Немодифицированное масло грибов mortierella sp., способ его получения, способ обеспечения детского питания арахидоновой кислотой, детское питание, содержащее арахидоновую кислоту, способ обеспечения человека дополнительным количеством арахидоновой кислоты и косметическая композиция

1 Данное изобретение относится к получению арахидоновой кислоты, композициям, содержащим арахидоновую кислоту и к ее применению. Арахидоновая кислота (ARA) представляет собой полиненасыщенную жирную кислоту с длинной углеродной цепью (PUFA) омега-6 класса (5,8,11,14-эйкозотетраеновая кислота, т.е. соотношение количества углеродных атомов в цепи и количества ненасыщенных связей равно 20:4). В организме человека ARA является наиболее распространенной C20PUFA. Она особенно распространена в тканях органов, мышц и крови, играя важную роль в качестве структурного липида, связанного преимущественно с фосфолипидами в крови, печени, мышечной ткани и других важных системах органов. Помимо первичной роли в качестве структурного липида, ARA также является непосредственным предшественником ряда циркулирующих в организме человека эйкозиноидов, таких как простагландин Е 2 (PGE2), простациклин I2 (PGI2),тромбоксан А 2 (ТxА 2), лейкотриены В 4 (LTB4) и С 4 (LTC4). Эти эйкозиноиды оказывают релуляторное действие на метаболизм липопротеинов,влияют на реологию крови, васкулярный тонус,функцию лейкоцитов и активацию тромбоцитов. Несмотря на важность ARA для метаболизма, протекающего в организме человека,организм не может синтезировать ее заново (от начала до конца). ARA синтезируется в организме из линолевой кислоты (LOA) - жизненноважной жирной кислоты - удлинением цепочки и введением ненасыщенных связей в ее структуру. Для этого процесса необходимо присутствие фермента 6-десатуразы, который присутствует в организме человека в малых количествах(Burre et al., Lipids, 25:354-356 (1990). Соответственно, большее количество ARA должно обеспечиваться введением с пищей, и это особенно важно во время очень быстрого роста организма, такого, который происходит в раннем детском возрасте. Во время первого года жизни ребенка его вес может увеличиваться в два или три раза. Следовательно, ему необходимо большое количество ARA, поступаемой с пищей. Вот почему женское грудное молоко должно иметь высокое содержание ARA (Sanders et al., Am. J. Clin.Nutr., 31:805-813 (1978). ARA представляет собой наиболее распространенную PUFA в грудном молоке. Среди матерей, особенно вегетарианок, которые кормят, своих детей грудью,многим необходимо дополнительно приниматьARA с пищей. Однако многие матери не кормят грудью своих детей, или не кормят грудью в период быстрого роста ребенка, предпочитая применять детское питание (детские смеси). Известно, что производимые ранее детские смеси не содержали ARA в триглицеридной форме. В патенте США 4670285 (Clandin etal.), введенном в список ссылок данного изобретения, впервые описывается потребность маленького ребенка в жирных кислотах, включаяARA. Для обеспечения этих жирных кислотClandinin с соавторами предлагает использовать смесь яичного желтка, рыбьего жира или фосфолипиды эритроцитов и растительные масла, в качестве жирового компонента предложенной детской смеси. Однако рыбий жир содержит высокие количества эйкозопентаеновой кислоты(ЕРА). Известно, что ЕРА подавляет синтезARA в организме детей. (Carlson et al., INFORM,1:306 (1990). Следовательно, существует потребность в обеспечении ARA без введения дополнительного количества ЕРА. Кроме того,яичные желтки содержат относительно низкую концентрацию ARA, таким образом смесь Clandin et al. является экономически нецелесообразной. Ввиду того, что ARA присутствует в животных жирах, а не в растительных маслах, получение ее в промышленных масштабах остается необходимым, но пока только желаемым процессом. Известен способ получения ARA,описанный Shinmen et al., Microbiol. Biotech.,31:11-16 (1989), из грибов Mortierella alpina с использованием общеизвестной емкостной ферментации с перемешиванием. (См. также патент Японии 1215245, Shuminmen et al.). После выращивания организмы собирают, сушат и их липиды экстрагируют из биомассы грибов органическим растворителем и химически (ковалентно) модифицируют. Например, липидную смесь гидролизуют или превращают в сложные этиловые эфиры и затем перед применением в качестве пищевой добавки соединяют с циклодекстрином. Shinmen et al. не описал и не предложил введение немодифицированных масел,выработанных микроорганизмами.Porhyridium cruentum, красные микроводоросли, могут выращиваться в бассейнах в больших количествах и содержат липиды, которые могут содержать до 40% ARA. Ahern, et al. Biotech. Bioeng. 25:1057-1070 (1983). ARA, к сожалению, является первично связанной с галактолипидами, сложным полярным липидом, не присутствующим в грудном молоке. Таким образом, в данном случае не только налицо то, что общее количество применимой ARA вырабатывается фракцией, составляющей лишь один процент биомассы, но и форма ARA не приемлема для применения в качестве добавки в детское питание без дальнейшей модификации. Известен способ получения липидов, таких как линолевая кислота из гриба рода Mortierella,описанный в патенте США 4870011 (Suzukiet al.). Линолевую кислоту очищают от смеси липидов, которые содержатся в грибе. В заявке Германии DE 3603000A1 (Milupa) впервые описывается смесь жиров высокополиненасыщенных кислот и ее применение в качестве жирового компонента в детском питании. 3 Смесь жиров имеет высокое содержание ARA и докозагексановых (DНА) кислот в соотношении 2,5 : 1, соответственно, а также высокое содержание холестерина. В качестве источников жирных кислот приведены определенные типы микроводорослей, рыбий жир, органические жиры из говядины и свинины или высоко рафинированное масло яичного желтка. Указывается на то, что источником DНА и ARA являются микроводоросли факофитного и родофитного типов. Здесь не предлагается использовать микробы в качестве источника масла. Масло, полученное из водорослей, а также рыбий жир обычно содержат ЕРА, которая подавляет синтез ARA in vivo. Помимо этого высокорафинированное масло яичного желтка представляет собой неэкономичный источник ARA. Кроме того, нет описания добавки с высоким содержанием ARA для уже существующей детской смеси. В WO 92/13086 описано получение и применение масел грибов в качестве добавок для детского питания и косметических композиций. Эти масла содержат 30-35% арахидоновой кислоты и не содержат регистрируемого количества эйкозапентаеновой кислоты. Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения ARA, предпочтительно без сопутствующего образования ЕРА. Еще одной задачей данного изобретения является разработка добавки и источника этой добавки для применения в детской смеси, такой,что содержание ARA в ней приближается к содержанию ARA в женском грудном молоке. Дополнительным предметом данного изобретения является получение масла грибов, содержащего ARA, для применения в препаратах,предназначенных для энтерального, парентерального или дермального применения. Данное изобретение относится к получению из грибов масла, содержащего арахидоновую кислоту (ARASCO), его применению и к композициям, содержащим такие масла. Это масло можно считать единственным в своем роде клеточным маслом. Грибы выращивают в условиях, при которых они вырабатывают масло, их собирают и масло экстрагируют и выделяют. Масло без дополнительной химической обработки может использоваться непосредственно для обеспечения дополнительной ARA тем, кому она необходима, включая новорожденных детей, беременных и кормящих женщин или людей с проявлением патологий, связанных с недостатком ARA в организме. Преимущества данного изобретения включают легкость получения масла, высокую его чистоту и отсутствие количеств ЕРА, которые могли бы быть обнаружены. 4 Термины "ARA" и "ЕРА" также используются в данном описании для обозначения остатков арахидоновой кислоты и эйкозапентаеновой кислоты, соответственно, в том случае, когда остатки этерифицированы глицерином и представляют собой часть жирного ацилтриглицерида или фосфолипида. В данном описании композицию считают "практически свободной от ЕРА", когда остаточное количество ЕРА в композиции меньше количества, которое подавляет синтез ARA при ее использовании в качестве пищевой добавки. Данное изобретение способствует обеспечению экономического источника арахидоновой кислоты (ARA). В одном воплощении данное изобретение относится к способу получения масла грибов,содержащего арахидоновую кислоту(ARASCO), которое является по существу свободным от эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА). В данном описании термин "практически свободно" означает, что ЕРА присутствует в количестве, составляющем приблизительно одну пятую часть от количества ARA в масле. Это масло единственное из вырабатываемых клеткой, которое может вводиться прямо в немодифицированном виде. В данном описании термин "немодифицированный" означает, что химические свойства жирных кислот или самого масла не подвергались ковалентному изменению. Таким образом, например, временное изменение вARASCO или ARA, которое могло быть обращено после выделения масла, не должно было бы принадлежать области данного изобретения. Немодифицированные масла из грибов в соответствии с данным изобретением обеспечивают триглицериды, в которых относительно высокую часть остатков жирных кислот составляет остатки ARA (предпочтительно по меньшей мере 40% остатков жирных кислот представляют собой остатки ARA, более предпочтительно по меньшей мере 50% остатков представляют собой ARA), и соотношение остатковARA к остаткам ЕРА является также высоким(по меньшей мере 5:1, предпочтительно по меньшей мере 20:1, мас./мас.). Такое масло, полученное из природных источников, не было описано ранее. Несмотря на то, что триглицериды с такой композицией могут быть химически синтезированы (например, этерификацией смесей свободных жирных кислот в ARA или трансэтерификацией с этиловыми эфирами такой смеси жирных кислот), работа со смесью жирных кислот (например, очистка, этерификация и т.д.) может приводить к получению нежелательных побочных продуктов. Способ данного изобретения, напротив, обеспечивает триглицериды, нужного состава посредством экстракции из натуральных источников. Таблица 1. Состав жирных кислот некоторых видов грибов Жирная кислота Виды Среди этих видов грибов, характеризованных выше их жирными кислотами, большинство, как было установлено, не производят ARA.Press, N.Y. (1974). Из тех видов, которые производят ARA, многие, включая все ранее характеризованные виды Pythium, вместе с ARA производят значительные количества эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА). В таблице 1 представлено содержание жирных кислот в грибах вида Р.insidiosum, a также содержание жирных кислот в грибах других видов. Неожиданно было установлено, что Р. insidiosum производит ARA без одновременной выработки ЕРА. Как и в случае с рыбьим жиром, высокие уровни ЕРА в пищевых добавках приводят к подавлению способности образовывать ARA из пищевой линолевой кислоты (LOA). Соответственно, несмотря на то, что в способе данного изобретения могут использоваться виды грибов, производящие какARA так и ЕРА, предпочтительно использовать виды, которые не продуцируют в значительных количествах ЕРА. Такими предпочтительными видами являются Pythium insidiosum и Mortierella alpina. Оба этих вида коммерчески доступны и хранятся в American Type Culture Collective in Rockille, Maryland под инвентарными номерами 28251 и 42430, соответственно. P.insidiosum и М. alpina в данном изобретении используются в качестве типичных видов грибов. Конечно, другие виды грибов, которые производят триглицерид, содержащий ARA и пониженное количество ЕРА, как описано здесь,также охватываются данным изобретением. Одной из основных проблем, которые решает данное изобретение, является подавление биосинтеза ARA у детей, которое вызывается присутствием повышенных количеств пищевой ЕРА. Эта проблема может быть решена обеспечением ARA для применения в детском питании(детских смесях) в количествах, по существу сходных с количествами, обнаруженными в женском грудном молоке. Обычно в женском грудном молоке соотношение ARA:EPA составляет соответственно приблизительно 20:1. Данное изобретение конкретно охватывает любое масло, вырабатываемое микроорганизмами, которое обеспечивает достаточное количествоARA для преодоления негативных влияний пищевой ЕРА. Предпочтительно применение масла, содержащего ARA, будет приводить к соотношению ARA:EPA, равному по меньшей мере приблизительно 5:1. Более предпочтительно,соотношение будет составлять по меньшей мере приблизительно 10:1, и наиболее предпочтительно оно будет равно по меньшей мере приблизительно 20:1. Как можно видеть, более высокое количество ARA относительно количества ЕРА более желаемо в результате. В способе данного изобретения грибы культивируют в условиях, подходящих для получения масла, содержащего ARA. Обычно методы культивирования грибов хорошо известны,и эти способы могут применяться в способе данного изобретения. Например, культивирование инокулирующего количества грибов может протекать в погруженной культуре в колбах со встряхиванием. В колбы помещают питательную среду, засевают мицелии грибов, и рост на вибрационном возвратно-поступательном шюттель-аппарате (вибраторе) протекает в течение приблизительно от трех до четырех дней. Состав питательной среды может изменяться, но всегда содержит источники углерода и азота. Предпочтительным источником углерода является глюкоза, количества которой могут находиться в интервале от приблизительно 10100 г глюкозы на литр питательной среды. Обычно используется приблизительно 15 г/л для культуры во встряхиваемых колбах. Количество может изменяться в зависимости от нужной плотности конечной культуры. Могут использоваться и другие источники углерода, которые включают мелассу, концентрированную фруктозную кукурузную патоку, гидролизированный крахмал или любой другой недорогой общеизвестный источник углерода, используемый в процессах ферментации. Кроме того, в качестве источника углерода для Р. insidiosum может использоваться лактоза. Следовательно,пермеат сыворотки, который богат лактозой и является очень недорогим источником углерода, 7 может использоваться в качестве субстрата. Подходящие количества этих источников углерода могут быть без труда определены квалифицированным специалистом. Обычно в процессе культивирования требуется добавление дополнительных количеств углерода. Это обуславливается тем, что микроорганизмы потребляют большое количество углерода, но добавление всего его количества сразу оказывает отрицательное действие на их рост. Источником азота обычно является дрожжевой экстракт в концентрации от приблизительно 2 до приблизительно 15 г на литр питательной среды. Предпочтительно добавляют приблизительно четыре грамма на литр. Могут использоваться и другие источники азота, которые включают пептон,триптон, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизованный растительный белок и т.д. Количество этих источников, которое следует добавлять, может легко определяться квалифицированным специалистом. Азот может добавляться весь сразу, т.е. весь в одно время перед культивированием. После выращивания в течение 3-4 дней при подходящей температуре, обычно 25 - 30 С,получают количество грибов, которое достаточно для применения в качестве инокулята в общеизвестном бродильном аппарате с мешалкой(STF). Такие ферментеры хорошо известны квалифицированным специалистам и коммерчески доступны. Ферментация может протекать периодическим, полупериодическим или непрерывным способом. Предпочтительно STF оснащают морским гонком (мешалкой), хотя может использоваться также турбинная мешалка раштонова типа (Rushton-type turbine impeller). Сначала в ферментер добавляют нужные источники углерода и азота. Например, бродильный аппарат объемом 1,5 л можно подготовить к ферментации смешением приблизительно 50 г глюкозы и приблизительно 15 г экстрата на литр воды. Как обсуждено выше, могут использо -ваться и другие источники углерода и азота или их смеси. Реактор, содержащий питательный раствор, необходимо простериллизовать, например выдерживанием при высокой температуре перед инокулированием. После охлаждения до приблизительно 30 С можно добавлять инокулят и начинать культивирование. Газовый обмен обеспечивается барботированием воздуха. Скорость барботирования воздуха можно изменять,но предпочтительно ее устанавливают в интервале от приблизительно 0,5 до приблизительно 4,0 VVM (объем воздуха на объем бродильного аппарата в минуту). Предпочтительно содержание растворенного кислорода поддерживают в интервале от приблизительно 10% до приблизительно 50% относительно величины насыщения раствора воздухом. Соответственно в процессе культивирования может потребоваться регулировка скорости барботажа воздуха. Необходи 001036 8 мым является перемешивание. Перемешивание обеспечивается при помощи гонка (мешалки). Скорость перемешивания - скорость движения кончика мешалки - предпочтительно заключается в интервале от приблизительно 50 см/с до приблизительно 500 см/с, предпочтительно от приблизительно 100 до 200 см/с. В общем случае количество инокулята может изменяться. Обычно может использоваться от приблизительно 2% до приблизительно 10% (объемн.) инокулята, предпочтительно приблизительно 5% (объем.). Содержание питательных веществ должно контролироваться. В том случае, когда содержание глюкозы падает ниже 5 г/л, необходимо добавлять дополнительное количество глюкозы. Обычно в цикле культивирования используется приблизительно 100 г глюкозы и приблизительно 15 г дрожжевого экстракта на литр. Желательно полное потребление азота в процессе брожения, так как это повышает выработку масла грибами. Это особенно важно, когда в качестве продуцирующего организма используется М. alpina. В наиболее предпочтительном вариантеMortierella alpina с высоким содержанием масла,включающим высокие уровни содержания ARA,может выращиваться в ферментере с использованием высоких уровней содержания питательных веществ. Было неожиданно установлено,что азотосодержащие питательные вещества в количестве сверх того, что обеспечивается дрожжевым экстрактом при содержании его 15 г/л, могут добавляться в начале ферментации до тех пор, пока общее количество углеродсодержащего питательного вещества, добавленного в процессе ферментации, является сравнительно высоким. Общее количество углеродсодержащего питательного вещества, предпочтительно подаваемого непрерывно или периодически на начальной стадии ферментации, составляющей первые 25-30% от общей продолжительности процесса, или в аликвотах, многократно добавляемых через равные промежутки времени, будет предпочтительно эквивалентно 75-300 граммам глюкозы на литр культуральной среды (соотношение C:N, выраженное в виде мас./мас. глюкозы: дрожжевой экстракт, 5:1). В особенно предпочтительном воплощении, азотсодержащее питательное вещество представляет собой соевую муку, добавленную в количестве приблизительно 16 г на литр среды, и углеродсодержащее питательное вещество присутствует первоначально в количестве, эквивалентном приблизительно 80 г глюкозы или более. При использовании более высокого содержания углерод- и азотсодержащих питательных веществ,предпочтительно стериллизовать растворы, содержащие два питательных вещества, отдельно. Было также установлено, что выход биомассы может повышаться для процессов брожения с высоким содержанием углеродсодержащих пи 9 тательных веществ приостановкой подачи части азотсодержащего питательного вещества и подачей этой оставшейся части азотсодержащего итательного вещества непрерывно и в одной или больше аликвот в процессе брожения. Время от времени культура будет производить избыточное количество пены. Для предотвращения пенообразования необязательно может добавляться антипенная добавка, из числа хорошо известных квалифицированным специалистам, например Маzu 310 или растительное масло. Температура культивирования может меняться. Однако для грибов, которые продуцируют как ARA, так и ЕРА, создают условия, при которых они производят меньшее количество ЕРА и большее количество ARA, при этом культивирование ведут при более высоких температурах. Например, когда Моrtierella alpina выращивают при температуре ниже 18 С, он начинает продуцировать ЕРА. Таким образом,предпочтительно поддерживать температуру на уровне, который обуславливает предпочтительное получение ARA. Подходящие температуры обычно заключаются в интервале от приблизительно 25 С до приблизительно 30 С. Предпочтительно культивирование продолжают до тех пор, пока не будет достигнута нужная плотность биомассы. Необходимая плотность биомассы составляет приблизительно 25 г организмов на литр. Такую биомассу обычно получают через 48-72 ч после инокуляции. В это время организмы обычно содержат приблизительно 5-40% сложных липидов, т.е. масел, из которых приблизительно 10-40% составляетARA или предпочтительно, по меньшей мере,40% остатков ARA в триглицеридной фракции,более предпочтительно, по меньшей мере, 50% остатков ARA в триглицеридной фракции, и они могут быть собраны. Ферментацию с использованием культуры грибов для получения ARA в соответствии с данным изобретением можно проводить в среде с рН в интервале приблизительно от 5 до 8. Однако выходы биомассы, масла и ARA из культур М. alpina могут повышаться регулированием рН среды, предупреждая неконтролированное повышение рН. Выходы можно повышать при помощи поддерживания высоких уровней содержания кислорода во время ферментации. Эти изменения в методике ферментации особенно эффективны при использовании высоких уровней содержания питательных веществ в бродильном аппарате. В том случае, когда начальное содержание азотсодержащего питательного вещества превышает количество, эквивалентное приблизительно 15 г дрожжевого экстракта на литр,и/или уровень содержания углеродсодержащего питательного вещества превышает количество, эквивалентное приблизительно 150 г глюкозы на литр, рост грибов может быть ин 001036 10 гибирован. Ингибирование роста можно избежать, проводя ферментацию с периодической подпиткой, например, делением питательных веществ для ферментации на аликвоты, которые последовательно подают в ферментер, эта часть или все питательное вещество, доставленное предыдущей аликвотой, метаболизируется. Ингибирование роста можно также предотвратить посредством подачи только углеродсодержащего питательного вещества (см. Shinmen et al.), а также путем разделения всего количества питательных веществ на аликвоты и подачей аликвот в процессе ферментации или подачей питательного раствора непрерывно. Было обнаружено, что результат возможен при подаче только азотсодержащего питательного вещества в ферментационную среду, в которой содержание углеродсодержащего питательного вещества является высоким. Было неожиданно обнаружено, что ингибирование роста может смягчаться регулированием рН среды ферментации, поддерживанием высокого давления кислорода в ферментационном аппарате или обоими этими способами. Было установлено, что ферментация М. alpina в среде с высоким содержанием питательного вещества при низкой рН (рН = 5-6) приводит к повышению роста биомассы (а также к повышению выхода масла). Однако масло, полученное в таких условиях, имеет более низкие уровни содержания ARA-остатков в масле. Ферментация при высоких рН (рН = 7-7,5), напротив,приводит к повышенным уровням содержанияARA в масле, но к замедленному росту биомассы. В предпочтительном варианте ферментацию данного изобретения осуществляют при регулированном рН, при этом рН является низкой на начальных стадиях ферментации и высокой на поздних стадиях. Начальные стадии включают периоды быстрого (экспоненциального) роста, в процессе которого происходит активное потребление питательных веществ, поздние стадии включают стационарную фазу, когда деление клеток приостанавливается, обычно вследствие недостатка одного или более питательных веществ, при этом наблюдается максимальный выход продукта, т.е. масла, обогащенного ARA. Анализ может осуществляться контролированием рН ферментационной среды на уровнях, которые достигаются в двух или более стадиях,охватывающих весь период ферментации. Аналогично было установлено, что сохранение высоких уровней содержания в среде растворенного кислорода (D.O.) (например, более 40% относительно насыщения раствора воздухом) будет приводить к снижению ингибирования роста благодаря высоким уровням содержания азотсодержащего питательного вещества и/или вследствие повышения относительного уровня содержания остатков ARA в масле. Можно поддерживать высокий уровень содержания D.O. повышением давления в емкости(нагнетанием большего количества воздуха в пространстве под верхней крышкой бродильного аппарата), повышением скорости перемешивания (например, повышением скорости вращения гонка), увеличением аэрации (т.е. повышением количества воздуха, проходящего через объем бродильного аппарата в определенное время, обычно выражаемую в виде повышенияVVM, объемов воздуха на объем бродильного аппарата в минуту) и/или повышением содержания О 2 в барботируемом газе. Установлено,что ферментация в этих условиях проходит с повышенным использованием углерода, приводя к большей конечной концентрации биомассы и большей выработки в среде масла, обогащенного ARA. В частности, ферментации, в которых используются одна или большее количество указанных выше модификаций, приводят к выработке экстрагируемого триглицеридного масла, содержащего, по меньшей мере, 40% остатков ARA, и предпочтительно, по меньшей мере,50% остатков ARA. В особенно предпочтительном воплощении среда ферментации включает углеродсодержащее питательное вещество в количестве, не менее 80 г/л глюкозы, и азотсодержащее питательное вещество в количестве не менее 16 г/л дрожжевого экстракта, и после стериллизации рН среды доводится до значения от 5 до 6. После инокуляции рН среды контролируется и поддерживается на первоначальном уровне или немного выше. Когда уровень содержания углеродсодержащего питательного вещества падает до уровня менее или равного 60 г глюкозного эквивалента/литр (обычно приблизительно через 48 ч), выбранную точку для контроля рН меняют до ее значения более или равного 6. В это время или приблизительно в то время, когда скорость поглощения кислорода (и/или скорость выделения диоксида углерода, CER) достигает максимума (обычно спустя приблизительно 72 ч), выбранную точку для контроля рН повышают до значения 6,5-7 (обычно, постепенно, например, со скоростью приблизительно 0,1 единиц значения рН в час). Затем на конечных стадиях процесса ферментации рН контролируют для поддержания ее на уровне ниже приблизительно рН = 7-7,5. Для этого воплощения уровень содержания растворенного кислорода в среде (D.O.) сохраняется около или выше 40% от уровня насыщения раствора воздухом, предпочтительно посредством последовательного повышения емкостного давления до 75,8 кПа, повышением скорости перемешивания до эквивалентного приблизительно движению кончика мешалки со скоростью 300 см/с, повышением аэрации до приблизительно 0,5 объемов воздуха на объем ферментера в минуту. После периода экспоненциального роста и высокой скорости потребления О 2 рост (и поглощение О 2) будет снижаться. Перемешивание/аэрацию можно снизить в этой 12 точке, в то время как D.O. сохраняют на высоком уровне, обычно выше приблизительно 40% от насыщения воздухом. Оптимизацией условий ферментации М.alpina, как описано выше, можно получить очень высокие выходы биомассы, содержащей,20-60% масла в биомассе, где 25-70% (мас.) составляют остатки ARA в триглицеридной форме. Биомасса (и масло) могут собираться как описано. Предпочтительно биомасса будет собираться из среды ферментации в пределах 48 ч после достижения максимальной продуктивности, измеренной в виде ARA/д/день. Сбор может выполняться любым подходящим способом, таким как, например, фильтрование, центрифугирование или распылительной сушкой. Ввиду низкой стоимости фильтрование может быть предпочтительным. После сбора мицельный корж можно подвергать экстрагированию. Мицельный корж представляет собой биомассу, полученную в результате сбора клеток, выросших в культуре,он может быть рыхлым или спрессованным, в виде порошка или в виде сгустка. Необязательно корж может содержать некоторое количество остаточной воды, удаляемой перед экстракцией вакуумной сушкой, сушкой в псевдоожиженном слое, распылительной сушкой или лиофилизацией. В этом случае для экстракции масла, содержащего ARA, предпочтительно применять неполярные растворители. Хотя подходящим является любой неполярный растворитель,предпочтительным является гексан. В предпочтительном варианте осуществления изобретения масло экстрагируют из высушенной биомассы мокрым дроблением или перколяцией свежеперегнанным гексаном. Растворитель обычно добавляют при соотношении растворитель:биомасса, равном приблизительно 5:1 (мас./мас.). После мокрого дробления частицы твердого вещества отделяют от растворителя декантированием или центрифугированием. Преимущественно сохранять экстракт, содержащий растворитель (мисцеллу), анаэробно во избежании окисления остатков ненасыщенных жирных кислот в масле. Для получения технического (сырца) масла грибов из мисцеллы удаляют растворитель. Техническое масло грибов, экстрагированное из биомассы грибов неполярными растворителями, может быть мутным, особенно в том случае, когда биомассу измельчают. Это объясняется образованием микрочастиц в ходе измельчения, таких как фрагменты клеточной стенки и растворимые полисахариды. Осветление такого мутного масла может выполняться растворением технического масла в более полярных растворителях, таких как ацетон или спирт. В предпочтительном воплощении технический масляный экстракт грибных мицелий дополнительно осветляют экстракцией/осаждением в ацетоне. Ацетоновую мисцеллу получа 13 ют добавлением ацетона к мутному экстракту технического масла (предпочтительно до получения содержания приблизительно 20% масла; т.е. приблизительно 4 объема ацетона на объем технического масла), тщательным перемешиванием и оставляя смесь стоять в течение периода времени, достаточного для осаждения тонкоизмельченных частиц (обычно приблизительно в течение одного часа при комнатной температуре). Ацетоновую мисцеллу, содержащую масло,осветляют центрифугированием и/или фильтрованием, и затем удалением растворителя для получения масла грибов, осветленного ацетоном. Масло грибов, осветленное ацетоном, является предпочтительным для дальнейшей технологической переработки (например, рафинирования, отбеливания и устранения запаха общеизвестными способами), ввиду того, что мелкие частицы, полученные в процессе экстракции грибной биомассы, будут препятствовать процессам очистки, если они не удалены на стадии применения ацетона. Другое предпочтительное воплощение включает экстракцию сухой биомассы противотоком, которую можно проводить например, в аппарате для экстракции, выпускаемом CrownIronwork (Crown Mark IY) или French, Inc., который обычно не применяется для экстракции растительных масел, но разработан для экстракции грязи и почвы. Хотя эффективность экстракции не является столь высокой без повторного размола биомассы, методика противоточной экстракции имеет преимущество, которое заключается в получении менее "мелких частиц", посредством чего снижается техническая трудность выделения чистого рафинированного масла. В соответствии с другим способом, влажный корж, который обычно содержит приблизительно 30-50% твердых веществ, можно измельчать и экстрагировать непосредственно с использованием полярных растворителей, таких как этанол или изопропиловый спирт, или с помощью жидкостной экстракции в сверхкритических условиях такими растворителями, как СО 2 или NO. Предпочтительно коржи перед экстракцией дробят. Преимущественно данное изобретение дает возможность экономически использовать методы суперкритической экстракции. McHugh, et al., Supercritical Fluid Extraction,Bitterworth (1986). Такие способы известны квалифицированным специалистам и применяются в настоящее время, например, для декофеинирования зерен кофе. Предпочтительный способ водной экстракции включает смешение мицельной биомассы с полярным растворителем изопропиловым спиртом в подходящем реакторе. Такие реакторы известны. Необходимо примене 001036 14 ние от трех до шести частей растворителя на часть биомассы. Более предпочтительно смешение проводят в атмосфере азота или в присутствии антиоксидантов для предупреждения окисления ARA в липидном экстракте. В данном описании термины "липидный экстракт", "масло", "липидный комплекс" и "грибное масло" используются взаимозаменяемо. После экстракции смесь может быть отфильтрована для удаления биомассы из растворителя, содержащего липидный экстракт. На этой стадии биомассу можно выделять и использовать в качестве пищевой добавки. В данном описании термин "пищевая добавка" относится к пище или добавке, предназначенной для смешения с обычной пищей, такой как злаки и т.д., и которая может предназначаться для животных. Растворитель отделяют от липидного экстракта, и он также может быть извлечен методом испарения в подходящий коллектор для повторного применения, оставляя экстракт, который в данном описании называется "техническим маслом". Применение изопропилового спирта в качестве растворителя приводит к удалению любой остаточной воды из технического масла, так как при испарении удаляется аэротропная вода/изопропиловый спирт, которая образуется самопроизвольно. Несмотря на то, что техническое масло может использоваться без дальнейшей обработки, оно также может подвергаться дополнительной очистке. На этой стадии дополнительной очистки могут использоваться процессы, которые используются для приготовления лицитина из растительных продуктов и которые хорошо известны квалифицированным специалистам. Такие процессы не изменяют химически или ковалентно липиды, содержащие ARA, или самуARA. Выходы изменяются, но обычно составляют приблизительно 5 г фосфолипида, содержащего ARA, на 100 г высушенных мицелий. В случае применения М. alpina дополнительно можно получать 10-50 г триглицерида на 100 г сухих мицелий. Для введения людям может использоваться либо техническое масло, либо очищенный продукт. Оба эти продукта включаются в определенное ARASCO, используемое в данном описании. Наиболее предпочтительным предметом данного изобретения является обеспечение таких добавок для применения в детских смесях,что концентрация ARA в такой смеси близко приближается к концентрации ARA в женском грудном молоке. В таблице 2 представлено сравнение состава жирных кислот в ARASCO, в женском грудном молоке и в детской смеси, не содержащей и содержащей ARASCO. Таблица 2. Состав жирных кислот полученного масла грибов и женского грудного молока. Рецептура детского Детское питание + Женское грудное Жирная кислотаARASCO питания Масло молоко 8:0 24,1 23,6 0,35 10:0 17,7 17,3 1,39 12:0 14,9 14,6 6,99 14:0 4,6 5,8 5,8 7,96 16:0 16,0 6,8 7,0 19,80 16:1 3,2 0,2 0,3 3,20 18:0 2,3 2,3 5,91 18:1 26,4 10,0 10,3 34,82 18:2n6 9,9 17,4 17,3 16,00 18:3n3 4,1 0,9 1,0 0,62 20:1 2,2 0,1 0,14 1,10 20:2n6 0,61 20:3n6 1,4 0,03 0,42 20:4n6 32,0 0,64 0,59 20:5n3 0,03 22:1 0,10 22:4n6 0,21 22:5n6 0,22 22:6n3 0,19 Из таблицы видно, что количество ARA,присутствующей в детской смеси с добавлениемARA в женском грудном молоке. Кроме того,общий состав жирных кислот в детской смеси не значительно изменяется при добавленииARASCO. Обычно можно применять от приблизительно 50 до приблизительно 1000 мгARASCO на литр детской смеси. Конкретное нужное количество ARASCO будет зависеть от содержания ARA. Оно может изменяться от приблизительно 10 до приблизительно 70% жирных кислот в масле. Однако обычно содержание ARA составляет приблизительно 30-50%. Предпочтительно масло, используемое для добавления в детскую смесь, содержит по меньшей мере 40% остатков жирных кислот в виде остатков ARA, более предпочтительно по меньшей мере 50% в виде остатков ARA. В том случае, когда содержание ARA составляет приблизительно 30%, особенно предпочтительная доза для добавления составляет приблизительно от 600 до 700 мг ARASCO на литр детского питания. При такой дозе добавления предварительно приготовленные жировые компоненты детской смеси, такой как Similac (Ross Laboratories, Columbus, Ohio), разбавляются только одной частью ARASCO на пять частей жировых компонентов смеси. Аналогично дозы разбавления можно вычислить для масел с более высоким содержанием ARA. Предпочтительно,ARASCO практически не содержит ЕРА. Когда в описанном процессе используетсяPythium insidiosum, экстрагированное масло,содержащее ARA, преимущественно представляет собой фосфолипид. Однако было установлено, что значительное количество триглицерида с высоким содержанием остатков ARA может также выделяться из выращенного Р. insidiosum,как описано выше. Когда в данном процессе используется Mortierella alpina, масло, содержащее ARA, преимущественно представляет собой триглицерид. Обе формы ARASCO полезны в качестве добавок в детскую смесь. Первый обеспечивает в смеси наличие не толькоARA, но и эмульгатора, например, фосфатидилхолина, который обычно добавляют в коммерческие смеси. Масло из М. alpina, вероятно, является более экономичным для получения. Масло, полученное в соответствии с данным изобретением, содержащее ARA, имеет разнообразное применение в дополнение к его применению в качестве добавки для детской смеси. Специалистам хорошо известно множество разных патологий, связанных с недостатком ARA, таких как маразм (Vajreswari, et alMetabolism 39:779-782 (1990), аллергические расстройства (Melnik, В., Manatsschr. Kinderheilta, 138: 162-166 (1990), заболевание печени,фенильная кетонурия (phenyl ketonuria), шизофрения, поздняя дискинезия или различные перокисомальные заболевания. В одном воплощении данного изобретения эти патологии лечат введением фармацевтически эффективного количества масла данного изобретения. Обычно фармацевтически эффективное количество представляет собой количество, которое необходимо для нормализации содержания ARA в сыворотке крови. Особенно предпочтительным для дополнения к лечению таких патологий является описанное выше масло с высоким содержаниемARA, в частности, масла, содержащие, по меньшей мере, 40% остатков ARA, или, более предпочтительно 50% остатков ARA. Масло можно применять энтерально, локально или 17 парентерально, в зависимости от выбора лечащего врача. Инкапсулирование, как известно, представляет собой эффективный способ энтерального введения. Капсулы, содержащие масло грибов, могут вводиться тем пациентам, которым требуется или необходимо добавлениеARA в пищу. Такой способ особенно эффективен для введения ARA беременным или кормящим женщинам. В тех случаях, когда ARASCO вводится для борьбы с патологиями, вызванными недостатком ARA, должно вводиться фармацевтически эффективное количество. Это количество может определяться без проведения эксперимента. Обычно количество, которое будет нормализовать содержание ARA в сыворотке крови,составляет 0,5 - 2,0 г/день. В другом воплощении данного изобретения предлагаются косметические композиции,содержащие ARASCO, такие как описанные выше масла с высоким содержанием ARA. Косметические композиции относятся к продуктам,применяемым в качестве косметических средств. Предпочтительный пример такой композиции представляет собой крем от морщин. Такие косметические композиции обеспечивают эффективные средства местного примененияARA на коже для сохранения цвета кожи. Изобретение, описанное в общих чертах,иллюстрируется далее при помощи конкретных примеров, не ограничивающих его область. Пример 1. Получение липида Р. insidiosum и добавление его в детское питание (детскую смесь) В бродильный аппарат объемом 80 л (аппарат большого объема) помещают 51 л водопроводной воды, 1,2 кг глюкозы, 240 г дрожжевого экстракта и 15 мл антипенной добавкиMAZU 210S. Аппарат стериллизуют при температуре 121 С в течение 45 мин. В процессе стериллизации добавляют дополнительные 5 л конденсата. рН смеси доводят до 6,2 и затем добавляют приблизительно 1 л инокулята ( с плотностью клеток 5-10 г/л) Pythium insidiosum(ATCC28251). Скорость перемешивания доводят до 125 об/мин (линейная скорость кончика мешалки - 250 см/с) и устанавливают скорость аэрации на уровне 1 SCFM (стандартный кубический фут в минуту - 0,471947 дм 3/с = 471,947 10-6 м 3/с). Спустя 24 ч скорость аэрации повышают до 3 SCFM (3 стандартных кубических фута в минуту = 1,415841 дм 3/с = 1,415841 10-3 м 3/с). На 28 часу добавляют дополнительные 2 л 50%-ного сиропа глюкозы (1 кг глюкозы). На 50 часу собирают полученный продукт, выход составляет приблизительно 2,2 кг влажного продукта (приблизительно 15 г сухого веса) на литр. Перед сушкой вымораживанием собранную биомассу отжимают на вакуумном фильтре для получения брикета с высоким содержанием твердого вещества (50% твердого вещества). 18 Высушенную биомассу измельчают с помощью ступки и пестика и экстрагируют гексаном из расчета 1 л гексана на 200 г сухой биомассы при комнатной температуре и при непрерывном перемешивании в течение 2 ч. Затем смесь фильтруют и фильтрат упаривают с получением приблизительно 5-6 г технического масла на 100 г сухой биомассы. После этого биомассу повторно экстрагируют этанолом из расчета 1 л этанола на 20 г сухой биомассы в течение 1 ч при комнатной температуре, фильтруют и растворитель упаривают с получением дополнительных 22 г технического масла из расчета на 100 г сухой биомассы. Вторая фракция представляет собой главным образом фосфолипиды, в то время как первая фракция содержит смесь фосфолипидов и триглицеридов. Соединенные фракции полученного масла содержат приблизительно 30-35% арахидоновой кислоты, и ЕРА не обнаруживается. Это масло по каплям добавляют в коммерческое детское питание Similac(Ross Laboratories, Columbus, Ohio) в дозе 60 мг на литр приготовленной среды. Пример 2. Получение липида М. alpina и добавление его в детское питание.Mortierella alpina (ATCC 42430) выращивают в качалочной колбе объемом 2 л, содержащей 1 л водопроводной воды и 20 г среды картофельной декстрозы. Культивирование проводят в течение 7 дней в колбе при постоянном перемешивании на качалке при температуре 25 С. После сбора культуры центрифугированием биомассу сушат вымораживанием, в результате получают приблизительно 8 г липидосодержащих мицелий. Мицелии экстрагируют, используя гексан, как в примере 1, в результате получают 2,4 г технического масла. Это масло содержит приблизительно 23% арахидоновой кислоты, и его по каплям добавляют в коммерческое детское питание Similac в концентрации 1000 мг/л. Пример 3. Получение большого количества арахидоновой кислоты с использованием М. аlpina. В ферментер для инокулирования, содержащий среду GYE (50 г/л декстрозы и 6 г/лTastone 154), вносят инокулят М. alpina. Температуру ферментации поддерживают на уровне 28 С, начальная скорость перемешивания 130160 см/с, начальное давление в аппарате 41,4 кПа и начальная скорость аэрации 0,25 VVM(объем воздуха на объем ферментера в минуту). Перед стериллизацией рН среды доводят до 5,0,а после стериллизации на начальной стадии ферментации рН доводят до 5,5. Кислотность среды поддерживают на уровне рН не менее 5,5 с помощью 8 Н NaOH. Cодержание кислорода поддерживают на уровне D.O. не менее 40% регулировкой перемешивание/аэрация в следующей последовательности: повышают емкостное давление до 75,8 кПа, повышают скорость перемешивания до скорости движения кончика 19 мешалки до 175 см/с, и повышают аэрацию до 0,5 VVM. Пенообразование контролируют добавлением при необходимости антипенной добавки Dow 1520-US (приблизительно 0,1 мл/л антипенной добавки следует вводить в среду перед стериллизацией для предотвращения ценообразования). Перенос инокулята из бродильного аппарата для получения посевного инокулята в основной бродильный аппарат осуществляют в пределах 12 ч после возрастания рН до значения более 6,0. Основной бродильный аппарат содержитGYE среду ( 50 г/л декстрозы и 6 г/л Tastone 154), глюкозу стериллизуют отдельно и добавляют в главный бродильный аппарат после стериллизации. Температуру ферментации поддерживают на уровне 28 С, начальная скорость перемешивания равна 160 см/с, начальное емкостное давление - 41,4 кПа и начальная скорость аэрации - 0,5 VVM. После стериллизации на начальной стадии ферментации рН устанавливают на уровне 5,5 и поддерживают рН на уровне 5,5 при помощи 8 Н NaOH. рН дают возможность возрасти в процессе стационарной фазы (начиная приблизительно с 24 ч после инокуляции), но поддерживают рН ниже 6,8 при помощи добавления Н 2SО 4. Содержание кислорода сохраняют на уровне D.O. не менее 40% последовательно повышая емкостное давление до 75,8 кПа, повышая скорость перемешивания до получения скорости движения конца гонка,равной 175 см/с, и повышая скорость аэрации до 0,5 VVM. Пенообразование контролируют добавлением при необходимости антипенной добавки Dow 1520-US. (Приблизительно 0,1 мл/л антипенной добавки следует вводить в среду перед стериллизацией для предотвращения ценообразования). Каждые 12 ч отбирают образцы культуры для анализа биомассы и жирных кислот, и сбор начинают через 3-4 дня после возрастания рН до 6,5. Плотность сухой биомассы должна составлять не менее 8,5 г/л. Концентрация глюкозы в бульоне должна снижаться с 50 г/л до не более 25 г/л. При сборе весь бульон с культурой центрифугируют на роторной центрифуге для отделения мицелий от маточной среды, и биомассу сушат. Пример 4. Повышение выхода биомассы из М. alpina - первая серия опытов. М. alpina выращивают в бродильном чане с перемешиванием объемом 20 л, инокулируя культурой, выращенной в качалочной колбе в соответствии с методикой примера 3. Культура М. alpina в 65 г/л глюкозы (Staleydex) и 6 г/л дрожжевого экстракта (Tastone 154) приводит к получению биомассы с плотностью 12 г/л. Добавление дополнительно 6 г/л Tastone 154 через 16 ч приводит к получению биомассы с плотностью 18 г/л биомассы. 20 Пример 5. Повышение выхода биомассы из М. alpina - вторая серия опытов. Эксперименты проводят с целью дальнейшего увеличения количества биомассы дополнительным добавлением Tastone 154. Эти эксперименты проводят в аппаратах для ферментации 2 х 20 л в течение 168 ч. В обоих аппаратах начальная концентрация глюкозы составляет 100 г/л (а не 65 г/л как в примере 4). В один ферментер добавляют 3 х 6 г/л Tastone 154, а в другой добавляют 4 х 6 г/л. Дрожжевой экстракт приготавливают в виде концентрированного раствора, выдерживают в автоклаве и добавляют в ферментер в разное время после стериллизации. Для приготовления инокулята рабочие семена (1 мл мацерированных мицелий) инокулируют в 2 колбы, каждая из которых содержит 50 мл среды GYE (100 г/л Staleydex, 6 г/л Tastone 154) и выращивают в течение 4 дней при температуре 28 С при перемешивании со скоростью 150 оборотов в минуту. Спустя 4 дня бульон содержит биомассу в виде пеллет (гранулированные частицы), с диаметром 2-5 мм. Рост в этих колбах происходит медленнее, чем ожидалось, возможно вследствие более высокой концентрации глюкозы. Биомассу мацерируют в течение 2 х 3 с в смесителе Варинга и 25 мл мацерированной культуры используют для инокуляции каждой из 2 х 2,8 л колб Варинга, чистый объем которых составляет 800 мл (в более ранних экспериментах использовали 10 мл мацерата). Количество инокулята повышают, ввиду меньшей плотности биомассы в колбе с посевным материалом, поэтому ожидается, что рост в колбах Фернбаха может протекать медленнее,вследствие более высокой концентрации глюкозы. Среда в колбах Фернбаха представляет собой декстрозу (Staleydex) 100 г/л и дрожжевой экстракт (Tastone 154) - 8 г/л. Декстрозу и дрожжевой экстракт отдельно автоклавируют в течение 40 мин. Температуру ферментации посевного материала поддерживают на уровне 28 С, скорость перемешивания - на уровне 100150 об/мин. Спустя 44 ч культуру в колбах Фернбаха инокулят - переносят в бродильные аппараты(2 х 20 л). Инокулят находится в форме очень рыхлых гифальных агрегатов, и плотность биомассы составляет приблизительно 5,2 г/л. Бродильные аппараты на станциях 14 и 15,содержащие 1,6 кг (10%) декстрозы (Staleydex) и антипенную добавку Mazu 204 (1,6 г растворяют в 12,5 л R.O. Н 2 О) стериллизуют в течение 45 мин при 122 С. 800 мл инокулята (5%) затем добавляют в каждый аппарат (0 ч). Параметры работы аппаратов: температура: 28 С; рН контролируется на уровне 5,5 с помощью 2 Н NaOH и 2 Н H2SO4; аэрация: 0,5 VVM; противодавление: 0,2 бар;D.O. : контролируется выше 40%. становятся более узкими, и присутствие больСтанция 14 : 3 х 6 г/л Tastone 154. шого количества рыхлых гифальных фрагменДрожжевой экстракт (Tastone 154) раствотов указывает на то, что гранулы фрагментируряют до получения концентрации 96 г/л и выются. К 168 часу ядра гранул достигают от 0,5 держивают в автоклаве в течение 1 ч. Дрожжедо 2 мм в диаметре, периферии уменьшаются с вой экстракт подают в количествах 3 х 1 л (1,8%) объединением гиф в толстые цепи, и присутстна 0, 20 и 26 ч. Через 15 ч после добавления вует большое количество концентрированных первой порции дрожжевого экстракта DO снигифальных агрегатов. жают до значения ниже 40%, а скорость переВ течение первых 24 ч в аппаратах происмешивания увеличивают до 175 см/с постепенно ходит очень слабое пенообразование. Количестс 15 до 22 ч. DO затем контролируют, обогащая во пены затем возрастает и контролируется допоток воздуха кислородом: кислород добавляют бавлением антипенной добавки, когда величина в поток воздуха с 23 до 72 ч. Начиная с 36 ч пены становится более чем 2-4 см. Пенообразоскорость перемешивания дополнительно повывание несколько спадает к 48 ч, хотя спорадичешают для обеспечения надлежащего смешения. ски вспыхивает. Оба аппарата пенообразуют в К 48 ч перемешивание повышают до 200 см/сек,выходящие фильтры один раз во время процесса на 72 часу - до 250 см/с, и на 80 часу - до 280 ферментации. Необходимо добавление в аппасм/с. К 120 часу перемешивание повышают до раты приблизительно 150 мл антипенной добав 290 см/с для ускорения адекватного темпераки. турного контроля. На 144 часу перемешивание В обоих аппаратах накапливается значиснижают до 280 см/с. тельное количество биомассы в головном проСтанция 15: 4 х 6 г/л Tastone 154. странстве. Это явление является обычным для Дрожжевой экстракт (Tastone 154) 384 г мицельной ферментации в небольших аппаратах растворяют до получения концентрации 96 г/л,с большим соотношением площадь поверхновыдерживают в автоклаве в течение 1 ч. Дополсти/объем. Оказалось, что количество полученнительное добавление дрожжевого экстракта ной биомассы на cтанции 15 возрастает в течепроизводят в количестве 4 х 1 л (2,4%) на 0, 20,ние последних 24 ч, когда понижение объема и 26 и 32 ч. уровня жидкости в аппарате приводит к значиЧерез 16 ч DO снижают до значения ниже тельному разбрызгиванию (уровень жидкости 40%, а скорость перемешивания повышают до достигает верха гонка). Конечный объем в аппа 175 см/с к 23 ч. Затем контролируют DO до боратах после 168 ч составляет приблизительно 13 лее 40%, обогащая поток воздуха кислородом,л. кислород добавляют в поток воздуха в течение Исследования под микроскопом показыпериода с 23 до 72 ч. Начиная с 36 ч скорость вают, что к 72 ч большое количество остатков перемешивания дополнительно повышают для присутствует в культуральном бульоне, и в необеспечения надлежащего смешения. К 48 чакоторых случаях просматриваются поврежденсам скорость перемешивания увеличивают до ные и атрофированные верхушки грибов. При 210 см/с, к 72 часам - до 260 см/с, к 80 часам сутствие маслянистых капель в ципоплазме дедо 290 см/с. С 90 часа скорость перемешивания монстрируется наличием красноватых пятен уменьшают до 280 см/с, и к 144 часу снижают спустя 168 ч. Масляные капли очень маленького до 260 см/с. размера присутствуют в большом количестве в Наблюдения. отличие от масляных капель большого размера,При инокулировании биомасса в обоих апкоторые встречаются лишь иногда. Выход биопаратах находится в форме очень рыхлых гимассы и масла, а также потребление источников фальных агрегатов. К истечению примерно 24 ч углерода и азота представлен в таблице 3. начинают образовываться гранулы. Гранулы имеют небольшой размер (1-3 мм) с небольшиТаблица 3. Изменение состава в зависимости от времени ферментации Станция 14 3 х 6 г/л дрожжевого эстракта Глюкоза Содержание масла Содержание ARA ПроизводительЧас Станция 15 3 х 6 г/л дрожжевого эстракта Содержание масла Содержание ARA Сухой вес (г/л) Пример 6. Повышение выхода биомассы из М. аlpina - третья серия опытов. В этой серии опытов предпринимается попытка дальнейшего повышения количества продукта повышением содержания фосфата и минеральных веществ. Методика опытов по существу повторяет методику примера 5 за исключением того, что декстрозу и антипенную добавкуMazu 204 растворяют в 11,5 л водопроводной воды, а не в 12,5 л, оставшийся объем оставляют для растворов солей, которые добавляют через 30 ч. На станции 14 добавляют Fe, Zn и Сu, на станции 15 добавляют фосфат, а также Fe, Zn и Сu. Станция 14: 3 х 6 г/л Tastone 154. Дрожжевой экстракт растворяют до концентрации 96 г/л в количестве 3 х 1 л и выдерживают в автоклаве 1 ч. Аликвоты в объеме 1 л раствора дрожжевого экстракта добавляют на 0,22 и 28 ч процесса ферментации. На 22 и 28 ч скорость выделения диоксида углерода (CER,показывает скорость метаболизма в бродильном аппарате) возрастает экспоненциально, и в среду ферментации необходимо добавлять основание. Солевой исходный материал содержит:FeCl растворяют в 1 л 5 г/л раствора лимонной кислоты. Остальные соли добавляют,рН раствора доводят с помощью NaOH до 4,5. Соли добавляют на 30 часу. Начальная скорость перемешивания для аппарата ферментирования составляет 50 см/с, а не 80 см/с, как планировалось вначале, ввиду того, что исходный уровень жидкости в аппарате (13 л) лишь частично закрывает верхнюю часть мешалки (гонка), и при более высокой скорости перемешивания разбрызгивание происходит в значительной степени. Через 16 ч после начала ферментации D.O. снижают до уровня менее 40%, скорость перемешивания увеличивают постепенно до 175 см/с к 28 часам. Затем D.O. поднимают и поддерживают на уровне выше 40%, добавляя в поток воздуха кислород. К 46 часу скорость перемешивания увеличива Производительность (г масла/л/д) 0,15 0,80 1,02 1,15 1,16 0,93 ют до 190 см/с для получения хорошего смешения. Скорость перемешивания повышают далее до 200 см/с к 48 часам, до 220 см/с к 51 часу, до 235 см/с к 53 часу, до 250 см/с к 56 часу, до 260 см/сек к 57 часам и до 280 см/с к 70 часам. Даже при такой скорости перемешивания (450 об/мин) смешение является слабым. Несмотря на поддерживание минимального критерия "некоторое движение", оборот биомассы происходит очень медленно, и некоторые зоны застаиваются. Добавление нескольких капель антипенной добавки снижает высоту пены и удаляет застойные зоны. На 116 часу скорость перемешивания снижают до 265 см/с, и на 120 часу ее продолжают снижать до 250 см/с. Пенообразование начинается в аппарате ферментации приблизительно на 18 часу. Пенообразование контролируют добавлением антипенной добавки. Первый раз антипенную добавку вносят на 20 часу. К 24 часам пенообразование является значительным и требуется регулярное добавление антипенной добавки. К 72 часам пенообразование по большей части спадает. Однако все еще необходимо редкое добавление антипенной добавки. К 24 часу биомасса имеет форму очень рыхлых гранул (1-2 мм) и рыхлых гифальных агрегатов. Наблюдается значительное количество клеточных остатков. К 48 часу биомасса имеет форму очень рыхлых гифальных агрегатов,очень маленьких гранул (1-2 мм) с очень небольшими ядрами и рыхлыми перифериями, и небольших компактных гранул (1-3 мм) без рыхлых периферий. К 96 часам биомасса имеет форму компактных округлых гранул (1-2 мм),иглообразных гранул (менее чем 0,5 мм) и рыхлых гифальных агрегатов. Красноватые пятна на 144 часу показывают присутствие множества очень маленьких капель масла в мицелиях. Станция 15: 3 х 6 г/л Tastone 154. Дрожжевой экстракт растворяют до концентрации 96 г/л и выдерживают в автоклаве в течение 1 ч. Раствор дрожжевого экстракта добавляют на 0, 22 и 26 часу. На 22 и 26 часу CER возрастает экспоненциально, в среду ферментации необходимо добавлять основание. ки. Первый раз антипенную добавку вносят на 17 часу процесса ферментации. На 20 часу происходит значительное образование пены в процессе ферментации, и оно требует регулярного добавления антипенной добавки. Пенообразование по большей части снижается на 72 часу. Однако эпизодическое внесение антипеннойFeCl3 растворяют в 500 мл раствора лидобавки все же необходимо. монной кислоты с концентрацией 5 г/л. ДобавК 24 часам биомасса имеет форму очень ляют остальные соли, доводят рН до значения рыхлых гранул (1-2 мм) и рыхлых гифальных 4,5 с помощью NaOH. КН 2 РО 4 растворяют в 500 агрегатов. Наблюдается значительное количестмл водопроводной воды. Оба раствора выдерво клеточных остатков. К 48 часам биомасса живают в автоклаве в течение 1 ч. Затем охлажимеет форму очень рыхлых гифальных агрегадают до 23 С, объединяют и добавляют в бротов, очень небольших гранул (1-2 мм) с очень дильный аппарат на 30 часу. маленькими ядрами и рыхлыми перифериями, и Начальная скорость перемешивания в небольших компактных гранул (1-3 мм) без ферментере составляет 50 см/с, а не 80 см/с, как рыхлых периферии. К 96 часам биомасса имеет планировалось сначала, так как начальный уроформу округлых гранул (1-2 мм в диаметре),вень жидкости в нем (13 л) лишь частично помногие из которых имеют рыхлые ворсистые крывает верхнюю часть мешалки, и большие периферий, и имеет место множество рыхлых скорости перемешивания приводят к значительгифальных фрагментов. Красноватые пятна на но большему разбрызгиванию. На 16 часу D.O. 144 часу показывают присутствие множества снижают до значения ниже 40%, скорость переочень маленьких капель масла в мицелиях, а мешивания постепенно повышают до 175 см/с также присутствие очень больших капель масла на 27 часу. Затем D.O. повышают до более 40%,по всем другим мицелиям. добавляя кислород в поток воздуха. На 41 часу Процесс на станции 15, отличающийся от скорость перемешивания повышают до 200 см/с,процесса на станции 14 только добавлением т.е. до скорости, обеспечивающей перемешивафосфата, показывает лучшее смешение по всему ние по крайней мере минимального количества. объему ферментации в общем случае при более Далее скорость перемешивания повышают до низких скоростях. На станции 15 наблюдается 220 см/с на 42, до 230 см/с на 46 часу, до 235 также более рыхлая морфология биомасс. Высм/с на 51 часу и до 240 см/с на 70 часу. При ход биомассы и масла, а также потребление исэтой скорости перемешивания (410 об/мин) точника углерода приведены в таблице 4. Больимеет место смешение от слабого до среднего. шее применение глюкозы (82 г/л для станции 15 Поддерживают минимальный уровень движения по сравнению с 64 г/л для станции 14), большее биомассы. На 80 часу скорость перемешивания накопление биомассы и присутствие больших снижают до 205 см/с. капель масла в части мицелий характеризуют Пенообразование начинается в аппарате процесс ферментации, в котором присутствует приблизительно на 18 часу. Пенообразование большее количество фосфата. контролируют добавлением антипенной добавТаблица 4. Изменение состава среды в процессе ферментации Станция 14+ соли Глюкоза Сухой вес Содержание масла Содержание ARA Производительность Час+ соли + фосфаты Глюкоза Сухой вес Содержание масла Содержание ARA Производительность Час 27 Пример 7. Получение биомассы М. alpina,содержащей арахидоновую кислоту, в большом количестве. Бродильный аппарат для получения инокулята, содержащий GYE среду (50 г/л декстрозы и 6 г/л Tastone 154), инокулируют из культиватора. Температуру поддерживают на уровне 28 С и начальное перемешивание проводят со скоростью 130-160 см/с (приблизительно 43 об/мин). Начальное давление в аппарате 41,4 кПа и начальная скорость аэрации 0,25 VVM. Перед стериллизацией рН среды доводят до 5,0,затем после стериллизации начальную рН среды в аппарате устанавливают на уровне 5,5. Содержание кислорода в среде поддерживают на уровне D.O. не менее 40% при помощи следующей последовательности операций: (i) повышение давления в аппарате до 75,8 кПа, (ii) повышение скорости перемешивания с 156 до 175 см/сек из расчета на скорость движения кончика мешалки, и (iii) повышение скорости аэрации до 0,5 VVM. Пенообразование контролируют добавлением антипенной добавки Dow 1520-US при необходимости (приблизительно 0,1 мл/л антипенной добавки следует вводить в среду перед стериллизацией для предотвращения ценообразования). После инокуляции сохраняют рН среды на уровне не менее 5,5 с помощью 8 Н NaOH. В течение 12 ч после возрастания рН до величины выше 6,0, содержание семенного ферментера переносят в главный ферментер. Среда основного ферментера содержит: 80 г/л декстрозы (ADM); 16 г/л соевой муки (ADM nutrisoy); 30 г/л FeCl3 6H2O (Sigma/Aldrich); 1,5 мг/л ZnSO4 7H2O (Sigma/Aldrich); 1 мг/л биотина (Sigma/Aldrich) 0,1 мг/л CuSO4 5H2O (Sigma/Aldrich); 2 мг/л тиамин НСl (Sigma/Aldrich) 2 мг/л пантотеновой кислоты (полукальциевая соль) (Sigma/Aldrich) (доводят рН до 4,85,0 перед стериллизацией). Основной ферментер инокулируют средой из аппарата для получения инокулята (11,8%). Температуру в ферментере поддерживают на уровне 28 С. Начальная скорость перемешива Час 0 66 94 118 142 165 188 215 237 28 ния 162 см/с (примерно 23 об/мин), начальное давление в аппарате 41,4 кПа, начальная скорость аэрации 0,15 VVM (300 scfh стандартных кубических футов в час - 2,359735 дм 3/с = 2,359735 10-3 м 3/с). Содержание кислорода в среде поддерживают на уровне D.O. не менее 40% i) повышением давления в аппарате до 75,8 кПа, ii) повышением скорости перемешивания до значения, при котором скорость движения кончика-мешалки равна 300 см/с (постепенно до около 30 см/с) иiii) увеличением скорости аэрации до 0,5 VVM. рН изменяют в соответствии со следующим протоколом:- Начальную рН после стериллизации устанавливают на уровне 5,5. Поддерживание рН на уровне не менее 5,5 осуществляют с помощью 8 Н NaOH.- Спустя 24-26 ч после инокулирования добавляют 2 г/л КН 2 РО 4 (110 кг в приблизительно 700 л воды).- Спустя 48 ч после инокулирования, если концентрация дестрозы составляет не более 60 г/л, изменяют рН, доводя ее значение до не менее 6,1.- Спустя 72 ч после инокулирования начинают медленно со скоростью приблизительно 0,1 единиц рН в час повышать значение рН и доводят его до 6,6.- Поддерживают значение рН ниже 7,3, добавляя при необходимости H2SO4. Каждые 12 ч отбирают образцы для анализа биомассы и содержания жирных кислот, и отбор начинают приблизительно через 3 дня после возрастания рН до значения не менее 6,6(приблизительно через 6 дней после инокуляции). Плотность сухой биомассы должна составлять не менее 24 г/л. Концентрация декстрозы в бульоне должна падать с 80 г/л до не более 14 г/л. Сбор выполняют, пропуская цельный бульон культуры через барабанный вакуумфильтр для отделения мицелий от среды, содержащей небольшое количество оставшихся питательных веществ. Результаты опытов в двух типичных ферментерах в соответствии с методикой данного примера приведены в таблицах 5 и 6. Таблица 5. Процесс ферментации М. alpina Культуральная среда = Глюкоза (80 г/л + Соевая мука (16 г/л) + Соли + Витамины Глюкоза NH3 Содержание масла Содержание ARA ПроизводительСухой вес (г/л) Таблица 6. Ферментация M.alpina Культуральная среда = Глюкоза (65 г/л + Соевая Myкa (16 г/л) + Соли + Витамины + Антибиотики Час Глюкоза NН 3 Сухой вес (г/л) Содержание масла Содержание ARA Производи тель(г/л)Mortierella sp., в котором не менее 40% остатков жирных кислот в составе триглицеридной фракции представляют собой остатки арахидоновой кислоты и общее количество остатков эйкозапентаеновой кислоты составляет не более одной пятой от общего количества остатков арахидоновой кислоты. 2. Немодифицированное масло грибов по п.1, в котором не менее 50% остатков жирных кислот в составе триглицеридной фракции представляют собой остатки арахидоновой кислоты. 3. Немодифицированное масло грибов по любому из пп. 1-2, в котором общее количество остатков эйкозапентаеновой кислоты составляет не более одной десятой от общего количества остатков арахидоновой кислоты. 4. Способ получения немодифицированного масла грибов, содержащего арахидоновую кислоту, по любому из пп.1-3, включающий в себя осуществление следующих стадий:- культивирование грибов Моrtierella sp. в ферментере с культуральной средой в условиях аэрации при добавлении в культуральную среду в процессе ферментации источника углерода в количестве, эквивалентном, по меньшей мере,80 г/л глюкозы, и источника азота в количестве,эквивалентном, по меньшей мере, 15 г/л дрожжевого экстракта, и поддержания рН среды в интервале между 5 и 6 на начальном этапе культивирования и в интервале между 7 и 7,5 - на конечном этапе культивирования;- сбор полученной биомассы и- выделение указанного масла, содержащего арахидоновую кислоту, из указанной биомассы. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что содержание растворенного кислорода в культуральной среде составляет, по меньшей мере,35% от величины насыщения воздухом. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что источник азота делят на две или более аликвот,которые добавляют в ферментер в различное время культивирования, причем, по меньшей мере, одну аликвоту вносят в среду не одновременно с добавлением источника углерода. 7. Способ по любому из пп.4-6, отличающийся тем, что грибы Mortierella sp. представляют собой грибы Mortierella alpina. 8. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что неочищенное масло, содержащее арахидоновую кислоту, выделяют из биомассы экстрагированием неполярным растворителем и далее осветляют экстрагированием полярным органическим растворителем. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что неполярный растворитель представляет собой гексан. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что полярный растворитель представляет собой ацетон, или этанол, или изопропиловый спирт. 11. Способ обеспечения детского питания арахидоновой кислотой, предусматривающий добавление в него немодифицированного масла грибов в количестве, достаточном для обеспечения такого содержания арахидоновой кислоты, которое соответствует ее содержанию в женском грудном молоке, отличающийся тем,что в качестве немодифицированного масла грибов в детское питание добавляют масло по любому из пп.1-3. 12. Детское питание, включающее в себя арахидоновую кислоту в количестве, соответствующем содержанию арахидоновой кислоты в женском грудном молоке, причем указанное количество арахидоновой кислоты обеспечивается добавлением в детское питание немодифицированного масла грибов, отличающееся тем,что в детское питание добавлено немодифицированное масло грибов по любому из пп. 1-3. 13. Способ обеспечения человека дополнительным количеством арахидоновой кислоты,заключающийся во введении человеку, нуждающемуся в дополнительном количестве арахидоновой кислоты, композиции, содержащей немодифицированное масло грибов по любому из пп.1-3, в количестве, эффективном для обеспечения указанного человека дополнительным количеством арахидоновой кислоты. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что человеку, нуждающемуся в дополнительном количестве арахидоновой кислоты, вводят композицию, содержащую указанное масло в количестве, эффективном для обеспечения 0,2-0,8 арахидоновой кислоты в день. 15. Способ по любому из пп.13-14, отличающийся тем, что указанную композицию вводят энтерально. 16. Способ по любому из пп.13-14, отличающийся тем, что указанную композицию вводят парэнтерально. 17. Способ по любому из пп.13-14, отличающийся тем, что указанную композицию вводят локально. 18. Способ по любому из пп.13-14, отличающийся тем, что указанную композицию вводят беременной или кормящей женщине. 19. Способ по любому из пп.13-14, отличающийся тем, что указанную композицию вводят человеку, страдающему неврологическим расстройством. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что неврологическое расстройство представляет 32 собой отложенную дискинезию, шизофрению или пероксисомное расстройство. 21. Способ по любому из пп.13-14, отличающийся тем, что указанную композицию вводят человеку, страдающему от заболевания, связанного с пониженным уровнем арахидоновой кислоты в сыворотке крови. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой заболевание печени, фенилкетонурию или кистозный фиброз. 23. Косметическая композиция, включающая в себя немодифицированное масло грибов,отличающаяся тем, что в качестве указанного масла она содержит масло по любому из пп. 1-2,причем указанное масло входит в состав косметической композиции в количестве, эффективном для содействия поддержания тонуса кожи, в том случае, когда она используется локально. Евразийский патент действует на территории всех Договаривающихся государств, кроме