Ингибитор белка, переносящего эфир холестерила

009466 Область изобретения Настоящее изобретение относится к способам лечения сердечно-сосудистых заболеваний, и конкретно оно относится к сочетаниям соединений, композициям и способам их применения в медицине,особенно для профилактики и лечения гиперлипидемических состояний, таких как состояния, связанные с атеросклерозом, гиперхолестеринемией и другими заболеваниями коронарной артерии у млекопитающих. Более конкретно, данное изобретение относится к соединениям, ингибирующим активность белка,переносящего эфир холестерила (СЕТР). Данное изобретение также относится к производным фибриновой кислоты (фибратам). Описание уровня техники Установлено, что гиперлипидемические состояния, связанные с повышенными концентрациями общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL), являются основными факторами риска сердечно-коронарной недостаточности, и особенно атеросклероза. Многочисленные исследования продемонстрировали, что низкая концентрация в плазме холестерина липопротеинов высокой плотности(HDL) является мощным фактором риска для развития атеросклероза (Barter and Rye, Atherosclerosis, 121,1-12 (1996. HDL представляют собой один из основных классов липопротеинов, участвующих в транспорте липидов через кровь. Основные липиды, которые, как известно, связаны с HDL, включают холестерин, эфир холестерила, триглицериды, фосфолипиды и жирные кислоты. Другими классами липопротеинов, обнаруженных в крови, являются липопротеины низкой плотности (LDL), липопротеины средней плотности (IDL) и липопротеины очень низкой плотности (VLDL). Так как низкие уровни холестерина HDL увеличивают риск атеросклероза, способы увеличения уровня холестерина HDL в плазме могут быть терапевтически полезными для лечения атеросклероза и других заболеваний, связанных с накоплением липидов в кровеносных сосудах. Данные заболевания включают, не ограничиваясь ими, сердечно-коронарную недостаточность, заболевания периферических сосудов и удар. Атеросклероз лежит в основе большей части заболеваний коронарной артерии (CAD), основной причины заболеваемости и смертности в современном обществе. Было показано, что высокий уровень холестерина LDL (выше приблизительно 180 мг/дл) и низкий уровень холестерина HDL (ниже 35 мг/дл) оказывают серьезное влияние на развитие атеросклероза. Неблагоприятные соотношения HDL/LDL отрицательно влияют на другие заболевания или факторы риска, такие как заболевания периферических сосудов, удар и гиперхолестеринемия. Обнаружено, что нарушение рециркуляции желчных кислот из просвета кишечного тракта уменьшает уровни сывороточного холестерина в причинном отношении. Были накоплены эпидемиологические данные, показывающие, что такое уменьшение приводит к улучшению состояния атеросклероза. Stedronsky в "Interaction of bile acids and cholesterol with nonsystemic agents having hypocholesterolemic properties",Biochimica et Biophysica Acta, 1210, 255-287 (1994) обсуждает биохимию, физиологию и известные активные агенты, имеющие отношение к желчным кислотам и холестерину. Было показано, что ингибирование белка, переносящего эфир холестерила (СЕТР), эффективно изменяет соотношение HDL/LDL в плазме и, как предполагается, подавляет развитие и/или возникновение некоторых сердечно-сосудистых заболеваний. СЕТР представляет собой белок плазмы, который содействует перемещению эфиров холестерила и триглицеридов между различными липопротеинами крови(Tall, J. Lipid Res., 34, 1255-74 (1993. Перемещение эфира холестерила от HDL к LDL с помощью СЕТР приводит к снижению холестерина HDL. Следовательно, ингибирование СЕТР должно приводить к увеличению уровня холестерина HDL и снижению уровня холестерина LDL в плазме, обеспечивая посредством этого улучшение терапевтического профиля липидов плазмы. Доказательство данного эффекта описано в McCarthy, Medicinal Res. Revs., 13, 139-59 (1993). Дополнительное доказательство данного эффекта описано в Sitori, Pharmac. Ther., 67, 443-47 (1995. Данное явление впервые было продемонстрировано Swenson et al., (J. Biol. Chem., 264, 14318 (1989 с помощью моноклональных антител, специфически ингибирующих СЕТР. У кроликов данные антитела вызывают увеличение уровня холестеринаHDL и уменьшение уровня холестерина LDL в плазме. Son et al. (Biochim. Biophys. Acta, 795, 743-480(1984 описывают белки человеческой плазмы, ингибирующие СЕТР. Патент США 5519001, включенный в данный документ в качестве ссылки, выданный Kushwaha et al., описывает пептид длиной в 36 аминокислот, полученный из аро С-1 бабуина, который ингибирует активность СЕТР. Cho et al. (Biochim. Biophys.Acta, 1391, 133-144 (1998 описывают пептид свиной плазмы, который ингибирует человеческий СЕТР.Bonin et al. (J. Peptide Res., 51, 216-225 (1998 раскрывают декапептидный ингибитор СЕТР. Депспептидный грибковый метаболит раскрыт как ингибитор СЕТР Hedge et al. в Bioorg. Med. Chem. Lett., 8,1277-80 (1998). Существует несколько сообщений о непептидных соединениях, действующих как ингибиторы СЕТР. Barrett et al. (J. Am. Chem. Soc, 188, 7863-63 (1996 описывают ингибиторы СЕТР, содержащие циклопропан. Другие ингибиторы СЕТР, содержащие циклопропан, описаны Kuo et al. (J. Am. Chem.Soc., 117, 10629-34 (1995. Pietzonka et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 1951-54 (1996 описывают фосфонатсодержащие аналоги эфира холестерила в качестве ингибиторов СЕТР. Coval et al. (Bioorg. Med.Chem. Lett., 5, 605-610 (1995 описывают Wiedendiol-A и -В и родственные сесквитерпеновые соединения в качестве ингибиторов СЕТР. Lee et al. (J. Antibiotics, 49, 693-96 (1996 описывают ингибиторы-1 009466 СЕТР, полученные из насекомых и грибков. Bush et al. (Lipids, 25, 216-220, (1990 описывают ацетилбромид холестерила в качестве ингибитора СЕТР. Morton and Zilversmit (J. Lipid Res., 35, 836-47 (1982 описывают, что п-хлорртутьфенилсульфонат, п-гидроксиртутьбензоат и этилртутьтиосалицилат ингибируют СЕТР. Connoly et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm., 223, 42-47 (1996 описывают другие цистеинмодифицированные реагенты в качестве ингибиторов СЕТР. Xia et al. описывают 1,3,5-триазины в качестве ингибиторов СЕТР (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 919-22 (1996. Bisgaier et al. (Lipids, 811-8 (1994 описывают 4-фенил-5-тридецил-4 Н-1,2,4-триазолтиол в качестве ингибитора СЕТР. Другие триазоловые ингибиторы СЕТР описаны в патентной заявке США 09/153360, включенной в данный документ в качестве ссылки. Sikorski et al. раскрывают другие новые ингибиторы СЕТР в патентной заявке РСТWO 9914204. Замещенные 2-меркаптоанилинамидные соединения могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР,и такие терапевтические соединения описаны Н. Shinkai et al. в патентной заявке РСТWO 98/35937. Некоторые замещенные гетероалкиламиновые соединения известны как ингибиторы СЕТР. В европейской патентной заявке 796846 Schmidt et al. описывают 2-арилзамещенные пиридины как ингибиторы белка, переносящего эфир холестерина, которые могут применяться в качестве сердечно-сосудистых агентов. Один заместитель при С 3 пиридинового цикла может быть гидроксиалкильной группой. В европейской патентной заявке 801060 Dow and Wright описывают гетероциклические производные,замещенные продуктом добавления альдегида к алкиламину с получением 1-гидрокси-1-аминов. Опубликовано, что данные соединения являются агонистами 3-адренергических рецепторов, которые могут применяться при лечении диабетов и других нарушений. В патентной заявке Великобритании 2305665Fischer et al. раскрывают 3-агонист вторичные аминоспиртзамещенные пиридиновые производные, которые могут применяться для лечения некоторых нарушений, включающих нарушения уровня холестерина, и атеросклеротические заболевания. В европейской патентной заявке 818448 (включенной в данный документ в качестве ссылки) Schmidt et al. описывают тетрагидрохинолиновые производные как ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина. В европейской патентной заявке 818197 Schmeket al. описывают пиридины с сопряженными гетероциклами как ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина. Brandes et al. в патентной заявке Германии 19627430 описывают бициклические конденсированные пиридиновые производные как ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина. В патентной заявке РСТWO 9839299 Muller-Gliemann et al. описывают хинолиновые производные как ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерила. Полициклические соединения, которые могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, также раскрыты A. Oomura et al. в патенте Японии 10287662. Например, терапевтические соединения,имеющие структуры С-1 и С-8, получают путем культивирования Penicillum spp. Циклоалкилпиридины, которые могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, раскрытыSchmidt et al. в европейском патентеЕР 818448. Например, терапевтическое соединение, имеющее структуру С-9, раскрыто как особенно эффективное в качестве ингибитора СЕТР. Замещенные тетрагидронафталиновые соединения, которые могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, описаны в патентной заявкеWO 9914174. Конкретно, в данном описании в качестве ингибитора СЕТР описано соединение (8S)-3-циклопентил-1-(4-фторфенил)-2-[(S)-фтор(4-трифторметилфенил)метил]-8-гидрокси-6-спироциклобутил-5,6,7,8-тетрагидронафталин. Некоторые 4-гетероарилтетрагидрохинолины, которые могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, описаны в патентной заявке РСТWO 9914215. Например, в данном описании в качестве ингибитора СЕТР описан 3-(4-трифторметилбензоил)-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-5-он. Производные фибриновой кислоты составляют другой класс лекарственных препаратов, обладающих влиянием на уровень липопротеинов. Среди первых разработанных соединений данного класса был клофибрат, раскрытый в патенте США 3262850, включенном в данный документ в качестве ссылки. Клофибрат представляет собой этиловый эфир п-хлорфеноксиизомасляной кислоты. Широко применяющимся лекарственным препаратом данного класса является гемфиброзил, раскрытый в патенте США 3674836, включенном в данный документ в качестве ссылки. Гемфиброзил часто применяют для уменьшения уровней триглицеридов или увеличения концентраций холестерина HDL (The PharmacologicalBasis of Therapeutics, p. 893, включен в данный документ в качестве ссылки). Фенофибрат (патент США 4058552, включен в данный документ в качестве ссылки) обладает действием, подобным действию гемфиброзила, но дополнительно уменьшает уровни LDL. Ципрофибрат (патент США 3948973, включен в данный документ в качестве ссылки) обладает действием, подобным действию фенофибрата. Другим лекарственным препаратом данного класса является безафибрат (патент США 3781328, включен в данный документ в качестве ссылки). Возможные побочные эффекты при применении производных фибриновой кислоты включают заболевание желчного пузыря (холелитиаз), рабдомиолиз и острую почечную недостаточность. Некоторые из данных эффектов обостряются при сочетании фибратов с ингибиторами HMG СоА редуктазы. В литературе были описаны некоторые сочетанные терапии, предназначенные для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Сочетания ингибиторов IBAT с ингибиторами HMG СоА редуктазы, которые могут применяться для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, раскрыты в патентной заявке-2 009466 США 0 9/037308, включенной в данный документ в качестве ссылки. Сочетанная терапия с использованием флювастатина и ницеритрола описана J. Sasaki et al. (Id.). Данные исследователи сделали вывод, что сочетание флювастатина и ницеритрола "в дозе, составляющей 750 мг/день, по-видимому, не увеличивает и не ослабляет полезных эффектов флювастатина".L. Cashin-Hemphill et al. (J. Am. Med. Assoc., 264 (23), 3013-17 (1990), включен в данный документ в качестве ссылки) описывают благоприятные эффекты сочетанной терапии с использованием колестипола и ниацина на коронарный атеросклероз. Описанные эффекты включают отсутствие развития и регресс нативных бляшек в коронарной артерии. Сочетанная терапия с использованием аципимокса и симвастатина демонстрирует благоприятное влияние на уровень HDL у пациентов с высокими уровнями триглицеридов (N. Hoogerbrugge et al., J.Internal Med., 241, 151-55 (1997), включен в данный документ в качестве ссылки). Сочетанная терапия с использованием ситостанолового эфира маргарина и правастатина описана Н.Gylling et al. (J. Lipid Res., 37, 1776-85 (1996), включен в данный документ в качестве ссылки). Как описано, в результате данной терапии одновременно ингибируется абсорбция холестерина и значительно снижается уровень холестерина LDL у людей с инсулиннезависимым диабетом.Brown et al. (New Eng. J. Med., 323 (19), 1289-1339 (1990), включен в данный документ в качестве ссылки) описывают сочетанную терапию с использованием ловастатина и колестипола, в результате которой уменьшается прогрессирование атеросклеротических бляшек и увеличивается регрессия бляшек по сравнению с использованием одного ловастатина. Сочетанная терапия с использованием ингибитора секреции ароВ и ингибитора СЕТР раскрытаBuch et al. (патентная заявка РСТWO 9911263, включенная в данный документ в качестве ссылки) описывает сочетанную терапию, включающую амлодипин и соединение статина, предназначенную для лечения субъектов, страдающих от грудной жабы, атеросклероза, одновременно от гипертонии и гиперлипидемии, и для лечения симптомов остановки сердца. Buch et al. описывает в патентной заявке РСТWO 9911259 сочетанную терапию, включающую амлодипин и аторвастатин.Dettmar and Gibson (патентная заявка ВеликобританииGB 2329334 А) заявляют терапевтическую композицию, которая: может применяться для уменьшения уровней липопротеинов низкой плотности и холестерина в плазме, причем данная композиция включает ингибитор HMG СоА редуктазы и агент,образующий комплексы с желчью. Вышеприведенные ссылки демонстрируют, что в настоящее время существует необходимость в поиске безопасных, эффективных агентов для профилактики или лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Краткое описание изобретения В данном документе описывается новое соединение, обозначенное как С-12, являющееся ингибитором СЕТР, которое можно применять для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Сфера применения настоящего изобретения станет более понятной из подробного описания, приведенного ниже. Однако следует понимать, что приведенные ниже подробное описание и примеры, хотя и определяют предпочтительные воплощения данного изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, так как различные изменения и модификации в пределах духа и сферы данного изобретения станут очевидны специалисту в данной области из подробного описания. Подробное описание предпочтительных воплощений Нижеследующее подробное описание приводится для того, чтобы помочь специалистам в данной области при практическом осуществлении настоящего изобретения. Все-таки, данное подробное описание не следует истолковывать как чрезмерно ограничивающее настоящее изобретение, так как рядовые специалисты в данной области могут осуществлять модификации и вариации воплощений, обсуждаемых в данном документе, не отступая от духа и объема открытия настоящего изобретения. Содержание каждой из ссылок, цитирующихся в данном документе, включая содержание ссылок,цитирующихся в пределах данных первичных ссылок, включено здесь в качестве ссылки во всей своей полноте. а. Определения. Следующие определения приводятся для того, чтобы помочь читателю в понимании подробного описания настоящего изобретения."Сочетанная терапия" относится к введению двух или более терапевтических агентов для лечения гиперлипидемического состояния, например атеросклероза и гиперхолестеринемии. Такое введение включает совместное введение данных терапевтических агентов, по существу, одновременно, например в одной капсуле, имеющей фиксированное соотношение активных ингредиентов, или в нескольких капсулах, отдельных для каждого ингибирующего агента. Кроме того, такое введение также включает последовательное применение теравтических агентов каждого типа. В любом случае, режим лечения обеспечивает благоприятные эффекты сочетания лекарственных препаратов при лечении гиперлипидемического состояния.-3 009466 Фраза "терапевтически эффективный" относится к определенному для сочетанной терапии объединенному количеству ингибиторов. Данное объединенное количество позволяет достичь цель, которая состоит в уменьшении или устранении гиперлипидемического состояния."Терапевтическое соединение" относится к соединению, которое может применяться для профилактики или лечения гиперлипидемического состояния, включая атеросклероз и гиперхолестеринемию.b. Сочетания. Сочетания настоящего изобретения имеют ряд применений. Например, в результате регулирования дозировки и медицинского мониторинга индивидуальные дозы терапевтических соединений, использующихся в сочетаниях настоящего изобретения, будут ниже, чем обычные дозы терапевтических соединений при использовании в монотерапии. Уменьшение дозы обеспечивает преимущества, включающие уменьшение побочных эффектов индивидуальных терапевтических соединений по сравнению с монотерапией. Кроме того, уменьшение побочных эффектов сочетанной терапии по сравнению с монотерапиями приводит к увеличению согласия пациентов с режимами лечения. Другое применение настоящего изобретения состоит в сочетаниях, имеющих дополнительные эффекты или дополнительные способы действия. Например, некоторые IBAT ингибиторы контролируют уровни холестерина в сыворотке крови путем ингибирования реабсорбции желчных кислот в подвздошной кишке. Напротив, ингибиторы СЕТР ингибируют перемещение эфиров холестерила и триглицеридов между различными липопротеинами крови. Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, охватывают широкий ряд терапевтических соединений. Некоторые индивидуальные соединения, ингибирующие СЕТР, применимые в настоящем изобретении, отдельно описаны в следующих индивидуальных патентных заявках, каждая из которых включена в данный документ в качестве ссылки.R24. Патент США 5925645. Соединение, ингибирующее СЕТР, представляющее в настоящем изобретении особый интерес,обозначено в табл. 1 как С-12, так же, как его диастереомеры, энантиомеры, рацематы, соли и таутометы. Таблица 1 Производные фибриновой кислоты, которые могут применяться в сочетаниях и способах настоящего изобретения, включают широкий ряд структур и функций. Предпочтительные производные фибриновой кислоты настоящего изобретения описаны в табл. 2. Терапевтические соединения, приведенные в табл. 2, могут применяться в настоящем изобретении в разных формах, включая кислую форму, солевую форму, рацематы, энантиомеры, цвиттерионы и таутометы. Конкретные патенты США, приведенные в табл. 2, включены в данный документ в качестве ссылки. Соединения (например, производные фибриновой кислоты или соединения, ингибирующие СЕТР),которые могут применяться в настоящем изобретении, могут не иметь асимметричных атомов углерода,или, альтернативно, применимые соединения могут иметь один или несколько асимметричных атомов углерода. Если использующиеся соединения имеют один или несколько асимметричных атомов углерода, следовательно, они включают рацематы и стереоизомеры, такие как диастереомеры и энантиомеры, в чистом виде и в виде смесей. Такие стереоизомеры могут быть получены с помощью традиционных методов, либо путем использования энантиомеров в качестве исходных веществ, либо путем разделения изомеров соединений настоящего изобретения. Изомеры могут включать геометрические изомеры, например цис-изомеры или транс-изомеры, относительно двойной связи. Считается, что все такие изомеры относятся к соединениям, которые могут применяться в настоящем изобретении. Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, также включают таутомеры. Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, как описано ниже, включают соли, сольваты и пролекарственные препараты данных соединений. Дозировки, композиции и способы введения Композиции настоящего изобретения могут быть введены для профилактики и лечения гиперлипидемических заболеваний или состояний с помощью любого способа, предпочтительно перорального,который обеспечивает контакт данных соединений с местом их действия в организме, например в подвздошной кишке, плазме или печени млекопитающего, например человека. Для профилактики или лечения состояний, указанных выше, соединения, применимые в композициях и способах настоящего изобретения, могут использоваться сами по себе. Фармацевтически приемлемые соли являются особенно подходящими для медицинских применений, так как они лучше растворяются в воде, чем исходные соединения. Безусловно, такие соли должны иметь фармацевтически приемлемый анион или катион. Подходящие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли соединений настоящего изобретения, если возможно, включают производные неорганических кислот, таких как хлористо-водородная, бромисто-водородная, фосфорная, метафосфорная, азотная, сульфоновая и серная кислоты, и органических кислот, таких как уксусная, бензолсульфоновая, бензойная, лимонная,этансульфоновая, фумаровая, глюконовая, гликолевая, изотионовая, молочная, лактобионовая, малеиновая, яблочная, метансульфоновая, янтарная, толуолсульфоновая, винно-каменная и трифторуксуная кислоты. Для медицинских целей особенно предпочтительными являются хлориды. Соли подходящих фармацевтически приемлемых оснований включают соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, и соли щелочно-земельных металлов, такие как соли магния и кальция. Анионы, применимые в настоящем изобретении, конечно, также должны быть фармацевтически приемлемыми и могут быть также выбраны из вышеприведенного списка. Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, могут быть представлены в виде фармацевтической композиции с приемлемым носителем. Носитель, конечно, тоже должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и не должен быть вредным для реципиента. Носитель может быть твердым, или жидким, или тем и другим, и предпочтительно вместе с соединением входит в состав в виде дозированной композиции, например таблетки, которая может содержать от 0,05 до 95 мас.% активного соединения. Могут также присутствовать другие фармакологически активные вещества, включая другие соединения настоящего изобретения. Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть получены с помощью любого из хорошо известных методов фармацевтики, состоящего, по существу, в смешивании компонентов. Сочетание настоящего изобретения необязательно может включать композицию, включающую производное фибриновой кислоты и соединение, ингибирующее СЕТР. В такой композиции производное фибриновой кислоты и соединение, ингибирующее СЕТР, могут присутствовать в дозированной лекарственной форме, например в виде пилюли, капсулы или жидкости, которая содержит оба соединения . Данные соединения могут быть введены с помощью любого традиционного средства, доступного для применения вместе с фармацевтическими препаратами, либо в виде индивидуальных терапевтиче-5 009466 ских соединений, или в виде сочетания терапевтических соединений. Количество соединения, необходимое для достижения желательного биологического эффекта, конечно, зависит от ряда факторов, таких как конкретное выбранное соединение, предназначенное для применения, способ введения и клиническое состояние реципиента. Общая дневная доза производного фибриновой кислоты, в основном, может находиться в интервале приблизительно от 1000 до 3000 мг/день в одной или нескольких отдельных дозах. Каждый из гемфиброзила или клинофибрата часто, например, вводят отдельно в дозе 1200 мг/день. Клофибрат часто вводят в дозе 2000 мг/день. Бинифибрат часто вводят в дозе 1800 мг/день. В случае ингибитора СЕТР подходящая, в основном, общая дневная доза составляет приблизительно от 0,01 до 100 мг/кг массы тела/день, и предпочтительно приблизительно от 0,5 до 20 мг/кг массы тела/день. Дневные дозы, описанные в предыдущих параграфах для разных терапевтических соединений, могут быть введены пациенту в одной дозе или в пропорционально разделенных нескольких дозах. Разделенные дозы могут вводиться от 2 до 6 раз в день. Дозы могут быть представлены в форме с непрерывным высвобождением, эффективным для получения желательных результатов. В случае фармацевтически приемлемых солей определенные выше массы относятся к массе кислотного или основного эквивалента терапевтического соединения, получающегося из соли. Пероральная доставка сочетаний настоящего изобретения может включать композиции, как хорошо известные в данной области, предназначенные для обеспечения пролонгированной или непрерывной доставки лекарственного препарата к желудочно-кишечному тракту с помощью любого из механизмов. Они включают, без ограничения, рН-чувствительное высвобождение из дозированной формы, основанное на изменении рН в тонком кишечнике, медленную эрозию таблетки или капсулы, удерживание в желудке на основе физических свойств состава, биоадгезию дозированной формы к слизистой выстилке кишечного тракта или ферментативное высвобождение активного препарата из дозированной формы. Для некоторых из терапевтических соединений, которые могут применяться в настоящем изобретении(например, производное фибриновой кислоты или ингибитор СЕТР), желательным эффектом является продление промежутка времени, в течение которого молекула активного препарата доставляется к месту действия, путем манипуляции с дозированной формой. Таким образом, композиции с энтеропокрытием и с энтеропокрытием с контролируемым высвобождением входят в объем настоящего изобретения. Подходящие энтеропокрытия включают фталат ацетатцеллюлозы, фталат поливинилацетата, фталат гидроксипропилметилцелюлозы и анионные полимеры метакриловой кислоты и метиловый эфир метакриловой кислоты. Сочетания настоящего изобретения могут быть доставлены перорально в твердой, полутвердой или жидкой форме. В случае жидкой или полутвердой формы сочетания настоящего изобретения могут, например, существовать в виде жидкости, сиропа или содержаться в гелевой капсуле (например, в гелевом колпачке). В одном воплощении, если ингибитор СЕТР применяется в сочетании настоящего изобретения, то ингибитор СЕТР может быть предоставлен в виде жидкости, сиропа или содержаться в гелевой капсуле. В другом воплощении, если производное фибриновой кислоты применяется в сочетании настоящего изобретения, то производное фибриновой кислоты может быть предоставлено в виде жидкости,сиропа или содержаться в гелевой капсуле. Для ингибитора СЕТР внутривенно вводимая доза может, например, находиться в интервале приблизительно от 0,003 до 1,0 мг/кг массы тела, предпочтительно приблизительно от 0,01 до 0,75 мг/кг массы тела, более предпочтительно приблизительно от 0,1 до 0,6 мг/кг массы тела. При внутривенном введении доза для производного фибриновой кислоты может, например, находиться в интервале приблизительно от 100 до 2000 мг/кг массы тела, предпочтительно приблизительно от 300 до 1000 мг/кг массы тела, более предпочтительно приблизительно от 400 до 750 мг/кг массы тела. Доза любого из данных терапевтических соединений может быть подходящим образом введена путем инфузии приблизительно от 10 до 100 нг/кг массы тела в минуту. Инфузионные жидкости, подходящие для данной цели, могут содержать, например, приблизительно от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно приблизительно от 1 нг до 10 мг на миллилитр. Разовые дозы могут содержать, например, приблизительно от 1 мг до 10 г соединения настоящего изобретения. Таким образом, ампулы для инъекции могут содержать, например, приблизительно от 1 до 100 мг. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением включают композиции,подходящие для перорального, ректального, местного, буккального (например, сублингвального) и парентерального (например, подкожного, внутримышечного, внутрикожного или внутривенного) введения,хотя наиболее подходящий способ в каждом данном случае зависит от природы и тяжести состояния,подлежащего лечению, а также от природы конкретного используемого соединения. В большинстве случаев предпочтительным способом введения является пероральное введение. Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут присутствовать в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, пастилки или таблетки, каждая из которых содержит предварительно определенное количество по меньшей мере одного терапевтического соединения,применимого в настоящем изобретении; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде эмульсий масло-в-воде или вода-в-масле. Как указано, такие-6 009466 композиции могут быть получены с помощью любого подходящего фармацевтического метода, который включает стадию объединения активного соединения(й) и носителя (который может включать один или несколько вспомогательных ингредиентов). В основном, композиции получают путем равномерного и однородного смешивания активного соединения с жидким или мелкоразмельченным твердым носителем или с обоими и затем, при необходимости, придают продукту форму. Например, таблетка может быть получена путем прессования или формования порошка или гранул соединения, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящем устройстве соединения в свободно-текучем виде, таком как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим агентом, смазочным агентом, инертным разбавителем и/или поверхностно-активным/диспергирующим агентом(ами). Формованные таблетки могут быть получены путем формования в подходящем устройстве порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Фармацевтические композиции, подходящие для буккального (сублингвального) введения, включают таблетки, содержащие соединение настоящего изобретения во вкусовой основе, обычно сахарозе, и гуммиарабик или трагакант, и пастилки, содержащие соединение в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахарозу и гуммиарабик. Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, обычно включают стерильные водные препараты соединения настоящего изобретения. Данные препараты предпочтительно вводят внутривенно, хотя введение может также осуществляться путем подкожной, внутримышечной или внутрикожной инъекции. Такие препараты традиционно могут быть получены путем смешивания соединения с водой и приведения полученного раствора в стерильную и изотоническую по отношению к крови форму. Композиции для инъекции в соответствии с данным изобретением обычно содержат от 0,1 до 5% мас./мас. соединения, раскрытого в данном документе. Фармацевтические композиции, подходящие для ректального введения, предпочтительно присутствуют в виде дозированных свечей. Они могут быть получены путем смешивания соединения настоящего изобретения с одним или несколькими традиционными твердыми носителями, например кокосовым маслом, и затем придания формы полученной смеси. Фармацевтические композиции, подходящие для местного применения на коже, предпочтительно находятся в виде мази, крема, лосьона, пасты, геля, спрея, аэрозоля или масла. Носители, которые могут применяться, включают петролатум (например, вазелин), ланолин, полиэтиленгликоли, спирты, а также сочетания двух или более из данных веществ. Активное соединение обычно присутствует в концентрации, составляющей от 0,1 до 50 мас.% от массы композиции, например от 0,5 до 2%. Также возможно чрескожное введение. Фармацевтические композиции, подходящие для чрескожного введения, могут присутствовать в виде отдельных пластырей, приспособленных для того, чтобы оставаться в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Подходящим является, если такие пластыри содержат соединение настоящего изобретения в необязательно забуференном водном растворе, растворенное и/или диспергированное в липкой основе или диспергированное в полимере. Подходящая концентрация активного соединения составляет приблизительно от 1 до 35%, предпочтительно от 3 до 15%. Особого внимания заслуживает способ, при котором соединение может быть доставлено из пластыря посредством электротранспорта или ионтофореза, например, как описано в Pharmaceutical Research, 3 (6), 318 (1986). В любом случае, количество активного ингредиента, которое может быть объединено с веществами-носителями с получением дозированной формы, предназначенной для введения, зависит от хозяина,подлежащего лечению, и конкретного способа введения. Твердые дозированные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли,порошки, гелевые колпачки и гранулы, указанные выше, содержащие одно или несколько соединений,применимых в настоящем изобретении, смешанных по меньшей мере с одним инертным разбавителем,таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие дозированные формы могут также содержать, как известно в обычной практике, добавочные вещества, отличные от инертных разбавителей, например смазывающие агенты, такие как стеарат магния, или солюбилизирующие агенты, такие как циклодекстрины. В случае капсул, таблеток, порошков, гранул, гелевых колпачков и пилюль дозированные формы могут также включать забуферивающие агенты. Могут быть также получены таблетки и пилюли с энтеропокрытиями. Жидкие дозированные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно применяющиеся в данной области, такие как вода. Такие композиции могут также включать адъюванты,такие как увлажняющие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, а также подсластители,ароматизаторы и отдушки. Препараты для инъекций, например стерильные водные или маслянистые суспензии для инъекций,могут быть получены в соответствии с известными в данной области способами с использованием подходящих диспергирующих агентов или стабилизаторов, а также суспендирующих агентов. Стерильные препараты для инъекций могут также представлять собой стерильный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1,3-7 009466 бутандиоле. К приемлемым средам и растворителям, которые могут применяться, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно применяются стерильные нелетучие масла. Для этого могут использоваться любые мягкие нелетучие масла, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в получении препаратов для инъекций находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Фармацевтически приемлемые носители охватывают все вышеупомянутые носители и т.п. В сочетанной терапии введение двух или более терапевтических агентов, применимых в настоящем изобретении, может происходить последовательно, в отдельных композициях, или может быть осуществлено путем одновременного введения в одной или в отдельных композициях. Введение может осуществляться пероральным способом или посредством внутривенных, внутримышечных или подкожных инъекций. Композиции могут находиться в виде болюса или в виде водных или неводных изотонических стерильных растворов или суспензий для инъекций. Данные растворы и суспензии могут быть получены из стерильных порошков или гранул, содержащих один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей или связующее вещество, такое как желатин или гидроксипропилметилцеллюлоза, вместе с одним или несколькими смазывающим агентом, консервантом, поверхностно-активным веществом или диспергирующим агентом. Фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, может находиться в виде, например, таблетки, капсулы, суспензии или жидкости. Капсулы, таблетки и др. могут быть получены с помощью традиционных способов, хорошо известных в данной области. Фармацевтическую композицию предпочтительно получают в виде дозированной формы, содержащей конкретное количество активного ингредиента или ингредиентов. Примерами дозированных форм являются таблетки или капсулы. Они могут преимущественно содержать одно или несколько терапевтических соединений в количестве,описанном выше. Например, в случае ингибитора СЕТР доза находится в интервале, который может составлять приблизительно от 0,01 до 500 мг/день, или представляет собой любую другую дозу, в зависимости от конкретного ингибитора, как принято в данной области. В случае производного фибриновой кислоты доза находится в интервале, который может составлять приблизительно от 0,01 до 500 мг, или представляет собой любую другую дозу, в зависимости от конкретного ингибитора, как принято в данной области. Активные ингредиенты также могут быть введены путем инъекции в виде композиции, в которой,например, в качестве подходящего носителя может применяться физиологический раствор, декстроза или вода. Подходящей дневной дозой каждого активного терапевтического соединения является такая доза, которая обеспечивает такой уровень в сыворотке крови, какой обеспечивается в результате перорального введения, как описано выше. Терапевтические соединения могут быть также введены посредством сочетания способов пероральный/пероральный, пероральный/парентеральный или парентеральный/парентеральный. Фармацевтические композиции, предназначенные для применения в способах лечения настоящего изобретения, могут быть введены в пероральной форме или путем внутривенного введения. При сочетанной терапии предпочтительно пероральное введение. Дозировка для перорального введения может находиться в пределах режима, указанного для однократной дневной дозы, или для однократной дозы каждый следующий день, или для нескольких, разделенных доз в течение дня. Терапевтические соединения, которые составляют сочетанную терапию, могут быть введены одновременно либо в объединенной дозированной форме, либо в отдельных дозированных формах, предназначенных для, по существу,одновременного перорального введения. Терапевтические соединения, которые составляют сочетанную терапию, могут быть также введены последовательно, причем каждое терапевтическое соединение вводят по режиму, указанному для двухстадийного приема. Таким образом, режим может требовать последовательного введения терапевтических соединений с разделенным приемом отдельных активных агентов. Период времени между несколькими стадиями приема может варьировать от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от свойств каждого терапевтического соединения, таких как активность, растворимость, биодоступность, период полужизни в плазме и кинетический профиль терапевтического соединения, а также в зависимости от эффекта приема пищи, возраста и состояния пациента. Циркадная вариация концентрации целевой молекулы также может определять интервал оптимальной дозы. Терапевтические соединения сочетанной терапии, введенные или одновременно, по существу одновременно, или последовательно, могут включать режим, требующий введения одного терапевтического соединения пероральным способом, а другого терапевтического соединения внутривенным способом. Вводят ли терапевтические соединения сочетанной терапии пероральным или внутривенным способом,отдельно или вместе, каждое такое терапевтическое соединение будет содержаться в подходящей фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемые эксципиенты, разбавители или другие компоненты композиций. Примеры подходящих фармацевтически приемлемых композиций, содержащих терапевтические соединения, предназначенные для перорального введения, приведены выше. Режим лечения Дозировочный режим для профилактики, облегчения или улучшения болезненного состояния, включающего гиперлипидемию как элемент заболевания, например атеросклероза, или, кроме того, для защиты от или лечения повышенных уровней холестерина в плазме или в крови с помощью соединений и/или-8 009466 композиций настоящего изобретения выбирают в соответствии с рядом факторов. Данные факторы включают тип, возраст, вес, пол, диету и медицинское состояние пациента, тяжесть заболевания, способ введения, фармакологические характеристики, такие как активность, эффективность, фармакокинетика и токсикологические профили конкретного применяемого соединения в случае использования системы доставки лекарственного препарата и в случае, если соединение вводят как часть сочетания лекарственных препаратов. Таким образом, применяемый в действительности дозировочный режим может широко варьировать и, следовательно, может отклоняться от предпочтительного дозировочного режима, приведенного выше. Начальное лечение пациента, страдающего от гиперлипидемического состояния, может начинаться с доз, указанных выше. Лечение обычно должно продолжаться, как необходимо, в течение периода от нескольких недель до нескольких месяцев или лет, до тех пор, пока гиперлипидемическое болезненное состояние не будет подавлено или устранено. Для определения эффективности сочетанной терапии состояние пациентов, подвергающихся лечению соединениями или композициями, раскрытыми в данном документе, обычно можно отслеживать, например, измеряя сывороточные уровни общего холестерина и холестерина LDL с помощью любого из методов, хорошо известных в данной области. Непрерывный анализ таких данных позволяет изменять режим лечения в процессе лечения так, чтобы в любой момент времени вводить оптимальные эффективные количества каждого типа терапевтического соединения и,кроме того, определить продолжительность лечения. Таким образом, режим лечения/дозировочный распорядок могут быть рационально изменены в течение курса лечения, так, что вводится самое низкое количество терапевтических соединений, которые вместе проявляют удовлетворительную эффективность,и так, что введение продолжается в течение времени, необходимого для удовлетворительного лечения гиперлипидемического состояния. Потенциальным преимуществом сочетанной терапии, раскрытой в данном документе, может быть уменьшенное количество любого терапевтического соединения или всех терапевтических соединений,эффективное для лечения гиперлипидемических состояний, таких как атеросклероз и гиперхолестеринемия. Одно из нескольких воплощений настоящего изобретения включает сочетанную терапию, включающую применение первого количества ингибитора СЕТР и второе количество другого сердечно-сосудистого терапевтического препарата, применяемого для профилактики или лечения гиперлипидемии или атеросклероза, где упомянутые первое и второе количества вместе составляют количество упомянутых соединений, эффективное против гиперлипидемического состояния или против атеросклеротического состояния. Например, одно из многих воплощений настоящего изобретения представляет сочетанную терапию, включающую терапевтические дозы производного фибриновой кислоты и ингибитора СЕТР. Воплощения настоящего изобретения могут включать сочетанную терапию, в которой применяются два или более терапевтических соединений, описанных или включенных в данном документе. Сочетанная терапия может включать два или более терапевтических соединений, относящихся к различным классам химических соединений, например производные фибриновой кислоты могут быть объединены с ингибиторами СЕТР. Терапевтические сочетания могут включать более двух терапевтических соединений. Например, такая терапия может включать применение производного фибриновой кислоты, ингибитора СЕТР и ингибитора HMG СоА редуктазы. Альтернативно, два или более терапевтических соединений, относящихся к одному классу химических соединений, могут составлять терапию, например сочетанную терапию, включающую два или более производных фибриновой кислоты или два или более ингибитора СЕТР. Следующее воплощение настоящего изобретения включает применение любой из сердечно-сосудистых сочетанных терапий, описанных в данном документе, для профилактики или лечения гиперхолестеринемии, атеросклероза или гиперлипидемии. Следующие неограничивающие примеры служат для иллюстрации различных аспектов настоящего изобретения. с. Примеры. Табл. 3 иллюстрирует примеры некоторых сочетаний настоящего изобретения, где сочетание включает первое количество ингибитора СЕТР (соединения С-12) и второе количество производного фибриновой кислоты, где упомянутые первое и второе количества вместе составляют количество упомянутых соединений, эффективное против гиперлипидемического состояния или против атеросклеротического состояния. Таблица 3-9 009466 Биологические анализы Применение сочетаний настоящего изобретения может быть продемонстрировано с помощью следующих анализов. Данные анализы проводят in vitro и на животных моделях, используя, по существу,методы, которые могут продемонстрировать применение настоящего изобретения.[14 С]-таурохолата (ТС) в клетках Н 14 Клетки почек детеныша хомяка (ВНК), трансфицированные кДНК человеческого IBAT (клеткиH14), высевали в количестве 60000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты Top-Count для культивирования тканей для проведения анализа в течение 24 ч после высевания, 30000 клеток/лунку для анализа,проводимого в течение 48 ч, и 10000 клеток/лунку для анализа, проводимого в течение 72 ч. В день анализа монослой клеток осторожно промывали 1 раз с помощью 100 мкл буфера для анализа (среда Игла, модифицированная по Дульбекко, содержащая 4,5 г/л глюкозы + 0,2% (мас./об.) не содержащего жирных кислот бычьего сывороточного альбумина - (FAF)BSA). К каждой лунке добавляли 50 мкл двукратного концентрата тестируемого соединения в буфере для анализа вместе с 50 мкл 6 мкМ[14 С]-таурохолата в буфере для анализа (конечная концентрация [14 С]-таурохолата 3 мкМ). Культуральные планшеты инкубировали 2 ч при 37C, после чего каждую лунку осторожно промывали дважды с помощью 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером по Дульбекко (PBS) с температурой 4C, содержащего 0,2% (мас./об.) (FAF)BSA. Затем лунки осторожно промывали 1 раз 100 мкл, 4C,PBS, не содержащего (FAF)BSA. К каждой добавляли 200 мкл жидкого сцинтиллятора, планшеты нагревали в закрытом состоянии и встряхивали 30 мин при комнатной температуре, после чего в каждой лунке измеряли количество радиоактивности на счетчике Packard Top-Count.In vitro анализ соединений, ингибирующих поглощение [14 С]-аланина Анализ поглощения аланина проводили по способу, идентичному таурохолатному анализу, за исключением того, что меченый таурохолат заменяли на меченый аланин.(См. "Metabolism of 3,7-dihydroxy-7-methyl-5-cholanoic acid and 3,7-dihydroxy-7-methyl-5cholanoic acid in hamsters" in Biochimica et Biophysica Acct, 833, 196-202 (1985) by Une et al., включенный в данный документ в качестве ссылки.) Самцов крыс Wistar (200-300 г) анестезировали инактином 100 мг/кг. В желчные протоки вводили канюлю РЕ 10 длиной 10". Тонкий кишечник вынимали и выкладывали на марлевую прокладку. Канюлю(1/8" луерный замок, зауженный к концу адаптор для самок) вставляли на расстоянии 12 см от соединения тонкого кишечника и слепой кишки. На расстоянии 4 см от того же соединения был сделан продольный разрез (с использованием подвздошной кишки длиной 8 см). Для промывания сегмента кишечника использовали 20 мл теплого физиологического раствора с фосфатным буфером по Дульбекко, рН 6,5(PBS). Дистальное отверстие каннюлировали с использованием силиконовой трубки длиной 20 см (0,02" внутр. диам. х 0,037" внешн. диам.). Проксимальную канюлю присоединяли к перистальтическому насосу и кишечник промывали в течение 20 мин теплым PBS со скоростью 0,25 мл/мин. Температуру сегмента кишки непрерывно отслеживали. В начале эксперимента 2,0 мл контрольного образца ([14 С]-таурохолата 0,05 мКи/мл с 5 мМ немеченого таурохолата) помещали в сегмент кишки с помощью 3 мл шприца и начинали сбор образца желчи. Контрольный образец вливали со скоростью 0,25 мл/мин в течение 21 мин. Порции образцов желчи собирали каждые 3 мин в течение первых 27 мин процедуры. После 21 мин вливания образца петлю подвздошной кишки промывали 20 мл теплого PBS (используя 30 мл шприц) и затем петлю промывали в течение 21 мин теплым PBS со скоростью 0,25 мл/мин. Вторую перфузию начинали, как описано выше, но, кроме того, вводили тестируемое соединение (21 мин - введение и затем 21 мин - промывание) и желчь собирали каждые 3 мин в течение первых 27 мин. При необходимости проводили третью перфузию, как описано выше, обычно с использованием контрольного образца. Измерение концентрации печеночного холестерина (HEPATIC CHOL) Ткань печени взвешивали и гомогенизировали в смеси хлороформ/метанол (2:1). После гомогенизации и центрифугирования супернатант отделяли и сушили в атмосфере азота. Остаток растворяли в изопропаноле и содержание холестерина измеряли с помощью ферментного анализа, используя сочетание холестериноксидазы и пероксидазы, как описано Allain, С.A. et al., Clin. Chem., 20, 470 (1974) (включен в данный документ в качестве ссылки). Измерение активности печеночной HMG СоА-редуктазы (HMG СоА) Печеночные микросомы получали путем гомогенизации образцов печени в фосфатно-сахарозном буфере, затем отделяли путем центрифугирования. Вещество конечного осадка ресуспендировали в буфере и аликвоту анализировали на активность HMG СоА-редуктазы путем инкубации в течение 60 мин при 37C в присутствии 14C-HMG-CoA (Dupont-NEN). Реакцию останавливали путем добавления 6N HCl,после чего центрифугировали. Аликвоту супернатанта разделяли с помощью тонкослойной хроматографии, пятно, соответствующее продукту ферментативной реакции, соскабливали с пластинки, экстрагировали и радиоактивность определяли путем сцинтилляционного счета (ссылка: Akerlund, J. and Bjorkhem,I. (1990) J. Lipid Res. 31, 2159).- 10009466 Определение сывороточного холестерина (SER.CHOL, HDL-CHOL, TGI и VLDL+LDL) Общий сывороточный холестерин (SER.CHOL) измеряли с помощью ферментного анализа с использованием коммерческого набора Wako Fine Chemicals (Richmond, VA); холестерин С 11,по каталогу 276-64909. Холестерин HDL (HDL-CHOL) анализировали, используя тот же набор, после осажденияVLDL и LDL, с помощью HDL холестеринового реагента, Sigma Chemical Co.,по каталогу 352-3 (декстран-сульфатный метод). Общие сывороточные триглицериды (контрольные) (TGI) анализировали с помощью ферментной реакции с использованием Sigma Chemical Co. GPO-Trinder,по каталогу 337-В. Концентрации холестерина VLDL и LDL (VLDL+LDL) рассчитывали как разность между общим холестерином и холестерином HDL. Измерение активности холестерин 7 гидроксилазы в печени (7-OHase) Печеночные микросомы получали путем гомогенизации образцов печени в фосфатно-сахарозном буфере, затем отделяли путем центрифугирования. Вещество конечного осадка ресуспендировали в буфере и аликвоту анализировали на активность холестерин 7 гидроксилазы путем инкубации в течение 5 мин при 37C в присутствии NADPH. После экстракции петролейным эфиром органический растворитель упаривали и остаток растворяли в смеси ацетонитрил/метанол. Продукт ферментативной реакции разделяли путем ввода аликвоты экстракта в колонку ВЭЖХ с обращенной фазой C18 и количественно определяли элюирующееся вещество с помощью детекции при 240 нм (ссылка: Horton, J.D., et al. (1994)J. Clin. Invest. 93, 2084). Измерение концентрации фекальных желчных кислот (FBA) Общий выход фекалий от индивидуально размещенных хомяков собирали в течение 24 или 48 ч,сушили в токе азота, растирали в порошок и взвешивали. Приблизительно 0,1 г отбирали и экстрагировали органическим растворителем (бутанол/вода). После разделения и высушивания остаток растворяли в метаноле и количество присутствующих желчных кислот измеряли с помощью ферментного анализа,используя реакцию 3-гидроксистероиддегидрогеназы с желчными кислотами с восстановлением NAD.(Mashige, F. et al., Clin. Chem., 27, 1352 (1981), включен в данный документ в качестве ссылки). Поглощение [3 Н]-таурохолата в мембранных везикулах ворсистого эпителия (BBMV) кролика Мембраны ворсистого эпителия подвздошной кишки кролика получали из замороженной слизистой оболочки подвздошной кишки с помощью метода осаждения кальцием, описанного Malathi et al. (BiochimicaBiophysica Acta, 554, 259 (1979), включен в данный документ в качестве ссылки). Способ для измерения таурохолата, по существу, являлся таким, как описан Kramer et al. (Biochimica Biophysica Acta, 1111, 93(1992), включен в данный документ в качестве ссылки), за исключением того, что аналитический объем составлял 200 мкл вместо 100 мкл. Вкратце, при комнатной температуре 190 мкл раствора, содержащего 2 мкМ [3 Н]-таурохолата (0,75 мкКи), 20 мМ tris, 100 мМ NaCl, 100 мМ маннитола рН 7,4, инкубировали 5 с с 10 мкл мембранных везикул ворсистого эпителия (60-120 мкг белка). Инкубацию инициировали путем добавления BBMV при энергичном перемешивании и реакцию останавливали путем добавления 5 мл охлажденного во льду буфера (20 мМ Hepes-tris, 150 мМ KCl), сразу после этого фильтровали через найлоновый фильтр (поры 0,2 мкм) и промывали еще 5 мл останавливающего буфера. Ацил-СоА; холестеринацилтрансфераза (АСАТ) Микросомы печени хомяка и кишечника крысы получали из ткани по описанной ранее методике (J.Biol. Chem., 255, 9098 (1980), включен в данный документ в качестве ссылки) и использовали в качестве источника фермента АСАТ. В анализе использовали 2,0 мл инкубационной среды, содержащей 24 мкМ олеоил-СоА (0,05 мкКи) в 50 мМ фосфате натрия, 2 мМ DTT, буфера рН 7,4, содержащего 0,25% BSA и 200 мкг микросомального белка. Анализ инициировали добавлением олеоил-СоА. Реакцию оставляли протекать 5 мин при 37C, ее завершали путем добавления 8,0 мл смеси хлороформ/метанол (2:1). К экстракционной смеси добавляли 125 мкг олеата холестерина в смеси хлороформ/метанол в качестве носителя и органическую и водную фазы экстракционной смеси разделяли путем центрифугирования после энергичного перемешивания. Хлороформную фазу высушивали и затем наносили на ТСХ пластинки с силикагелем 60 и развивали в смеси гексан/этиловый эфир (9:1). Количество образовавшегося эфира холестерина определяли путем измерения количества радиоактивности, включенной в пятно на пластинке ТСХ, содержащее олеат холестерина, с помощью Packard Instaimager. Оценки лекарственных препаратов, снижающих уровень липидов на модели собак Самцов коротконогих гончих собак, полученных из такого источника, как питомник Маршалла, весом 6-12 кг кормили 1 раз в день в течение 2 ч и давали воду без ограничений. Собак случайным образом определяли в дозировочные группы, состоящие из 6-12 собак каждая, такие как среда для лекарства, в.ж.; 1 мг/кг, в.ж.; 2 мг/кг, в.ж.; 4 мг/кг, в.ж.; 2 мг/кг, р.о. (порошок в капсуле). Внутрижелудочное введение дозы терапевтического вещества, растворенного в водном растворе (например, 0,2% раствор Tween 80[полиоксиэтилена моноолеат, Sigma Chemicals Co., St. Louis, МО]), может быть осуществлено с помощью желудочного зонда. Перед началом получения дозы образцы крови брали из латеральной подкожной вены передней конечности утром перед кормлением для оценки уровней холестерина (общего иHDL) и триглицеридов в сыворотке. В течение нескольких последующих дней животные получали дозу утром, перед кормлением. Животным позволяли есть 2 ч, после чего остатки пищи удаляли. Фекалии- 11009466 собирали в течение двухдневного периода в конце исследования и анализировали на содержание желчных кислот или липидов. В конце периода лечения также брали образцы крови для сравнения с уровнями липидов в сыворотке до исследования. Статистически достоверное значение определяли с помощью стандартного Т-теста Стьюдента при р 0,05. Измерение липидов в сыворотке собак Кровь собирали из латеральной подкожной вены передней конечности собак, не получающих пищу,в пробирки для отделения сыворотки (Vacutainer SST, Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ). Кровь центрифугировали 20 мин при 2000 об./мин и сыворотку декантировали. Общий холестерин измеряли в 96-луночном формате с помощью ферментного диагностического набора Wako (холестерин CII) (Wako Chemicals, Richmond, VA) с использованием реакции холестериноксидазы с образованием пероксида водорода, который измеряли колориметрически. Стандартную кривую для концентраций холестерина от 0,5 до 10 мкг получали, используя первые две колонки планшета. Образцы сыворотки (20-40 мкл, в зависимости от ожидаемой концентрации липидов) или известные сывороточные контрольные образцы добавляли в отдельные лунки с повторами. Воду добавляли в таком количестве, чтобы довести объем в каждой лунке до 100 мкл. К каждой лунке добавляли аликвоту окрашивающего реагента объемом 100 мкл и планшеты считывали при 500 нм после 15 мин инкубации при 37 стоградусной шкалы. Холестерин HDL анализировали с помощью набора Sigma352-3 (Sigma Chemical Co., St. Louis,МО) с использованием декстрансульфата и ионов Mg для избирательного осаждения LDL и VLDL. Каждый сывороточный образец объемом 150 мкл добавляют в отдельные микроцентрифужные пробирки с последующим добавлением 15 мкл холестеринового реагента HDL (Sigma 352-3). Образцы перемешивали и центрифугировали 5 мин при 5000 об./мин. Затем аликвоту супернатанта объемом 50 мкл смешивали с 200 мкл физиологического раствора и анализировали по методу, использующемуся для измерения общего холестерина. Триглицериды измеряли с помощью набора Sigma337 в формате 96-луночного планшета. По данной методике измеряли глицерин после его высвобождения в результате взаимодействия триглицеридов с липопротеинлипазой. Для получения стандартной кривой использовали стандартные растворы глицерина (Sigma 339-11) с концентрацией, находящейся в интервале от 1 до 24 мкг. Образцы сыворотки(20-40 мкл, в зависимости от ожидаемой концентрации липидов) добавляли в лунки с повторами. Воду добавляли в таком количестве, чтобы довести объем в каждой лунке до 100 мкл, и к каждой лунке также добавляли 100 мкл окрашивающего реагента. После перемешивания и инкубации в течение 15 мин планшеты считывали при 540 нм и значения концентраций триглицеридов рассчитывали по стандартной кривой. В опыте также использовали дубликат планшета с использованием контроля ферментного реагента для корректировки эндогенного глицерина в образцах сыворотки. Измерение желчных кислот в фекалиях собаки Для определения концентрации фекальных желчных кислот (FBA) собирали образцы фекалий каждого животного. Сбор фекалий проводили в течение последних 48 ч исследования, в течение двух последовательных 24-часовых периодов между 9:00 и 10:00 утра каждый день, перед получением препаратов и кормлением. Отдельные двухдневные сборы фекалий от каждого животного взвешивали, объединяли и гомогенизировали с дистиллированной водой в процессоре (Cuisinart) до получения гомогенной взвеси. Приблизительно 1,4 г гомогената экстрагировали смесью третичный бутанол/дистиллированная вода(2:0,6) с конечной концентрацией 50% в течение 45 мин в водяной бане при 37C и центрифугировали 13 мин при 2000xg. Концентрацию желчных кислот (ммоль/день) определяли с помощью 96-луночной ферментной аналитической системы (1,2). Аликвоту фекального экстракта объемом 20 мкл добавляли к двум сериям каждого из тройных повторов лунок в 96-луночном аналитическом планшете. Для качественного контроля анализа также анализировали стандартизированный раствор таурохолата натрия и стандартизированный раствор фекального экстракта (предварительно полученный из объединенных образцов и охарактеризованный по концентрации присутствующих в нем желчных кислот). Подобным образом к двум сериям тройных повторов лунок добавляли 20-мкл аликвоты таурохолата натрия, серийно разбавленные для получения стандартной кривой. К каждой лунке добавляли 230 мкл реакционной смеси, содержащей 1M гидразингидрат, 0,1 М пирофосфат и 0,46 мг/мл NAD. Затем к одной из двух серий тройных повторов добавляли аликвоту фермента 3-гидроксистероиддегидрогеназы (HSD; 0,8 ед./мл) или аналитического буфера (0,1 М пирофосфат натрия) объемом 50 мкл. Все реагенты были получены отSigma Chemical Co., St. Louis, МО. После 60 мин инкубации при комнатной температуре измеряли оптическую плотность при 340 нм и рассчитывали среднее значение каждой серии тройных повторов образцов. Различие в оптической плотности HSD фермент использовали для определения концентрации желчных кислот (мМ) в каждом образце на основе стандартной кривой таурохолата натрия. Для расчета соответствующей концентрации FBA в ммоль/кг/день для каждого животного использовали концентрацию желчных кислот в экстракте, массу гомогената фекалий (граммы) и массу тела животного. Для определения увеличения (значение дельта) концентрации FBA в результате лечения среднюю концентрациюFBA (ммоль/кг/день), полученную для группы, получающей среду для лекарства, вычитали из концен- 12009466 трации FBA, полученной для группы, получающей лекарственный препарат. Анализ активности СЕТР в человеческой плазме (меченный тритием эфир холестерина) Кровь получали от здоровых добровольцев. Кровь собирали в пробирки, содержащие ЭДТА (пул плазмы, содержащей ЭДТА). Пул человеческой плазмы, содержащей ЭДТА, которую предварительно хранили при -20C, оттаивали при комнатной температуре и центрифугировали 5 мин для удаления каких-либо частичек. Меченные тритием HDL с радиоактивной меткой, введенной во фрагмент эфира холестерила ([3 Н]CE-HDL), как описано Morton and Zilversmit (J. Biol. Chem., 256, 11992-95 (1981, добавляли к плазме до получения конечной концентрации (25 мкг/мл холестерина). Ингибиторные соединения добавляли к плазме следующим образом. Равные объемы плазмы, содержащей [3H]CE-HDL (396 мкл),добавляли с помощью пипетки в микропробирки (Titertube, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA). Готовили серийные разведения в DMSO (или в некоторых случаях в альтернативных растворителях, таких как диметилформамид или этанол) базовых растворов соединений в DMSO с концентрацией, составляющей обычно 20-50 мМ. Затем к каждой из пробирок, содержащих плазму, добавляли 4 мкл каждого из серийных разведений ингибиторных соединений или только DMSO. Содержимое пробирок сразу перемешивали. После этого тройные повторы аликвот (100 мкл) из каждой пробирки с плазмой переносили в лунки 96-луночных круглодонных полистирольных микротитровальных планшетов (Corning, Corning, NY). Планшеты герметично закрывали пластиковой пленкой и инкубировали 4 ч при 37C. Опытные лунки содержали плазму с разведениями ингибиторных соединений. Контрольные лунки содержали плазму только с DMSO. "Пустые" лунки содержали плазму только с DMSO, которые оставляли в микропробирках при 4C в течение 4 ч инкубации и добавляли к лункам микротитровального планшета в конце периода инкубации. VLDL и LDL осаждали путем добавления 10 мкл осаждающего реагента (1% (мас./об.) декстрансульфата (Dextralip50)/0,5 М хлорид магния, рН 7,4) во все лунки. Содержимое лунок перемешивали на миксере для планшетов и затем инкубировали 10 мин при температуре окружающей среды. Планшеты затем центрифугировали при 1000 хg в течение 30 мин при 10C. Затем супернатанты (50 мкл) из каждой лунки переносили в 96-луночные планшеты Picolate (Packard, Meriden, CT), содержащий 250:1 Microscint-40 (Packard, Meriden, CT). Планшеты нагревали в герметично закрытом состоянии(TopSeal-P, Packard, Meriden, CT) в соответствии с инструкциями производителя и перемешивали в течение 30 мин. Радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике для микропланшет (TopCount, Packard, Meriden, CT) . Значения IC50 определяли как концентрацию ингибиторного соединения,ингибирующую перенос [3 Н]СЕ из [3H]CE-HDL супернатанта в осажденные VLDL и LDL на 50% по сравнению с переносом, полученным для контрольных лунок. Максимальный процент переноса (в контрольных лунках) определяли, используя следующеее уравнение: Значения IC50 рассчитывали из графиков зависимости процента от контроля от концентрации ингибиторного соединения. Активность СЕТР in vitro Способность соединений ингибировать активность СЕТР оценивали, используя in vitro анализ, в котором измеряли скорость переноса радиоактивно меченного эфира холестерина ([3 Н]СЕ) от донорных частиц HDL к акцепторным частицам LDL. Подробности анализа предоставлены Glenn et al. (Glenn andAssay of CETP Protein", Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996. CETP получали из не содержащей сыворотки кондиционированной среды клеток СНО, трансфицированных кДНК, кодирующей СЕТР (Wang, S. etal., J. Biol. Chem. 267, 17487-17490 (1992. Для измерения активности СЕТР [3H]CE-меченные HDL,LDL, CETP и аналитический буфер (50 мМ трис(гидроксиметил)аминометан, рН 7,4; 150 мМ хлорид натрия; 2 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота; 1% бычий сывороточный альбумин) инкубировали в объеме 200 мкл в течение 2 ч при 37C в 96-луночных планшетах. LDL избирательно осаждали путем добавления 50 мкл смеси 1% (мас./об.) декстрансульфат/0,5 М хлорид магния, энергично перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Раствор (200 мкл) переносили на фильтровальный планшет (Millipore). После фильтрации радиоактивность, присутствующую в осажденных LDL, измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Коррекцию неспецифического переноса или осаждения осуществляли путем включения образцов, не содержащих СЕТР. Скорость переноса [3 Н]СЕ, определенная с помощью данного анализа, является линейной функцией от времени и концентрации СЕТР,до 25-30% переносимого [3 Н]СЕ.- 13009466 Активность тестируемых соединений определяли с помощью вышеописанного анализа в присутствии различных концентраций тестируемых соединений и путем определения концентрации, требующейся для 50% ингибирования переноса [3 Н]СЕ от HDL к LDL. Данное значение определяли как IC50. ЗначенияIC50, определенные с помощью данного анализа, являются точными, если IC50 выше 10 нм. В случае, если соединения имеют более высокую ингибиторную активность, точные значения IC50 могут быть определены с использованием более длительного времени инкубации (до 18 ч) и более низких концентраций СЕТР (50 нМ). Ингибирование активности СЕТР in vivo Ингибирование активности СЕТР под действием тестируемого соединения определяли путем введения соединения животному посредством внутривенной инъекции или перорально через зонд, измерения количества меченного тритием эфира холестерина ([3 Н]CE), перенесенного от частиц HDL к частицам VLDL и LDL, и сравнения данного количества перенесенного эфира с количеством, наблюдаемым у контрольных животных. Самцов золотистых сирийских хомяков держали на пищевой диете, содержащей 0,24% холестерина, в течение по меньшей мере 2 недель перед исследованием. В случае животных, получающих дозы препарата внутривенно, непосредственно перед экспериментом животных анестезировали пентобарбиталом. Анестезию поддерживали в течение всего эксперимента. Внутренние катетеры вставляли в яремную вену и сонную артерию. В начале эксперимента все животные получали 0,2 мл раствора, содержащего[3H]CE-HDL, через яремную вену. [3H]CE-HDL представляет собой препарат человеческих HDL, содержащих меченный тритием эфир холестерила, его получали по способу Glenn et al. (Meth. Enzymol., 263,339-351 (1996. Соединение в виде базового раствора с концентрацией 80 мМ растворяли в среде (2% этанол: 98% PEG 400, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missuri, USA) и вводили либо путем болюсной инъекции, либо путем непрерывного вливания. Через 2 мин после введения дозы [3H]CE-HDL животные получали 0,1 мл тестируемого раствора, введенного в яремную вену. Контрольные животные получали 0,1 мл раствора для внутривенного введения, представляющего собой среду для лекарства, без тестируемого соединения. Через 5 мин брали первые образцы крови (0,5 мл) из сонной артерии и собирали в стандартные микропробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту. Для промывания катетера и замены объема крови вводили физиологический раствор (0,5 мл). Последующие образцы крови брали по тому же методу через 2 и 4 ч. Образцы крови хорошо перемешивали и держали на льду до завершения эксперимента. Плазму получали путем центрифугирования образцов крови при 4C. Плазму(50 мкл) обрабатывали 5 мкл осаждающего реагента (декстрансульфат, 10 г/л; 0,5 М хлорид магния) для удаления VLDL/LDL. После центрифугирования полученный супернатант (25 мкл), содержащий HDL,анализировали на наличие радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Процент [3 Н]СЕ, перенесенного от HDL к LDL и VLDL (% переноса), рассчитывали на основе общей радиоактивности в одинаковых образцах плазмы до осаждения. Обычно количество переноса отHDL к LDL и VLDL у контрольных животных составляет от 20 до 35% через 4 ч. Альтернативно, находящиеся в сознании, не анестезированные животные получали дозу тестируемого соединения перорально через зонд в виде суспензии в 0,1% метилцеллюлозе в воде. В определенный для каждого соединения момент времени, когда уровень тестируемого вещества в плазме достигает своего пика (Cmax) после перорального введения, животных анестезировали пентобарбиталом и затем вводили 0,2 мл раствора, содержащего [3H]CE-HDL, в яремную вену, как описано выше. Контрольные животные получали 0,25 мл раствора, представляющего собой среду для лекарства, не содержащего тестируемое соединение, путем перорального введения через зонд. Через 4 ч животных умерщвляли, собирали образцы крови и процент [3 Н]СЕ, перенесенного от HDL к LDL и VLDL (% переноса), анализировали, как описано выше. Альтернативно, ингибирование активности СЕТР под действием тестируемого соединения определяли путем введения соединения мышам, которые были отобраны на основе наличия экспрессии человеческого СЕТР (hCETP) в результате трансгенных манипуляций (hCETP мыши). Тестируемые соединения вводили путем внутривенной инъекции или перорально через зонд и определяли количество меченного тритием эфира холестерила ([3 Н]СЕ), перенесенного от частиц HDL к частицам LDL и VLDL, и сравнивали с перенесенным количеством, наблюдаемым у контрольных животных. Мышей С 57 В 1/6, которые являются гомозиготными по отношению к гену hCETP, держали на пищевой диете с высоким содержанием жира, такой как TD88051, как описано Nishina et al. (J. Lipid Res., 31, 859-869 (1990, в течение последних 2 недель перед исследованием. Мыши получали перорально через зонд дозу тестируемого соединения в виде суспензии в 0,1% метилцеллюлозе в воде или внутривенно болюсную инъекцию тестируемого соединения в 10% этанола и 90% полиэтиленгликоля. Контрольные животные получали раствор,представляющий собой среду для лекарства, не содержащий тестируемого соединения, путем перорального введения через зонд или путем внутривенной болюсной инъекции. В начале эксперимента всем животным вводили в хвостовую вену 0,05 мл раствора, содержащего [3H]CE-HDL. [3H]CE-HDL представляет собой препарат человеческих HDL, содержащих меченный тритием эфир холестерила, его получали по способу Glenn et al. (Meth. Enzymol., 263, 339-351 (1996. Через 30 мин животных обескровливали и кровь собирали в стандартные микропробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту. Об- 14009466 разцы крови хорошо перемешивали и держали на льду до завершения эксперимента. Плазму получали путем центрифугирования образцов крови при 4C. Плазму разделяли и анализировали с помощью гельфильтрационной хроматографии и определяли относительные количества [3 Н]СЕ во фракциях, содержащих VLDL, LDL и HDL. Процент [3 Н]СЕ, перенесенного от HDL к LDL и VLDL (% переноса), рассчитывали на основе общей радиоактивности в одинаковых образцах плазмы до осаждения. Обычно количество переноса отHDL к LDL и VLDL у контрольных животных составляет от 20 до 35% через 30 мин. Анализ абсорбции холестерина в кишечнике Показано, что ряд соединений ингибируют абсорбцию холестерина из кишечного тракта. Данные соединения снижают уровень холестерина в сыворотке путем уменьшения абсорбции в кишечнике как экзогенного (диетарного), так и эндогенного (секретирующегося из желчного пузыря в кишечный тракт) холестерина. У хомяков применение двойного изотопного метода плазменного соотношения для измерения абсорбции холестерина в кишечнике было усовершенствовано и оценено, как описано Turley et al. (J. LipidRes. 35, 329-339 (1994), включен в данный документ в качестве ссылки). Самцы хомяков весом 80-100 г получали пищу и воду без ограничений в комнате с 12-часовыми чередующимися световыми и темновыми периодами. 4 ч в световом периоде каждому хомяку вводили вначале внутривенно дозу 2,5 мкКи [1,2-3 Н]холестерина, суспендированного в Intralipid (20%), и затем перорально дозу [4-14 С]холестерина в масле из среднецепочечных триглицеридов (МСТ). В.в. дозу давали путем введения смеси Intralipid объемом 0,4 мл в дистальную бедренную вену. Пероральную дозу давали путем введения масляной смеси МСТ объемом 0,6 мл в желудок через зонд, представляющий собой полиэтиленовую трубку. Через 72 ч хомяков обескровливали и определяли количество 3 Н и 14 С в плазме и в исходном количестве введенной метки с помощью жидкостной сцинтилляционной спектрометрии. Абсорбцию холестерина рассчитывали на основе следующего уравнения: Процент абсорбированного холестерина = Анализ микросомального белка, переносящего триглицериды (МТР) МТР выделяли из ткани печени или из культуры клеток (например, клеток HepG2) с помощью стандартных методов, таких как описанные Ohringer et al. (Acta Crystallogr. D52, 224-225 (1996), включен в данный документ в качестве ссылки). Последующие анализы активности МТР проводили, как описано Jamil et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 11991-11995 (1996), включен в данный документ в качестве ссылки). Основой данного анализа является измерение переноса меченых триглицеридов от популяции донорных везикул к популяции акцепторных везикул в присутствии МТР. Ингибиторы МТР оценивали путем добавления их к смеси перед введением МТР. Донорные везикулы получали путем обработки ультразвуком водной смеси яичных фосфолипидов, кардиолипина, 3 Н-меченого фосфолипида и 14 Смеченых триглицеридов. Акцепторные везикулы получали путем обработки ультразвуком водной смеси яичных фосфолипидов. Растворы везикул смешивали вместе, в присутствии или в отсутствие добавленных ингибиторов МТР, и добавляли МТР для инициации реакции переноса. Анализ завершали через 60 мин путем добавления 0,5 мл целлюлозы DE-52, затем центрифугировали для осаждения донорных молекул. Количество 3 Н и 14 С в осадке и исходное количество метки в смеси определяли с помощью жидкостной сцинтилляционной спектрометрии. Скорость переноса липидов оценивали на основе кинетической зависимости первого порядка, используя выражение[S]=[S]0 e-kt 14 где [S]0 и [S] обозначают долю метки С в осадке донорной мембраны в моменты времени 0 и t, соответственно, а коэффициент k обозначает долю метки, переносимую в единицу времени. Анализ липидов плазмы кроликов Липиды плазмы анализировали с помощью стандартных методов, как описано J.R. Schuh et al., J.Clin. Invest., 91, 1453-1458 (1993), включен в данный документ в качестве ссылки. Группы самцов новозеландских белых кроликов сажали на стандартную диету (100 г/день), дополненную 0,3% холестерина и 2% кукурузного масла (Zeigler Bothers, Inc., Gardners, PA). Воду давали в свободном доступе. Группы контрольных и обработанных животных умерщвляли после 1 и 3 месяцев обработки. Ткани удаляли для оценки атеросклеротических бляшек. Для определения концентрации липидов в плазме брали образцы крови. Липиды плазмы Плазму для анализа липидов получали путем забора крови из ушной вены в ЭДТА-содержащие пробирки (Vacutainer; Becton DickensonCo., Rutherford, NJ) с последующим отделением клеток путем центрифугирования. Общий холестерин определяли с помощью ферментного анализа с использованием реакции холестериноксидазы (С.A. Allain et al., Clin. Chem., 20, 470-475 (1974), включен в данный документ в качестве ссылки). Холестерин HDL также измеряли с помощью ферментного анализа после изби- 15009466 рательного осаждения LDL и VLDL под действием декстрансульфата и магния (G.R. Warnick et al., Clin.Chem., 28, 1379-1388 (1982), включен в данный документ в качестве ссылки). Уровни триглицеридов в плазме определяли путем измерения количества глицерина, высвобождающегося под действием липопротеинлипазы, посредством анализа с использованием связанного фермента (G. Bucolo et al., Clin.Chem., 19, 476-482 (1973), включен в данный документ в качестве ссылки). Атеросклероз Животных умерщвляли путем инъекции пентобарбитала. Торакальные аорты быстро удаляли, фиксировали погружением в 10% нейтральный забуференный формалин и окрашивали маслорастворимым красным О (0,3%). После одного продольного надреза вдоль стенки, противоположной устью, сосуды закрепляли открытыми для оценки площади, занимаемой бляшками. Процент площади, покрытой бляшками, определяют из значений общей исследуемой площади и окрашенной площади путем порогового анализа с использованием анализатора изображения подлинного окрашивания (Videometric 150; AmericanInnovision, Inc., San Diego, CA), сопряженного с цветовой камерой (Toshiba 3CCD), установленной на аналитическом микроскопе. Тканевой холестерин измеряли с помощью ферментного анализа, как описано, после экстракции смесью хлороформ/метанол (2:1) в соответствии с методом, описанным Folch et al.(J. Biol. Chem., 226, 497-509 (1957), включен в данный документ в качестве ссылки). Сосудистый ответ in vitro После инъекции пентобарбитала натрия абдоминальные аорты быстро вырезали и помещали в насыщенный кислородом бикарбонатный буфер Кребса. После удаления периваскулярной ткани вырезали круговые сегменты диаметром 3 мм, помещали при 37C в баню для мускульной ткани, содержащую бикарбонатный раствор Кребса, и подвешивали между двумя неокрашенными стальными проволоками,одна из которых присоединена к преобразователю усилия (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Изменение усилия в ответ на добавление к водяной бане ангиотензина II записывали на регистрирующем устройстве. Примеры, описанные в данном документе, могут быть осуществлены путем замены обычно или конкретно описанных терапевтических соединений или инертных ингредиентов на применяемые в предшествующих примерах. Очевидно, что в пределах описанного изобретения разными способами могут осуществляться вариации. Такие вариации не должны считаться отклонением от духа и объема настоящего изобретения, и подразумевается, что все такие модификации и эквиваленты, являющиеся очевидными специалисту в данной области, включены в объем нижеприведенной формулы изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Соединение, имеющее формулу