Улучшенные способы приготовления активированного белка с

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Улучшенный способ лиофилизации водного раствора рекомбинантного активированного белка С, включающий осуществление такой лиофилизации при ионной силе выше чем 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3.

2. Способ по п.1, где белок С является активированным белком С человека.

3. Способ по п.2, где величина рН находится в пределах от 5,6 до 6,2.

4. Способ по п.3, где указанный раствор включает хлорид натрия.

5. Способ по п.4, где концентрация хлорида натрия составляет от 200 до 1000 мМ.

6. Способ по п.1, где величину рН поддерживают буфером на основе цитрата натрия.

7. Препарат активированного белка С, полученного лиофилизацией раствора активированного белка С, имеющего ионную силу выше чем 150 мМ и рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3, в отсутствии денатурирующего агента, гиситидина, гидрохлорида лизина или альбумина.

8. Водный раствор рекомбинантного активированного белка С, включающий рекомбинантный активированный белок С, где указанный раствор имеет ионную силу выше чем 150 мМ и рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3 и содержит менее 10% де(1-9)-активированного белка С и де(1-10)-активированного белка С от общего веса белка.

9. Фармацевтический препарат, содержащий рекомбинантный активированный белок С, где указанный препарат содержит менее 10% де(1-9)-активированного белка С и де(1-10)-активированного белка С от общего веса белка.

10. Фармацевтический препарат по п.9, где указанный препарат содержит менее 5% де(1-9)-активированного белка С и де(1-10)-активированного белка С от общего веса белка.

Текст

Смотреть все

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение в общих чертах касается способа снижения автодеградации активированного белка С в процессе приготовления и очистки. Предпосылки для изобретения Белок С, являющийся сериновой протеазой, - это естественно встречающийся антикоагулянт, играющий важную роль в регуляции гомеостаза за счет инактивации факторов Va иVIIIa свертывания крови. Белок С человека в основном вырабатывается в печени в виде единственного полипептида, состоящего из 461 аминокислоты. Эта молекула-предшественник претерпевает множественные посттрансляционные модификации, включая 1) отщепление 42 аминокислотного сигнального участка; 2) протеолитическое отщепление от одной цепи зимогена остатка лизина по 156-му положению и остатка аргинина по 157-му положению с образованием 2-цепочечной формы данной молекулы (т.е. легкая цепь, состоящая из 155 аминокислотных остатков, присоединена через дисульфидный "мостик" к тяжелой цепи, состоящей из 262 аминокислотных остатков, включающей домен собственно сериновой протеазы); 3) карбоксилирование с участием витамина К по 9 остаткам глутаминовой кислоты, которые кластеризованы на начальном 42-аминокислотном участке легкой цепи, в результате чего образуются девять остатков -карбоксиглутаминовой кислоты (GLA); и 4) присоединение углеводных остатков по четырем сайтам (один в составе легкой цепи и три в составе тяжелой цепи). В составе тяжелой цепи находится высококонсервативная для сериновых протеаз трипептидная"триада" - аспарагиновая кислота-257, гистидин 211 и серин-360. Наконец, циркулирующий двухцепочечный зимоген активируется in vivo с участием тромбина на поверхности фосфолипидной мембраны в присутствии иона кальция. Активация происходит в результате отщепления додекапептида от N-конца тяжелой цепи с образованием активированного белка С (абС), обладающего соответствующей каталитической активностью. При взаимодействии с другими белками белок С функционирует, по-видимому, как самый важный негативный регулятор процесса свертывания крови, приводящего к тромбозам. К сожалению, активированный белок С способен саморазрушаться, в результате чего снижается его функциональная активность, как антикоагулянта. В данной области техники определен механизм деструкции активированного белка С: он связан с протеолитическим расщеплением по остатку лизина в 308-м положении тяжелой цепи, в результате чего образуется 111 аминокислотный фрагмент. Этот продукт расщепления обозначается как фрагмент ЕАК. Предыдущие попытки снизить уровень самопроизвольного расщепления были сфокуси 002149 2 рованы на минимизации уровня образования фрагмента ЕАК. Наиболее заметной является заявка на европейский патент 0662513 (Prouty etal.) от 12 июля 1995 г., в которой предлагается минимизировать саморасщепление активированного белка С путем контроля за величиной рН в пределах примерно от 6,3 до 7,0; инкубирования абС в 3 М мочевине; или подвергая абС действию экстремальных солевых условий, которые определяются в пределах выше 0,4 М или ниже 0,05 М. Заявители установили второй важный механизм деградации, связанный с саморасщеплением в N-концевой области легкой цепи, проявляющийся в образовании разрыва с любой из"сторон" от остатка гистидина в 10-м положении. В результате этого механизма расщепления образуются два неактивных продукта. Nконцевое отщепление девяти первых остатков легкой цепи приводит к образованию де(1-9)активированного белка С, а N-концевое отщепление десяти первых остатков легкой цепи приводит к образованию де(1-10)-активированного белка С. Этот механизм расщепления, о котором ранее известно не было, приводит к утрате антикоагулянтной активности из-за удаления функционально ключевых гликозилированных остатков GLA, находящихся в положениях 6 и 7. Следовательно, минимизация уровня образования продуктов разрушения -де(1-9)- и де(1-10)активированного белка С - является важной для получения фармацевтических препаратов,включающих активный высокочистый активированный белок С. Ранее такие варианты продуктов разрушения известны не были, поэтому,очевидно, весьма трудно, если невозможно,удалить их с помощью стандартных процедур очистки. Условия минимизации уровня их образования ранее известны не были. Установление заявителями этого важного механизма саморасщепления активированного белка С позволяет установить и условия получения и обработки с целью повышения чистоты и активности активированного белка С. Заявители показали, что при низком значении рН (например, менее 6,3) механизм самопроизвольного расщепления, приводящий к образованию продуктов де(1-9)- и де(1-10)-абС, преобладает над механизмом деструкции с расщеплением по остаткам 308-309, в то время как применение повышенных концентраций хлорида натрия (более 150 мМ) при рН 6,3 в значительной степени снижает уровень реакции саморасщепления с образованием де(-19)- и де(1-10)-абС. Соответственно, настоящее изобретение представляет способ обработки активированного белка С при ионной силе раствора свыше 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до не более чем 6,3. В таких условиях образование продуктов де(1-9)- и де(1-10)-абС в существенной степени снижено. Таким образом настоящее изобретение представляет способ получения водного раство 3 ра активированного белка С, характеризующегося отсутствием нежелательного саморасщепления. Описание чертежей Фиг. 1 показывает первичную структуру активированного белка С человека и призвана проиллюстрировать описываемые в данном тексте механизмы самопроизвольного расщепления. Применяемая здесь номенклатура основана на нумерации первичной (аминокислотной) последовательности полипептида активированного белка С человека. Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что другие виды активированного белка С могут в незначительной степени варьироваться по своей аминокислотной последовательности, тем самым определяя изменения в применяемой здесь номенклатуре. Резюме изобретения Настоящее изобретение представляет водные растворы активированного белка С и улучшенный способ получения таких растворов,включающий проведение процесса получения при ионной силе раствора выше 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до не более чем 6,3. Также настоящее изобретение представляет способ очистки активированного белка С с помощью хроматографического разделения,включающий элюирование упомянутого активированного белка С в ходе упомянутого хроматографического разделения с применением водной элюции раствором с ионной силой выше 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до не более чем 6,3. Также настоящее изобретение представляет способ концентрирования раствора активированного белка С путем фильтрации, включающий нанесение упомянутого активированного белка С на фильтрующую мембрану в виде водного раствора с ионной силой выше 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до не более чем 6,3. Также настоящее изобретение представляет активированный белок С, полученный с применением описанных здесь способов. Наконец, настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции с активированным белком С, характеризующимся содержанием продуктов де(1-9)-абС и/или де(110)-абС менее 10% по весу. Подробное описание изобретения Все сокращенные обозначения аминокислот, использованные в данной заявке, соответствуют тем, которые приняты Официальной службой патентования и регистрации торговых марок США: они перечислены в п.37 C.F.R.,параграф 1.822 (В) (2). Для целей изложения настоящего изобретения, как описано здесь и использовано в формуле изобретения, определены нижеследующие термины. Понятие "активированный белок С", или 4 крови, так и к рекомбинантному белку С. абС включает в себя и предпочтительно является белком С человека, хотя абС также включают другие виды или производные, обладающие протеолитической, амидолитической, эфиролитической и биологической (антикоагулянтной или профибринолитической) активностью белка С. Примерами производных белка С являются те белки, которые описаны в патенте США 5453373 (Gerlitz et al.) и в патенте США 5516650 (Foster et al.), полное содержание которых включено здесь в виде библиографической ссылки. АРТТ - время частичной активации тромбопластина. Понятие "водный" включает сорастворительные системы, равно как и использование в качестве растворителя только воды. Предпочтительно термин "водный" обозначает использование в качестве растворителя только воду. Понятие "хроматографическое разделение" включает хроматографические методики, известные и применяемые в данной области техники, включая гель-фильтрацию, анионобменную, катион-обменную, гидрофобную хроматографию, хроматографию в обратной фазе и подобное. Понятие "фильтрация в перекрестных потоках" обозначает разделение с помощью тангенциального по отношению к фильтрующей мембране потока таким образом, что продукт либо остается на этой мембране (при концентрировании или повторной фильтрации), либо проходит через мембрану (как в случае с вирусной клиренс-фильтрацией).PC обозначает зимоген белка С. Понятие "приготовление" обозначает отдельные операции, применяемые в производстве активированного белка С, такие как хроматография на колонках, фильтрация (тангенциальная, в перекрестных потоках, до конечной точки), лиофилизация, пампинг или хранение. Аббревиатура "р-абС" обозначает рекомбинантный активированный белок С, полученный путем активации PC in vitro или путем прямой секреции активированной формы белка С прокариотическими клетками, эукариотическими клетками или трансгенными животными,включая, например, секрецию почечными клетками человека линии 293 в виде зимогена, который затем очищают и активируют с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, что продемонстрировано в патенте США 4981952 (Yan) и в заявкеWO 97/20043 (Cottingham). Настоящее изобретение касается улучшенного способа приготовления активированного белка С. Изобретение, в частности, касается приготовления активированного белка С путем обогащения или концентрирования белка и методов белковой очистки, обеспечивающих снижение интенсивности саморазрушения. На 5 стоящее изобретение характеризуется описанием такого приготовления, а особенно таких модификаций процессов обогащения и очистки,проводимых с использованием водного раствора данного белка в таких условиях, которые описаны в данном тексте. Сочетание условий, заявляемых в настоящем изобретении, минимизирует образование вариантов де(1-9)-абС и де 1-10)-абС. С применением известных методик удаление де(1-9)абС и де(1-10)-абС чрезвычайно затруднительно, поэтому желательным является минимизировать образование этих вариантов в ходе производства фармацевтических композиций,включающих активированный белок С. Активированный белок С, полученный в заявляемых условиях, по существу свободен от вариантов де(1-9)-абС и де(1-10)-абС. В целом, фармацевтические композиции, содержащие абС, приготовленный в данных условиях, в существенной степени свободны от де(1-9)-абС и де(1-10)-абС,в целом, включая их менее 10%, предпочтительно менее 8%, более предпочтительно менее 5%, а наиболее предпочтительно - менее 3% этих вариантов по отдельности или вместе в расчете на вес препарата. Лиофилизованные фармацевтические препараты, включающие абС, полученные в заявляемых условиях, проявляют улучшенные показатели стабильности в растворенном виде (до проведения лиофилизации) и стабильности спустя 24-38 ч после реконституции. Уровень утраты функциональности не превышает 5% после 5-дневного хранения при 2-8 С, после 50-часового хранения при 15 С и 40-часового хранения при 25 С. До настоящего изобретения такие показатели стабильности были недостижимы. При тщательном соблюдении величины рН, ионной силы и предпочтительной температуры саморазрушение активированного белка С в водных растворах в ходе приготовления и получения фармацевтических препаратов может быть снижено до уровней, ранее не достигавшихся: в частности, в отсутствие мочевины или других денатурирующих агентов, гистидина,лизингидрохлорида или альбумина. С точки зрения практики настоящего изобретения представляется, что приготовление белка С включает широкий круг отдельных операций, физического разделения и этапов очистки, включая хроматографию и перекрестное фильтрование, например, в связи с очисткой белковой композиции, концентрирование белкового раствора в связи с заменой растворителя,а также вероятные химические и ферментные обработки. Представляемая настоящим изобретением выработка белка, в частности, включает очистку с помощью стандартных хроматографических методов, таких как ион-обменная хроматография, гидрофобная хроматография и подобное, а также концентрирование белка путем ультрацентрифугирования и сходных про 002149 6 цедур. Приготовление белка также должно включать сохранение белкового раствора в специальных резервуарах и подобном, необходимых для приготовления к этапам концентрирования и очистки. Для целей снижения нестабильности весь процесс приготовления раствора активированного белка С, включая различные этапы очистки и концентрирования белка, проводят в условиях, которые описаны в данном тексте. Эти этапы приготовления направлены на то, чтобы обеспечить обязательное выделение данного белка, как правило, в виде лиофилизованного порошка, для использования в приготовлении фармацевтических препаратов. Величина рН в ходе приготовления водного раствора составляет примерно 5,5 и не более чем 6,3. Более предпочтительно она составляет от 5,7 до не более чем 6,3. Еще более предпочтительно величина рН составляет от примерно 5,6 до примерно 6,2. Еще более предпочтительно величина рН составляет от примерно 5,8 до примерно 6,2. Еще более предпочтительно величина рН составляет от примерно 5,9 до примерно 6,1. Наиболее предпочтительной является величина рН примерно 6,0. Буферными системами, пригодными для эффективного поддержания величины рН, являются системы с Трисацетатом, цитратом натрия, цитратом калия,цитрат-глицином и фосфатом натрия. Более предпочтительными являются буферные системы на основе цитрата натрия и фосфата натрия. Наиболее предпочтительная буферная система основана на цитрате натрия. Предпочтительная молярность буферной системы находится в пределах 10-50 мМ. Наиболее предпочтительная молярность составляет 20-40 мМ. Для специалиста в данной области техники понятно, что многие другие буферные системы пригодны с точки зрения того, что они могут быть использованы для поддержания рН в заявляемом диапазоне. Ионная сила приготавливаемых растворов является вторым критическим компонентом настоящего изобретения. Ионная сила в целом определяется добавлением фармацевтически приемлемых солей- предпочтительно хлорида натрия или хлорида калия. Ионная сила предпочтительно превышает или равна 150 мМ, что обеспечивается концентрацией соли свыше 150 мМ в забуференном растворе. Предпочтительно концентрация соли не превышает примерно 1000 мМ,что должно облегчить дальнейшие этапы приготовления. Более предпочтительно концентрация соли находится в диапазоне от примерно 200 мМ до примерно 1000 мМ. Ранее считалось, что концентрации, превышающие 50 мМ и уступающие 400 мМ, являются неприемлемыми. Дополнительным критерием обеспечения минимизированной деструкции является температура. Предпочтительно температура при приготовлении раствора находится в пределах 0 7 10 С, более предпочтительно в пределах 2-8 С,а при выходе за пределы этого температурного интервала имеет место существенное саморасщепление активированного белка С. Однако,кратковременный выход за пределы 10 С может оказаться безопасным с точки зрения сохранения структурной целостности активированного белка С. Концентрация активированного белка С не является критической по настоящему изобретению. Существенно то, что описываемые здесь условия повышают возможность приготовления данного белка при его высоких концентрациях. Предпочтительная концентрация белка составляет от примерно 1 мг/мл до примерно 50 мг/мл,более предпочтительно 1-30 мг/мл, еще более предпочтительно 1-20 мг/мл и наиболее предпочтительно 1-10 мг/мл, хотя и с более высокими, и с более низкими концентрациями также можно работать. Активированный белок С, полученный в соответствии с описанным здесь, пригоден для лечения широкого круга ненаследственных заболеваний, включая внутрисосудистое свертывание крови, включая тромботический шок,тромбофлебит, эмболию легочных сосудов,тромбоз периферических артерий, эмболию,начинающуюся с коронарных сосудов или периферических артерий, острый инфаркт миокарда, рассеивающееся внутрисосудистое свертывание крови и острые пре- и посткапиллярные закупорки, включая трансплантации и тромбоз сетчатки. Активированный белок С в лиофилизованном виде идеально пригоден для включения в состав препаратов с компонентомнаполнителем. В идеале наполнитель выбирают таким образом, чтобы он улучшал стабильность данной молекулы в твердой фазе. Примерами таких наполнителей являются сахароза, трегалоза и раффиноза. Для специалиста в данной области техники должно быть ясно, что и другие наполнители пригодны для использования вместе с активированным белком С. Концентрация наполнителя в фармацевтическом препарате является критической переменной для процесса замораживания-высушивания. Предпочтительным наполнителем является сахароза, концентрация которой в предназначенном для лиофилизации растворе составляет 15-30 мг/мл. Наиболее предпочтительной в предназначенном для лиофилизации растворе является концентрация сахарозы 15 мг/мл при том, что в этом препарате содержится 2,5 мг/мл активированного белка С. Наиболее предпочтительной концентрацией сахарозы в предназначенном для лиофилизации растворе является 30 мг/мл при том, что содержание абС в этом препарате составляет 5,0 мг/мл. Следующие примеры представлены с целью проиллюстрировать и пояснить настоящее изобретение. Масштаб настоящего изобретения 8 не должен рассматриваться как в какой-нибудь степени ограничиваемый этими примерами. Если специально не оговаривается, то все указания частей и процентов являются весовыми, а все значения температуры даны в градусах Цельсия. Подготовительный этап 1 Подготовка белка С человека Рекомбинантный белок С человека (зимоген) был получен в клетках линии 293 почек человека с применением методик, хорошо известных специалистам в данной области техники, изложенных Yan в патенте США 4981952,полное содержание которого включено здесь в виде библиографической ссылки. Ген, кодирующий белок С человека, представлен и защищен патентом США 4775624 (Bang et аl.). Плазмидой, использовавшейся для экспрессии белка С человека в клетках линии 293, являлась плазмида pLPC, которая была описана в патенте США 4992373 (Bang et al.), полное содержание которого включено здесь в виде библиографической ссылки. Конструирование плазмидыpLPC также описано в патентной публикации 0445939 и у Grinnell et al., 1987, Bio/Technology,5,1189-1192, содержание которых также включено в данный текст в виде библиографических ссылок. Вкратце, плазмидой трансфицировали клетки линии 293, затем идентифицировали стабильные трансформанты, субкультивировали их и выращивали в среде, лишенной сыворотки. После ферментации бессывороточную культуральную среду получали с помощью микрофильтрования. Зимоген белка С человека отделяли от культуральной жидкости с применением адаптированной методики, описанной в патенте США 4981952 (Yan), полное содержание которого включено здесь в виде библиографической ссылки. Осветвленную культуральную среду включали в концентрации 4 мМ в EDTA с последующей адсорбцией на анионобменной смоле (Fast-Flow Q, Pharmacia). После промывки четырьмя объемами колонки 20 мМ Трис, 200 мМ NaCl(рН=7,4) и двумя объемами колонки 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl (рН=7,4) связанный рекомбинантный зимоген белка С человека элюировали раствором 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2 (рН=7,4). Элюированный белок характеризовался более чем 95%-ной чистотой,что подтверждается проверкой с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле. Дальнейшую очистку данного белка осуществляли путем приготовления белка 3 М NaCl с последующей адсорбцией на гидрофобную смолу (Toyopearl Phenyl 650 М, TosoHaas),уравновешенную 20 мМ Трис, 3 М NaCl, 10 мМCaCl2 (pH=7,4). Элюированный белок приготавливали для активации путем удаления остаточного кальция. Зимоген пропускали через металлаффинную колонку (Chelex-100, BioRad) с целью удаления кальция и снова связывали с ани 9 онным обменником (Fast-Flow Q, Pharmacia). Обе эти колонки выстраивали в серию и уравновешивали 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 5 мМEDTA (рН= 7,4). После загрузки данного белка колонку Chelex-100 промывали одним объемом колонки того же буфера перед тем, как выключить ее из сформированной серии. Анионобменную колонку промывали тремя объемами уравновешивающего буфера перед элюированием данного белка с помощью 0,4 М NaCl, 29 мМ Трис-ацетата (рН=6,5). Концентрации рекомбинантного белка С человека измеряли по экстинкции при УФ 280 нм - E0,1% = 1,81. Подготовительный этап 2 Активация рекомбинантного белка С человека Бычий тромбин соединяли с активированной-СН-сефарозой 4 В (Pharmacia) в присутствии 50 мМ HEPES, рН=7,5, при 4 С. Реакцию связывания осуществляли на смоле, уже упакованной в колонку с использованием смолы, содержащей примерно 5000 ед. тромбина на 1 мл. Для раствора тромбина обеспечивали циркуляцию по колонке в течение приблизительно 3 ч с последующим добавлением 2-аминоэтанола до концентрации 0,6 мл/л по отношению к циркулирующему раствору. Содержащий 2 аминоэтанол раствор включали в циркуляцию на протяжении еще 10-12 ч для обеспечения полной блокировки непрореагировавших аминов в смоле. После такой блокировки связанную с тромбином смолу промывали 10 объемами колонки 1 М NaCl, 20 мМ Трис (рН=6,5) с целью удаления всего неспецифически связанного белка и использовали для реакции активации после уравновешивания активационным буфером. Очищенный рекомбинантный белок С человека готовили в концентрации 5 мМ в EDTA(с целью хелатирования оставшегося кальция) и разводили до концентрации 2 мг/мл в 20 мМ Трис (рН=7,4) или 20 мМ Трис-ацетате(рН=6,5). Полученный материал пропускали через тромбинсодержащую колонку, уравновешенную при 37 С 50 мМ NaCl и либо 20 мМ Трис (рН=7,4), либо 20 мМ Трис-ацетата(рН=6,5). Скорость потока была доведена таким образом, чтобы полное время контакта рекомбинантного белка С человека и тромбинсодержащей смолы составило 20 мин. Эффлюент собирали и немедленно подвергали тестированию на амидолитическую активность. Если полученный материал не обладал специфической (амидолитической) активностью по сравнению с установленным стандартом активированного белка С, то этот материал подвергали новому циклу обработки на тромбинсодержащей колонке с целью более полной активации рекомбинантного белка С человека. После этого осуществляли разведение в соотношении 1:1 вышеназванным 20 мМ буфером. Антикоагулянтную активность активированного белка С определяют путем измерения увеличения времени свертывания в тесте на оп 002149 10 ределение времени АРТТ (время частичной активации тромбопластина) при свертывании крови. Калибровочную кривую формируют при варьировании концентрации белка С в пределах 125-1000 нг/мл в дилюционном буфере (1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина чистоты"для радиоимунного анализа", 20 мМ Трис, рН= 7,4, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN3,), в то время как образцы готовят в нескольких разведениях в пределах этого диапазона концентраций. В каждую емкость с образцом добавляют 50 мкл холодной лошадиной плазмы и 50 мкл реагента(АРТТ Reagent, Sigma) и инкубируют при 37 С в течение 5 мин. После инкубации в каждую емкость добавляют по 50 мкл соответствующих образцов или стандартов. Для определения исходного времени свертывания используют чистый дилю-ционный буфер вместо образца или стандарта. Таймер фиброметра (СоА ScreenerHemostasis Analyzer, American Labor) запускают сразу после добавления в каждый образец или стандарт 50 мкл нагретого до 37 С 30 мМ CaCl2. Концентрацию активированного белка С в образцах определяют по линейному уравнению регрессии для калибровочной кривой. Время свертывания определяют как среднее по крайней мере по трем повторностям, включая образцы для калибровочной кривой. Концентрации рекомбинантного активированного белка С определяли по параметрам экстинкции в УФ 280 нм Е 0,1% = 1,85. Пример 1. Хроматографическое отделение абС Раствор абС, характеризующийся проводимостью на уровне приблизительно 14 мМо(1410-3 см) и величиной рН=5,7, был помещен на колонку 9,5 х 9 см (соотношение высоты и диаметра) быстротечной S-сефарозы с катионобменной смолой, последовательно соединенной с колонкой размером 25 х 14 см (соотношение высоты и толщины) быстротечной Qсефарозы с анион-обменной смолой. Обе колонки предварительно уравновешивали 20 мМ цитрата натрия (рН=6,0), 150 мМ NaCl. Колонку загружали 10 г абС в расчете на 1 л анионобменной смолы. Колонку промывали более чем двумя объемами колонки уравновешивающим буфером и постепенно выполняли элюцию 20 мМ цитрат натрия (рН=6,0), 400 мМ NaCl. Все операции были осуществлены при 2-8 С и линейной скорости потока 60 см/ч. Хотя абС проявлял высокий уровень активности (539 ед./мг в тесте на АРТТ) и оказался весьма концентрированным в процессе хроматографии (более 20 г/л в точке пика) и в условиях агрегированного потока (10 г/л), полученный продукт оставался стабильным. Эти данные были подтверждены путем масс-спектроскопии с восстановлением или невосстановлением протеазного расщепления легкой цепи, которые показали отсутствие выявляемых изоформ(2%), которые бы включали эндопротеолитическое расщепление по положению 308/309, как 11 и отсутствие вариантов де(1-9)-абС и де(1-10)абС ( 5%). Пример 2. Вирусная фильтрация Активированный белок С (4 мг/мл) в буфере с 20 мМ Трис, 150 мМ Nacl и 20 мМ EDTA фильтруют с использованием проточной тангенциальной фильтрации (мембрана MilliporeVirusolve 180). Пропускание абС через этот фильтр облегчается использованием диафильтрационного буфера. Диафильтрационный буфер включает 20 мМ цитрата натрия и 150 мМ NaCl. Раствор (10 л), 4 мг/мл абС в буфере с 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl и 20 мМ EDTA отфильтровывали. Буфер с цитратом натрия и хлоридом натрия использовали в качестве диафильтрационного буфера с целью получения конечного объема раствора абС в количестве 21,5 л. Пример 3. Лиофилизация Раствор приготавливали в ампуле путем добавления соответствующего количества сахарозы, хлорида натрия и цитрата натрия к заранее определенному количеству рекомбинантного активированного белка С с выходом 2,5 мг/мл абС, 15 мг/мл сахарозы, 325 мМ хлорида натрия и 20 мМ цитрата натрия при рН=6,0. Раствор лиофилизуют с использованием стандартной лиофильной сушки с получением ампул, содержащих лиофилизованный абС, пригодный для последующего восстановления и введения пациенту. Лиофилизованные препараты содержат менее 10% де(1-9)-абС и де(1-10)абС. Пример 4. Лиофилизация Раствор приготавливали в ампуле путем добавления соответствующего количества сахарозы, хлорида натрия и цитрата натрия к заранее определенному количеству рекомбинантного активированного белка С с выходом 5 мг/мл абС, 30 мг/мл сахарозы, 650 мМ хлорида натрия и 40 мМ цитрата натрия при рН=6,0. Раствор лиофилизуют с использованием стандартной лиофильной сушки с получением ампул, содержащих лиофилизованный абС, пригодный для последующего восстановления и введения пациенту. Лиофилизованные препараты содержат менее 10% де(1-9)-абС и де(1-10)-абС. Принципы, предпочтительные варианты и пути применения настоящего изобретения были представлены в предшествующих конкретных описаниях. Однако настоящее изобретение, 002149 12 представленное здесь к патентной защите, не должно рассматриваться как ограниченное конкретными описанными вариантами, поскольку они являются более иллюстративными, нежели ограничивающими. Изменения и модификации могут быть произведены специалистом в данной области техники без отхода от духа настоящего изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Улучшенный способ лиофилизации водного раствора рекомбинантного активированного белка С, включающий осуществление такой лиофилизации при ионной силе выше чем 150 мМ и при рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3. 2. Способ по п.1, где белок С является активированным белком С человека. 3. Способ по п.2, где величина рН находится в пределах от 5,6 до 6,2. 4. Способ по п.3, где указанный раствор включает хлорид натрия. 5. Способ по п.4, где концентрация хлорида натрия составляет от 200 до 1000 мМ. 6. Способ по п.1, где величину рН поддерживают буфером на основе цитрата натрия. 7. Препарат активированного белка С, полученного лиофилизацией раствора активированного белка С, имеющего ионную силу выше чем 150 мМ и рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3, в отсутствии денатурирующего агента, гиситидина, гидрохлорида лизина или альбумина. 8. Водный раствор рекомбинантного активированного белка С, включающий рекомбинантный активированный белок С, где указанный раствор имеет ионную силу выше чем 150 мМ и рН от примерно 5,5 до менее чем 6,3 и содержит менее 10% де(1-9)-активированного белка С и де(1-10)-активированного белка С от общего веса белка. 9. Фармацевтический препарат, содержащий рекомбинантный активированный белок С,где указанный препарат содержит менее 10% де(1-9)-активированного белка С и де(1-10)активированного белка С от общего веса белка. 10. Фармацевтический препарат по п.9, где указанный препарат содержит менее 5% де(1-9)активированного белка С и де(1-10)активированного белка С от общего веса белка.

МПК / Метки

МПК: C12N 9/50, C07K 14/745, C12P 21/06, A61K 38/48, A61P 7/02

Метки: улучшенные, способы, белка, активированного, приготовления

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/8-2149-uluchshennye-sposoby-prigotovleniya-aktivirovannogo-belka-s.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Улучшенные способы приготовления активированного белка с</a>

Похожие патенты