Пептидное соединение с антимикробной активностью, полученное из bacillus clausii, и его применение

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Пептидное соединение, которое имеет антимикробную активность и может быть получено культивированием Bacillus clausii в подходящей питательной среде вплоть до споруляции, сбором супернатанта от культивирования после центрифугирования и фильтрации и экстракцией фракции с антимикробной активностью, где указанное соединение характеризуется следующей аминокислотной формулой:

Рисунок 1

в которой Dhb представляет дидегидроаминобутират;

Dha представляет дидегидроаланин и

Abu представляет аминобутират.

2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно имеет молекулярный вес 2107,5 Да.

3. Соединение по п.1 или 2, отличающееся тем, что аминокислотные остатки являются энантиомерами L формы.

4. Способ получения соединения по любому из пп.1-3, который включает следующие стадии:

культивирование штаммов Bacillus clausii в подходящей питательной среде вплоть до споруляции штаммов;

сбор супернатанта из культивирования после центрифугирования и фильтрации;

экстракция твердой фазой полученной фракции и элюирование;

очистка полученной фракции высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), при необходимости.

5. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного продукта, предназначенного для лечения и/или профилактики кишечных нарушений или инфекционных болезней.

6. Применение по п.5 для лечения и/или профилактики кишечного дисбиоза и эндогенного витаминого нарушения для восстановления кишечной бактериальной флоры, измененной в результате антибиотикотерапии или химиотерапии, для лечения и профилактики диареи, в частности острой диареи или диареи, связанной с использованием лекарственных продуктов.

7. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве добавки в косметических или пищевых препаратах.


Текст

Смотреть все

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Изобретение относится к пептидному соединению с биологической активностью,которое, в частности, обладает антимикробными свойствами, которое включает аминокислотную последовательность: Phe-Dhb-Ala-Val-Dha-Phe-Ala-Abu-Pro-Gly-Ala-Gly-GluDhb-Gly-Ala-Phe-Asn-Ala-Phe-Ala, где Dhb представляет дидегидроаминобутират; Dha представляет дидегидроаланин; Abu представляет аминобутират, а также к способу получения такого соединения и его применению. 015943 Настоящее изобретение относится к пептидному соединению с биологической активностью, в частности, обладающему антимикробными свойствами, его получению и к его применениям. Известно, что определенные живые микроорганизмы, когда вводятся людям или животным, способны оказывать благоприятное воздействие на здоровье организма, в частности, продуцируя антимикробные вещества. Такие организмы обычно называют пробиотическими организмами. Многочисленные исследования показали благоприятные воздействия этих пробиотических организмов на людей или животных, в особенности при лечении желудочно-кишечных нарушений, таких как диарея, острая диарея и диарея, связанная с использованием лекарственных препаратов. Пробиотические организмы, наиболее изученные до настоящего времени, являются молочнокислыми бактериями, но было также сообщено, что другие живые организмы могут иметь благоприятное воздействие на здоровье. Эти другие организмы включают, например, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, Bacillus clausii, Bacillus polyfermentans. Среди них Bacillus clausii использовались много лет в фармацевтическом препарате, продаваемом под тортовой маркой Enterogermina. Этот фармацевтический препарат предназначен, в частности, для борьбы с желудочно-кишечными нарушениями и включает смесь четырех штаммов Bacillus clausii. Антимикробная биологическая активность этих пробиотических организмов обычно связана с естественным продуцированием соединений с антимикробной активностью, таких как лантибиотики. Таким образом, штаммы Bacillus clausii, Streptomyces mutans, Lactococcus lactis продуцируют соответственно субтилин, мутацины и низины соответственно. Многочисленные антибиотики используются в настоящее время как терапевтические вещества для лечения инфекционных болезней, но болезнетворные организмы становятся все более устойчивыми к фармацевтическим препаратам, которые используются. Некоторые из них, как уже известно, "устойчивы ко многим препаратам", и иногда чрезвычайно трудно лечить инфекции, которые они вызывают. Поэтому постоянно разыскиваются новые молекулы, имеющие антибиотические свойства. Цель изобретения состоит в том, чтобы удовлетворить этому требованию, предлагая соединение с антимикробной активностью, полученное из Bacillus clausii. Первый объект изобретения относится к соединению с антимикробной активностью. Второй объект изобретения относится к способу получения соединения с антимикробной активностью по изобретению. Третий объект изобретения относится к фармацевтическому препарату, содержащему соединение с антимикробной активностью по изобретению. Четвертый объект изобретения относится к использованию соединения с антимикробной активностью по изобретению. Согласно первому аспекту изобретение относится к соединению с антимикробной активностью. Таким образом, молекула, продуцируемая Bacillus clausii, которая показывает антимикробную активность, была выделена и охарактеризована. Соединение по изобретению с антимикробной активностью имеет природу пептида и может быть получено из культуры Bacillus clausii в подходящей питательной среде вплоть до споруляции, сбора супернатанта культуры после центрифугирования и фильтрации и экстракции фракции с антимикробной активностью и соединение включает следующую последовательность аминокислот и аминокислотных производных: Phe-Dhb-Ala-Val-Dha-Phe-Ala-Abu-Pro-Gly-Ala-Gly-Glu-Dhb-Gly-Ala-Phe-Asn-Ala-Phe-Ala,в которой Dhb представляет собой дидегидроаминобутират; Dha представляет собой дидегидроаланин;Abu представляет собой аминобутират. Соединение по изобретению, которое является, главным образом, активным против грамположительных бактерий, может быть получено из Bacillus clausii и имеет молекулярную массу 2107,5 Да, определенную масс-спектрометрией с лазерно-десорбционной ионизацией в присутствии матрицы и с времяпролетным масс-анализатором с ионизацией электрораспылением (метод MALDI TOF и ESI). Согласно другой характеристике соединение по изобретению является лантибиотиком и имеет лантиониновые мостики и измененные аминокислоты в пептидной последовательности. Соединение по изобретению обладает двумя лантиониновыми мостиками, один между аланином в положении 3 и аланином в положении 7 и другой между аланином в положении 16 и аланином в положении 21. Кроме того, метил-лантиониновый мостик присутствует между остатком аминобутирата в положении 8 и аланином в положении 11. Четвертый мостик присутствует между С-концевой группой аминовинилцистеина и остатком аланина в положении 19. Представленное с имеющимися мостиками соединение по изобретению имеет следующую последовательность: в которой Dha, Dhb и Abu определены выше. Согласно второму аспекту изобретение относится к способу получения соединения с антимикробной активностью по изобретению. Согласно изобретению соединение по изобретению может быть извлечено из Bacillus clausii следующим способом. Способ получения соединения по изобретению включает стадии культивирования штаммов Bacillus clausii в подходящей питательной среде вплоть до споруляции штаммов; сбор супернатанта от культивирования после центрифугирования и фильтрации; экстракции полученной фракции твердой фазой и элюирование. В случае необходимости, полученная фракция, которая соответствует молекуле изобретения, может быть очищена высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Согласно другому варианту соединение по изобретению может быть получено обычным химическим синтезом, способами, известными специалисту в технологии. Соединение по изобретению показывает антимикробную активность против грамположительных бактерий. В частности, оно показало антимикробную активность против S. aureus, Enterococcus faecium,Micrococcus sp., Lactococcus lactis, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes и грамположительных бактерий ротовой полости. Вследствие его лантиобиотического характера соединение по изобретению может показать более широкий спектр биологической активности, например противовирусной, противопаразитарной или иммуномодулирующей активности. Следовательно, соединение по изобретению может применяться для приготовления лекарственных продуктов. Таким образом, согласно другому аспекту изобретение относится к лекарственным продуктам, которые содержат соединение по изобретению. Эти лекарственные продукты находят применение в терапии, в частности при лечении и профилактике инфекционных болезней. Эти лекарственные продукты также находят применение при лечении и (или) профилактике кишечных нарушений, например при лечении и профилактике кишечного дисбиоза и эндогенного витаминного нарушения, так же как при дополнительном лечении для восстановления кишечной бактериальной флоры, которая была изменена в результате антибиотикотерапии или химиотерапии. Они также находят применение при профилактике и лечении диареи, в частности специфической острой диареи и диареи, связанной с использованием лекарственных продуктов. Согласно другому аспекту изобретение относится к фармацевтическим препаратам, включающим как действующее начало соединение по изобретению для лечения и (или) профилактики патологий, описанных выше. Эти фармацевтические препараты содержат эффективную дозу соединения по изобретению, так же как по меньшей мере один фармацевтически эффективный эксципиент. Указанные эксципиенты выбирают согласно фармацевтической форме и желаемого пути введения из традиционных эксципиентов, которые известны специалисту в технологии. В фармацевтических препаратах по настоящему изобретению для перорального, подъязычного,подкожного, внутримышечного, внутривенного, топического, местного, эндотрахеального, носового,трансдермального или ректального введения, соединение может применяться в дозировочных единицах,смешанное с обычными фармацевтическими инертными наполнителями для введения животным и людям для профилактики или для лечения упомянутых выше нарушений или болезней. Соответствующие дозировочные единицы включают формы для перорального пути введения, такие как таблетки, мягкие или твердые капсулы, порошки,гранулы и пероральные растворы или суспензии; подъязычные, защечные, эндотрахеальные, внутриглазные, носовые и формы ингаляционного введения; местные, трансдермальные, подкожные, внутримышечные или внутривенные формы введения; ректальные формы введения, и имплантаты. Для местного применения соединения по изобретению могут использоваться в кремах, гелях, мазях или лосьонах. Композиция по изобретению может вводиться наиболее подходящим путем и в дозе, которая зависит, в частности, от природы инфекции, от типа рассматриваемого организма, от возраста организма,веса и общего состояния, от получаемого сопутствующего лечения, так же как от реакции организма на лечение и от терапевтического обоснования.-2 015943 В общем для введения людям препарат применяется перорально в форме фармацевтического препарата спор. Например, доза может составлять приблизительно 10109 спор ежедневно, например от 1 до 8109 спор ежедневно, в частности 2,4 или 6109 спор ежедневно, в единственной дозе или в нескольких дозах. Могут быть особые случаи, в которых более высокие или более низкие дозы являются адекватными; такие дозы также представляются в рамках изобретения. Согласно другому из его аспектов изобретение относится к применению соединения по изобретению для получения лекарственного продукта, предназначенного для профилактики и (или) лечения патологий, описанных выше. Согласно другому из его аспектов изобретение также относится к методу лечения вышеизложенных патологий, который включает введение больному эффективной дозы соединения по изобретению. Согласно другому аспекту соединение по изобретению может также использоваться как добавка в косметических и пищевых препаратах. Согласно этому применению соединение по изобретению добавляют в количестве, достаточном,чтобы ингибировать увеличение бактериального роста в косметическом или пищевом препаратах и, таким образом, обеспечить их сохранение. Примеры, данные ниже, иллюстрируют изобретение, хотя не ограничивают его. 1. Получение молекулы. Получение супернатанта. Штамм О/С Bacillus clausii (полученный из фармацевтического препарата, продаваемого под торговой маркой Enterogermina) культивируют в течение трех дней на питательной среде Mueller Hinton при 37 С и 180 об/мин до тех пор, пока споруляция штамма не будет иметь место. Культуру затем центрифугируют и супернатант фильтруют с использованием мембраны с размером пор 0,45 мкм, чтобы удалить любые остаточные клетки. Экстракция. Соединение с антимикробной активностью экстрагируют на твердой фазе на патроне Sep Pak plusC18 (Waters). Для этого 150 мл супернатанта, полученного в предыдущей стадии, наносят на патрон и элюируют 100%-ным метанолом после трех последовательных промывок с помощью 25 мМ NH4HCO3,рН 8; 25 мМ NH4HCO3, рН 8+10%-ный метанол и 25 мМ NH4HCO3, рН 8+50%-ный метанол. Все активные фракции, элюированные 100%-ным метанолом, объединяют и концентрируют вакуумным испарением до тех пор, пока не получают фактор сокращения объема 10. Концентрат хранят при -20 С. Никакой потери активности не наблюдалось после 6 месяцев хранения в этих условиях. Очистка. Очистку до состояния гомогенности вещества, извлеченного твердой фазой, выполняют ВЭЖХ. Первую полупрепаративную стадию выполняют на колонне С 4 Synchropack 1008 мм. Фракции элюата, которые показывают антимикробную активность, собирают и объединяют. Чистота соединения,полученного в конце этой стадии, больше 80% и выход в экстракции-очистке составляет приблизительно 6 мг I-1 супернатанта. Вторую аналитическую стадию выполняют на колонне С 1 Bischoff 1504,6 мм. Фракции элюата,которые показывают антимикробную активность, собирают и объединяют. Чистота соединения, полученного в конце этой стадии, больше 90%. 2. Структурное исследование. Определение веса молекулы. Очищенное соединение, полученное в примере 1 выше, имеет молекулярный вес 2107,5 Да, определенный масс-спектрометрией, используя метод MALD TOF, и подтвержденный масс-спектрометрией,используя метод ESI. УФ/видимый спектр поглощения. Соединение по изобретению поглощает в ультрафиолете и имеет, в частности, пик при 265 нм, совместимый с наличием ароматических аминокислот в его структуре. Аминокислотный состав. После полного гидролиза под действием 5,7N HCl, под вакуумом, в течение 16 ч при 115 С, наличие различных аминокислот определяют в структуре очищенного соединения. Исследование различных энантиомерных форм аминокислот. Энантиомерные L и D формы аминокислот, которые составляют последовательность соединения с антимикробной активностью, были исследованы после полного кислотного гидролиза, дериватизацией с(J. Chromato., 1988, 444, с. 115-122). Результаты указывают, что все остатки аминокислот, которые составляют антибиотическую молекулу, являются энантиомерами L формы.-3 015943 Влияние ферментативных или химических обработок на структуру. Полная потеря активности после ферментативной обработки проназой подтверждает пептидный характер нового антибиотического соединения. Дисульфидные мостики исключаются, так как цистеин-специфический анализ оказался отрицательным. Напротив, наличие лантиониновых мостиков, чувствительных к восстановительной обработке в щелочной среде (Meyer, Anal. Biochem, 223, с. 185-190, 1994), может объяснить потерю активности, наблюдаемую в присутствии -меркаптоэтанола после структурной модификации, обнаруженной ВЭЖХ с обращенными фазами. Снижение, только частичное, в активности, измеренное в конце менее интенсивной обработки, такой как инкубация при нейтральном рН в присутствии 25 мМ дитиотреитола (DTT),может быть результатом определенного восстановления дидегидроаминокислот, присутствующих в структуре. Эти наблюдения позволяют сформулировать гипотезу, согласно которой антимикробная молекула, произведенная Bacillus clausii, является лантибиотиком. Это семейство антибиотиков обычно характеризуется наличием лантиониновых мостиков и модифицированных аминокислот в их структуре. Секвенирование природной молекулы. Секвенирование выполнено с использованием автоматического секвенатора Procise 492 A (AppliedBiosystem), посредством ступенчатой деградации Эдмана, начиная с N-конца. Полученные фенилтиогидантоиновые (ФТГ) производные аминокислоты анализируют с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами на микроколонке CI8. Секвенирование антибиотической молекулы, в естественном состоянии, блокируют в конце первой стадии химической деградации Эдмана. Единственный идентифицированный остаток соответствует фенилаланину, который занимает N-концевое положение. Секвенирование молекулы после химической модификации. Информация, касающаяся потенциальной последовательности нового антимикробного вещества,произведенного Bacillus clausii, полученная из последовательности кодирующего гена, соединенная с информацией, полученной из анализа аминокислотного состава и из поведения в восстанавливающей среде, показывает наличие посттрансляционных модификаций, характерных для лантибиотиков. Наличие дидегидроаминокислот и лантиониновых мостиков в структуре является началом блокирования секвенирования молекулы в естественном состоянии. Дегидроаминокислоты, такие как Dha (дидегидроаланин) и Dhb (дидегидроаминобутират), дезаминируются во время химической деградации Эдмана и, таким образом, блокируют прогресс секвенирования. Эти те же самые остатки Dha и Dhb не обнаруживаются анализом аминокислотного состава после полного кислотного гидролиза по тем же самым причинам, а их дезаминирование делает неэффективной реакцию дериватизации с 6-аминохинолил-Nгидроксисукцинимидил карбаматом (AQC) (Waters), специфической для функции первичного амина. С целью преодоления проблем, связанных с присутствием модифицированных аминокислот и лантиониновых мостиков, двойная химическая реакция была применена к пептидному антибиотику до его секвенирования. Используемый метод был заимствован из работы Смита (Smith), Eur. J. Biochem. 2000,267, p. 6810-6816. С этой целью 50 нмоль очищенного пептида загружают в 10 мкл H2O+4 мг NaBH4. Добавляют 190 мкл раствора для денатурирования с антиоксидантом (570 мг хлорида гуанидина+0,1 мл Nэтилморфолина, доведенного водой H2O до рН 8,5 к конечному объему 1 мл), затем реакционную смесь культивируют в потоке N2 в течение 72 ч при 37 С. Эта обработка специфично восстанавливает дидегидроаминокислоты, не повреждая лантиониновые мостики. Таким образом, восстановленный пептид выделяют на колонке Prosorb (Perkin Elmer), снабженной мембраной PVDF. После промывки мембраны 200 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФК), пептид,адсорбированный на этой подложке, подвергают второму восстановлению в присутствии этантиола, добавление 20 мкл раствора, включающего 280 мкл метанола+200 мкл H2O+65 мл NaOH+60 мкл этантиола,в течение 1 ч при 50 С. Ковалентная структура антибиотической молекулы, произведенной Bacillus clausii. Ковалентная структура находится в согласии со всеми полученными данными. Молекулярная масса, вычисленная на основе масс моноизотопных остатков, составляет 2107,5 Да. Антимикробная молекула, секретируемая Bacillus clausii, является лантибиотиком, обладающим 4 лантиониновыми мостиками и метил-лантионином, так же как 3 остатками дидегидроаминокислоты, в структуре. Структура находится в согласии с найденной массой, 2107,5 Да, с результатами, полученными после выполнения химических модификаций на молекуле, и с последовательностью аминокислот, выведенной на основе гена, который кодирует ее продукцию, найденного в В. clausii. Структура была подтверждена анализом ЯМР. Другие три штамма (N/R, SIN, T) Bacillus clausii, присутствующие в фармацевтическом препаратеEnterogermina, показали тот же самый профиль антимикробной активности, как штамм О/С. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Пептидное соединение, которое имеет антимикробную активность и может быть получено культивированием Bacillus clausii в подходящей питательной среде вплоть до споруляции, сбором супернатанта от культивирования после центрифугирования и фильтрации и экстракцией фракции с антимикробной активностью, где указанное соединение характеризуется следующей аминокислотной формулой:Abu представляет аминобутират. 2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что оно имеет молекулярный вес 2107,5 Да. 3. Соединение по п.1 или 2, отличающееся тем, что аминокислотные остатки являются энантиомерами L формы. 4. Способ получения соединения по любому из пп.1-3, который включает следующие стадии: культивирование штаммов Bacillus clausii в подходящей питательной среде вплоть до споруляции штаммов; сбор супернатанта из культивирования после центрифугирования и фильтрации; экстракция твердой фазой полученной фракции и элюирование; очистка полученной фракции высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), при необходимости. 5. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного продукта, предназначенного для лечения и/или профилактики кишечных нарушений или инфекционных болезней. 6. Применение по п.5 для лечения и/или профилактики кишечного дисбиоза и эндогенного витаминого нарушения для восстановления кишечной бактериальной флоры, измененной в результате антибиотикотерапии или химиотерапии, для лечения и профилактики диареи, в частности острой диареи или диареи, связанной с использованием лекарственных продуктов. 7. Применение соединения по любому из пп.1-3 в качестве добавки в косметических или пищевых препаратах.

МПК / Метки

МПК: C07K 14/45

Метки: антимикробной, bacillus, применение, активностью, полученное, clausii, пептидное, соединение

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/6-15943-peptidnoe-soedinenie-s-antimikrobnojj-aktivnostyu-poluchennoe-iz-bacillus-clausii-i-ego-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Пептидное соединение с антимикробной активностью, полученное из bacillus clausii, и его применение</a>

Похожие патенты