Композиция, содержащая липосомы малого размера, и способ ее получения

Номер патента: 20604

Опубликовано: 30.12.2014

Авторы: Рейли Уильям Дж., Дюпуи Роберт А.

Есть еще 1 страница.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Композиция, включающая липосомы с размерами в ограниченном интервале, в которой по меньшей мере примерно 90% липосом имеют размер менее чем примерно 200 нм и в которой липосомы дополнительно содержат пептид MUC-1, или гликозилированное, и/или липидированное производное пептида MUC-1, причем композицию получают способом, включающим стадии:

создание, по существу, постоянного потока воды,

создание, по существу, постоянного потока органического растворителя, содержащего в растворенном виде по меньшей мере один липид и по меньшей мере один пептид MUC-1, причем указанные липиды или липид способны образовывать липосомы,

по существу, постоянное смешивание указанного потока воды и указанного потока органического растворителя с образованием смеси,

охлаждение указанной смеси и

формирование липосом в указанной смеси,

причем соотношение скоростей потока воды и потока органического растворителя и скорость охлаждения указанной смеси регулируют таким образом, чтобы получить препарат липосом, в котором по меньшей мере примерно 90% липосом имеют размер менее примерно 200 нм.

2. Композиция по п.1, в которой липосомы содержат фосфолипиды, которые выбирают из группы, состоящей из дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), фосфатидилхолина (PC, лецитин), фосфатидной кислоты (РА), фосфатидилглицерина (PG), фосфатидилэтаноламина (РЕ), фосфатидилсерина (PS), другие пригодные фосфолипиды включают также дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), димиристоил­фосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), дипальмитоилфосфатидную кислоту (DPPA), димиристоилфосфатидную кислоту (DMPA), дистеароилфосфатидную кислоту (DSPA), дипальмитоил­фосфатидилсерин (DPPS), димиристоилфосфатидилсерин (DMPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE) и дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE).

3. Композиция по п.1, в которой липосомы включают дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC).

4. Композиция по п.1, в которой липосомы дополнительно включают стерин.

5. Композиция по п.1, в которой пептид MUC-1 включает последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1.

6. Композиция по п.5, в которой пептид MUC-1 липидирован по лизиновому остатку.

7. Композиция по п.5 или 6, в которой пептид MUC-1 пальмитоилирован.

8. Композиция по п.1, в которой пептид MUC-1 включает последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.

9. Композиция по п.8, в которой пептид MUC-1 липидирован по двум терминальным сериновым остаткам последовательности SEQ ID NO: 2.

10. Композиция по п.8 или 9, в которой пептид MUC-1 гликозилирован.

11. Композиция по любому из пп.1-10, которая является лиофилизированной.

12. Композиция, которая восстановлена из лиофилизированной композиции по п.11.

13. Композиция по п.1, где соотношение скоростей потока воды и потока органического растворителя составляет по меньшей мере примерно 2:1.

14. Композиция по п.1, где скорость охлаждения составляет в среднем по меньшей мере примерно 4°С в час.

15. Композиция по п.1, где поток органического растворителя до смешивания имеет температуру по меньшей мере на 10°С выше температуры перехода указанных липидов.

16. Композиция по п.1, где дополнительно включено обеспечение средств для создания турбулентности в потоке воды, в потоке органического растворителя или в потоке смеси, образующейся в результате смешивания.

17. Вакцинный препарат, включающий композицию по п.1, профильтрованную в стерильных условиях.

18. Вакцинный препарат, включающий лиофилизированную композицию по любому из пп.1 или 17.

19. Вакцинный препарат, включающий восстановленную композицию по п.18.

20. Способ получения препарата липосом с размерами в ограниченном интервале, включающий стадии:

создание, по существу, постоянного потока воды,

создание, по существу, постоянного потока органического растворителя, содержащего в растворенном виде по меньшей мере один липид, причем указанные липид или липиды способны образовывать липосомы,

по существу, постоянное смешивание указанного потока воды и указанного потока органического растворителя с образованием смеси,

охлаждение указанной смеси и

формирование липосом в указанной смеси,

причем соотношение скоростей потока воды и потока органического растворителя и скорость охлаждения указанной смеси регулируют таким образом, чтобы получить препарат липосом, в котором по меньшей мере примерно 90% липосом имеют размер менее примерно 200 нм.

Рисунок 1

Текст

Смотреть все

КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЛИПОСОМЫ МАЛОГО РАЗМЕРА, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Липосомы с размерами в ограниченном интервале получают при практически непрерывном смешивании практически постоянных потоков воды и органического растворителя, который содержит липид(ы), способные образовывать липосомы, с последующим охлаждением смеси полученных липосом, причем соотношение скоростей потока воды и потока органического растворителя и скорость охлаждения указанной смеси регулируют таким образом, чтобы по меньшей мере примерно 90% липосом имели размер менее примерно 200 нм. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение в целом относится к области получения липосомальных вакцин. Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является получение липосом размером менее примерно 200 нм. Заявители неожиданно обнаружили, что при получении липосом путем смешивания органической жидкости (в которой растворены липиды) с водой решающее влияние на образование и сохранение липосом нужного размера оказывают концентрация органического растворителя и быстрое охлаждение полученной смеси. Предлагаемый способ и аппаратура позволяют осуществить синтез в примышленном масштабе гомогенных препаратов лекарственных вакцин, включенных в липосомы, путем смешивания раствора липида, содержащего липиды, растворенные в смешивающемся с водой органическом растворителе, с потоком воды в новых условиях, способствующих непрерывному получению липосом, пригодных для изготовления вакцин. В способе используют систему непрерывного смешивания, в которой соотношение скоростей потоков, т.е. соотношение скорости потока раствора липида и скорости потока воды, поддерживают постоянным, таким образом сохраняя постоянным содержание органического растворителя в системе. В способе также используют быструю стадию охлаждения независимо от масштаба,которая следует за образованием липосом и препятствует увеличению размера липосом. Кроме того,способ предлагает такое расположение трубопроводов, которое способствует образованию липосом нужного размера. Для получения липосом размером менее примерно 200 нм согласно настоящему способу поддерживают концентрацию органического растворителя в смеси органический растворитель/вода на уровне 530%, более предпочтительно 10-25%, наиболее предпочтительно 10-25%; соотношение скоростей потоков (вода/органический растворитель) поддерживают на уровне между 19:1 и 3 1/3:1, более предпочтительно между 9:1 и 5:1 или между 9:1 и 4:1; и охлаждение смеси липосом продолжают (при температуре примерно 55-30 С) в течение менее 5 ч, более предпочтительно менее 2 ч, наиболее предпочтительно менее 30 мин, наиболее предпочтительно, по существу, мгновенно. Изобретение позволяет преодолеть трудности в данной области, в том числе разброс в различных партиях продукта, нежелательное увеличение размера липосом во время охлаждения и необходимость разработки таких способов, как ультразвуковые способы и способы с применением давления. Липосомы,полученные согласно данному изобретению, пригодны для изготовления вакцин для людей или животных. Перечень фигур На фиг. 1 представлена схема аппаратуры; на врезках показано расположение Т-образных сочленений, которые необязательны в случае, когда в трубопроводе имеются внутренние выступы или перегородки для увеличения турбулентности и облегчения перемешивания. На фиг. 2 представлена блок-схема, на которой показаны различные параметры суммарного производственного процесса в условиях клиники. На фиг. 3 показана фотография распределения красителя (в системе, имитирующей смесь липида с растворителем) и воды в трубопроводах различного диаметра: (А) оба трубопровода диаметром 9 мм; (В) трубопроводы диаметром 5 мм (вода) и 3 мм (липид/растворитель). На фиг. 4 показана микрофотография, полученная методом просвечивающей электронной микроскопии (увеличение 18000), показывающая образование липосом с включенными пептидами MUC-1 при использовании 20%-го раствора трет-бутанола согласно настоящему изобретению. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Настоящий способ пригоден для широкомасштабного промышленного производства препаратов наноразмерных липосом, в особенности по существу однородных липосом диаметром не более 200 нм. Предпочтительно, чтобы более 90% (средневзвешенная по объему величина по данным динамического рассеяния света) липосом имели размер менее 200 нм, наиболее предпочтительно, чтобы более 99% имели размер менее 200 нм. Частицы такого размера легко стерилизовать посредством фильтрации в соответствии со стандартами приближенного к промышленному производству в клинических условиях. Такие однородные по размеру липосомы можно изготовить согласно данному изобретению путем регулирования концентрации органического растворителя, поддерживая ее по существу постоянной во время и после образования липосом. Регулируя концентрацию растворителя, можно контролировать размер липосом, образующихся при объединении и перемешивании раствора липида и воды (или другого водного растворителя, пригодного для формирования липосом). При этом раствор липида и вода объединяются непосредственно в потоке сразу после места соединения трубопроводов, по которым сначала подавали раствор и воду. Раствор липида непрерывно поступает из одного трубопровода в непрерывный поток воды. Два потока могут встретиться под любым углом; например, два трубопровода, через которые текут вода и раствор липида соответственно, могут быть расположены примерно под углом 90 или менее 90. Взвесь раствора липида и воды и "облако растворителя" образуются сразу после объединения трубопроводов, и это обозначает место, где, как полагают, образуются липосомы. Кроме того, степень, в которой смешивание липида/растворителя и водной жидкости является тур-1 020604 булентным, может также облегчать образование липосом. Соответственно особенностью аппаратуры и точки объединения, которую надо учитывать, но которая не является необходимой для образования липосом, является использование перегородок, внутренних выступов или углублений в полости любого из трубопроводов, что может способствовать увеличению турбулентности и в результате формированию липосом. Таким образом, согласно данному изобретению, создание высокой неоднородности в точке смешивания жидкостей способствует образованию липосом. Встроенное устройство для охлаждения смеси в течение времени между образованием липосом и входом смеси в сосуд для хранения позволяет быстро остудить смесь, содержащую липосомы. Этого можно достичь, например, с помощью охлаждающей рубашки, охлаждающих змеевиков или ледяной бани, в которую погружают трубопровод или другую линию, по которой течет смесь, содержащая липосомы. При быстром охлаждении размер липосом сохраняется, в то время как при медленном охлаждении и при заданной концентрации органического растворителя размер липосом со временем увеличивается. Регулируя (1) соотношение скоростей потоков воды и органического растворителя и (2) концентрацию органического растворителя в смеси, а также (3) охлаждение смеси сразу после образования липосом и необязательно (4) используя приспособления, повышающие турбулентность потока, можно непрерывно получать липосомы определенного размера. Предлагаемая аппаратура и ее конструкция позволяют избежать недостатков, присущих неэффективным системам периодического действия предшествующего уровня техники, где предварительно смешивали большие объемы воды и смеси липид/растворитель, т.е. перекачивали их из одного бака в другой(см., например, патентную заявку США 11/185448). Вместо этого данная аппаратура представляет собой непрерывно проточную открытую систему, которая позволяет осуществлять бесконечный и воспроизводимый способ получения однородных липосомных препаратов, содержащих любые терапевтические средства, включенные в раствор липида. Данная конструкция также отличается от аппаратуры предшествующего уровня техники тем, что в ней не надо пропускать под давлением раствор липид/растворитель через сопло или отверстия микронного размера для того, чтобы они попадали в поток воды в виде аэрозоля липид/растворитель (см., например, патент США 6843942, Wagner et al, 2002, Journal of Liposome Research, 12(3), p. 259-270, патент США 6855277). В предлагаемой аппаратуре отсутствует необходимость в "модуле инжекции перекрестных потоков", например в узле с указанным микронным отверстием, и, с другой стороны, данная конструкция препятствует смешиванию объемов воды и раствора липида в пространстве между трубопроводами. Иными словами, в данном изобретении отсутствует принудительное впрыскивание смеси липид/растворитель в воду через малое отверстие в общей стенке трубопроводов с движущимися жидкостями, которая с другой стороны разделяет две жидкости. Напротив, предложенные в изобретении аппаратура и способ создают перекрестный поток одной жидкости (воды) с другим свободно текущим потоком жидкости (раствором липида) без применения каких-либо преград или сжатого аэрозоля. В настоящем изобретении для приготовления липосом в определенном заданном интервале их размеров также не требуется гомогенизация или обработка ультразвуком, как описано ранее (например, в патенте США 6855277). Добавление нужного терапевтического соединения типа лекарства, пептида или липопептида в раствор липида по настоящему изобретению, а также любых других желательных ингредиентов типа адъюванта или эксципиента облегчает включение этих веществ в липосомы, которые образуются при объединении раствора липида с потоком воды. Помимо регулирования концентрации растворителя и соотношения скоростей потоков воды и раствора липида желательно также нагревать один раствор липида или раствор липида и воду до начала подачи липида через указанную систему трубопроводов. Соответственно температура жидкостей по настоящему изобретению может быть важным критерием для установления нужного и воспроизводимого выхода однородных по размеру фильтруемых липосом. Предпочтительная температура зависит от температуры перехода используемых липидов. Способ по настоящему изобретению позволяет работать в интервале используемых на практике скоростей потоков. Удивительным наблюдением было то, что поскольку соотношение скоростей потоков(т.е. соотношение скорости потока раствора липида и скорости потока воды) поддерживают постоянным,то неважно, с какой скоростью жидкости проникают друг в друга в пределах используемых на практике интервалов скоростей. Следовательно, предлагаемый способ можно применять как для очень малых, так и для очень больших суммарных объемов раствора. Соответственно, факторы настоящего изобретения, имеющего целью непрерывное образование фильтруемых липосом с включенным лекарством, представляют собой, но не ограничиваются этим:(3) соотношение скоростей потоков раствора липида и воды;(4) температура жидкостей до и во время смешивания;(5) охлаждение после смешивания жидкостей и образования липосом;(6) непрерывная беспрепятственная подача потока каждой жидкости из одной в другую и(7) приспособления, обеспечивающие турбулентность. Следующие разделы рассматривают каждый из этих факторов.(1) Растворитель и его концентрация. Одним из типов растворителя является смешивающийся с водой органический растворитель, такой как, но не ограничиваясь этим, низшие спирты типа метанола, этанола, пропанола, бутанола, изоамилового спирта, изопропанола, 2-метоксиэтанола и ацетон. Предпочтительным растворителем по настоящему изобретению является бутанол или трет-бутанол. Органический растворитель нужен для растворения липидов и лекарства или биоактивных реагентов, которые затем, согласно настоящему изобретению,попадают в поток воды или водной среды, где образуются указанные липосомы с включенным лекарством или реагентом. Одним из факторов получения липосом с размерами в определенном интервале является концентрация смешивающегося с водой органического растворителя. Согласно настоящему изобретению, концентрация органического растворителя в месте смешивания, которая является также конечной концентрацией перед удалением растворителя (например, путем лиофилизации), составляет 5-30%, более предпочтительно 10-25%, наиболее предпочтительно 10-25%. Обычно чем ниже концентрация растворителя,тем меньше размер получаемых липосомальных везикул. Следовательно, было установлено, что в предлагаемой аппаратуре в рамках предложенного способа 10%-ная концентрация трет-бутанола привела к получению липосом, среди которых примерно 99% имели размер менее 100 нм; в отличие от этого при 20%-ной концентрации трет-бутанола 99% липосом имели размер менее 200 нм. Например, при 24%-ой концентрации трет-бутанола образуются липосомы размером менее 400 нм. Соответственно, средний размер частиц в наборе липосом можно задавать путем подбора концентрации растворителя в смеси с растворителем и поддержания этой концентрации постоянной. Желательно получать липосомы размером менее примерно 200 нм, поскольку их легко подвергнуть стерилизации путем фильтрации через применяемые в клинической практике фильтры с порами 0.22 мкм. Таким образом, в одном варианте настоящего изобретения для получения липосом размером менее 200 нм, которые легко проходят через указанные фильтры, предпочтительной концентрацией растворителя, в частности трет-бутанола, является концентрация не выше примерно 20%. Быстрое диспергирование смеси липид/растворитель в воде способствует поддержанию стационарной концентрации растворителя, сохраняя ее на уровне указанных примерно 20%.(2) Липиды. Предпочтительные фосфолипиды, способные образовывать липосомы, включают, но не ограничиваются этим, дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), фосфатидилхолин (PC; лецитин), фосфатидную кислоту (РА), фосфатидилглицерин (PG), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилсерин (PS). Другие подходящие фосфолипиды включают также дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), дистеароилфосфатидилглицерин(DSPG), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), дипальмитоилфосфатидную кислоту (DPPA); димиристоилфосфатидную кислоту (DMPA), дистеароилфосфатидную кислоту (DSPA), дипальмитоилфосфатидилсерин (DPPS), димиристоилфосфатидилсерин (DMPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE). Наиболее предпочтительным липидом является DPPC. Для облегчения или регулирования образования липосом желательно включать в раствор липида стерин. Особенно предпочтительным в этом отношении стерином является холестерин. Холестерин не является необходимым для облегчения формирования липосом, но он улучшает свойства липосом (например, их стабильность).(3) Соотношение скоростей потоков раствора липида и воды. При синхронизации начала и остановки подачи потоков воды и раствора липида соотношение скоростей потоков воды и раствора липида определяет концентрацию растворителя и, следовательно, размер липосом. Чем выше концентрация растворителя, тем крупнее будут образующиеся липосомы. Предпочтительно, чтобы соотношение скоростей потоков воды и раствора липида составляло по меньшей мере 2:1 (что соответствует концентрации органического растворителя не более примерно 33 1/3%), более предпочтительно по меньшей мере 3:1 (что соответствует концентрации органического растворителя не более примерно 25%). Предпочтительно, чтобы соотношение было не выше 19:1. Оно может быть между примерно 19:1 (концентрация органического растворителя составит примерно 5%) и 3 1/3:1 (концентрация органического растворителя составит примерно 30%), более предпочтительно между 9:1 (концентрация органического растворителя составит примерно 10%) и 5:1 (концентрация органического растворителя составит примерно 20%) или между 9:1 и 4:1 (концентрация органического растворителя составит примерно 25%). Соответственно скорость потока воды согласно настоящему изобретению может составлять примерно 1,7 л/мин. Скорость потока липид/растворитель согласно настоящему изобретению может составлять примерно 0,43 л/мин. На практике для данного размера липосом можно установить нужную скорость потока, поскольку соотношение держат постоянным. Например, если желательно готовить липосомы таким образом, чтобы более примерно 99% липосом имели размер менее примерно 200 нм и кон-3 020604 центрация органического растворителя составляла примерно 20%, тогда скорости потоков можно установить при соотношении скорости потока воды и скорости потока раствора липида примерно 4:1, исходя из практических соображений о времени смешивания и объема используемых растворов.(4) Температура липидов. Предпочтительная минимальная температура связана с температурой перехода. Желательно нагреть как воду, так и раствор липида по настоящему изобретению предпочтительно на 10 С или более выше температуры перехода для участвующих компонентов. Таким образом, она может быть на 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более градусов выше температуры перехода. Жидкости можно нагревать в резервуарах для хранения, которые можно заизолировать рубашками для уменьшения потерь тепла. Температура каждой жидкости может быть примерно 40-45 С, примерно 45-50 С, примерно 50-55 С или примерно 55-60 С. Для DPPC предпочтительно держать температуру по меньшей мере 42 С, более предпочтительно по меньшей мере 45 С, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 50 С. Максимальная температура не является критической, но, разумеется, более высокие температуры требуют повышенных затрат энергии. Для DPPC температуру выбирают предпочтительно между примерно 42 и 65 С, более предпочтительно в интервале 45-60 С, наиболее предпочтительно 50-55 С.(5) Охлаждение. Во многих способах требуется охладить массу перед хранением, фильтрацией или другой обработкой. Авторы установили, что при выбранной температуре и концентрации растворителя, необходимых для формирования липосом в данном способе, размер липосом возрастает во времени по мере их образования. Следовательно, если охлаждение проводить в сборнике, размер порции будет влиять на конечный размер липосом, т.к. порции большего размера требуют более длительного охлаждения. Мгновенное охлаждение с помощью теплообменника сразу после образования липосом позволяет регулировать размер липосом и устраняет это препятствие, так что их размер не будет зависеть от величины порции. Для сохранения размера липосом время охлаждения на 20 С не должно превышать 5 ч, например охлаждение от примерно 55 до примерно 35 С проводят менее чем за 5 ч, более предпочтительно примерно от 55 до примерно 30 С менее чем за 2 ч, наиболее предпочтительно примерно от 55 до примерно 30 С менее чем за 30 мин. При желании смесь можно охладить до более низких температур.(6) Постоянный поток одной жидкости в другую. Жидкости по настоящему изобретению, т.е. воду и раствор липида, можно подавать отдельными насосами, каждый из которых отрегулирован на заданную скорость потока, как описано выше, и хранить жидкости в больших многолитровых баках. Например, в качестве резервуара можно использовать бак емкостью до 50 л или более (предпочтительно 200 л) воды для инжекции, из которого подают воду через указанные трубопроводы и Т-образные сочленения, и скорость перекачки можно контролировать с помощью расходомера, установленного на пути воды. Аналогично через аппаратуру можно прокачивать содержимое отдельного многолитрового бака для раствора липид/растворитель, например, емкостью до 50 л или более, и контролировать скорость потока таким же образом. В зависимости от скорости, с которой воду прокачивают через аппаратуру, в исходном резервуаре в течение определенного периода времени убавляется большее или меньшее количество воды. То же самое относится и к резервуару для исходного раствора липида. Поскольку иногда желательно, чтобы скорость потока воды была по меньшей мере примерно в четыре раза выше скорости потока раствора липида, желательно использовать водный резервуар, вмещающий объем воды по меньшей мере в четыре раза больший, чем объем раствора липида. В действительности, однако, бывает период времени, когда в обоих резервуарах достаточное количество жидкости для создания непрерывного потока воды и раствора липида в течение такого времени, когда можно получить максимальное количество липосом нужного размера за единицу времени. "Резервуар" может быть любым сосудом, в котором можно хранить и/или нагревать объемы жидкостей, которые здесь обсуждаются, включая, но не ограничиваясь ими, сосуды из стекла, нержавеющей стали и пластика.(7) Беспрепятственный поток жидкостей и средства, вызывающие турбулентность. Как указано выше, в хорошей установке для подачи раствора липида в поток воды используют два трубопровода, расположенные таким образом, что внутренние пространства обоих трубопроводов открыты один для другого в точке их соединения, т.е. в сочленении, без каких-либо внутренних препятствий, которые ограничивали бы свободное протекание раствора липида через это сочленение. Два потока могут встретиться под любым углом, т.е. трубопроводы, через которые протекают вода и раствор липида соответственно, могут встретиться под углом примерно 90 или менее 90. См. фиг. 1. Поскольку настоящий способ вполне пригоден для целей масштабного промышленного производства, можно использовать трубопроводы любого диаметра в зависимости от соответствующего модифицирования других параметров, таких как скорость потоков и концентрация растворителя согласно настоящему изобретению. Соответственно, трубопроводы по настоящему изобретению могут быть любого диаметра, например примерно 1-20 мм или больше 20 мм. Диаметр можно выбрать на основании анализа скорости потока и эффективности перемешивания. Трубопровод может иметь одинаковый диаметр по всей длине или на одном из его участков. Т.е. для использования типичных "соединяющих деталей", широко применяемых в лабораториях для гибкого-4 020604 соединения стеклянных трубок или кранов и насосов, трубопровод по настоящему изобретению может быть узким с одного конца для того, чтобы его можно было легко вставить в трубу. Два соединяющихся трубопровода могут иметь одинаковый диаметр в точке их сочленения, где встречаются их отверстия. Таким образом, водяной трубопровод может быть уже или шире трубопровода с раствором липида или наоборот. Трубопровод по настоящему изобретению может быть изготовлен из стекла, пластика или металла. Можно использовать трубопроводы, в которых внутренние поверхности содержат ребра, выступы,углубления и зазубрины, которые модулируют поток жидкости во внутреннем пространстве. Если нужно повысить турбулентность среды в точке, где встречаются поток воды и раствор липида, то для облегчения формирования липосом один из таких трубопроводов используют для турбулизации потока воды в месте соединения и в результате индуцирования поперечных усилий выше нормальных. Такие выступы или зазубрины оптимально разместить выше сочленения в водном трубопроводе, а также или вместо этого ниже сочленения, что способствует смешиванию жидкостей.(i) Липосомы. Желательно получать липосомы размером менее 200 нм, поскольку их легко подвергнуть стерилизации путем фильтрации через применяемые в клинической практике фильтры с порами 0,22 мкм. Приготовление липосом согласно настоящему способу с использованием предлагаемой аппаратуры приводит к популяции липосом конкретного максимального размера. В целом размер липосом увеличивается при уменьшении соотношения скоростей потока воды и потока раствора липида и в результате с увеличением концентрации органического растворителя. На размер липосом влияют также другие факторы, такие как температура или используемый органический растворитель. Липосомы, полученные после того, как смесь липид/растворитель сливается и смешивается с водой,затем можно (необязательно) пропустить через охлаждающую рубашку и собрать в отдельном резервуаре. Затем полученные липосомы можно лиофилизировать и позже восстановить хорошо известными способами.(ii) Биоактивные реагенты. Муцин 1 (MUC-1) представляет собой распространенный высокомолекулярный муцин, который содержит полипептидное ядро, состоящее из 30-100 последовательных единиц 20 аминокислот. В составеMUC-1 пептиды, гликопептиды, липопептиды и гликолипопептиды являются особенно важными пептидами, пригодными для включения в липосомы по настоящему изобретению, но настоящее изобретение не ограничено только этими веществами, т.к. в липосомы по настоящему изобретению можно включать и другие пептиды, биоактивные реагенты, лекарства или терапевтические средства. Предпочтительно, чтобы реагент был пептидом (необязательно гликозилированным и/или липидированным), содержащим по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь или по меньшей мере девять последовательных остатков упомянутой повторяющейся последовательности из 20 аминокислот. Следует подчеркнуть, что поскольку это тандемный повтор, выбор первой аминокислоты является в значительной степени произвольным. Предпочтительно,чтобы пептид включал по меньшей мере повторяющуюся последовательность трипептида DTR. Он может включать, например, последовательности PDTRP (АК 13-17 из SEQ ID NO:1), SAPDTRP (АК 11-17 из SEQ ID NO:1), TSAPDTRP (АК 10-17 из SEQ ID NO:1), PDTRPAP (АК 13-19 из SEQ ID NO:1) илиTSAPDTRPAP (АК 10-19 из SEQ ID NO:1). Реагент может включать более одной повторяющейся последовательности и нецелое число повторяющихся последовательностей, например, 1 1/4. Липидирование облегчает включение пептида в липосому. Предпочтительно, чтобы после липидирования пептид включал первую последовательность, которая является фрагментом области тандемного повтора (этот фрагмент может быть меньше, равен или больше единичного повтора), и вторую липидированную последовательность. Предпочтительно, чтобы первая последовательность была последовательностью BLP25 или BLP40 из MUCl, как описано ниже. Предпочтительно, чтобы вторая последовательность была соединена с терминальным атомом углерода первой последовательности и предпочтительно включала не более пяти аминокислот и наиболее предпочтительно две или три аминокислоты. Предпочтительно липидировать от одной до трех аминокислот и предпочтительно, чтобы это были последовательные аминокислоты. Предпочтительно, чтобы липидированные аминокислоты представляли собой независимо Ser, Thr,Asp, Glu, Cys, Tyr, Lys, Arg, Asn или Gln (лучше всего). Предпочтительно, чтобы терминальная аминокислота второй последовательности не была липидирована и предпочтительно представляла собой Gly,Ala, Val, Leu или Ile. Предпочтительно, чтобы липидная группа содержала остатки С 12 (лауриновой), С 14 (миристиновой), C16 (пальмитиновой), С 18 (стеариновой) или С 20 (арахидоновой) кислот. В составе MUC-1 особый интерес представляет липопептид из 27 аминокислот "BLP25". Он состоит из остатков 25 аминокислот в области тандемного повтора белка MUC-1 (т.е. повтор 1 1/4) и терминального расширения в виде С-терминального модификатора из двух аминокислот (KG), в котором KSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP-K(пальмитоил)-G-OH (SEQ ID NO: 1). Другой особенно интересный реагент "BGLP40" представляет собой фрагмент из 40 аа остатков в области тандемного повтора белка MUC-1 и С-терминального модификатора (SSL), который липидирован, как показано ниже (примером является показанное гликозилирование и другие варианты гликозилирования, а также без него):(iii) Другие ингредиенты. Другими пригодными участниками липидного компонента являются гликолипиды и другие липидные адъюванты, такие как монофосфориллипид A (MPLA) или липид А, или синтетические адъюванты,которые могут быть или не быть аналогами природных адъювантов.(iv) Вода. Вода должна быть клинической чистоты.(9) Масштабируемость. Объемы лимитированы только размерами сосуда. Промышленные способы можно регулировать с помощью компьютерной техники. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция, включающая липосомы с размерами в ограниченном интервале, в которой по меньшей мере примерно 90% липосом имеют размер менее чем примерно 200 нм и в которой липосомы дополнительно содержат пептид MUC-1, или гликозилированное, и/или липидированное производное пептида MUC-1, причем композицию получают способом, включающим стадии: создание, по существу, постоянного потока воды,создание, по существу, постоянного потока органического растворителя, содержащего в растворенном виде по меньшей мере один липид и по меньшей мере один пептид MUC-1, причем указанные липиды или липид способны образовывать липосомы,по существу, постоянное смешивание указанного потока воды и указанного потока органического растворителя с образованием смеси,охлаждение указанной смеси и формирование липосом в указанной смеси,причем соотношение скоростей потока воды и потока органического растворителя и скорость охлаждения указанной смеси регулируют таким образом, чтобы получить препарат липосом, в котором по меньшей мере примерно 90% липосом имеют размер менее примерно 200 нм. 2. Композиция по п.1, в которой липосомы содержат фосфолипиды, которые выбирают из группы,состоящей из дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), фосфатидилхолина (PC, лецитин), фосфатидной кислоты (РА), фосфатидилглицерина (PG), фосфатидилэтаноламина (РЕ), фосфатидилсерина (PS), другие пригодные фосфолипиды включают также дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), дистеароилфосфатидилглицерин(DSPG), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), дипальмитоилфосфатидную кислоту (DPPA), димиристоилфосфатидную кислоту (DMPA), дистеароилфосфатидную кислоту (DSPA), дипальмитоилфосфатидилсерин (DPPS), димиристоилфосфатидилсерин (DMPS), дистеароилфосфатидилсерин (DSPS), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE) и дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE). 3. Композиция по п.1, в которой липосомы включают дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC). 4. Композиция по п.1, в которой липосомы дополнительно включают стерин. 5. Композиция по п.1, в которой пептид MUC-1 включает последовательность аминокислот SEQ IDNO: 1. 6. Композиция по п.5, в которой пептид MUC-1 липидирован по лизиновому остатку. 7. Композиция по п.5 или 6, в которой пептид MUC-1 пальмитоилирован. 8. Композиция по п.1, в которой пептид MUC-1 включает последовательность аминокислот SEQ IDNO: 2. 9. Композиция по п.8, в которой пептид MUC-1 липидирован по двум терминальным сериновым остаткам последовательности SEQ ID NO: 2. 10. Композиция по п.8 или 9, в которой пептид MUC-1 гликозилирован. 11. Композиция по любому из пп.1-10, которая является лиофилизированной. 12. Композиция, которая восстановлена из лиофилизированной композиции по п.11. 13. Композиция по п.1, где соотношение скоростей потока воды и потока органического растворителя составляет по меньшей мере примерно 2:1. 14. Композиция по п.1, где скорость охлаждения составляет в среднем по меньшей мере примерно 4 С в час.-6 020604 15. Композиция по п.1, где поток органического растворителя до смешивания имеет температуру по меньшей мере на 10 С выше температуры перехода указанных липидов. 16. Композиция по п.1, где дополнительно включено обеспечение средств для создания турбулентности в потоке воды, в потоке органического растворителя или в потоке смеси, образующейся в результате смешивания. 17. Вакцинный препарат, включающий композицию по п.1, профильтрованную в стерильных условиях. 18. Вакцинный препарат, включающий лиофилизированную композицию по любому из пп.1 или 17. 19. Вакцинный препарат, включающий восстановленную композицию по п.18. 20. Способ получения препарата липосом с размерами в ограниченном интервале, включающий стадии: создание, по существу, постоянного потока воды,создание, по существу, постоянного потока органического растворителя, содержащего в растворенном виде по меньшей мере один липид, причем указанные липид или липиды способны образовывать липосомы,по существу, постоянное смешивание указанного потока воды и указанного потока органического растворителя с образованием смеси,охлаждение указанной смеси и формирование липосом в указанной смеси,причем соотношение скоростей потока воды и потока органического растворителя и скорость охлаждения указанной смеси регулируют таким образом, чтобы получить препарат липосом, в котором по меньшей мере примерно 90% липосом имеют размер менее примерно 200 нм.

МПК / Метки

МПК: C07K 14/775, A61K 9/127

Метки: содержащая, размера, получения, липосомы, композиция, малого, способ

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/9-20604-kompoziciya-soderzhashhaya-liposomy-malogo-razmera-i-sposob-ee-polucheniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Композиция, содержащая липосомы малого размера, и способ ее получения</a>

Похожие патенты