Композиция для окрашивания in vivo, способ ее получения и способы ее применения для идентификации диспластической ткани

1 По данной заявке испрашивается множественный конвенционный приоритет на основе международной заявки РСТ США/97/20981,поданной 13 ноября, тех же авторов, 1997 г., и на основе заявки США, серийный 09/110 788,поданной 6 июля 1998 г., тех же авторов. Настоящее изобретение относится к новым биологическим красящим композициям, предназначенным для местного применения in vivo у людей. В частности, предметом данного изобретения являются новые красители, такие как толуидиновый синий 0 ("ТВО"), продукты, содержащие ТВО и определенные производные ТВО в определенных пропорциях. В соответствии с другим аспектом данное изобретение относится к новым способам получения композиций ТВО, включающих эти новые продукты ТВО, как описано в соответствующей международной заявке. Кроме того, данное изобретение относится к улучшенным способам получения, обеспечивающим больший выход продукта ТВО, что приводит к значительной производственной экономии и увеличению производительной мощности используемого оборудования, как описано в соответствующей заявке США. В соответствии со следующим аспектом данное изобретение относится к способам применения таких новых веществ ТВО in vivo для идентификации подозрительной диспластической, т.е. патологической, ткани. В соответствии с другим аспектом данное изобретение относится к композициям, диагностическим способам их применения in vivo и способам их получения, специально приспособленным для обнаружения подозрительной диспластической оральной ткани, особенно раковой и предраковой ткани. В соответствии с еще одним аспектом данное изобретение относится к новым и Nдеметилированным продуктам ТВО, синтезированным, выделенным и идентифицированным. В соответствии с другим аспектом данное изобретение относится к способам ЖХВД (жидкостная хроматография высокого давления) анализа продуктов ТВО, содержащих конформационные изомеры и другие структурно родственные соединения. Различные варианты осуществления данного изобретения и его осуществления очевидны для специалистов в данной области из его нижеследующего подробного описания, формулы изобретения и чертежами, описание которых представлено ниже. Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет собой диаграмму ЖХВД при 254 нм, изображающую пики, обычно характерные для известных и промышленно изготовляемых композиций продукта ТВО; Фиг. 2 представляет собой диаграмму ЖХВД при 254 нм, изображающую пики, харак 002127 2 терные для типичных композиций продукта ТВО по данному изобретению; и Фиг. 3 представляет собой технологическую схему способов получения продуктов ТВО настоящего изобретения, включая новые композиции продукта ТВО по данному изобретению. Большая часть поражений слизистой оболочки рта вызвана травмами. Однако другие оральные поражения включают диспластические опухоли, которые могут быть доброкачественными, некоторые из них могут быть раковыми или предраковыми. Кроме того, многие диспластические поражения невелики и могут быть не замечены при очередном визуальном осмотре клиницистами-стоматологами. Известен диагностический тест in vivo для идентификации и очерчивания подозрительной диспластической оральной ткани. Этот тестскрининг в общем описан в патенте США 4 321 251, Mashberg, а также в патенте США 5 372 801, Tucci et al. Позднее были разработаны наборы, позволяющие клиницистам быстро и легко проводить тест, как часть обычной зубоврачебной процедуры и таким образом идентифицировать и/или очерчивать подозрительные участки на том этапе, когда пациенты еще не имеют симптомов или когда диспластические поражения настолько малы, что они могут быть пропущены при обычном визуальном осмотре. После идентификации подозрительного диспластического поражения в соответствии с протоколом Машберга (Mashberg) может быть отобран обычный образец на биопсию, подвергнут гистологическому исследованию, чтобы определить, является ли поражение злокачественным или предраковым. Наборы для проведения такого теста, содержащие предварительно смешанные красящее вещество и растворы для опрыскивания в необходимых количествах, лицензированы Zila, Inc. и промышленно изготавливаются в Канаде, Germiphene, TM Inc. под торговым знаком ORASCAN, а также в Соединенном королевстве и Австралии Stafford-MillerLtd. под торговым знаком "ORASCREEN". Известные продукты ТВО Было найдено, что содержание органического красителя в известных коммерчески доступных продуктах ТВО, в зависимости от фирмы-изготовителя, относительно низкое. Обычно суммарные площади пиков ЖХВД при 254 нм(см. методику ЖХВД в примере 3), представляющие конформационные изомеры толуидинового синего 0 в этих известных продуктах,составляют всего лишь около 2-75% от суммарных площадей пиков ЖХВД при 254 нм,представляющих все ТВО и соединения, родственные ТВО, т.е. два конформационных изомера ТВО плюс до шести компонентов, родственных ТВО. На фиг. 1 пики 7 и 8 ЖХВД представляют два конформациoнных изомера толуидинового синего 0 (показанных в виде хлоридов) Пики 5 и 6 ЖХВД идентифицируют как Nдеметилированные производные двух конформационных изомеров толуидинового синего 0.N,N-деметилированные производные двух конформационных изомеров толуидинового синего 0. Точные структуры соединений, представленных пиками 1 и 4 ЖХВД не были положительно определены. В любом случае, в известных композициях ТВО, типичные из которых показаны на фиг. 1,соединения, представленные пиками 1-4, присутствуют в относительно большем количестве,чем в композициях по данному изобретению(см. фиг. 3), а соединения, представленные пиками 5-8, присутствуют в относительно меньшем количестве, чем в продуктах ТВО по данному изобретению. Два N-деметилированных производных конформационных изомеров ТВО,представленные пиками 5 и 6, известных ранее(фиг. 1), присутствуют в сравнительно большем количестве, обычно свыше 20% от содержания органического красителя, чем производные,присутствующие в продуктах ТВО в соответствии с данным изобретением. 4 Известные процессы получения толуидинового синего 0 Примеры классического синтеза толуидинового синего 0 приведены в патенте США 418 055, опубликованном 30 ноября 1989 г., Dandliker et al. Такой синтез представляет собой серию, включающую 3 стадии окисления:(2) конденсация тиосульфоновой кислоты с о-толуидином с получением соответствующей индамин-тиосульфоновой кислоты; и(3) замыкание цикла индаминтиосульфоновой кислоты, например, в присутствии хлорида цинка при температуре кипения приблизительно в течение 30 мин с получением толуидинового синего 0. Затем реакционную смесь охлаждают и получают комплекс или соль продукта ТВО реакции замыкания цикла, например обработкой хлоридом натрия и цинка с осаждением комплекса ТВО, например, в виде комплекса TBO/ZnCl2. Очистка может осуществляться путем повторного растворения и осаждения, например, путем повторного растворения в горячем водном растворе хлорида цинка и повторного осаждения хлоридом натрия или цинка. Насколько известно, предыдущие исследователи, изучавшие применение толуидинового синего 0 для идентификации дисплазии in vivo,использовали вышеупомянутые известные продукты ТВО, т.е. композиции, в которых конформационные изомеры толуидинового синего 0 плюсN,Nдеметилированные производные составляли менее 80% от количества композиции красителя и в которых оба производныеNдеметилирования конформационных изомеров составляли более приблизительно 20% композиции красителей. Известно, что предыдущие исследователи не знали точного состава своих продуктов ТВО,а производители известных продуктов ТВО не могли точно воспроизвести их. В сущности, в литературе большинство описаний качества толуидинового синего 0 сводится к "толуидиновый синий с хорошей цветовой насыщенностью". Комиссия по биологическим красителям описывает методику аналитического титрования для определения только "содержания органического красителя" материала. Использование такого свободно определенного толуидинового синего 0 привело к неправильным клиническим наблюдениям и серьезным проблемам при разработке необходимых правил очистки для производства и продажи таких продуктов для использования в диагностических методиках для людей. Вкратце, новые композиции, составляющие предмет данного изобретения, представля 5 ют собой продукт ТВО, который включает конформационные изомеры толуидинового синего 0 и N-деметилированные производные этих конформационных изомеров, присутствующие в таком соотношении изомеров ТВО к их Nдеметилированным производным, что отношение суммарных площадей пиков ЖХВД при 254 нм, представляющих изомеры ТВО (определенные в соответствии с методикой ЖХВД по примеру 3) к суммарным площадям пиков, представляющих их N-деметилированные производные, составляет, по крайней мере, приблизительно 6:1. Таким образом, как показано на фиг. 2, суммарная площадь пиков ЖХВД при 854 нм,представляющих конформационные изомеры толуидинового синего 0 (пики 7 и 8), по крайней мере, приблизительно в 6 раз больше суммарной площади пиков ЖХВД при 254 нм, представляющих их соответствующие производные Nдеметилирования (пики 5 и 6). В предпочтительном варианте осуществления изобретения компоненты, представленные пиками 5, 6, 7 и 8,составляют, по крайней мере, приблизительно 95% от содержания органического красителя продукта. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения площадь пика 8 (254 нм) представляет, по крайней мере, 58% от содержания органического красителя продукта. Данное изобретение также включает способ определения диспластической ткани in vivo у людей, включающий стадию нанесения на человеческую ткань вышеописанных новых продуктов ТВО. Другой вариант осуществления изобретения представляет собой новый общий способ воспроизводимого получения композиций ТВО,включающих вышеописанные новые продукты ТВО, в которых комплексoобразующий агент добавляют к реакционной смеси перед стадией(третьей) замыкания цикла синтеза Дандликера(Daaclliker), предпочтительно, перед первой стадией окисления (11, фиг. 3) процессе. Известный процесс Дандликера включает следующие стадии: окисление ионовN,N-диметил-nфенилендиамина в первой реакционной смеси с получением первого промежуточного соединения 2-амино-5-диметиламинофенил тиосульфоновой кислоты,окисление первого промежуточного соединения и конденсация оксидизата отолуидином во второй реакционной смеси с получением второго промежуточного соединения индамин тиосульфоновой кислоты,окиcление второго промежуточного соединения в третьей реакционной смеси для замыкания индаминового цикла с получением реакционного продукта ТВО, растворенного в третьей реакционной смеси, 002127 6 введение комплексообразующего реагента в третью реакционную смесь с получением продукта комплекса ТВО, и выделение указанного комплекса ТВО из указанной третьей реакционной смеси. Усовершенствование этого известного способа Дандликера в данном изобретении включает стадию добавления комплексообразующего реагента на стадии более ранней, чем получение третьей реакционной смеси, предпочтительно, перед получением второй реакционной смеси. В соответствии с дальнейшим предпочтительным вариантом осуществления изобретения, специально приспособленным для получения нового продукта ТВО по данному изобретению, температура реакционной смеси во время стадий окиcления составляет не выше приблизительно 10 С. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, специально предназначенном для улучшения качества продукта ТВО, рН реакционной смеси во время стадий окисления сохраняют в интервале приблизительно 2,8-3,8 (предпочтительно, 3,3) в первой реакционной смеси, приблизительно 3,1-4,1(предпочтительно, 3,6) во второй реакционной смеси и приблизительно 3,0 в третьей реакционной смеси. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения новый общий способ, вкратце описанный выше, усовершенствован для обеспечения существенного повышения выхода продукта ТВО. Как показано на фиг. 1, типичный, известный, коммерчески доступный толуидиновый синий 0 дает при 254 нм пики ЖХВД (7 и 8),представляющие конформационные изомеры ТВО, а также два пика (5 и 6) ЖХВД при 254 нм, которые, как удалось установить, представляют деметелированные производные конформационных изомеров. Отношение количества конформационных изомеров ТВО к их Nдеметилированным производным в этом типичном известном продукте является таковым, что отношение площади пиков конформационных изомеров к N-деметилированным производным составляет менее 4:1. Более высокое соотношение, ниже или выше 6:1, иногда наблюдалось у отдельных известных продуктов ТВО, однако,относительное количество таких продуктов было неизвестно или считалось не имеющим значения. В любом случае, продукты ТВО с таким высоким соотношением не могли быть воспроизводимо получены с помощью известных промышленных способов. В соответствии с установленными требованиями, основанными на последних клинических испытаниях, толуидиновый синий 0, предназначенный для проведения диагностических процедур с людьми (в целом, в соответствии с протоколом Машберга) для определения дис 7 пластической ткани, должен иметь отношение площади пиков ЖХВД при 254 нм конформационных изомеров ТВО к N-деметелированным производным, по крайней мере, приблизительно 6:1, т.е. суммарная площадь пиков 7 и 8 ЖХВД при 245 нм должна быть, по крайней мере, в 6 раз больше суммарной площади пиков 5 и 6 ЖХВД при 254 нм. Весьма желательна разработка композиций продукта ТВО, удовлетворяющих требованиям диагностических процедур для людей, в которых отношение площадей пиков ЖХВД при 254 нм конформационных изомеров к площадям их деметилированных производных составляет, по крайней мере, 6:1. Далее, весьма желательна разработка способов получения для надежного и воспроизводимого получения таких композиций ТВО, имеющих это конкретное соотношение изомеров ТВО к деметилированным производным ТВО, а также надежного и воспроизводимого получения других продуктов ТВО с повышенными выходом и общей чистотой. Как видно из фиг. 8, изображающей анализ ЖХВД при 254 нм типичных композиций по данному изобретению, отношение площади пиков конформационных изомеров ТВО к Nдеметилированным производным выше приблизительно 6:1, в частности, 6,68:1, что подтверждается тем фактом, что суммарные площади пиков 7 и 8 ЖХВД при 254 нм в 6,69 раз больше суммарных площадей пиков 5 и 6. Общая чистота, определенная анализами ЖХВД и прокаливанием как [100% минус процент остатка после прокаливания], умноженная на чистоту по ЖХВД (т.е. сумму площадей пиков 5, 6, 7 и 8,разделенную на общую площадь пиков) продуктов ТВО по данному изобретению, составляет,по крайней мере, более 75%, по сравнению с 210%, большей части известных композиций. В отдельных случаях может быть получена сравнимая чистота в известных продуктах, но не воспроизводимо. В соответствии с одним из аспектов данного изобретения отношение площадей пиков (3, 6 и 8) с кольцевой метильной группой в положении 2 (например, см. формулу I) к площадям пиков (4, 5 и 7) с кольцевой метильной группой в положении 4 (например, см. формулу II) составляет 2,5:1. В противоположность этому,насколько известно, это отношение в известных продуктах не превышает 1,5:1. Это сочетание высокого значения соотношения площадей пиков 7+8 к пикам 5+6 и высокого значения отношения площадей пиков 3+6+8 и пиков 2+5+7, насколько известно, не имеет ни один из известных продуктов. Поскольку пик 8 является основным пиком толуидинового синего 0, структура которого общепризнана как ТВО, то пики 3, 6 и 8 предпочтительнее пиков 2, 5 и 7. Конечно, пики 7 и 8 предпочтительнее пиков 5 и 6, которые, в свою очередь, предпочтительнее пиков 2 и 3. Таким 8 образом, в самом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, продукты удовлетворяют этим двум критериям соотношений. Фиг. 3 представляет собой технологическую схему процесса получения продуктов ТВО, удовлетворяющих установленным требованиям клинического применения в общем соответствии с протоколом Машберга. Исходным материалом 10 для синтеза, показанного на фиг. 3, является коммерчески доступный N,N-диметил-n-фенилендиамин высокой чистоты Получение первой реакционной смеси Водный раствор исходного материала 10 окисляют 11, предпочтительно при температуре ниже 10 С, особенно предпочтительно, ниже 5 С, реакцией с подходящим окислителем 12,например, дихроматом калия 12, в присутствии кислоты, сульфата алюминия и реагента 13 (который, как считается, образует комплексы с промежуточным соединением (соединениями) и используется на более поздней стадии процесса для образования комплекса с компонентами композиции ТВО), например, хлорида цинка. Затем добавляют источник ионов тиосульфата 14, например, тиосульфат натрия, для получения первой реакционной смеси 15, содержащей первое промежуточное соединение, т.е. 2 амино-5-диметиламинофенил тиосульфоновую кислоту Получение второй реакционной смеси Затем первую реакционную смесь 15 подвергают дальнейшей реакции, предпочтительно,при температуре не выше приблизительно 10C,с дополнительным окислителем 16, например,дихроматом калия, и O-толуидингидрохлоридом 17 на стадии конденсирования 18 с получением второго промежуточного соединения, продукта конденсации, индамина тиосульфоновой кислоты во второй реакционной смеси 19. Получение третьей реакционной смеси Вторую реакционную смесь 19 затем дополнительно окисляют 21, предпочтительно добавлением подходящего окислителя 22, например, дихромата калия, при температуре не выше приблизительно 10 С. Затем добавляют сульфат меди, комплексообразующий агент хлорид меди, кислоту и нагревают до 100 С для 9 замыкания индаминового кольца с получением ТВО в третьей реакционной смеси 24. На этой стадии толуидиновый синий 0 выделяют из третьей реакционной смеси и очищают. Выделение и очистка толуидинового синего 0 Например, в предпочтительном варианте осуществления способа по данному изобретению толуидиновый синий 0 осаждают из третьей реакционной смеси путем образования комплекса 24 с подходящим комплексообразующим агентом 25, т.е. хлоридом цинка, с получением комплекса двойная соль ТВО-хлорид цинка. Осадок отфильтровывают 26 из жидкой фазы и промывают раствором хлорида натрия 27. Затем промытый осадок на фильтре вновь растворяют 28 в критическом 1 объеме воды с получением раствора 30 ТВО, который после этого фильтруют 31 для удаления нерастворенных твердых веществ 32 а, которые набрасывают. Затем к фильтрату 32 добавляют хлорид цинка с последующим добавлением критического 2 объема/концентрации хлорида натрия 33 для повторного осаждения двойной соли ТВО-хлорид цинка, как показано ниже (приведен лишь один из конформационных изомеров) Слишком большое количество используемой воды препятствует выделению ТВО. Использование слишком малого количества воды приводит (1) к неполному растворению ТВО и снижению выхода, и (2) к снижению чистоты продукта. 2 Использование слишком малого количества хлорида натрия приводит к неполному высаливанию продукта, снижая его выход. Использование слишком большого количества хлорида натрия приводит к осаждению примесей вместе с ТВО, снижая таким образом чистоту продукта. Двойную соль ТВО-хлорид цинка выделяют из смеси фильтрацией, получая осадок на фильтре 34, состоящий из ТВО-хлорида цинка/гидрохдорида ТВО. Как обозначено пунктирной линией 35,осадок на фильтре ТВО 34 может быть вновь многократно подвергнут растворению, фильтрации, осаждению и выделению с получением желаемой степени чистоты и выхода ТВО. Конечный очищенный комплексный продукт 34 из осадка на фильтре затем высушивают 35, например, в обычной конвекционной и/или вакуумной сушилке, а высушенный осадок на фильтре 36 измельчают и смешивают 37 для получения конечного продукта ТВО 38. Конечный продукт ТВО содержит как двойную соль хлорида цинка ТВО (формула X), так и соль хлорида ТВО (формулы I и II). 10 Добавление комплексообразующего реагента перед получением третьей реакционной смеси, т.е. до окисления индаминтиосульфоновой кислоты и соединения полученного реакционного продукта ТВО с получением его комплекса, приводит к получению комплексного продукта ТВО, имеющего улучшенное отношение конформационных изомеров ТВО к продуктам N-деметилирования. Введение комплексообразующего реагента до получения третьей реакционной смеси обеспечивает соотношение,по крайней мере, 6:1. Конечно, как известно специалистам в данной области, получение такого улучшенного отношения изомеров к деметилированным производным также в некоторой степени зависит от соблюдения других рабочих параметров, как будет указано ниже в описании предпочтительных вариантов способа по данному изобретению, осуществление которых желательно для улучшения выхода и чистоты комплексного продукта ТВО. Однако даже при соблюдении других параметров, связанных с увеличением выхода и чистоты, желаемое улучшенное отношение изомеров к продуктам Nдеметилирования не будет достигнуто и желаемое улучшенное отношение пиков с метиловой группой в положении -2 по отношению к -4 не будет достигнуто, если только комплексообразующий реагент не будет добавлен, по крайней мере, перед получением третьей реакционной смеси, т.е. перед окислением индаминсульфоновой кислоты и образованием комплекса полученного продукта ТВО. Полагают, что раннее добавление комплексообразующего реагента, т.е. перед получением третьей реакционной смеси, улучшает соотношение изомер: N-деметилированные производные конечного продукта благодаря раннему образованию комплекса исходного материала и/или тиосульфоновой кислоты и/или индаминтисоульфоновой кислоты, что, по всей очевидности, создает стерическое затруднение для деметилирования. Другими словами, комплекс,благодаря своему увеличенному размеру и структуре создает пространственный объем (и,возможно, электронный эффект), что защищаетN-метильные группы от окислительного деметилирования. Поскольку все три реакционные стадии включают окисление и возможное деметилирование, предпочтительным является как можно более раннее образование этого комплекса, поэтому рекомендуется введение комплексообразующего агента как можно раньше. В соответствии с другими наиболее предпочтительными вариантами осуществления изобретения, как описано в предыдущей заявке США, указанной выше, выход вышеописанного общего способа значительно повышается при введении источника ионов тиосульфата в первую реакционную смесь для получения первого промежуточного соединения, при этом температуру реакционной смеси понижают приблизи 11 тельно до 10 С и продолжают реакцию при этой пониженной температуре до ее повышения. Таким образом, при получении промежуточного соединения индаминтиосульфоновой кислоты,включающем стадии окисления N,N'-диметил-nфенилендиамина в реакционной смеси, содержащей его и окислитель, а также введения источника ионов тиосульфата с последующим повышением температуры приблизительно в течение 30 мин с получением раствора индаминтиосульфоновой кислоты, растворенного в реакционной смеси, общий выход продукта ТВО в результате всего процесса значительно увеличивается при снижении температуры смеси для окисления - тиосульфонизации до или ниже приблизительно 10 С приблизительно в течение 30 мин перед повышением температуры для получения раствора реакционной смеси индаминтиосульфоновой кислоты. Рабочие примеры Следующие примеры предназначены для иллюстрации осуществления данного изобретения таким образом, чтобы дать возможность специалистам в данной области получить и использовать новые композиции толуидинового синего 0, осуществлять новые диагностические способы с использованием таких композиций ТВО, новый способ получения композиций ТВО, которые вместе составляют различные варианты воплощения изобретения, а также указать специалистам наилучшие известные способы осуществления различных вариантов данного изобретения. Эти примеры представлены лишь для иллюстрации, а не для ограничения объема данного изобретения, определяемого только прилагаемой формулой изобретения. Пример 1. Способ получения Данный пример иллюстрирует в деталях,необходимых для удовлетворения установленных условий GMP (действующей клинической практики), точные методики осуществления периодического промышленного получения красящего продукта ТВО. Приготовление растворов сырьевых материалов Оборудование/материалы: А. Весы Ohaus IP15 КS. В. Весы AnD HV150KAI. С. Весы Fairbanks H90-5150.F. Приспособления для отбора проб, такие как стальные черпаки, барабанные пробоотборники и т.д.G. Конические колбы Эрленмейера, мензурки, бутыли для кислот и другая соответствующая стеклянная посуда. Н. Наклейки для полученных растворов. Меры предосторожности В соответствии с требованиями MSDS при работе с химическими веществами необходимо использовать защитные средства, такие как пер 002127 12 чатки, защитные очки, лабораторные халаты и респираторы. Методика приготовления растворов сырьевых материалов К соляной кислоте, 1364,2 г (5,5 г) добавляют 1364,2 г (5,5 г) очищенной воды (в соответствии с Фармакопеей США). Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. К гексадекагидрату сульфата алюминия,1779,1 г (7,0 г) добавляют 2548,9 г (10,0 г) очищенной воды (в соответствии с Фармакопеей США). Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. К хлориду цинка, 7384,6 г (30,0 г), добавляют 2786,7 г (11,0 г) очищенной воды (в соответствии с Фармакопеей США). Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. К дихромату калия, 2101,9 г (8,0 г), добавляют 2503,8 г (100 г) очищенной воды (в соответствии с Фармакопеей США). Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. К пентагидрату тиосульфата натрия,1526,6 г (6,0 г), добавляют 2043,6 г (8,0 г) очищенной воды (в соответствии с Фармакопеей США). Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. К пентагидрату сульфата меди, 509,7 г(2,0 г), добавляют 1613,1 г (6,0 г) очищенной воды (в соответствии с Фармакопеей США). Перемешивать до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. К серной кислоте, 600,0 г (2,0 г), добавить 600,0 г очищенной воды (в соответствии с Фармакопеей США). Перемешивают до тех пор,пока раствор не станет прозрачным. К хлориду натрия, 70,4 кг ( 250 г), добавляют 234,4 кг (850 г) очищенной воды (в соответствии с Фармакопеей США) . Перемешивают до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Синтез Оборудование и материалы для синтеза: Приборная доска LFE (3000) 20-Галлоновые (90,920 л) баки для очистки, футерованные стеклом с рубашкой и крышкой (Е 71224) Два 100-галлоновых (454,60 л) бака для очистки, футерованных стеклом с рубашкой и крышками (P1, PT-001) (P2, L-13621) Рециркулирующий холодильник(RC096C032,) и 500-галлонный (2273, 00 л) бак для холодного хранения (500 Сsт) Три смесителя Caframo (BDC-1850) (R1,18500961) (P1, 18501149) (P2, 18501173) с валом и мешалкой Подсвеченный смеситель (L1U08) (201550) Три теплообменника (Gardner Machinery)(Rl, 0196L763) (P1, 01960764) (P2, 08950727) Три рециркулятора для жидкости с рубашкой 12KW (Watlow, BLC726C3S 20) Три рециркуляционных насоса (Sta-Rite,JBHD-62S, C48J2EC15) 13 Цифровой перистальтический насос Masterflex (A94002806) Перистальтический насос(1,69705069191,2,69705069199,3,6970509194,4,69705058829,5,69705058805, 6, 69705069195) 6 Датчиков потока (1, 69704295165, 2,69704024995, 3, 69704024994, 4, 69704025027,5, 69612178606, 6, 69703120990) 4 Диафрагменных насоса (Ml) 4 Гасителя волн (А 301 Н) (2, 15557, 3,15561, 4, 15558, 5, 15559) 4 Регулятора воздуха (CFR10) 4 Соленоидных клапана (используемых в регуляторах воздуха) 4 Датчика нижнего потока (FS-500) 3 Соленоидных клапана (EASM5V16W20) Воздушный фильтр/регулятор (TlR)PTFE/Orion 620 (001911) Спектрофотометр 20 (3MU7202070) Лабораторная вакуумная печь Fisher (9502033) Печь с нагнетаемым воздухом FM VWR 1370 (1370FM) Респиратор от пыли/паров Лабораторная мельница Thomas Wiley 14 Температурный самописец с термопарой,тип К (КТx, 6292753, 6355146) Конические колбы Эрленмейера (8 л, 6 л,4 л, 1 л) Мензурки (8 л, 6 л, 500 мл, 250 мл) Бутыли для кислот (4 л, 10 л, 50 л) Барабаны из полиэтилена высокой плотности (55 галлонов (250,03 л), 100 галлонов(454,60 л Мерные колбы (100 мл) Пластиковые воронки Пипетки Пастера с грушами и градуированные пипетки (10 мл, 5 мл) с грушами Гофрированные трубки (25 мл, 50 мл) Бумага для взвешивания Шпатели Упаковочный материал (емкости, крышки,наклейки) Растворы сырьевых материалов Синтез: Стадия I. Синтез 2-амино-5-диметиламинофенил тиосульфоновой кислоты Проверяют соответствие водной системы в соответствии с Фармакопеей США. Вливают в реактор взвешенную, очищенную воду (в соответствии с Фармакопеей США) (28,000 г 100,0 г) и перемешивают при 19010 об./мин. Регистрируют проводимость указанной воды в момент времени ее разлива. Добавляют N,N-диметил-1,4-фенилендиамин (5,128 мол., 720,0 г 3,0 г). Материал должен быть добавлен в виде порошка (без комков). Перемешивают в течение 10 мин (5 мин). Добавляют соляную кислоту(5 мин). Проверяют, что измеритель рН градуирован в соответствии с SOP (стандартная рабочая методика)LM-007. Используя пластиковый пробоотборник,отбирают образец реакционной смеси, объемом приблизительно 10 мл. Маркируют образец, как партия 1PS1a. Проверяют рН и записывают его значения. рН должен составлять 2,8-3,8 при 25 5 С. Добавляют раствор гексадекагидрата сульфата алюминия (4328,0 г 21,0 г). Перемешивают в течение 10 мин (5 мин) при 27510 об./мин. Добавляют раствор хлорида цинка (3641,5 г 18,0 г). Охлаждают до 4 С 1 С. При температуре (PV1) 4 С 1 С в течение более 20 мин (5 мин) добавляют раствор дихромата калия (6532,432,0 г). Закончив добавление, перемешивают в течение 20 мин (5 мин), а затем меняют заданное значение (SP1) до 25,0 С из главного меню. После того, как температура достигла 20,03,0 С, добавляют раствор пентагидрата тиосульфата натрия (3570,2 г 18,0 г). Переме 15 шивают раствор при 25 С в течение 30 мин (5 мин). Меняют заданное значение до 60 С. После того, как температура (PV1) достигает 60,0 С 3,0 С, перемешивают реакционную смесь в течение 5 мин (3 мин) и перенастраивают заданное значение на контролере LFE до 10,0. После того, как температура достигнет 13,0 С 2,0 С, отбирают образец реакционной смеси объемом приблизительно 10 мл, используя пластиковый пробоотборник. Маркируют партию образца как 1 РS1b. Проверяют и регистрируют величину рН, которая должна составлять 3,1-4,1 при 25 С-5 С. Синтез: Стадия 2 Синтез индаминтиосульфоновой кислоты Взвешивают о-толуидин (604,4 г 2,5 г) и охлаждают до 18 С 3 С на ледяной бане. К отолуидину медленно добавляют соляную кислоту (6N, 1230,7 г 5,0 г). Удаляют гидрохлорид отолуидина с ледяной бани и дают возможность раствору нагреться до 38 С 3 С. Раствор добавляют к реакционной смеси и перемешивают в течение 5 мин (3 мин). В течение 20 мин (5 мин) добавляют раствор дихромата калия (6532,4 г 32,0 г). Завершив добавление, перемешивают в течение 10 мин (5 мин). Перенастраивают заданное значение на контролере (SP1) до 60,0. После того, как температура реакционной смеси достигнет 60,0 С 3 С, смесь перемешивают в течение 25 мин (5 мин). Образуется осадок из зеленого индамина. Пипеткой отбирают образец реакционной смеси, объемом приблизительно 10 мл. Маркируют партию образца IPS2. Регистрируют цвет раствора. Синтез: Стадия 3. Синтез толуидинового синего 0 и двойной соли хлорида цинка толуидинового синего 0 Устанавливают заданное значение на контроллере LFE до 7,0. После того, как температура реакционной смеси достигнет 10,0 С 3 С, в течение 20 мин (5 мин) добавляют раствор дихромата калия (6532,432,0 г). После завершения добавления, смесь перемешивают в течение 20 мин. В течение 20 мин (5 мин) добавляют раствор дихромата калия. После завершения добавлений, смесь перемешивают в течение 20 мин(5 мин). Пипеткой отбирают образец реакционной смеси, объемом приблизительно 10 мл. Маркируют партию образца как 13S3. Добавляют раствор хлорида цинка (3641,5 г 18,0 г). Перемешивают 20 мин (5 мин) при 35010 об./мин. Добавляют пентагидрат сульфата меди 16 Пипеткой отбирают образец реакционной смеси, объемом приблизительно 10 мл. Маркируют партию образца как 1 РS4. Изменяют заданное значение на контролере (SP1) до 100,0. После того, как температура реакционной смеси достигнет 67,0 С 3,0 С,начинают добавлять раствор серной кислоты до рН 2,90,3, добавляя аликвотные части (500 мл,250 мл, 125 мл и т.д.). После каждого добавления перемешивают в течение 5-10 мин и проверяют рН. После того, как температура реакционной смеси достигнет 100 С 3 С, смесь перемешивают в течение 355 мин. Изменяют заданное значение на контроллере (SP1) до 35,0. После того, как температура реакционной смеси достигнет 70,0 С 3 С, пипеткой отбирают образец реакционной смеси,объемом приблизительно 10 мл. Маркируют партию образца как 1 РS5. Изменяют заданное значение на контроллере (S31) до 2,5. Охлаждают до 2,5C в течение 4 ч и выдерживают при 2,5 С 2,0 С в течение 418 ч. Пипеткой отбирают образец реакционной смеси, объемом приблизительно 10 мл. Помечают партию образца как 1 РS6. Регистрируют цвет раствора. Фильтруют образец через 0,45 микронную фильтровальную бумагу. Отбирают приблизительно 100 мг осадка и растворяют приблизительно в 100 мл воды ЖХВД. Фильтруют раствор через 0,45 микронную фильтровальную бумагу. Маркируют партию образца как IРS7 и анализируют образец, используя метод анализа КР-ЖХВД толуидинового синего 0 ( см. пример 8). Регистрируют результаты. Очистка: Стадия 1 Фильтруют реакционную смесь через подходящую фильтрующую среду (сорт 52 Whatman). После опустошения реактора взвешивают 724,0 кг 150,0 г 30% раствора NaCl м добавляют 24,0 кг 150,0 г воды в соответствии с Фармакопеей США (записывают проводимость израсходованной воды). Закрывают клапан на дне реактора и добавляют 15% раствора NaCl в реактор. Быстро перемешивают раствор. После завершения фильтрации, в фильтрационный узел добавляют раствор NaCl для промывки осадка на фильтре. Собирают фильтрат в ту же емкость и маркируют партию какHW1(вредные отходы 1). Обрабатывают фильтрат (партияHW1) в соответствии с методиками по утилизации отходов. Проверяют состояние 100-галлонового(464,60 л) бака для очистки 1, футерованного стеклом, с рубашкой и убеждаются в том, что на баке имеется пометка "Чистый" с датой и подписью. Оборудуют бак крышкой из полиэтилена высокой плотности, смесителем Caframo перемешивающим валом, мешалкой и термопарой, 17 вставленной в пластиковую ячейку для термопары. Проверяют, чтобы нижний клапан был открыт, а выходное отверстие закрыто. Маркируют бак как "Партия Р 1 А" (очистка 1 А). Взвешивают 190,0 кг 1,0 кг воды в соответствии с Фармакопеей США в емкость из полиэтилена высокой плотности (регистрируют проводимость израсходованной воды) и переносят воду в бак для очистки 1. Перемешивают смесь при 350 об./мин. Завершив промывание осадка на фильтре NaCl, осадок на фильтре при перемешивании добавляют в бак для очистки 1. Перемешивают смесь в течение 2-4 ч. Отбирают образец (через нижний клапан), объемом приблизительно 50 мл. Маркируют образец как партия 1 РS8. Регистрируют цвет раствора. Устанавливают контроллер LFE бака для очистки 1 до 75,0 (SP1). После того, как температура смеси (PV1) достигает 75,0 С 3 С, изменяют заданное значение на контролере до 40,0. Перемешивают смесь при 40 С и 350 об./мин в течение 12-36 ч. Отбирают образец (через нижний клапан),объемом приблизительно 50 мл. Маркируют партию образца какIРS9. Регистрируют цвет раствора. Проверяют и записывают рН. Отмеряют 1,0 мл образца с помощью 1,0-мл пипетки и доводят до 100 мл в мерной колбе объемом 100 мл. Маркируют партию образца как 1 РS9 А. Затем отбирают 10,0 мл этого раствора 10,0-мл пипеткой и доводят до 100 мл в мерной колбе объемом 100 мл. Маркируют партию образца как 1 РS9 В. Измеряют абсорбцию этих образцов, используя спектроник 20+. Регистрируют результаты. Абсорбция образца 9 В должна составлять 0,220. Очистка: Стадия 2 Фильтруют смесь через фильтрационную среду в фильтрационной установке. Собирают фильтрат в тарированную емкость из полиэтилена высокой плотности с крышкой. Проверяют состояние 100-галлонового(464,60 л) бака для очистки 2, футерованного стеклом с рубашкой и убеждаются в том, что на баке имеется соответствующая пометка "Чистый" с датой и подписью. Оборудуют бак крышкой из полиэтилена высокой плотности,смесителем Caframo, перемешивающим валом,мешалкой и термопарой, вставленной в пластиковую ячейку для термопары. Проверяют, чтобы на нижнем клапане имелась пометка "Чистый", чтобы он был выключен (в горизонтальном положении) и чтобы выходное отверстие было закрыто крышкой. Маркируют бак как Партия Р 2 А (Очистка 2 А), ставят дату и подпись. 18 После завершения фильтрации взвешивают емкость и раствор. Вычитают вес тары. Записывают вес раствора. Подсчитывают объем раствора.(Вес раствора ТВО в г) (100,0 мл раствора ТВО/100,42 г раствора ТВО) = мл раствора ТВО Маркируют осадок на фильтре как партияHW2 (вредные отходы 2) и обрабатывают в соответствии с методиками по утилизации отходов. В чистую емкость из высокоплотного полиэтилена отвешивают количество 30% раствора NaCl, равное объему раствора, записанного выше, используя следующую формулу:NaCl/100,0 мл раствора NaCl) = г раствора NaCl. Берут 10 мл фильтрата в качестве образца и проверяют рН. Маркируют как партия 1 РS10. рН должен составлять 3,0-4,0. Переносят фильтрат (по весу) в бак для очистки 2. Перемешивают раствор при 350 об./мин. Добавляют раствор хлорида цинка (1636,3 г 6,5 г). Переносят раствор NaCl (по весу) в бак для очистки 2. Устанавливают контролер LFE бака для очистки 2 до 75,0 (SP1). После того, как температура смеси (pVl) достигнет 75,0 С 3 С, изменяют заданное значение на контролере на 5,0. Охлаждают до 5 С в течение 6 ч и выдерживают при температуре 5 С 4,0 С в течение 424 ч. Отбирают образец (через нижний клапан),объемом приблизительно 50 мл. Маркируют образец как Партия 1PS11.РТ 2. Обработка:i. Фильтрование Фильтруют смесь через тарированную фильтровальную среду (сорт 52 Whatman) на фильтровальной установке. Отвешивают 12 кг 50 г 30% раствора хлорида натрия и разбавляют 12 кг 50 г воды в соответствии с Фармакопеей США (записывают проводимость израсходованной воды). Промывают осадок на фильтре 15% раствором хлорида натрия, добавляя раствор непосредственно в воронку Бюхнера. После завершения фильтрации, осторожно удаляют фильтровальную бумагу, содержащую продукт толуидинового синего 0. Обрабатывают Партию HW3 (вредные отходы 3) в соответствии с методиками по утилизации отходов.ii. Сушка Помещают продукт ТВО в печь и сушат при 50,0 С 3,0 С в течение 5-1 ч. Продукт маркируют как "Предварительно высушенный". Удаляют продукт из печи с нагнетаемым воздухом и помещают в вакуумную печь. Высушивают при 45,0 С 3,0 С при 28" Нg 2" Нg 19 в течение 102 ч. Маркируют продукт как "Высушенный".iii. Взвешивание Удаляют продукт и взвешивают толуидиновый синий 0 и фильтр. Вычитают вес фильтра и записывают вес ТВО. Используя шпатель из нержавеющей стали, осторожно удаляют продукт с фильтровальной бумаги. Надевают респиратор от пыли/паров. Взвешивают толуидиновый синий.iy. Измельчение Переносят продукт на заключительную стадию получения толуидинового синего 0. Проверяют состояние лабораторной мельницыThomas Wiley и убеждаются в том, что мельница имеет соответствующую пометку "Чистая" с датой и подписью. Используют сито с ячейками 0,5 мм. Поставляют чистую емкость к выходному желобу. Дверца камеры должна быть закрыта и защелкнута. Закрывают скользящую задвижку в нижней части бункера, снимают крышку бункера и помещают образец. Закрывают крышку бункера. Включают мельницу и слегка приоткрывают скользящую задвижку. Подают образец в камеру мельницы достаточно медленно, так чтобы работа мельницы не замедлялась и не прерывалась. Завершив измельчение, осторожно отнимают емкость от выходного желоба. у. Смешивание Проверяют состояние лабораторного смесителя Patterson-Kelly и убеждаются в том, что смеситель имеет соответствующую пометку"Чистый" с датой и подписью. Переносят продукт толуидинового синего 0 в емкость смесителя и закрывают крышку. Устанавливают таймер на 15 мин 5 мин.y1. Анализ Отбирают образец продукта для анализа. Анализируют образец с помощью анализа RPЖХВД толуидинового синего 0. Записывают результаты. Пример 2. Протокол клинического испытания. Приготовление растворов для клинических испытаний Данный пример иллюстрирует применение продукта ТВО примера 1 для идентификации оральной дисплазии. Продукт толуидинового синего 0 примера,малиновый корригентIC563457), буфер тригидрат ацетата натрия и консервант H2O2 (30% в соответствии с Фармакопеей США) (см. патент США 5 372 801) растворяют в очищенной воде (в соответствии с Фармакопеей США), ледяной уксусной кислоте и этиловом спирте SD 18 для получения тестраствора ТВО, имеющего состав, указанный в табл. А. Таблица А Компонент Вес. % 20 Продукт толуидинового синего 0 Корригент Буфер Консервант Уксусная кислота Этиловый спирт Вода Готовят тест-растворы 1% (по весу) уксусной кислоты в очищенной воде консервант из бензоата натрия и малиновый корригент для предварительного и окончательного ополаскивания. Клинический протокол Пациенту надевают нагрудник для защиты одежды. Ожидается отхаркивание, поэтому пациенту дают чашку объемом 10 унций (311,035 г), которая может быть выброшена в контейнер для инфекционных отходов или содержимое которой может быть вылито прямо в середину сливной раковины во избежание ее загрязнения. Поверхности предметов, которые могут быть загрязнены, накрывают или удаляют с испытательного участка. Проводят визуальный осмотр на наличие рака в полости рта, не используя инструментов,которые могут поцарапать или порезать мягкие ткани. Делают описание внешнего вида мягких тканей и зубов перед окрашиванием. Пациент споласкивает полость рта приблизительно 15 мл раствора для предварительного споласкивания в течение приблизительно 20 с и выплевывает его, удаляя избыточную слюну и обеспечивая подходящие условия во рту. Эту стадию затем повторяют, используя дополнительный раствор для предварительного cполаскивания. Затем пациент полощет рот и горло водой в течение 20 с, а затем выплевывает ее. Потом пациент полощет рот и горло 30 мл тест-раствора ТВО в течение одной минуты и выплевывает его. Затем пациент полощет рот 15 мл раствора для окончательного споласкивания в течение 20 с и выплевывает его. Эту стадию затем повторяют. Затем пациент полощет рот и горло водой в течение 20 с и выплевывает ее. Эту стадию повторяют. Проводят осмотр полости рта, применяя соответствующие методы исследования мягких тканей, включая ретракцию, удобное освещение и увеличение, если это необходимо. Фиксируют расположение, размер, морфологию, цвет и особенности поверхности подозрительных поражений, сохранивших голубую окраску. Чтобы избежать ошибочных заключений,пациента вновь приглашают через 10-14 дней для повторения вышеуказанной процедуры. За это время заживают любые язвенные или травматические поражения, а также раздра 21 жения, обнаруженные во время первого обследования. Положительное окрашивание подозрительного участка также и во время второго обследования считается признаком наличия раковой или предраковой ткани, и для подтверждения этого заключения проводят биопсию. Ранние эритропластические поражения окрашиваются в синий цвет, зачастую в виде полос или пятен. Происходит также окрашивание неправильных капиллярных бороздок на спинке языка, что не считается положительным признаком. Другие участки, окрашивающиеся в синий цвет, но не считающиеся положительными,включают зубной налет, края десны у каждого зуба, диффузные пятна на мягком небе вследствие переноса красителя с пятна на спинке языка,а также легко распознаваемые язвенные поражения. Во всех случаях, когда подозрительное поражение не окрашивается в результате данного теста, тем не менее необходимо проведение биопсии. Пример 3. Методика ЖХВД. Данный пример описывает методику исследования образцов толуидинового синего 0,применяемого для идентификации, анализа и теста на чистоту. Оборудование и материалы Ацетонитрил,предназначенный для ЖХВД Ледяная уксусная кислота, марки "чистая" Ацетат аммония марки "чистый" Деионизированная вода, подходящая для анализа ЖХВД Измеритель рН со стандартными буферами, имеющими рН 4,0 и 7,0 Стеклянная лабораторная посуда, включая мерные колбы и пипетки Ультразвуковая баня Аналитические весы Магнитная мешалка Сжатый гелий Установка для фильтрования с нейлоновыми фильтрами, имеющими размер ячеек 0,45 микрон 1000 л шприц Хроматограф ЖХВД и оборудование включая: Насос серии 1050 Hewlett Packard или аналогичный насос, обеспечивающий изократический поток с высоким давлением. Диодный порядковый детектор серии 1050Hewlett Packard или аналогичный УФ детектор с такой же длиной волны. Дисковой привод серии 3 Hewlett PackardVectra (компьютерный контроллер) с монитором Ultra VGA 1280 и лазерным принтером или аналогичный интегpирующий самописец.Prodigy, 5, QDS (3) 100 А, 2,5 см х 4,6 мм,или аналогичная колонка для ЖХВД Инжектор с зафиксированной петлей (10 или 20 л) 22 Нагреватель для колонки Приготовление подвижной фазы Готовят один литр 0,01 М раствора ацетата аммония, перенося 0,77 ацетата аммония в 1000 мл мерную колбу. Добавляют воду, перемешивают для растворения и разбавляют водой до отметки. Переносят 0,010 М раствор ацетата аммония в коническую колбу Эрленмейера и перемешивают магнитной мешалкой. С помощью измерителя рН, предварительно калиброванного буферами с рН 4,0 и 7,0, уксусной кислотой доводят рН раствора до 3,3-3,6. Фильтруют раствор через фильтр с размером ячеек 0,45 мкм. Фильтруют ацетонитрил через нейлоновый фильтр с размером ячеек 0,45 мкм, используя фильтровальную установку Millipore, и к перемешиваемому водному раствору ацетата аммония добавляют точно 250 мл. Помещают эту емкость с подвижной фазой рядом с насосом ЖХВД и продувают гелием в течение 5-10 мин. Приготовление образцов толуидинового синего 0 Тщательно взвешивают приблизительно 50 г образца ТВО, переносят в 100-мл мерную колбу и разбавляют водой до отметки. Закрывают колбу крышкой, подвергают действию ультразвука в течение 30 мин и перемешивают, получая приблизительно 0,5 мг/мл маточного раствора. Переносят 10,0 мл маточного раствора в 100-мл мерную колбу, разбавляют водой до отметки и перемешивают. На колбу с 0,05 мг/мл разбавленного рабочего раствора ТВО наклеивают соответствующую этикетку. Условия для хроматографии Объем впрыскивания - 10 или 20 л Скорость потока - приблизительно 1,5 мл/мин Температура колонки - 40 С Длина волны детектора - 254 нм Настройка чувствительности и затухания: подходящие для используемых приборов Интеграция - область ответа Анализ ЖХВД образцов Приводят ЖХВД в равновесие с потоком подвижной фазы. Проводят тесты на соответствие системы, как описано в Фармакопее СШАXXIII, для определения точности и правильности полученных данных ЖХВД. Для каждого исследования оценивают следующие параметры: Точность: Сравнивают как минимум 5 впрыскиваний рабочего образца. Относительное стандартное отклонение должно быть равно или менее 2,0%. В том случае, если относительное стандартное отклонение больше 2,0%, но меньше 3,0% для суммарных площадей пиков 5-8, проводят 6 впрыскиваний. Разрешение: Вычисляют разрешение базовой линии пиков 7 и 8 (основных пиков) наt1 - время удерживания пика 7 в мм,t2 - время удерживания лика 8 в мм,W1 - ширина пика 7 в мм,W2 - ширина пика 8 в мм Разрешение между пиками 7 и 8 должно превышать 1,5. Хвостовой эффект: Измеряют симметрию пиков, для того чтобы убедиться, что площадь под пиком определена правильно. Определяют хвостовой коэффициент (Т) для пиков 7 и 8 на одной хроматограмме образца, используя следующее уравнение: Т = W0,05 - 2f гдеW0,05 - ширина пика, определенная при 5% от пика базовой линии высоты пика,f - расстояние между максимумом пика и передней частью пика при W0,05,Величина Т должна быть меньше коэффициента 3. Записывают хроматограммы и определяют площадь ответа основных пиков (5, 6, 7 и 8), а также всех пиков примесей (все пики, не являющиеся передними пиками растворителя),присутствующие на хроматограмме. Расчеты и другие показания ЖХВД Идентичность (лекарственное вещество и лекарственный продукт ТВО): Хроматографический профиль образца препарата должен быть в общем таким же (форма и интенсивность пиков), как и профиль хроматограммы, приведенной на фиг. 2. Родственные вещества (лекарственное вещество) Количество каждого пика примесей (известные примеси обозначены как пики 1, 2, 3 и 4 плюс любой другой пик примеси) определяют как процент площади по отношению к общей площади всех пиков на хроматограмме. Анализ лекарственного вещества ТВО Процентную величину каждого из четырех основных пиков ТВО (пики 5-8) определяют таким же образом, как и для примесей, т.е. Выше дано описание изобретения таким образом, чтобы обеспечить его понимание и воплощение специалистами в данной области, а также даны предпочтительные варианты его осуществления. На основании вышеизложенного представлена следующая формула изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция продукта толуидинового синего 0 (ТВО), отличающаяся тем, что соотношение суммарных площадей пиков ВЭЖХ 24 при 254 нм, представляющих конформационные изомеры толуидинового синего 0, и суммарных площадей пиков,представляющихNдеметилированные производные указанных изомеров, составляет, по крайней мере, приблизительно 6:1. 2. Композиция продукта толуидинового синего 0 (ТВО), отличающаяся тем, что соотношение суммарных площадей пиков ВЭЖХ при 254 нм, представляющих первую группу компонентов, включающую конформационный изомер толуидинового синего 0, имеющий кольцевую метильную группу в положении 2,его N-деметилированное производное и егоN,N-деметилированное производное, и суммарных площадей пиков ВЭЖХ, представляющих вторую группу компонентов, включающую конформационный изомер толуидинового синего 0, имеющий кольцевую метильную группу в положении 4, его N-деметилированное производное и его N,N-деметилированное производное, составляет, по крайней мере, приблизительно 2,5:1. 3. Композиция продукта толуидинового синего 0 (ТВО), отличающаяся тем, что изомер,имеющий кольцевую метильную группу в положении 2, составляет, по крайней мере, 58% от общего содержания органического красителя в указанной композиции. 4. Способ идентификации диспластической ткани, включающий стадию нанесения композиции по п.1 в жидком носителе на оральную ткань человека. 5. Способ получения композиции продукта толуидинового синего 0 (ТВО) по любому из пп.1-3, включающий стадии:(A) окисление N,N-диметил-п-фенилендиамина в первой реакционной смеси с получением первого промежуточного соединения, 2 амино-5-диметиламинофенил тиосульфоновой кислоты,(B) окисление указанного первого промежуточного соединения и конденсация оксидизата во второй реакционной смеси с о-толуидином с получением второго промежуточного соединения, индамин-тиосульфоновой кислоты,(C) окисление второго промежуточного соединения для замыкания его индаминового кольца с получением реакционного продукта,содержащего ТВО и растворенного в третьей реакционной смеси,(D) введение комлексообразующего реагента в указанную третью реакционную смесь с получением комплексного продукта ТВО, растворенного в указанной третьей реакционной смеси,(Е) осаждение указанного комплексного продукта ТВО из указанной третьей реакционной смеси, и(F) выделение указанного комплексного продукта ТВО, содержащего конформационные изомеры ТВО, а также его N-деметилированные и N,N-деметилированные производные из указанной третьей реакционной смеси,где введение указанного комплексообразующего реагента в реакционную смесь осуществляют до получения указанной третьей реакционной смеси. 6. Способ по п.5, в котором температура реакционных смесей составляет не выше 10 С. 7. Способ по п.5, в котором рН реакционных смесей находится в интервале приблизительно 2,8-3,8 в первой реакционной смеси,приблизительно 8,1-4,1 во второй реакционной смеси и приблизительно 3,0 в третьей реакционной смеси. 8. Способ по п.5, включающий стадии введения источника ионов тиосульфата в указанную первую реакционную смесь при поддержании температуры указанной первой реакционной смеси, не превышающей 10 С. 9. Способ ВЭЖХ анализа красящего продукта толуидинового синего 0 (ТВО), включающий получение подвижной фазы,получение образца раствора ТВО,уравновешивание колонки ВЭЖХ с потоком подвижной фазы и инъектирование образца раствора в колонку ВЭЖХ, отличающийся тем, что указанную подвижную фазу получают в виде композиции,включающей водорастворимую соль органической кислоты. 10. Способ синтеза 2-амино-5-диметиламинофенил тиосульфоновой кислоты, включающий стадию окисления N,N-диметил-пфенилендиамина в присутствии источника ионов тиосульфата, при поддержании температуры реакционной смеси не более приблизительно 10 С.