1, R2, R3, R4 и R5 представляют собойC1-6 алкил (такой как C1-2 алкил) или С 2-3 алкенил, например, один или более из R1, R2, R3, R4 и R5 представляют собой метил. Подходящим является, когда R1 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН или C1-6 алкил (например, метил). Наиболее подходящим является, когда R1 представляет собой Н или F, в особенности Н. Подходящим является, когда R2 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН, NH2 или C1-6 алкил (например,метил). Более подходящим является, когда R2 представляет собой Н, F, ОН или NH2, в особенности, ОН. Подходящим является, когда R3 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН или C1-6 алкил (например, метил). Более подходящим является, когда R3 представляет собой Н, Me или F. R3 также может представлять собой этил. Подходящим является, когда R4 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН или C1-6 алкил (например, метил). Более подходящим является, когда R4 представляет собой Н или F. Подходящим является, когда R5 представляет собой Н, F, Cl, CF3, ОН или C1-6 алкил (например, метил). Более подходящим является, когда R5 представляет собой Н или F. Подходящим является, когда один или несколько, более подходящим является, когда два или более(например, три или более) из R1, R2, R3, R4 или R5 не представляют собой Н. Подходящим является, когда один или более, например, два или более из R1, R2, R3, R4 или R5 пред-9 022408 ставляют собой F. Подходящим является, когда R3, или R4, или R3 и R4 представляют собой F. В другом варианте осуществления изобретения R1 и R3 представляют собой F. В одном варианте осуществления изобретения X1 представляет собой N (следовательно, R1 отсутствует). В другом, более предпочтительном варианте осуществления изобретения X1 представляет собой С. Подходящим является, когда Х 2 представляет собой С. Подходящим является, когда Х 3 представляет собой С. Подходящим является, когда Х 4 представляет собой С. Подходящим является, когда X5 представляет собой С. В одном варианте осуществления изобретения соединение представляет собой соединение формулы (I). В другом варианте осуществления изобретения соединение представляет собой соединение формулы (II). В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой F, R5 представляет собой Н, и X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой F, R4 представляет собой F, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой F, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и X5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой Me, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой Н, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой NH2, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой F, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой H, R4 представляет собой F, R5 представляет собой Н, X1 представляет собой N и Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: которая также может быть представлена как В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой F, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой F, R4 представляет собой F, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой F, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой Me, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, X2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой Н, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой NH2, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой F, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой Et, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, X2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой F, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой F, R4 представляет собой Н, R5 представляет собой Н, X1, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: В приемлемом варианте осуществления изобретения R1 представляет собой Н, R2 представляет собой ОН, R3 представляет собой Н, R4 представляет собой F, R5 представляет собой Н, X1 представляет собой N, Х 2, Х 3, Х 4 и Х 5 представляют собой С, как это продемонстрировано следующей структурой: которая также может быть представлена как В некоторых вариантах осуществления изобретения двойная связь в положении С 26, 27 (со ссылкой на структуру санглиферина А) может быть в виде цис вместо транс. Как правило, соединения по изобретению получают мутасинтезом. Обычно, способ получения некоторых соединений формулы (I) или (II) или его фармацевтически приемлемой соли включает затравку бактериологического ферментативного бульона культурой производителя санглиферина(такого как Streptomyces sp. A92-308110 (известный также как DSM 9954 или более предпочтительно производителя санглиферина с инактивированным или удаленным геном sfaA или гомологом гена sfaA; подпитку бактериологического ферментативного бульона аналогом метатирозина (как показано в формуле (III; проведение ферментации до получения аналога санглиферина; экстракцию и выделение аналога санглиферина где R7 представляет собой Н или группу, образующую сложный эфир, такую как алкильная группа,например C1-6 алкил, такой как Me. Подходящие Х 1, Х 2, Х 3, Х 4, Х 5, R1, R2, R3, R4 и R5 группы в формуле (III) являются такими, как определено для соединений формулы (I) и (II). Подпиткой может быть рацемическая или L-форма соединения формулы (III). Соединения формулы (III) являются либо коммерчески доступными, либо получены обычными способами синтеза органической химии. Один общий путь получения соединений формулы (III) такой,как показано на следующей схеме 1:(IV) с подходящим фрагментом,например,(R7O)2P(О)СН(NHPG)CO2R7,b) гидрирование и удаление защитных групп, если необходимо. PG=защитная группа. Альдегиды формулы (IV) могут быть коммерчески доступными или легко могут быть синтезированы специалистом в данной области. При получении соединений формулы (III) из соединений формулы(IV) может быть необходимым использовать приемы введения и удаления защитных групп. Эти методы известны специалисту в данной области, и подходящие защитные группы описаны в обзоре Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (Wuts andGreene, 4th Edition, 2007). В дополнение к конкретным способам и ссылкам, предложенным в настоящем описании, специалист в данной области может также обратиться к ссылкам на способы синтеза в обычных учебниках,включая, но, не ограничиваясь ими, Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (Furniss et al., 1989) иMarch's Advanced Organic Chemistry (Smith и March, 2001). Мутасинтетический аналог санглиферина согласно изобретению может быть введен самостоятельно или в комбинации с другими терапевтическими агентам. Совместное введение двух (или более) средств может позволить уменьшить дозу каждого из используемых, снижая, таким образом, побочный эффект, что может привести к улучшению эффективности и, следовательно, повышенной SVR, и уменьшить резистентность. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения мутасинтетический аналог санглиферина вводят совместно с одним или несколькими терапевтическим(ими) средством(ами) при лечении инфекции HCV, согласно стандартам проведения лечения. Таким средством может быть интерферон(например, pIFN и/или рибавирин). В альтернативном варианте осуществления изобретения мутасинтетический аналог санглиферина вводят совместно с одним или нескольким другими противовирусными средствами, такими как STATC/DAA (в частности, средство-мишень для лечения HCV), которое может представлять собой одно или более из следующих: ненуклиозидные ингибиторы полимеразы (например, IDX375, VCH-222, BI 207127,ANA598, VCH-916), нуклеозидные или нуклеотизные ингибиторы полимеразы (например, 2'-Сметилцитидин, 2'-С-метиладенозин, R1479, PSI-6130, R7128, R1626), ингибиторы протеазы (например,BILN-2061, VX-950 (телапревир), SCH503034 (боцепревир), ТМС 435350, MK-7009, R7227/ITMN-191,ЕА-058, ЕА-063) или ингибиторы проникновения вирусов (например, PRO 206). Препараты удобным образом могут быть представлены в виде единичной дозированной формы и могут быть получены любым способом, хорошо известным в области фармации. Такие способы включают стадию приведения в контакт активного ингредиента (соединение по изобретению) с носителем, который представляет собой один или более ингредиентов состава. Обычно препараты получают путем равномерного и тщательного перемешивания активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с обоими, и затем, если необходимо, формования продукта. Соединения по изобретению обычно вводят перорально в виде фармацевтического препарата, содержащего активный ингредиент, необязательно, в виде нетоксичной аддитивной соли органической или неорганической кислоты или основания, в фармацевтически приемлемой дозированной форме. В зависимости от заболевания и получающего лечение пациента, а также от пути введения, композиции могут быть введены в различных дозах. Например, соединения по изобретению могут быть введены перорально, буккально или подъязычно в виде таблеток, капсул, овул, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать ароматизирующие или окрашивающие агенты, для применения с немедленным, замедленным или контролируемым высвобождением. Такие таблетки могут содержать инертные эксципиенты, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин, дезинтегранты,такие как крахмал (предпочтительно, кукурузный, картофельный крахмал или крахмал из тапиоки), натрийкрахмалгликолят, натрийкроскармеллоза и некоторые сложные силикаты, и гранулирующие связующие агенты, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), гидроксипропилцеллюлоза (НРС), сахароза, желатин и камедь. Дополнительно могут быть включены агенты, такие как агенты, придающие скольжение, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерина бегенат и тальк. Твердые составы подобного типа также могут быть использованы в виде наполнителей в желатиновых капсулах. В этом отношении предпочтительные инертные эксципиенты включают лактозу, крахмал,целлюлозу, молочный сахар или высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Для водных суспензий и/или эликсиров соединения по изобретению могут быть объединены с различными подслащивающими или ароматизирующими агентами, красящим веществом или красками, с эмульгирующим и/или суспендирующим агентами и с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, и их комбинациями. Таблетка может быть изготовлена прессованием или формованием, необязательно с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть изготовлены путем прессования в соответствующей машине активного ингредиента в свободной текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим агентом (например, повидоном, желатином, гидроксипропилметилцеллюлозой), лубрикантом, инертным разбавителем, консервантом, дезинтегрантом(например, натрийкрахмалгликолятом, поперечно-связанным повидоном, поперечно-связанной натрийкарбоксиметилцеллюлозой), поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены формовкой в соответствующей машине смеси порошкообразного соединения с инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут быть покрыты или на них могут быть нанесены пометки, и они могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента с использованием, например, гидроксипропилметилцеллюлозы в различных пропорциях для обеспечения желаемого режима высвобождения. Препараты согласно настоящему изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, саше или таблетки, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или в неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле. Активный ингредиент может быть также представлен в виде болюса,электуария или пасты. Следует понимать, что в дополнение к ингредиентам, конкретно указанным выше, препараты по данному изобретению могут включать другие агенты, общеизвестные в данной области, относящиеся к виду рассматриваемого препарата, например, подходящие для перорального введения препараты могут включать ароматизирующие агенты. Агенты, такие как консерванты и буферирующие агенты, могут быть успешно растворены в наполнителе. Для повышения стабильности, после помещения в пузырек композиция может быть заморожена,и вода удалена в вакууме. Затем пузырек с сухим лиофилизованным порошком может быть снабжен пузырьком с водой для инъекций для восстановления жидкого препарата перед использованием. Доза вводимого соединения по изобретению будет меняться в соответствии с конкретным соединением, со страдающим заболеванием субъекта и природой и серьезностью заболевания и физического состояния субъекта, и выбранного пути введения. Соответствующая доза может быть легко определена специалистом в данной области. Композиции могут содержать 0,1% по массе, предпочтительно 5-60%, более предпочтительно 1030% по массе, соединения по изобретению, в зависимости от способа введения. Специалисту в данной области понятно, что оптимальное количество и интервал индивидуальных дозировок соединения по изобретению будут определяться природой и пределами возможности подвергаемого лечению состояния, формой, путем и участком введения, а также возрастом и состоянием конкретного, находящегося на лечении субъекта, и что лечащий врач окончательно устанавливает подходящие дозы, которые должны быть использованы. Указанное дозирование можно повторять так часто, как это необходимо. В случае развития побочных эффектов количество и/или частоту дозировок можно изменить или снизить в соответствии с обычной клинической практикой. Следующие аспекты изобретения включают соединение согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического препарата; соединение согласно изобретению для применения в качестве фармацевтического препарата при лечении вирусных инфекций (в особенности, ДНК-вирусных инфекций), таких как HCV или ВИЧ инфекции, для применения в качестве противовоспалительного средства или для профилактики отторжения трансплантатов органов; фармацевтическую композицию, содержащую соединение согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем; фармацевтическую композицию, содержащую соединение согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, содержащую дополнительно второй или последующий активный ингредиент, в особенности, активный ингредиент, показанный при лечении вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ инфекции, для применения в качестве противовоспалительного средства или для профилактики отторжения трансплантатов органов; способ лечения вирусных инфекций (в особенности, ДНК-вирусных инфекций), таких как HCV или ВИЧ инфекции, для применения в качестве противовоспалительного средства или для профилактики отторжения трансплантатов органов, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения согласно изобретению; применение соединения согласно изобретению при получении лекарственного средства для лечения вирусных инфекций, таких как HCV или ВИЧ инфекции, для применения в качестве противовоспалительного средства или для профилактики отторжения трансплантатов органов; способ получения мутасинтетического санглиферина (такого как соединение формулы (I) или (II,который включает подпитку продуцирующих санглиферин бактерий, таких как Streptomyces sp (например, А 92-308110), соединением формулы (III) или его солью, и культивирование таких бактерий, которые вырабатывают мутасинтетический санглиферин; способ в соответствии с предыдущим абзацем, где бактерией, вырабатывающей санглиферин, является Streptomyces sp, в котором ген sfaA или гомолог гена sfaA инактивирован или удален; способ в соответствии с предыдущими двумя абзацами, дополнительно включающий стадию выделения мутасинтетического санглиферина. Новые соединения формулы (III) (такие как перечислено в табл. 1, и кислоты и сложные эфиры соединений формулы (III), как перечислено в табл. 1) и формулы (IV), включая их соли и сложные эфиры,также образуют аспект изобретения. Общие способы. Вещества и способы. Штаммы бактерий и условия роста. Производитель санглиферина Streptomyces sp. A92-308110 (DSM no 9954, приобретен у фирмыDSMZ, Braunschweig, Germany), также называемый BIOT-4253 и BIOT-4370 или его производные, такие как BIOT-4585, поддерживаемый на среде овсяного агара, МАМ, ISP4 или ISP2 (см. далее) при температуре 28 С.pKC1139, стандартную Streptomyces-E.coli челночную плазмиду, получали от фирмы John InnesBIOT-4585 выращивали на овсяном агаре при температуре 28 С в течение 7-10 дней. Споры с поверхности агарного планшета собирали в раствор 20% мас./об. стерильного глицерина в дистиллированной воде и хранили по 0,5 мл аликвот при температуре -80 С. Штамм замороженных спор использовали для затравки посевной среды SGS или SM25-3. Посевную среду с затравкой инкубировали при встряхивании в интервале 200 и 300 об/мин при 5,0 или 2,5 см амплитуде качания при температуре 27 С в течение 24 ч. В ферментативную среду SGP-2 или ВТ 6 вносили затравку 2,5-10% семян культуры и инкубировали при встряхивании в интервале 200 и 300 об/мин при 5 или 2,5 см амплитуде качания при температуре 24 С в течение 4-5 дней. Затем культуру собирали для экстракции. Аналоги метатирозина. МетилL-3 аминофенилаланина, метиловый эфир L-4-метилметатирозина, метиловый эфир L-4-фторметатирозина и метиловый эфир L-4,5-дифторметатирозина получали от фирмы Netchem (USA).DL-3-фторфенилаланин и L-фенилаланин были получены от фирмы Sigma (UK).DL-метатирозин был получен от фирмы Fluorochem (UK).L-метатирозин был получен от фирмы Alfa Aesar (UK). К раствору 8-1 (3 г, 19,5 ммоль) в сухом DCM (150 мл) добавляли по каплям BBr3 (4 M в DCM, 14,6 мл, 58,5 ммоль) при температуре -70 С. После добавления реакционную смесь перемешивали при температуре -20 С в течение 3 ч, осторожно добавляли ледяную воду и экстрагировали DCM. Органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, с получением желаемого соединения 8-2. К раствору 8-2 (0,9 г, 6,4 ммоль) в ацетоне (40 мл) при комнатной температуре добавляли K2CO3(2,2 г, 16 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли воду и ацетон удаляли в вакууме, затем экстрагировали EtOAc, органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, с получением желаемого соединения 8-3. Смесь 8-3 (1 г, 4,34 ммоль), гиппуровой кислоты (860 мг, 4,80 ммоль), NaOAc (400 мг) и Ас 2 О (2,2 мл) перемешивали при температуре 80 С в течение 2 ч. Реакционную смесь желтого цвета охлаждали и добавляли холодный EtOH (10 мл), смесь охлаждали на ледяной бане в течение 15 мин и затем выливали в 30 мл ледяной воды, охлаждали, и продукт собирали фильтрованием. Твердое вещество сушили в вакууме, с получением соединения 8-4. Раствор соединения 8-4 (300 мг, 0,8 ммоль) и NaOAc (71 мг, 0,87 ммоль) в МеОН (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляли роторным упариванием, и остаток растворяли в 50 мл EtOAc, EtOAc раствор промывали два раза водой и концентрировали, с получением соединения 8-5. Раствор соединения 8-5 (360 мг, 0,89 ммоль) в МеОН (50 мл) подвергали гидрированию над 10%Pd/C (77 мг) при нормальном давлении в течение 20 час. После удаления катализатора фильтрованием,растворитель упаривали, с получением продукта 8-6. Раствор соединения 8-6 (210 мг) в 3 н. HCl (10 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 24 ч, раствор упаривали досуха и остаток очищали флэш-хроматографией с обращенной фазой (reversecombiflash), с получением целевого продукта 8. К раствору соединения 9-1 (20 г, 97,55 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) при температуре -78 С добавляли по каплям н-бутиллитий (43 мл, 2,5 М, 107,3 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 мин и при этой температуре добавляли N,N-диметилформамид (15,1 мл, 195,1 ммоль). Смесь перемешивали в течение еще 30 мин и удаляли охлаждающую баню. Спустя 1 час реакцию гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония. Органический слой промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили (сульфат натрия), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, с получением соединения 9-2. К раствору соединения 9-2 (6 г, 38,9 ммоль) в сухом DCM (200 мл) при температуре -70 С добавляли по каплям BBr3 (4 М в DCM, 30 мл, 116,8 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при температуре -20 С в течение 3 ч, осторожно добавляли ледяную воду и экстрагировали DCM. Органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над Na2SO4,фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, с получением желаемого соединения 9-3. К раствору метил 2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (4,64 г, 14 ммоль) в DCM (150 мл) при комнатной температуре добавляли DBU (4,26 г, 28 ммоль). Спустя 10 мин добавляли соединение 9-3 (1,95 г, 14 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор разбавляли EtOAc (150 мл), разделяли и органический слой промывали 1 н. HCl, сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле, с получением соединения 9-4. Раствор соединения 9-4 (1 г) в МеОН (20 мл) подвергали гидрированию над 200 мг 10% Pd/C при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора путем фильтрования растворитель упаривали, с получением соединения 10. К раствору соединения 10 (300 мг, 1,4 ммоль) в EtOH (30 мл) добавляли водн. NaOH (2 н., 4 мл), реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Растворитель удаляли и остаток нейтрализовали до рН 6 с помощью 2 н. HCl, образовавшиеся кристаллы белого цвета собирали фильтрованием, с получением целевого соединения 9. Метил 2-амино-3-(2-фтор-5-гидроксифенил)пропаноат (11) К раствору соединения 11-1 (1,4 г, 9 ммоль) в 50 мл DCM при температуре -78 С добавляли по каплям BBr3 (4 М в DCM, 3,6 мл, 13,5 ммоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при температуре -20 С в течение 4 ч. Затем медленно добавляли смесь лед/вода, слои разделяли, органические слои промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над Na2SO4 и упаривали досуха. Остаток использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору метил 2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил) ацетата (3 г, 9 ммоль) в 100 мл DCM при комнатной температуре добавляли DBU (2,8 г, 18 ммоль), через 10 мин добавляли соединение 11-2 (неочищенное соединение с последней стадии), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор затем разбавляли DCM (50 мл), промывали 1 н. HCl (20 мл), сушили над Na2SO4 и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=5/1), с получением соединения 11-3. Смесь соединения 11-3 (500 мг, 1,5 ммоль) в МеОН (20 мл) подвергали гидрированию над 50 мг 10% Pd/C при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора путем фильтрования,растворитель упаривали, с получением неочищенного продукта, который очищали флэшхроматографией с обращенной фазой (reverse-combiflash), с получением соединения 11 в виде белого твердого вещества. Метил 2-амино-3-(2-фтор-3-гидроксифенил)пропаноат (12) К раствору соединения 12-1 (1,4 г, 9 ммоль) в 50 мл DCM при температуре -78 С добавляли по каплям BBr3 (4 М в DCM, 3,6 мл, 13,5 ммоль). После добавления реакционную смесь перемешивали при температуре -20 С в течение 4 ч. После медленного добавления смеси лед/вода, слои разделяли, органический слой промывали водой и насыщенным раствором соли, сушили над Na2SO4 и упаривали досуха. Остаток использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. К раствору метил 2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил) ацетата (3 г, 9 ммоль) в 100 мл DCM при комнатной температуре добавляли DBU (2,7 мл, 18 ммоль), через 10 мин добавляли соединение 12-2 (неочищенное соединение с последней стадии), перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор затем разбавляли DCM (100 мл), промывали 1 н. HCl (30 мл), сушили надNa2SO4 и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=5/1), с получением соединения 12-3. Смесь соединения 12-3 (500 мг, 1,44 ммоль) в МеОН (10 мл) подвергали гидрированию над 100 мг 10% Pd/C при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора путем фильтрования растворитель упаривали, с получением неочищенного продукта, который очищали флэшхроматографией с обращенной фазой (reverse-combiflash), с получением желаемого соединения 12 в виде белого твердого вещества. Метил 2-амино-3-(2,6-дифтор-3-гидроксифенил)пропаноат (13) К раствору 2,4-дифторфенола (2 г, 15,4 ммоль) в 50 мл ДМФ при температуре 0 С добавляли K2CO3(3,2 г, 23,1 ммоль) и BnBr (2,2 мл, 18,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавляли воду (100 мл) и ЕА (200 мл), органические слои промывали водой (50 мл) и насыщенным раствором соли (50 мл), сушили над Na2SO4 и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=10/1), с получением неочищенного соединения 13-1. К раствору соединения 13-1 (2 г, 9 ммоль) в 10 мл ТГФ при температуре -78 С добавляли по каплямH-BuLi (4 мл, 2,5 М) и перемешивали в течение 30 мин. Добавляли ДМФ (1,3 г, 0,018 ммоль) и вновь перемешивали в течение 30 мин. Затем охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешива- 20022408 ли при комнатной температуре в течение 1 ч, затем гасили водой. Смесь экстрагировали этилацетатом(20 мл 3), сушили над Na2SO4 и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле(петролейный эфир/этилацетат=10/1), с получением соединения 13-2 в виде желтого твердого вещества. К раствору метил 2-(бензилоксикарбониламино)-2-(диметоксифосфорил)ацетата (728 мг, 2,2 ммоль) в 20 мл DCM при комнатной температуре добавляли DBU (319 мг, 2,1 ммоль). Спустя 10 мин добавляли соединение 13-2 (500 мг, 2 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Раствор затем разбавляли DCM (50 мл), промывали 1 н. HCl (20 мл), сушили над Na2SO4 и упаривали досуха. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=5/1) с получением 13-3 в виде масла желтого цвета. Соединение 13-3 (600 мг, 1,32 ммоль) в МеОН (20 мл) подвергали гидрированию над 60 мг 10%Pd/C при нормальном давлении в течение ночи. После удаления катализатора путем фильтрования растворитель упаривали, с получением неочищенного продукта, который очищали флэш-хроматографией с обращенной фазой (reverse-combiflash), с получением желаемого соединения 13 в виде твердого вещества белого цвета. Составы сред. Воду, используемую для приготовления питательной среды, получали, используя систему для очистки воды Millipore Elix Analytical Grade. Питательная среда для посева SGS рН для предварительной стерилизации доводили до рН 7,0 с помощью 10 М NaOH/10 M H2SO4,стерилизовали путем нагревания при температуре 121 С, 20-30 мин (автоклавирование). Внимание:противовспениватель использовали только в биореакторах для посева, не в колбах для посева, окончательный объем устанавливали в соответствии с учетом объема посева. или его соли,рН для предварительной стерилизации доводили до рН 6,8 с помощью 10 М NaOH,стерилизовали путем нагревания при температуре 121 С, 20-30 мин (автоклавирование). Внимание:окончательный объем устанавливали в соответствии с учетом объема посева, противовспениватель использовали только в биореакторах, не в колбах. Среда SM25-3 Делали пасту с крахмалом в небольшом количестве холодной воды и доводили до объема 500 мл. Добавляли другие ингредиенты в раствор II в 500 мл воды, рН должно быть в пределах от рН 7,0 до рН 7,4 (рН 7,3). Смешивали два раствора вместе и добавляли агар. Криоконсервированные штаммы спор BIOT-4585 размораживали при комнатной температуре. Растительные культуры (культуры семян) получали путем перенесения 4,0 мл штаммов спор в 400 мл средыSM25 в 2-л колбу Эрленмейера с пробкой из пены. Культивирование проводили в течение 48 ч при 27 С и 250 об/мин (5,0 см амплитуда качания). Из культуры семян 25 мл переносили в 250 мл производственной среды SGP2+5% HP20 2 л в колбу Эрленмейера с пробкой из пены. После 24 ч культивирования при 24 С и 250 об/мин (2,5 см амплитуда качания) добавляли 2 мл 250 мМ рацемического или 125 мМ энантиомерно чистого раствора нужного предшественника в 1 М хлористо-водородной кислоте и 2 мл 250 мМ метанольного раствора DL-пиперазиновой кислоты в каждую производственную колбу до конечной концентрации 1 мМ отдельных энантиомеров предшественников. Культивирование продолжали еще в течение четырех дней при 24 С и 250 об/мин (2,5 см амплитуда качания). Анализ культуральных бульонов с помощью ЖХ-УФ и ЖХ-УФ-МС. Культуральный бульон (1 мл) и этилацетат (1 мл) добавляли и перемешивали в течение 15-30 мин,затем центрифугировали в течение 10 мин. Собирали 0,4 мл органического слоя, упаривали досуха и затем повторно растворяли в 0,20 мл ацетонитрила. Условия ВЭЖХ: С 18 Heperclone BDS C18 Колонка 3 мкм, 4,6 мм 150 мм Снабженная системой защиты для ВЭЖХ колонок Phenomenex Analytical C18, держатели картриджа KJ0-4282 Температура колонки при 50 С Скорость потока 1 мл/мин Монитор УФ при 240 нм Инжектируемая аликвота 20 мкл Градиент растворителей: 0 мин: 55% В 1,0 мин: 55% В 6,5 мин: 100% В 10,0 мин: 100% В 10,05 мин: 55% В 13,0 мин: 55% В Растворитель А представляет собой смесь вода+0,1% муравьиная кислота Растворитель В представляет собой смесь ацетонитрил+0,1% муравьиная кислота В этих условиях SfA элюируется на 5,5 мин В этих условиях SfB элюируется на 6,5 мин ЖХ-МС осуществляли на интегрированной системе ВЭЖХ Agilent НР 1100 в сочетании с BrukerQC ЖХ-МС способ. Условия ВЭЖХ: С 18 Hyperclone BDS C18, Колонка 3 мк, 4,6 мм 150 мм Снабженная системой защиты для ВЭЖХ колонок Phenomenex Analytical C18, держатели картриджа KJ0-4282 Температура колонки 50 С Скорость потока 1 мл/мин Монитор УФ при 210, 240 и 254 нм Градиент растворителей: 0 мин: 10% В 2,0 мин: 10% В 15 мин: 100% В 17 мин: 100% В 17,05 мин: 10% В 20 мин: 10% В Растворитель А представляет собой смесь вода+0,1% муравьиная кислота Растворитель В представляет собой смесь ацетонитрил+0,1% муравьиная кислота Условия МС: МС работает в режиме коммутации (переключение между положительным и отрицательным), сканируя от 150 до 1500 а.е.м. ЖХ-МС метод in vitro анализа (например, для оценки микросомальной стабильности) Используемые приборы API-2000, API-4000 или UPLC Условия ВЭЖХ: для соединения 15: ACQUITY UPLC ВЕН С 18 (2,150 мм, 1,7 мкм) для соединений 5, 14, 16, 17, 18, 19 Ultimate XB-C18 (2,150 мм, 5 мкм). Температура колонки при 50 С Скорость потока 0,6 мл/мин Градиент растворителей А 1 (например, для соединения 15): 0,2 мин: 20% В 0,6 мин: 95% В 1,1 мин: 95% В 1,15 мин: 20% В 1,5 мин: стоп Растворитель А представляет собой смесь Н 2 О-0,025% FA-1 мМ NH4OAC Растворитель В представляет собой смесь ACN-0,025% FA-1 мМ NH4OAC Градиент растворителей А 2 (например, для соединений 5, 14, 16, 17, 18, 19): 0,3 мин: 10% В 0,8 мин: 95% В 2,3 мин: 95% В 2,31 мин: 10% В 3,5 мин: стоп Растворитель А представляет собой смесь Н 2 О-0,1% FA Растворитель В представляет собой смесь МеОН-0,1% FA отрицательный режим сканирования:In vitro анализ репликонов для оценки противовирусной HCV активности. Противовирусная эффективность против HCV генотипа 1 может быть исследована следующим образом. За день до добавления исследуемого вещества, клетки Huh5.2, содержащие репликон HCV генотипаI389luc-ubi-neo/NS3-375.1 (Vrolijk et al., 2003) и субкультивированные в среде для роста клеток [DMEM(Cat41965039) с добавлением 10% FCS, 1% заменимых аминокислот (11140035), 1% пенициллина/стрептомицина (15140148) и 2% генетицина (10131027); Invitrogen] в соотношении 1,3-1,4 и выращенные в течение 3-4 дней в 75 мл колбах для культур ткани (Techno Plastic Products), собирали и высевали в аналитическую среду (DMEM, 10% FCS, 1% заменимых аминокислот, 1% пенициллина/стрептомицина) при плотности 6500 клеток/лунка (100 мкл/лунка) в микротитровальные 96-луночные планшеты для культуры тканей (Falcon, Beckton Dickinson для оценки антиметаболический эффект и CulturPlate, PerkinElmer для оценки противовирусного эффекта). Микротитровальные планшеты инкубировали в течение ночи (37 С, 5% CO2, 95-99% относительной влажности), с получением несливающегося монослоя клеток. Готовили серийные разведения; каждые серии разведения осуществляли, по меньшей мере, дважды. Следуя установке анализа, микротитровальные планшеты инкубировали в течение 72 ч (37 С, 5% СО 2,95-99% относительной влажности). Для оценки антиметаболических эффектов, аналитическую среду отсасывали, заменяя на 75 мкл 5%-ного раствора MTS (Promega) в среде без фенола красного, и инкубировали в течение 1,5 ч (37 С, 5%CO2, 95-99% относительной влажности). Оптическую плотность измеряли при длине волны 498 нм (Safire2, Tecan) и оптические плотности (оптическую плотность) преобразовывали в процент от необрабо- 24022408 танного контроля. Для оценки противовирусных эффектов аналитическую среду отсасывали и клеточные монослои промывали PBS. Промывочный буфер отсасывали, добавляли 25 мкл лизирующего буфера Glo (Cat. . Е 2661, Promega), после чего в течение 5 мин при комнатной температуре клетки оставляли лизироваться. Затем добавляли 50 мкл системы для анализа люциферазы (Cat.Е 1501, Promega) и сразу считали сигнал люминесценции люциферазы (1000 мс время интегрирования/лунка, Safire2, Tecan). Относительные единицы люминесценции преобразовывали в процент от необработанного контроля. ЕС 50 и ЕС 90 (значения, полученные с помощью кривой доза-ответ) представляют собой концентрации, при которых соответственно наблюдалось 50 и 90% ингибирование репликации вируса. СС 50 (значение, полученное с помощью кривой доза-ответ) представляет собой концентрацию, при которой метаболическая активность клеток будет снижена до 50% относительно метаболической активности необработанных клеток. Индекс селективности (SI), показатель терапевтического окна соединения, рассчитывается как СС 50/ЕС 50. Концентрация соединения считается вызывающей подлинное противовирусное действие в системе репликона HCV, если при этой конкретной концентрации наблюдается антирепликоновое действие выше 70% предельного значения и не более чем 30% уменьшение в метаболической активности. Результаты см. в примере 12.In vitro анализ репликонов для оценки противовирусной HCV активности в генотипах 1 а и 2 а. Клетки с репликонами (субгеномные репликоны генотипа 1 а (Н 77) и 2 а (JFH-1 выращивали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина-стрептомицина, 1% глутамина, 1% заменимых аминокислот, 250 мкг/мл G418 в 5% СО 2 инкубаторе при температуре 37 С. Все реагенты клеточных культур могут быть приобретены в Mediatech (Herndon,VA). Клетки с репликонами обрабатывали трипсином и высевали в количестве 5103 клеток на лунку в 96-луночные планшеты с указанной выше средой без G418. На следующий день, культуральную среду заменяли содержащими DMEM соединениями, серийно разведенными в присутствии 5% FBS. В противовирусном анализе репликонов изучали эффекты соединений в серийных разведениях. Кратко, клетки,содержащие репликон HCV, высевали на 96-луночные планшеты. Испытуемое вещество серийно разводили DMEM плюс 5% FBS. Разведенное соединение наносили в соответствующие лунки на планшете. После 72 ч инкубации при 37 С, клетки обрабатывали. Внутриклеточные РНК из каждый лунки экстрагировали с использованием набора инструментов RNeasy 96 (Qiagen). Уровень РНК HCV определяли с помощью ПЦР-анализа обратной транскриптазы в реальном времени, используя мастер смесь реагентовTaqMan One-Step RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) и систему определения последовательностей ABI Prism 7900 (Applied Biosystems), как описано ранее (Vrolijk et al., 2003). Цитотоксические эффекты измеряли с использованием контрольных реагентов TaqMan Ribosomal РНК (Applied Biosystems) в качестве показателя количества клеток. Количество HCV РНК и рибосомальной РНК затем использовали для получения соответствующих значений IC50 (концентрация, ингибирующая репликацию репликонов на 50%). Оценка метаболизма микросом (анализ стабильности микросом). Скорость метаболизма в микросомах может быть испытана следующим образом. Микросомы печени мыши или человека разводили буфером С (0,1 М калийфосфатный буфер, 1,0 мМ EDTA, рН 7,4) до концентрации 2,5 мг/мл. Затем готовили образцы для изучения стабильности микросом путем добавления 50 мкл 5 мкМ сток раствора (0,5 мкл 10 мМ ДМСО исходного раствора в 9,5 мкл ACN, добавленный в 990 мкл буфера С) в 50 мкл раствора микросом (2,5 мг/мл), 110 мкл буфера С, и тщательно смешивая. Все образцы были предварительно инкубированы в течение приблизительно 15 мин при температуре 37 С. Затем реакцию инициировали добавлением 40 мкл раствора NADPH (12,5 мМ) при осторожном перемешивании. Отбирали аликвоты (40 мкл) на 0, 15, 30, 45 и 60 мин и гасилиACN, содержащей внутренний стандарт (120 мкл). Белок удаляли центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин) и планшет с образцами анализировали на концентрацию соединений с использованием ЖХМС/МС. Затем обычными способами рассчитывали время полужизни, сравнивая концентрацию анализируемого продукта с первоначально имеющимся количеством. Результаты см. в примере 13. Оценка стабильности гепатоцитов. Криоконсервированные гепатоциты, предварительно хранящиеся в жидком азоте, помещали при 371 С на встряхиваемую водяную баню в течение 2 мин 15 с. Затем гепатоциты добавляли в 10 кратный по объему предварительно нагретый бикарбонатный буфер Кребса-Хенселейта (КНВ) (2000 мг/л глюкозы, без карбоната кальция и бикарбоната натрия, Sigma), осторожно смешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение 3 мин. После центрифугирования супернатант осторожно удаляли и к вновь суспендированному остатку клеток добавляли 10-кратный объем предварительно нагретого буфера КНВ. Смесь осторожно смешивали и центрифугировали при 500 об/мин в течение 3 мин. Супернатант затем удаляли и отбрасывали. Затем определяли жизнеспособность клеток и выход подсчетом клеток, и эти значения использовали при получении суспензии гепатоцитов человека для соответствующей плотности посева (плотность жизнеспособных клеток=2106 клетки/мл). Раствор 2 Х дозированный готовят в предварительно нагретом КНВ (1% ДМСО) (200 мкМ сток раствор: 20 мкл субстрата исходного раствора(10 мМ) в 980 мкл ДМСО, раствор 2 Х дозированный: 10 мкл 200 мкМ сток раствора в 990 мкл КНВ (2 мкМ после разбавления). 50 мкл предварительно нагретого раствора 2 Х дозированного помещали в лунки и добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2106 клетки/мл) и начинали отсчет времени. Планшет затем инкубировали при температуре 37 С. По окончании инкубационного времени (0, 15, 30,60 и 120 мин) в каждую лунку добавляли 100 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт, осторожно смешивали, и добавляли 50 мкл предварительно нагретого раствора гепатоцитов (2106 клетки/мл). В конце инкубирования определяли жизнеспособность клеток. Образцы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин при температуре 4 С, супернатанты разводили 2 раза ультрачистой водой,и содержание соединений анализировали с использованием ЖХ-МС/МС. Оценка растворимости в воде. Растворимость в воде может быть исследована следующим образом. 10 мМ сток раствора аналога санглиферина готовили в 100% ДМСО при комнатной температуре. Делали трехкратные 0,01 мл аликвоты 0,5 мл либо с раствором 0,1 М PBS, рН 7,3, либо со 100% ДМСО во флаконах из янтарного стекла. Полученные 0,2 мМ растворы встряхивали при комнатной температуре на шейкере IKA vibrax VXR в течение 6 ч, затем переносили полученные растворы или суспензии в 2 мл пробирки Эппендорфа и центрифугировали в течение 30 мин при 13200 об/мин. Затем анализировали аликвоты супернатантной жидкости методом ЖХ-МС, как описано выше. Альтернативно, растворимость в PBS при рН 7,4 может быть исследована следующим образом. Выстраивали калибровочную кривую путем разбавления исследуемых соединений и контрольных соединений до 40 мкМ, 16 мкМ, 4 мкМ, 1,6 мкМ, 0,4 мкМ, 0,16 мкМ, 0,04 мкМ и 0,002 мкМ с помощью 50% МеОН в H2O. Стандартные точки затем еще разбавляли 1:20 с помощью MeOH:PBS 1:1. Конечные концентрации после разбавления 1:20 составляли 2000 нМ, 800 нМ, 200 нМ, 80 нМ, 20 нМ, 8 нМ, 2 нМ и 1 нМ. Стандарты затем смешивали с таким же объемом (1:1) ACN, содержащего внутренний стандарт Исследуемые соединения готовили в виде сток растворов в ДМСО при концентрации 10 мМ. Сток растворы разводили дважды в PBS, рН 7,4, в 1,5 мл-ых пробирках Эппендорфа до целевой концентрации 100 мкМ с конечной концентрацией ДМСО в 1% (например, 4 мкл 10 мМ ДМСО сток раствора в 396 мкл 100 мМ фосфатного буфера). Пробирки с образцами затем осторожно встряхивали в течение 4 ч при комнатной температуре. Образцы центрифугировали (10 мин, 15000 об/мин) для высаживания нерастворенных частиц. Супернатанты переносили в новые пробирки и разводили PBS (коэффициент разбавления для отдельного тестируемого вещества подтверждали сигнальным уровнем соединения на используемом аналитическом инструменте). Разведенные образцы затем смешивали с таким же объемом (1:1) МеОН. В заключение образцы смешивали с таким же объемом (1:1) ACN, содержащего внутренний стандарт (гидроксимакроцикл, 6) для ЖХ-МС/МС анализа. Оценка проницаемости клеток. Проницаемость клеток может быть исследована следующим образом. Исследуемое соединение разводили до 10 мМ в ДМСО и затем разводили в буфере с получением конечной концентрации дозы 10 мкМ. Также для контроля целостности мембран был включен флуоресцентный маркер люциферин желтый. Исследуемое соединение затем наносили на апикальную поверх- 26022408 ность монослоев клеток Сасо-2 и измеряли проникновение соединений в базолатеральный отсек. Это осуществляли в обратном направлении (от базолатеральной к апикальной) для исследования активного транспорта. Для количественного определения содержания использовали ЖХ-МС/МС как для исследуемых, так и для стандартных контрольных соединений (например, пропанолол и ацебутолол). Оценка фармакокинетики in vivo. Исследования in vivo также могут быть использованы для измерения биодоступности соединения. Обычно, соединение вводят исследуемому животному (например, мыши или крысе) как внутривенно(IV), так и перорально (РО), и с регулярными интервалами отбирают образцы крови для определения того, как изменяется концентрация препарата в плазме с течением времени. Период нахождения концентрации в плазме крови с течением времени может быть использован для расчета абсолютной биодоступности соединения в виде процента с использованием стандартных моделей. Пример обычного протокола описан ниже. Мышам дозировали 1, 10, или 100 мг/кг соединения по изобретению или исходное соединение i.v. или р.о. Образцы крови брали на 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 и 2880 мин и определяли концентрацию соединения по изобретению или исходного соединения в образце с использованием ВЭЖХ. Период нахождения концентрации в плазме крови затем может быть использован для получения ключевых параметров, таких как площадь под кривой концентрация-время (AUC - которая прямо пропорциональна общему количеству неизмененного препарата, который попадает в большой круг кровообращения), максимум (пик) концентрации лекарственного препарата в плазме, время, за которое достигается максимум концентрации лекарственного препарата в плазме (временной пик), дополнительные факторы, которые используются для точного определения биодоступности, включают: конечное время полужизни соединений, общая очистка организма, статистическая оценка параметров распределения и F%. Указанные параметры затем анализировали способами без компартментализации или с компартментализацией с получением рассчитанного процента биодоступности, в качестве примера данного вида способа см. Egorin et al. 2002, и имеющиеся в работе ссылки.In vivo оценка пероральной и внутривенной фармакокинетики (конкретный способ). Для аналогов санглиферина полностью анализировали кровь. Соединения готовили в растворе 5% этанол/5% кремофор EL/90% физиологический раствор как для р.о., так и i.v. введения. Группам по 3 самца мышей CD1 вводили либо по 1 мг/кг i.v., либо по 10 мг/кг р.о. Образцы крови (40 мкл) отбирали из подкожной вены, перед дозированием и на 0,25, 0,5, 2, 8 и 24 ч, и разбавляли равным количеством dH2O и сразу помещали на сухой лед. Образцы до анализа хранили при температуре -70 С. Концентрацию соединения по изобретению или исходного соединения в образце определяли с использованием ЖХ-МС следующим образом: в образец 20 мкл крови:H2O (1:1, об./об.)/РК добавляли 20 мкл внутреннего стандарта (гидроксил макроцикл, 6) при 100 нг/мл, 20 мкл рабочего раствора/МеОН и 150 мкл ACN, встряхивали в течение 1 мин при 1500 об/мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант впрыскивали в ЖХ-МС/МС. Строили кривую пребывания в крови концентраций и использовали для определения площади под кривой общая концентрация в крови-время (AUC - которая прямо пропорциональна общему количеству неизмененного препарата, который попадает в большой круг кровообращения). Указанные значения использовали для определения пероральной биодоступности (F%) и других параметров РК, которые возможны.In vitro оценка цитотоксичности. Клетки Huh-7 и HepG2, полученные от АТСС, выращивали в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллин-стрептомицин и 1% глутамин; тогда как СЕМ клетки (Т-клетки лейкемии человека, полученные от АТСС) выращивали в среде RPMI 1640 с 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина и 1% глутамина. Свежие РВМС человека выделяли из цельной крови, полученной по меньшей мере от двух нормальных защищенных доноров. Кратко, клетки периферальной крови осаждали центрифугированием/промыванием 2-3 раза при центрифугировании с низкой скоростью и вновь суспендировали в PBS для удаления загрязняющих тромбоцитов. Промытые клетки крови затем разводили 1:1 в среде Дульбекко в забуференном фосфатом физиологическом растворе (D-PBS) и наносили слоем на 14 мл среды для фракционирования лимфоцитов (LSM; клетки выращены Mediatech, Inc.; плотность 1,0780,002 г/мл; Кат. 85-072-CL) в 50 мл пробирку для центрифугирования и центрифугировали в течение 30 мин при 600g. Связанные РВМС осторожно отсасывали с полученной границы раздела двух фаз и далее промывали 2 PBS при низкой скорости центрифугирования. После конечной промывки клетки подсчитывали путем исключения при окрашивании трипановым синим и вновь суспендировали при 1107 клеток/мл в RPMI 1640, дополненный 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 2 мМ L-глутамина, 4 мкг/мл РНА-Р. Клетки оставляли инкубироваться в течение 48-72 ч при температуре 37 С. После инкубирования РВМС центрифугировали и вновь суспендировали в RPMI 1640 с 15% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мкг/мл гентамицина и 20 Ед/мл рекомбинантного IL-2 человека. Цитотоксичность соединений оценивали, исследуя полулогарифм концентраций каждого соединения в трех повторах против клеток, описанных выше. Среда, содержащая одни клетки, служила в качест- 27022408 ве клеточного контроля (СС). Клетки Huh-7 и HepG2 высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 5103 клеток на лунку. На следующий день среду отсасывали, и добавляли 100 мкл соответствующей среды, содержащей 5% FBS. Разведения исследуемых лекарственных средств готовили в 2 концентрации в пробирках для микротитрования и 100 мкл каждой концентрации помещали в соответствующие лунки стандартного формата. Через 72 ч клетки обрабатывали для оценки цитотоксичности. РВМС разбавляли в свежей среде и высевали во внутренние клетки 96 луночного микропланшета с круглым дном при 5104 клеток/лунка с объемом 100 л. Подобным образом, клетки СЕМ высевали при 1104 клеток/лунка. Затем добавляли 100 мкл 2 препаратов исследуемых лекарственных средств в соответствующие лунки в стандартном формате. Культуры выдерживали в течение шести-семи дней и затем обрабатывали для определения цитотоксичности. Цитотоксичность определяли, используя набор для анализа однородной целостности мембран CytoTox-он (Promega). Анализ определял высвобождение лактата дегидрогиназы (LDH) из клеток с поврежденными мембранами в флуорометрическом, гомогенном формате. Высвобожденную в культуральную среду LDH определяли анализом ферментативного связывания, который приводит к конверсии резазурина во флуоресцентном резоруфиновом продукте. Количество флюоресценции пропорционально числу лизированных клеток. Шестисерийные разведенные концентрации каждого соединения наносили на клетки для определения значений для получения, где это применимо ТС 50 (токсичная концентрация лекарственного средства, снижающая жизнеспособность клеток на 50%) и ТС 90 (токсичная концентрация лекарственного средства, снижающая жизнеспособность клеток на 90%).In vitro оценка ингибирования траспортеров MDR1 и MRP2. Для оценки ингибирования и активации MDR1 (Р-гликобелок 1) и траспортеров MRP2, может быть использован анализ АТРазы in vitro от Solvo Biotechnology Inc. (Glavinas et al., 2003). Соединения (при 0,1, 1, 10 и 100 мкм) инкубировали с мембранными везикулами MDR1 или MRP2 как в отсутствие, так и в присутствии ванадата для изучения возможной активации АТРазы. Кроме того, подобную инкубацию проводили в присутствии верапамила/сульфасалазина с целью выявления возможного ингибирования активности траспортера. Активность АТРазы количественно измеряли спектрофотометрически с помощью неорганического фосфата. Активацию рассчитывали из ванадат чувствительной увеличению активности АТРазы. Ингибирование определяли по снижению верапамил/сульфасалазин опосредованной активности АТРазы. Примеры Пример 1. Конструирование мутанта Streptomyces sp. A92-308110 с делецией sfaA (DSM9954). 1.1. Построение конструкции с делецией sfaA. Фрагмент EcoRV-StuI космиды TL3006 (SEQ ID NO:3), размером приблизительно 7 kb, охватывающий sfaA (положение нуклеотида 14396-21362, NCBI инвентарный номер последовательностиFJ809786) отрезали расщеплением EcoRV и StuI, и полученный выделенный фрагмент лигировали напрямую в pKC1139, которые ранее расщепляли с помощью EcoRV и обрабатывали щелочной фосфатазой креветок (Roche). Полученную плазмиду обозначали как PSGK268. Мутацию в рамке считывания гена sfaA, содержащегося в этом клоне, осуществляли, используя комплект для рекомбинации Red/ET, поставляемый Gene Bridges (номер по каталогу K006): Два олигонуклеотида, SfaA17161f и SfaA17825r, использовали для амплификации неомицинового маркера из FRT-PGK-gb2-neo-FRT матрицы ДНК, из набора, используя ДНК-полимеразу KOD. Полученный продукт амплификации приблизительно 1,7 т.п.н. выделяли с использованием гель электрофореза и очищали от геля на смоле QiaEX. Плазмиду pSGK268 трансформировали в E.coli DH10B, используя стандартные методики и отбирая в чашки, содержащие апрамицин (50 мкг/мл). Введение конструкции с делецией проводили по существу в соответствии с протоколом Gene Bridges. Единичную колонию выращивали в течение ночи в 2TY апрамицине (50 мкг/мл) и трансформировали с плазмидой pRedET (tet) и отбирали на апрамицин (50 мкг/мл) и тетрациклин (3 мкг/мл) при температуре 30 С. Единичную колонию использовали для получения ночной культуры этого штамма в 3 мл 2TY апрамицина (50 мкг/мл) и тетрациклина (3 мкг/мл) при температуре 30 С. 0,5 мл полученной культуры использовали для посева 10 мл 2TY апрамицина (50 мкг/мл) и тетрациклина (3 мкг/мл) при температуре 30 С и выращивали до OD600nm приблизительно 0,5. 1,4 мл данной культуры переносили в каждую из 2 пробирок Эппендорфа и в одну пробирку добавляли 50 мкл 10% арабинозы для индукции экспрессии рекомбинантных белков Red/ET. Пробирки встряхивали в течение приблизительно 1 ч при температуре 37 С. Индуцированные и неиндуцированные клетки осаждали на настольной центрифуге и промывали два раза охлажденной стерильной водой; ресуспендировали и центрифугировали каждый раз для осаждения клеток. Полученные осадки суспендировали в приблизительно 30-40 мкл воды и выдерживали на льду. Выделяли 1,7 т.п.н. разрушенного фрагмента, сначала добавляли в индуцированные и неиндуцированные пробирки и переносили в 1 мм электрокюветыBiorad на льду. Образцы подвергали электропорации (Biorad Micropulser при 1,8 кВ, полученная константа времени приблизительно 4 мс), добавляли 1 мл 2TY (без антибиотиков) и смешивали для удаления клеток из кюветы. Клетки инкубировали в течение приблизительно 3 ч при температуре 37 С при встряхивании (1100 об/мин, компактный термомиксер Эппендорфа), затем высевали на чашки 2TY, содержащие апрамицин (50 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при температуре 37 С. Делали посевы штрихом колоний из чашек с индуцированными образцами на чашки 2TY,содержащие канамицин, при 50 мкг/мл для очистки и подтверждения введения кассеты резистентности к канамицину. PCR на отдельных колониях бактерий использовали для подтверждения введения кассеты. Плазмиды получали из указанных культур и обрабатывали для подтверждения ожидаемой плазмидыpSGK270. Плазмиды затем обрабатывали NsiI для удаления фрагмента маркера, и остальное повторно легировали с получением конструкции pSGK271 в рамке удаления sfaA. 1.2 Конъюгирование Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) и введение делеции sfaA. Плазмиду pSGK271 трансформировали в E.coli ET12567 pUZ8002, используя стандартные методики, и отбирали в чашки 2TY, содержащие апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл). Полученный штамм инокулировали в 3 мл жидкости 2TY, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при температуре 37 С, 250 об. /мин. 0,8 мл данной культуры использовали для посева 10 мл жидкости 2TY, содержащей апрамицин (50 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и хлорамфеникол (10 мкг/мл) в 50 мл пробиркеFalcon и инкубировали при температуре 37 С и 250 об/мин до достижения OD600nm приблизительно 0,5. Полученную культуру центрифугировали при 3500 об/мин в течение 10 мин при температуре 4 С, промывали два раза 10 мл среды 2TY, используя центрифугирование для осаждения клеток после каждой промывки. Полученный осадок вновь суспендировали в 0,5 мл 2TY и перед использованием держали на льду. Полученный процесс согласовывали по времени с завершением получения спор Streptomyces, описанного ниже. Споры Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) (Biot-4370) собирали из 1-2 недельного конфлюэнтного планшета путем повторного суспендирования в приблизительно 3 мл 20% глицерина. Споры центрифугировали (5000 об/мин, 10 мин, комнатная температура) и промывали два раза 50 мМ буфера TES,затем вновь суспендировали в 1 мл 50 мМ буфера TES и распределяли в 2 пробирки Эппендорфа. Эти пробирки нагревали при встряхивании при температуре 50 С в течение 10 мин на водной бане, затем добавляли 0,5 мл 2TY и инкубировали в компактном термомиксере Эппендорфа при температуре 37 С в течение 4-5 ч. Полученные E.coli ET12567 pUZ8002 pSGK271 и Biot-4370 смешивали при соотношении 1:1 (250 мкл каждый штамм) и 1:3 (100 мкл Е. coli) и сразу распределяли на плашки R6 и переносили в инкубатор при 37 С. Приблизительно через 2 ч инкубирования указанные планшеты покрывали 2 мл стерильной воды, содержащей налидиксовую кислоту, с получением конечной концентрации на пластине в 25 мкг/л. Пластины возвращали в инкубатор при 37 С на всю ночь, затем покрывали 2 мл стерильной воды, содержащей апрамицин, с получением конечной концентрации на пластине в 20-25 мкг/л. Эксконъюгатные колонии, появляющиеся через приблизительно 4-7 дней помещали пятнами на среду ISP4,содержащую апрамицин (25 мкг/л) и налидиксовую кислоту (25 мкг/л) и инкубировали при температуре 37 С. После наблюдаемого адекватного роста мицелия штаммы вновь наносили пятнами на среду ISP4,содержащую апрамицин (25 мкг/л) при температуре 37 С и оставляли спорулировать. Затем штаммы три раза субкультивировали (для ускорения удаления чувствительной к температуре плазмиды) путем нанесения пятнами на ISP4 (без антибиотика) и инкубирования при температуре 37 С в течение 3-4 дней. Штаммы в конце наносили пятнами на ISP4 и инкубировали при температуре 28 С для полного спорулирования (5-7 дней). Споры собирали и серийно разводили в планшетах ISP4 при температуре 28 С для выбора отдельных колоний. Спорулированные отдельные колонии двукратно наносили пятнами на планшеты ISP4 вместе с апрамицином или без него (25 мкг/л) для подтверждения потери плазмиды и оставляли расти приблизительно 7 дней перед исследованием для продуцирования санглиферинов. 1.3 Скрининговые штаммы для получения санглиферинов в пробирках Falcon. Единичный приблизительно 7 мм агаровый слой спорулированного в лунках штамма использовали для посева 7 мл стерильной среды SM25-3 и инкубировали при 27 С 200 об/мин в шейкере с амплитудой 2". Через 48 ч роста 0,7 мл данную культуру переносили в стерилизованную пробирку фалькона, содержащую 7 мл среды SGP2 с 5% смолы НР 20. Культуры выращивали при температуре 24 С 300 об/мин. Во встряхиваемом с амплитудой 1 дюйм инкубаторе в течение 5 дней, затем харвестировали. 0,8 мл бактериальной культуры удаляли и помещали аликвотами в 2 мл пробирку Эппендорфа, обеспечивая адекватный разгон смолы в культуре перед тем, как помещать аликвотами. Добавляли 0,8 мл ацетонитрила и 15 мкл муравьиной кислоты, и пробирку перемешивали в течение приблизительно 30 мин. Смесь делали