Рекомбинантные мультимерные белковые комплексы, связанные с масляными тельцами, способы получения указанных комплексов и масляных телец и содержащие их продукты и композиции

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ получения масляного тельца, связанного с биологически активным рекомбинантным мультимерным белковым комплексом, включающий:

(a) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого рекомбинантного полипептида и второго рекомбинантного полипептида, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса; и

(b) связывание указанного биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным масляным тельцем и указанным первым рекомбинантным полипептидом,

причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.

2. Способ по п.1, в котором указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.

3. Способ по п.2, в котором указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.

4. Способ обеспечения экспрессии в клетке биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, содержащего первый и второй рекомбинантные полипептиды, включающий:

(a) введение в клетку первой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:

(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию первого рекомбинантного полипептида в указанной клетке, функционально связанную со

(ii) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид;

(b) введение в указанную клетку второй химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:

(i) третью последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию второго рекомбинантного полипептида в указанной клетке, функционально связанную с

(ii) четвертой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид; и

(c) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных первого и второго рекомбинантных полипептидов в клетке-потомке, содержащей масляные тельца, где указанный первый рекомбинантный полипептид и указанный второй рекомбинантный полипептид способны образовывать биологически активный рекомбинантный мультимерный белковый комплекс;

причем указанный первый рекомбинантный полипептид связывается с масляным тельцем через нацеливающий на масляное тельце белок, способный связываться с указанным масляным тельцем и указанным первым рекомбинантным полипептидом, и

причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.

5. Способ по п.4, в котором указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.

6. Способ по п.5, в котором указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.

7. Способ получения в растении биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающий:

(a) получение первого растения, клетки которого содержат масляные тельца и первый рекомбинантный полипептид, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок;

(b) получение второго растения, клетки которого содержат масляные тельца и второй рекомбинантный полипептид; и

(c) половое скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением с получением растения-потомка, клетки которого содержат масляные тельца, где указанные масляные тельца способны связываться с указанным первым рекомбинантным полипептидом, а указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.

8. Способ по п.7, в котором указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.

9. Способ по п.8, в котором указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.

10. Химерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая биологически активный мультимерный слитый белок, содержащая:

(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нацеливающий на масляные тельца белок, функционально связанную в рамке считывания со

(b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, связанной в рамке считывания с

(с) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать биологически активный мультимерный слитый белок,

причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного мультимерного слитого белка, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.

11. Химерная последовательность нуклеиновой кислоты по п.10, где указанный биологически активный мультимерный слитый белок представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.

12. Химерная последовательность нуклеиновой кислоты по п.11, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.

13. Биологически активный рекомбинантный мультимерный слитый белок, содержащий:

(i) нацеливающий на масляные тельца белок или его фрагмент,

(ii) первый рекомбинантный полипептид и

(iii) второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать биологически активный мультимерный слитый белок,

причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного мультимерного слитого белка, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.

14. Рекомбинантный мультимерный слитый белок по п.13, где указанный биологически активный рекомбинантный мультимерный слитый белок представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.

15. Рекомбинантный мультимерный слитый белок по п.14, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.

16. Выделенные масляные тельца, содержащие биологически активный мультимерный белковый комплекс, содержащий:

(i) нацеливающий на масляные тельца белок и

(ii) первый рекомбинантный полипептид,

причем указанные масляные тельца дополнительно содержат второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать биологически активный мультимерный белковый комплекс,

причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активнюую мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.

17. Выделенные масляные тельца по п.16, где указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.

18. Выделенные масляные тельца по п.17, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.

19. Выделенные масляные тельца, содержащие:

(a) первый слитый белок, содержащий первый нацеливающий на масляные тельца белок, слитый с первым рекомбинантным полипептидом; и

(b) второй слитый белок, содержащий второй нацеливающий на масляные тельца белок, слитый со вторым рекомбинантным полипептидом,

причем указанный первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать биологически активный мультимерный белковый комплекс и причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.

20. Выделенные масляные тельца по п.19, где указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.

21. Выделенные масляные тельца по п.20, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.

22. Растительная клетка, содержащая масляные тельца по п.16.

23. Клетка по п.22, где указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.

24. Клетка по п.23, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.

25. Композиция, содержащая выделенные масляные тельца по п.16, тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу.

26. Композиция, содержащая выделенные масляные тельца по п.19, тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу.

27. Пищевой продукт, содержащий композицию по п.25 или 26.

28. Продукт для личной гигиены, содержащий композицию по п.25 или 26.

29. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по п.25 или 26.

30. Способ уменьшения аллергенности пищевых продуктов, включающий стадии получения выделенных масляных телец по п.16 или 19 и добавления выделенных масляных телец в пищевые продукты, посредством чего аллергенность пищевых продуктов уменьшается.

31. Способ восстановления мишени, включающий стадии получения биологически активного рекомбинантного мультимерного слитого белка по п.13 и контактирования биологически активного рекомбинантного мультимерного слитого белка с мишенью, где мишень является чувствительной к окислительному стрессу.

32. Способ получения ферментативно активного редокс-комплекса, связанного с масляными тельцами, включающий:

a) получение в клетке слитого редокс-белка, содержащего первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком;

b) связывание указанного слитого редокс-белка с масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным слитым редокс-белком и указанными масляными тельцами; и

c) выделение указанных масляных телец, связанных с указанным слитым редокс-белком.

33. Химерная нуклеиновая кислота, содержащая:

1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию второй нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, функционально связанную со

2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида к масляному тельцу, связанную с

(ii) последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, содержащий первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком, функционально связанной с

3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию указанной второй нуклеиновой кислоты в указанной клетке,

причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго редокс-белков с образованием биологически активного рекомбинантного слитого редокс-полипептида, включающего первый и второй редокс-белки.

34. Способ получения биологически активного редокс-комплекса, связанного с масляными тельцами, включающий:

a) введение в клетку химерной последовательности нуклеиновой кислоты по п.33;

b) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного слитого редокс-белка в клетке-потомке, содержащей масляные тельца; и

с) выделение из указанной клетки-потомка указанных масляных телец, содержащих указанный слитый редокс-белок,

причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго редокс-белков с образованием биологически активного редокс-комплекса, включающего первый и второй редокс-белки.

35. Трансгенное растение, содержащее химерную нуклеиновую кислоту по п.33.

36. Растение Carthamus tinctorius, содержащее химерную нуклеиновую кислоту по п.33.

37. Семя растения, содержащее химерную нуклеиновую кислоту по п.33.

38. Семя Carthamus tinctorius, содержащее химерную нуклеиновую кислоту по п.33.

39. Ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, полученный способом по п.32.

40. Пищевой продукт, содержащий ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.

41. Композиция, содержащая ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.

42. Продукт для личной гигиены, содержащий ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.

43. Продукт, способный восстанавливать мишень, чувствительную к окислительному стрессу, содержащий ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.

44. Детергентная композиция, содержащая ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.

45. Эмульсионная форма, содержащая указанный ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, полученный способом по п.32.

46. Семя растения по п.35.

47. Экстракт семян по п.46, содержащий биологически активный рекомбинантный слитый редокс-полипептид.

48. Масляное тельце из семени по п.46.

49. Масло, полученное из семени по п.46.

 

Текст

Смотреть все

009181 Родственные заявки Настоящая заявка согласно 35 U.S.С. (Разделу 35 Кодекса Законов США) p. 119(e) имеет приоритет предварительной заявки США 60/302885, поданной 5 июля 2001 г. (van Rooijen, et al., "METHODSFOR THE PRODUCTION OF REDOX PROTEINS"). Эта заявка является также частичным продолжением заявки США 10/006038, поданной 4 декабря 2001 г. (Rooijen, et al., "METHODS FOR THE PRODUCTION OF REDOX PROTEINS"); которая является частичным продолжением заявки США 09/742900,поданной 19 декабря 2000 г. (Heifetz, et al., "METHOD OF PRODUCTION AND DELIVERY OF THIOREDOXIN"). Эта заявка является также частичным продолжением заявки на США 09/742900. Объекты каждой предварительной заявки включены сюда в качестве ссылки в полном виде. Область изобретения Данное изобретение относится к мультимерным белковым комплексам, редокс-белкам и рекомбинантным полипептидам и улучшенным способам их получения. Предпосылки Мультимерные белки (т.е. белки, содержащие множественные полипептидные цепи) являются биологически и коммерчески важным классом белков. Например, антитела являются мультимерными белками, которые используются для лечения большого диапазона патологических состояний. Однако в связи с их сложностью (комплексностью) мультимерные белки часто представляют значительные затруднения с точки зрения их производства. Редокс-белки являются также коммерчески важным классом белков с применениями во множестве различных отраслей промышленности, в том числе фармацевтической промышленности, промышленности, изготовляющей продукты для личной гигиены, и пищевой промышленности. Например, редоксбелок тиоредоксин может быть использован в изготовлении продуктов для личной гигиены (заявки на патент Японии JP 9012471 A2, JP 103743 A2, JP 1129785 A2), фармацевтических композиций/продуктов(Aota et al. (1996) J. Cardiov. Pharmacol. (1996) 27: 727-732), а также для уменьшения белковых аллергенов, присутствующих в пищевых продуктах, таких как молоко (del Val et al. (1999) J. Allerg. Vlin. Immunol. 103: 690-697) и пшеница (Buchanan et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5372-5377). Однако в данной области техники существует потребность для дополнительного улучшения способов рекомбинантной экспрессии мультимерных белков, в том числе редокс-белков. Данное изобретение удовлетворяет эту потребность и обеспечивает также дополнительные преимущества. Сущность изобретения Данное изобретение относится к новым и улучшенным способам получения первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, полипептидных цепей иммуноглобулинов, иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов и/или слитых родственных тиоредоксину белков в ассоциации с масляными тельцами. Таким образом, здесь обеспечены способы получения рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающие: (а) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого рекомбинантного полипептида и второго рекомбинантного полипептида, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного мультимерного белкового комплекса; и (b) связывание указанного мультимерного белкового комплекса с масляным тельцом через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и указанным первым рекомбинантным полипептидом. Этот способ предполагает дополнительно выделение масляных телец, связанных с указанным рекомбинантным мультимерным белковым комплексом. Второй рекомбинантный полипептид может быть связан со вторым нацеливающим на масляные тельца белком, способным связываться с масляным тельцем и указанным вторым рекомбинантным полипептидом. Каждый из указанных нацеливающих на масляные тельца белков может быть белком масляного тельца или иммуноглобулином. Нацеливающим на масляные тельца белком может быть олеозин или калеозин. В том случае, когда нацеливающим на масляные тельца белком может быть олеозин или калеозин, первый рекомбинантный полипептид может быть слит с указанным олеозином или калеозином. Подобным образом, второй рекомбинантный полипептид может быть слит со вторым олеозином или вторым калеозином, способным связываться с масляным тельцем. Первый и второй рекомбинантные полипептиды могут быть получены в виде мультимерного слитого белка, содержащего указанные первый и второй полипептиды, и могут образовывать мультимерный белковый комплекс. Этот мультимерный белковый комплекс может быть гетеромультимерным белковым комплексом, и этот гетеромультимерный белковый комплекс может быть ферментативно активным редокс-комплексом или иммуноглобулином. В одном варианте первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом в клетке. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть тиоредоксином, в второй рекомбинантный полипептид может быть тиоредоксинредуктазой. В конкретных вариантах тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 38, 42, 46, 50 и SEQ ID NO: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и SEQ ID NO: 195-313. В другом варианте первый рекомбинант-1 009181 ный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью,а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляное тельце белок может содержать белок А, белок L или белок G. Клетка может быть растительной клеткой, например клеткой сафлора и т.п. Здесь обеспечен также способ экспрессии рекомбинантного мультимерного белкового комплекса,содержащего первый и второй рекомбинантные полипептиды, в клетке, причем указанный способ включает:(a) введение в клетку первой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со(ii) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид;(b) введение в указанную клетку второй химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:(i) третью последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную с(ii) четвертой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид;(c) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных первого и второго рекомбинантных полипептидов в клетке-потомке, содержащей масляные тельца, где указанный первый рекомбинантный полипептид и указанный второй рекомбинантный полипептид способны образовывать мультимерный белковый комплекс; и(d) связывание указанного первого рекомбинантного полипептида с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и указанным первым рекомбинантный полипептидом. Этот способ предполагает дополнительно выделение из клетки-потомка масляных телец, содержащих мультимерный белковый комплекс. Второй рекомбинантный полипептид может быть связан во вторым нацеливающим на масляные тельца белком, способным связываться с масляным тельцем и вторым рекомбинантным полипептидом. Каждый из нацеливающих на масляные тельца белков может быть белком масляного тельца или иммуноглобулином. Нацеливающим на масляное тельце белком может быть олеозин или калеозин. В том случае, когда нацеливающим на масляное тельце белком может быть олеозин или калеозин, первый рекомбинантный полипептид может быть слит с указанным олеозином или калеозином. Подобным образом, второй рекомбинантный полипептид может быть слит со вторым олеозином или вторым калеозином, способным связываться с масляным тельцем. Первый и второй рекомбинантные полипептиды могут быть получены в виде мультимерного слитого белка, содержащего указанные первый и второй полипептиды, и могут образовывать мультимерный белковый комплекс. Мультимерный белковый комплекс может быть гетеромультимерным белковым комплексом, и этот гетеромультимерный белковый комплекс может быть ферментативно активным редокс-комплексом или иммуноглобулином. В одном варианте первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом в указанной клеткепотомке с образованием мультимерного белкового комплекса. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть тиоредоксином, в второй рекомбинантный полипептид может быть тиоредоксинредуктазой. В конкретных вариантах тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 38, 42, 46, 50 и SEQ ID NO: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 40,44, 48, 50 и SEQ ID NO: 195-313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляное тельце белок может содержать белок А, белок L или белок G. Клетка может быть растительной клеткой, например клеткой сафлора и т.п. Здесь обеспечены также способы продуцирования в растении рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, причем указанный способ включает:(a) получение первого растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и первый рекомбинантный полипептид, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок;(b) получение второго растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и второй рекомбинантный полипептид; и(c) половое скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением с получением растения-потомка, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца, где указанные масляные тельца способны связываться с указанным первым рекомбинантным полипептидом,-2 009181 а указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса. Второй рекомбинантный полипептид может быть связан с масляными тельцами через второй нацеливающий на масляные тельца белок во втором растении. Масляные тельца могут быть выделены из растения-потомка, содержащего указанный мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина, где белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин. Первый рекомбинантный полипептид может быть слит с олеозином или калеозином; и второй рекомбинантный полипептид может быть слит со вторым олеозином или вторым калеозином, способным связываться с масляным тельцем. Первый и второй рекомбинантные полипептиды могут образовывать мультимерный белковый комплекс, например, гетеромультимерный белковый комплекс, где этот гетеромультимерный белковый комплекс может быть ферментативно активным редокс-комплексом или иммуноглобулином. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностейSEQ ID NO: 38, 42, 46, 50 и SEQ ID NO: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы,состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и SEQ ID NO: 195-313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляное тельце белок может содержать белок A, белок L или белок G. Растением может быть растение сафлора. Здесь обеспечены также химерные нуклеиновые кислоты, кодирующие мультимерный слитый белок, описанный здесь, причем указанные нуклеиновые кислоты содержат:(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нацеливающий на масляные тельца белок, функционально связанную в рамке считывания со(b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, связанной в рамке считывания с(c) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина. Белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин. Мультимерный белковый комплекс может быть гетеромультимерным белковым комплексом, а первый и второй рекомбинантные полипептиды могут образовывать ферментативно активный гетеромультимерный редокс-комплекс или иммуноглобулин. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 38, 42, 46,50 и SEQ ID NO: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и SEQ ID NO: 195-313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляное тельце белок может содержать белок А, белок L или белок G. Еще в одном варианте между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей нацеливающий на масляные тельца белок, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, может быть расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Необязательно, этот слитый ген дополнительно содержит линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием,причем линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты,кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, которая является также непротеолитическим линкером, и указанной последовательностью, кодирующей первый рекомбинантный полипептид. Здесь обеспечены также рекомбинантные мультимерные слитые белки, содержащие:(i) нацеливающие на масляные тельца белок или его фрагмент,(ii) первый рекомбинантный полипептид и(iii) второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина, и белком масляного тельца-3 009181 может быть олеозин или калеозин. Мультимерный слитый белок может быть гетеромультимерным слитым белком, где первый и второй рекомбинантные полипептиды образуют ферментативно активный гетеромультимерный редокс-комплекс или иммуноглобулин. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQID NO: 38, 42, 46, 50 и SEQ ID NO: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и SEQ ID NO: 195313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок A, белок L или белок G. Еще в одном варианте между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей нацеливающий на масляные тельца белок, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид,может быть расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу,отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Необязательно, слитый ген дополнительно содержит линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, и указанной последовательностью, кодирующей первый рекомбинантный полипептид. Здесь обеспечены также выделенные масляные тельца, содержащие мультимерный белковый комплекс, содержащий:(i) нацеливающий на масляные тельца белок и(ii) первый рекомбинантный полипептид, причем указанные масляные тельца содержат дополнительно второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина, и белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин. Мультимерный слитый белок может быть гетеромультимерным слитым белком, где первый и второй рекомбинантные полипептиды образуют ферментативно активный гетеромультимерный редокс-комплекс или иммуноглобулин. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок A, белок L или белок G. Здесь обеспечены также выделенные масляные тельца, содержащие:(a) первый слитый белок, содержащий первый нацеливающий на масляные тельца белок, слитый с первым рекомбинантным полипептидом; и(b) второй слитый белок, содержащий второй нацеливающий на масляные тельца белок, слитый со вторым рекомбинантным полипептидом,где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина, и белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин. Мультимерный слитый белок может быть гетеромультимерным слитым белком, где первый и второй рекомбинантные полипептиды образуют ферментативно активный гетеромультимерный редокс-комплекс или иммуноглобулин. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксин может быть выбран из группы,состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 38, 42, 46, 50 и SEQ ID NO: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и SEQ ID NO: 195-313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок A, белок L или белок G. Здесь обеспечены также клетки и трансгенные растения, содержащие масляные тельца, мультимер-4 009181 ные белковые комплексы и мультимерные слитые комплексы, представленные здесь. В одном варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например,первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок A, белок L или белок G. В вариантах, где указанным первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза, способы, описанные здесь, могут быть использованы для получения масляных телец для применения в изготовлении пищевого продукта, продукта для личной гигиены или фармацевтической композиции. Эти формы могут дополнительно содержать добавку НАДФ или НАДФН. Пищевым продуктом может быть молоко или пищевой продукт на основе пшеницы. Продукт для личной гигиены может уменьшать окислительный стресс, оказываемый на площадь поверхности тела человека, или может быть использован для осветления кожи. Фармацевтическая композиция может быть использована для лечения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), катаракты, диабета, интоксикации, обусловленной укусом ядовитого животного, бронхо-легочного заболевания, злокачественных опухолей,псориаза, реперфузионного повреждения, заживления ран, сепсиса, желудочно-кишечного кровотечения,воспалительного заболевания пищеварительного тракта (IBD), язв, желудочно-пищеводного рефлюкса(GERD). Здесь обеспечены также композиции, содержащие выделенные масляные тельца, тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу, где указанный тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 38, 42, 46, 50 и SEQ ID NO: 52-194; а указанная тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 8, 9, 10,40, 44, 48, 50 и SEQ ID NO: 195-313. Эта композиция может дополнительно содержать НАДФ или НАДФН. В другом варианте эта композиция содержит первый рекомбинантный полипептид, который может быть полипептидной цепью иммуноглобулина, и второй рекомбинантный полипептид. Например,первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок А, белок L или белок G. Обеспечены также мультимерные слитые белки, где такой слитый белок содержит две или более полипептидных цепей, выбранных из группы белков, представленных на фиг. 5. Обеспечены также способы уменьшения аллергенности пищевых продуктов, включающие стадии получения выделенных масляных телец, описанных здесь; и добавления выделенных масляных телец к пищевым продуктам, посредством чего аллергенность этих пищевых продуктов уменьшается. Пищевой продукт может быть выбран из группы, состоящей из пшеничной муки, пшеничного теста, молока, сыра, йогурта и мороженого. Различные способы обработки пищевых продуктов могут дополнительно предусматривать обеспечение НАДН в качестве кофактора, по существу, в отсутствие НАДФН. Обеспечены также способы лечения или защиты мишени от окислительного стресса, включающие стадии получения рекомбинантного слитого редокс-полипептида, содержащего тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу; и контактирования рекомбинантного слитого полипептида с мишенью, где эта мишень является чувствительной к окислительному стрессу, посредством чего обеспечивается лечение или защита от этого стресса. Мишень может быть выбрана из группы, состоящей из молекулы, молекулярного комплекса, клетки, ткани и органа. Здесь обеспечены также способы получения ферментативно активного редокс-белка, связанного с масляными тельцами, включающие:a) получение в клетке слитого редокс-полипептида, содержащего первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком;b) связывание указанного слитого редокс-полипептида с масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным слитым редокс-полипептидом и указанными масляными тельцами; иc) выделение указанных масляных телец, связанных с указанным слитым редокс-полипептидом. Первым редокс-белком может быть тиоредоксин, а вторым редокс-белком может быть тиоредоксинредуктаза. Здесь обеспечены также способы получения иммуноглобулина, включающие:(а) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первой полипептидной цепи иммуноглобулина и второй полипептидной цепи иммуноглобулина, где указанная первая полипептидная цепь иммуноглобулина способна связываться с указанной второй полипептидной цепью иммуноглобулина с образованием указанного иммуноглобулина; и(b) связывание указанного иммуноглобулина с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и указанной первой полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первая полипептидная цепь иммуноглобулина может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а вторая полипептидная-5 009181 цепь иммуноглобулина может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок А, белок L или белок G. Здесь обеспечены также способы для получения редокс-белка или иммуноглобулина, связанного с масляными тельцами, включающие: а) введение в клетку химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей: 1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со 2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида на масляное тельце, связанную с(ii) последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, содержащий первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком, или последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, содержащий первую полипептидную цепь иммуноглобулина, связанную со второй полипептидной цепью иммуноглобулина, функционально связанной с 3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию в указанной клетке;b) выращивание указанной клетки в условиях, позволяющих осуществить экспрессию указанного слитого редокс-полипептида или иммуноглобулина, в клетке-потомке, содержащей масляные тельца; иc) выделение из указанной клетки-потомка указанных масляных телец, содержащих указанный слитый редокс-полипептид или иммуноглобулин. В некоторых вариантах между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей достаточную часть белка масляного тельца, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид или иммуноглобулин, может быть расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Необязательно, слитый ген дополнительно содержит линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, и указанной последовательностью, кодирующей первый слитый редокс-полипептид. В этом необязательном варианте рассматривается также введение фермента или химикалия, который отщепляет указанный слитый редокс-полипептид от указанного масляного тельца, посредством чего получают выделенный слитый редокс-полипептид. Первым редокс-белком может быть тиоредоксин, а указанным вторым редокс-белком может быть тиоредоксинредуктаза. В одном варианте тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза могут быть получены из Arabidopsis. В другом варианте первый редокс-белок является по меньшей мере в 5 раз более активным при получении его в виде слитого редокс-полипептида в сравнении с получением этого первого редокс-белка без второго редокс-белка. Здесь также обеспечена для применения с различными способами, изложенными здесь, композиция эмульсии масляных телец, связанных со слитым редокс-полипептидом для применения в получении продукта, способного лечить окислительный стресс в мишени, продукта, способного химически восстанавливать мишень, фармацевтической композиции, продукта для личной гигиены или пищевого продукта. Таким образом, обеспечена эмульсионная композиция. Здесь обеспечена также химерная нуклеиновая кислота, содержащая: 1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в клетке-хозяине, функционально связанную со 2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей:(i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида на масляное тельце, связанную с(ii) последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, содержащий первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком, функционально связанной с 3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию в указанной клетке. Белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин, первым редокс-белком может быть тиоредоксин, а указанным вторым редокс-белком может быть тиоредоксинредуктаза. В некоторых вариантах между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей достаточную часть белка масляного тельца, и указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая-6 009181 избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. В одном варианте этот слитый ген необязательно дополнительно содержит линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем эта линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, и указанной последовательностью, кодирующей слитый редокс-полипептид. Здесь обеспечены также трансгенные растения, например, растения сафлора, содержащие любую из химерных последовательностей нуклеиновых кислот и конструкций, описанных здесь. Химерные нуклеиновые кислоты могут содержаться в плазмиде. Таким образом, обеспечены выделенные плазмиды,имеющие в них химерные нуклеиновые кислоты. Также обеспечены семена растений, содержащие обеспеченные здесь химерные нуклеиновые кислоты. Обеспечены также препараты масляных телец, полученные с использованием любого из обеспеченных здесь способов, и пищевые продукты, фармацевтические композиции и продукты для личной гигиены, содержащие препараты масляных телец. Продукты и/или композиции, обеспеченные здесь,способны лечить окислительный стресс в мишени, способны химически восстанавливать мишень. Обеспечена также детергентная композиция, содержащая препарат масляных телец, способная химически восстанавливать мишень, и связанные с ней способы очистки предмета, включающие нанесение такого продукта на предмет в условиях, стимулирующих очистку. Здесь обеспечены также конструкции нуклеиновых кислот, содержащие слияние генов, содержащее первый участок, кодирующий белок масляного тельца или его активный фрагмент, функционально связанный со вторым участком, кодирующим по меньшей мере один родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент. В одном варианте по меньшей мере одним родственным тиоредоксину белком может быть тиоредоксин. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 38, 42, 46, 50 и SEQ ID NO: 52-194. Тиоредоксин может быть получен из Arabidopsis или из пшеницы. В другом варианте по меньшей мере одним родственным тиоредоксину белком может быть тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и SEQ ID NO: 195-313 и/или получена из Arabidopsis или из пшеницы. Тиоредоксинредуктаза может быть НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазой. Второй участок может кодировать тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу. В одном варианте тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу получают из Mycobacterium leprae. В другом варианте по меньшей мере один родственный тиоредоксину белок может быть сконструированным слитым белком. Первый участок может предшествовать в направлении 5'-3' второму участку. Альтернативно, первый участок следует в направлении 5'-3' за вторым участком. Слияние генов может необязательно дополнительно содержать третий участок, кодирующий второй родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент, функционально связанный с первым участком или со вторым участком или с обоими. С этим слиянием генов может быть функционально связан семеноспецифический промотор, например, промотор фазеолина. В одном варианте, по меньшей мере один родственный тиоредоксину белок получен из вида растения, выбранного из группы, состоящей из Arabidopsis или пшеницы. В другом варианте по меньшей мере один родственный тиоредоксину белок может быть получен из Е. coli. В одном варианте это слияние генов дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, где эта линкерная аминокислотная последовательность расположена между первым участком и вторым участком. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Кроме того, это слияние генов может дополнительно содержать линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между избегающей поверхности масляного тельца линкерной аминокислотной последовательностью и вторым участком. Здесь обеспечены также трансгенные растения, содержащие конструкцию нуклеиновых кислот, содержащую слияние генов, содержащее участок, кодирующий белок масляного тельца или его активный фрагмент, функционально связанный с участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент. Родственным тиоредоксину белком может быть тиоредоксин. Эта конструкция нуклеиновой кислоты может содержаться в плазмиде. В одном варианте, когда первый родственный тиоредоксину белок является тиоредоксином, конструкция может дополнительно содержать участок,кодирующий тиоредоксинредуктазу. Это слияние генов может необязательно содержать дополнительно третий участок, кодирующий второй родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент,-7 009181 функционально связанный с первым участком, или со вторым участком, или с обоими. Это слияние генов может необязательно дополнительно содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность,где эта нуклеиновая кислота, кодирующая линкерную аминокислотную последовательность, расположена между участком, кодирующим белок масляного тельца, и участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину белок. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Слияние генов может необязательно дополнительно содержать линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, и участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину белок. Обеспечены также трансгенное растение, содержащее конструкцию нуклеиновой кислоты, семеноспецифический промотор, функционально связанный со слиянием генов, где это слияние генов содержит участок, кодирующий белок масляного тельца или его активный фрагмент, функционально связанный с участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент, где слитый белок, обладающий активностью олеозина и родственного тиоредоксину белка, продуцируется в семени растения. В другом варианте обеспечен родственный тиоредоксину белок, имеющий концентрацию по меньшей мере 0,5% общего клеточного белка семени. Здесь обеспечен также экстракт, обладающий активностью родственного тиоредоксину белка. Обеспечены также масляные тельца и/или масло,полученное из различных семян. Здесь обеспечены также способы получения слитого белка, обладающего родственной тиоредоксину активностью, включающие стадии: а) обеспечения трансгенного растения, содержащего конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую семеноспецифический промотор, функционально связанный со слиянием генов, где это слияние генов обладает участком, кодирующим белок маслянного тельца или его активный фрагмент, функционально связанный с участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину участок или его активный фрагмент, причем это слияние генов кодирует слитый белок, обладающий родственной тиоредоксину активностью;b) получения семян из растения иc) извлечения слитого белка посредством выделения масляных телец из семян. В одном варианте масляные тельца фракционируют для получения частичной очистки слитого белка. Масляные тельца могут быть связаны со слитым белком. Белок масляных телец может быть отщеплен от родственного тиоредоксину белка после фракционирования масляных телец. В стадии отщепления можно использовать протеазу или химический протеолиз. Здесь обеспечены также способы уменьшения аллергенности пищевых продуктов, включающие стадии:a) получения препарата, содержащего масляные тельца, связанные со слитым белком, причем слитый белок содержит белок масляных телец или его активный фрагмент и родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент; иb) добавления этого препарата к пищевому продукту, посредством чего аллергенность этого пищевого продукта уменьшается вследствие активности родственного тиоредоксину белка или фрагмента. Пищевым продуктом может быть пшеничная мука, пшеничное тесто, молоко, сыр, йогурт и мороженое. В одном варианте используют НАДН в качестве кофактора, по существу, в отсутствие НАДФН. Здесь обеспечены также фармацевтические композиции, содержащие слитый белок, причем слитый белок содержит белок масляных телец или его активную часть и родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент, в фармацевтически приемлемом носителе. Масляные тельца могут быть связаны со слитым белком. Обеспечена также косметическая композиция, содержащая масляные тельца, связанные со слитым белком, причем слитый белок содержит белок масляных телец или его активную часть и родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент, в фармацевтически приемлемом носителе. Обеспечены также способы лечения или защиты мишени от окислительного стресса, включающие стадии:a) получения препарата, содержащего слитый белок, причем слитый белок содержит белок масляных телец или его активный фрагмент и родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент; иb) контактирования препарата с мишенью, где эта мишень является чувствительной к окислительному стрессу, и тем самым лечения или защиты от этого стресса. Мишень может быть выбрана из группы, состоящей из молекулы, молекулярного комплекса, клетки, ткани и органа. Обеспечена также конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая слияние генов, где слияние генов содержит первый участок, кодирующий белок масляных телец или его активный фрагмент, функционально связанный со вторым участком, кодирующим по меньшей мере один полипептид или его фрагмент и избегающий поверхности масляного тельца линкер в рамке считывания между полипептида-8 009181 ми первого и второго участков. Обеспечены также способы экспрессии этой конструкции с образованием кодируемой аминокислотной последовательности; и масляные тельца, композиции, эмульсии, клетки и растения, содержащие конструкцию и кодируемую аминокислотную последовательность. Конкретные конструкции, масляные тельца, композиции, эмульсии, клетки и растения могут быть получены в соответствии со способами, описанными здесь. Второй участок может кодировать любой полипептид, например, терапевтически, питательно, промышленно или косметически полезный пептид, описанный здесь. Например, второй участок может кодировать редокс-белок, иммуноглобулин, родственный тиоредоксину белок или любой один или несколько рекомбинантных полипептидов мультимерного белкового комплекса. Другие признаки и преимущества данного изобретения станут легко понятными из следующего подробного описания. Однако должно быть понятно, что это подробное описание и конкретные примеры, раскрывающие конкретные варианты осуществления данного изобретения, приводятся только в качестве иллюстрации. Краткое описание фигур Фиг. 1 показывает сопоставление, отформатированное в соответствии с ClustalW, известной последовательности нуклеиновой кислоты НАДФН-тиоредоксинредуктазы (SEQ ID NO: 9) (ATTHIREDBJacquot et al. J. Mol. Biol. (1994) 235 (4): 1357-63) с последовательностью, выделенной здесь в примере 1(TR; SEQ ID NO: 8). Фиг. 2 показывает сопоставление, отформатированное в соответствии с ClustalW, расшифрованной аминокислотной последовательности известной последовательности нуклеиновой кислоты НАДФНтиоредоксинредуктазы (SEQ ID NO: 12 (ATTHIREDB Jacquot et al. J. Mol. Biol. (1994) 235 (4): 1357-63) с последовательностью, выделенной здесь в примере 1 (TR; SEQ ID NO: 13). Фиг. 3 показывает сопоставление, отформатированное в соответствии с ClustalW, аминокислотной последовательности синтетического слияния тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин ArabidopsisMycobacterium leprae (M.lep TR/Trxh; SEQ ID NO: 36). В целом эти белки являются приблизительно на 50% идентичными на уровне аминокислот. Фиг. 4 представляет диаграмму в виде столбцов, показывающую измерения активности тиоредоксина/тиоредоксинредуктазы для различных фракций трансгенных семян Arabidopsis. Относительная удельная активность выражена в виде процента активности тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы Е.coli. Пронумерованные столбцы на диаграмме соответствуют следующему: 1. W.T. + олеозин-тиоредоксин 2. W.T. + тиоредоксин-олеозин 3. W.T. + тиоредоксин 4. W.T. + олеозин-тиоредоксинредуктаза 5. W.T. + тиоредоксинредуктаза-олеозин 6. W.T. + тиоредоксинредуктаза 7. тиоредоксин + олеозин-тиоредоксинредуктаза 8. тиоредоксин + тиоредоксинредуктаза-олеозин 9. тиоредоксин + тиоредоксинредуктаза 10. тиоредоксинредуктаза + олеозин-тиоредоксин 11. тиоредоксинредуктаза + тиоредоксин-олеозин 12. олеозин-M.lep. TR/Trxh 13. тиоредоксинредуктаза Е. coli + тиоредоксин, где W.T. - означает "дикий тип". Фиг. 5 представляет перечень примеров белков для применения в гетеромультимерных слитых белках и гетеромультимерных белковых комплексах, описанных здесь. Подробное описание Как упоминалось выше, данное изобретение относится к новым и улучшенным способам получения мультимерных белков, в том числе первого и второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, полипептидных цепей иммуноглобулинов, иммуноглобулинов, слитых редокс-белков и первого и второго родственных тиоредоксину белков; и родственных продуктов. Эти способы обеспечивают возможность получения активных мультимерных белковых комплексов, ассоциированных (связанных) с масляными тельцами. Масляные тельца в ассоциации с мультимерным белковым комплексом могут быть использованы для получения разнообразных полезных эмульсий. Таким образом, здесь обеспечены способы получения рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, связанного с масляным тельцем, причем указанный способ включает:(a) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого рекомбинантного полипептида и второго рекомбинантного полипептида, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного мультимерного белкового комплекса; и(b) связывания указанного мультимерного белкового комплекса с масляным тельцем через нацели-9 009181 вающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным масляным тельцем и указанным первым рекомбинантным полипептидом. Определения и термины. Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, в котором они обычно понимаются специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Где это допускается, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации и последовательности из GenBank, SwissPro и других баз данных, которые цитируются во всем описании здесь,включены в качестве ссылки в их полном виде. В применении здесь фраза мультимерный белковый комплекс относится к двум или более полипептидным цепям, которые постоянно или периодически взаимодействуют или постоянно или периодически координируются с образованием биологически активного комплекса, содержащего указанные две или более полипептидных цепей. Следует отметить, что полипептиды могут быть независимо биологически активными без взаимодействия или координации с образованием комплекса. Мультимерный белковый комплекс может обеспечивать биологическую структуру, или он может быть способен облегчать химическую или биологическую реакцию. Например, один из участков белка в этом мультимерном белковом комплексе может периодически активировать или периодически инактивировать биологическую или метаболическую активность одного или более других белков, содержащихся в этом мультимерном белковом комплексе. В одном варианте первый и второй рекомбинантные полипептиды, содержащиеся в мультимерном белковом комплексе, могут либо связываться, либо взаимодейтствовать в качестве независимых не непрерывных полипептидных цепей, или мультимерный белковый комплекс может быть приготовлен в виде слитого полипептида (мультимерного слитого белка) между первым и вторым рекомбинантными полипептидами. Одним из примеров периодического (например, повторяющегося) взаимодействия или периодической (или повторяющейся) ассоциации между двумя или более полипептидами мультимерного белкового комплекса, обеспеченного здесь, является взаимодействие между двумя или более неидентичными редокс-белками с образованием гетеромультимерного белкового комплекса. Примерами редокс-белков для применения в этой связи являются тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза. Следующим примером является взаимодействие между двумя или более полипептидными цепями иммуноглобулина с образованием иммуноглобулина. В данном контексте фраза гетеромультимерный белковый комплекс относится к двум или более неидентичным полипептидным цепям, которые постоянно или периодически взаимодействуют или постоянно или периодически координируются с образованием биологически активного комплекса, содержащего указанные две или более полипептидных цепей. Другие примеры мультимерных белковых комплексов, описанных здесь, включают первый и второй рекомбинантные полипептиды, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, первую и вторую полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редоксполипептиды и первый и второй родственные тиоредоксину белки. Рекомбинантный полипептид или мультимерный белковый комплекс связан с масляным тельцем. В данном контексте фраза масляное тельце или масляные тельца относится к любой запасающей масло или жир органелле в любом типе клеток. Таким образом, масляные тельца могут быть получены из любой клетки, содержащей масляные тельца, в том числе из растительных клеток (описанных, например,Huang (1982) Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43: 177-200), животных клеток (описанных, например, Murphy(1990) Prog Lipid Res 29(4): 299-324), включающих адипоциты, гепатоциты, стероидогенные клетки, эпителиальные клетки молочной железы, макрофаги, клетки водорослей (описанные, например, Rossler(1988) J. Physiol. London, 24: 394-400), грибковых клеток, в том числе дрожжевых клеток (описанных,например, Leber et al., (1994) Yeast 10: 1421-1428), и бактериальных клеток (описанных, например,Pieper-Furst et al., (1994) J. Bacteriol. 176: 4328-4337). Предпочтительно масляные тельца, используемые здесь, являются масляными тельцами, получаемыми из растительных клеток, и более предпочтительно масляными тельцами, получаемыми из клеток семян растений. В данном контексте фраза способен связываться с, связываются или их грамматические вариации относятся к любому взаимодействию между двумя или более полипептидами, в том числе любым ковалентным взаимодействиям (например, мультимерным слитым белкам), а также нековалентным взаимодействиям. Примерами нековалентных взаимодействий могут быть взаимодействия между нацеливающим на масляные тельца белком и редокс-белком или полипептидной цепью иммуноглобулина, а также между двумя или более различными белками, содержащимися в двух или более отдельных слитых с белком масляного тельца белках (например, редокс-белками в олеозин-тиоредоксине и олеозинтиоредоксинредуктазе). В применении здесь термин "рекомбинантный" (также называемый гетерологичным), в контексте с рекомбинантными белками и аминокислотами, означает "различного природного происхождения" или обозначает неприродное состояние. Например, если клетка-хозяин трансформирована нуклеотидной последовательностью, происходящей из другого организма, в частности, из другого вида, эта нуклеотидная последовательность и кодируемая ею аминокислотная последовательность являются рекомбинантными(гетерологичными) в отношении этой клетки-хозяина и также в отношении потомков клетки-хозяина,- 10009181 которые несут этот ген. Подобным образом, термин "рекомбинантный" (или гетерологичный) относится к нуклеотидной последовательности, происходящей из того же самого природного, исходного типа клеток (или встроенной в тот же самый природный исходный тип клеток), но присутствующей в неприродном состоянии, например, в отличающейся копийности или под контролем разных регуляторных элементов. Трансформирующая нуклеотидная последовательность может включать рекомбинантную кодирующую последовательность или рекомбинантные регуляторные элементы. Альтернативно, трансформирующая нуклеотидная последовательность может быть полностью гетерологичной или может включать любую возможную комбинацию гетерологичных и эндогенных последовательностей нуклеиновых кислот. В различных вариантах данного изобретения первый и/или второй рекомбинантные полипептиды,мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов,слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки продуцируются в клетке, содержащей масляные тельца. В применении здесь фразы "в некоторой клетке", "в данной клетке" или их грамматические вариации означают, что первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки могут продуцироваться в любом клеточном компартменте клетки, при условии, что клетка несет в себе масляные тельца. В вариантах данного изобретения, в которых используются растительные клетки, эта фраза включает апопласт растения. В различных представленных здесь вариантах первый и/или второй рекомбинантные полипептиды,мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов,слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки связываются с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок. В применении здесь фраза "нацеливающий на масляные тельца белок" относится к любому белку, фрагменту белка или пептиду, способному связываться с масляным тельцем. Примеры нацеливающих на масляные тельца белков для применения здесь включают белки масляных телец, такие как олеозин и калеозин; иммуноглобулины, такие как биспецифические антитела и т.п. В вариантах, описанных здесь, в которых используется белок масляного тельца, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки предпочтительно слиты с белком масляного тельца. Термин "белок масляного тельца" относится к любому белку, природно присутствующему в клетках и способному связываться с масляными тельцами,в том числе к любому олеозину или калеозину. Таким образом, здесь обеспечен способ экспрессии рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, содержащего первый и второй рекомбинантные полипептиды, в клетке, включающий:(a) введение в клетку первой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со(ii) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, такой как редокс-белок, полипептидная цепь иммуноглобулина или родственный тиоредоксину белок, слитый с белком масляного тельца;(b) введение в указанную клетку второй химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:(i) третью последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную с(ii) четвертой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид, такой как второй редокс-белок, вторая полипептидная цепь иммуноглобулина или второй родственный тиоредоксину белок;(c) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных первого и второго рекомбинантных полипептидов в клетке-потомке, содержащей масляные тельца, где указанный первый рекомбинантный полипептид и указанный второй рекомбинантный полипептид способны образовывать мультимерный белковый комплекс, предпочтительно в указанной клетке-потомке; и(d) связывание указанного первого рекомбинантного полипептида с масляным тельцем через белок масляного тельца. Термин нуклеиновая кислота в данном контексте относится к последовательности нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящих из природно встречающихся оснований, сахаров и межсахарных (скелетных) связей. Этот термин включает также модифицированные или замещенные последовательности, содержащие не встречающиеся в природе мономеры или их части, которые функционируют сходным образом. Эти последовательности нуклеиновых кислот могут быть рибонуклеиновыми кисло- 11009181 тами (РНК) или дезоксирибонуклеиновыми кислотами (ДНК) и могут содержать природно встречающиеся основания, в том числе аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Эти последовательности могут также включать модифицированные основания, такие как ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6 метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 6-азаурацил, 6-азацитозин и 6-азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8 тиоалкиладенины, 8-гидроксиладенин и другие 8-замещенные аденины, 8-галогенгуанины, 8 аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанины, 8-гидроксилгуанин и другие 8-замещенные гуанины,другие аза- и деаза-урацилы, тимидины, цитозины, аденины или гуанины, 5-трифторметилурацил и 5 трифторцитозин. Мультимерные белковые комплексы. В соответствии со способами и композициями, обеспеченными здесь, могут быть использованы любые два рекомбинантных полипептида, способные образовывать мультимерный белковый комплекс. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие эти два рекомбинантных полипептида, могут быть получены из любого биологического источника или могут быть получены синтетически. В общем,последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие мультимерные белки, известны в данной области и являются легкодоступными. Известные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие мультимерные белковые комплексы, могут быть использованы для сборки и конструирования зондов на основе последовательности нуклеиновой кислоты для обнаружения и идентификации ранее не обнаруженных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих мультимерные белковые комплексы, например, посредством скрининга библиотек кДНК или геномных библиотек или с использованием 2- или мультигибридных систем. Таким образом, могут быть обнаружены и использованы дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие мультимерные белковые комплексы, как описано здесь. Первые и/или второй рекомбинантные полипептиды, которые содержатся в обеспеченном здесь мультимерном белковом комплексе, могут сами находиться в форме гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов,полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов и/или первого и/или второго родственных тиоредоксину белков. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый и второй рекомбинантные полипептиды, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, может быть получена из разных источников или может быть получена из одного и того же источника. Однако обычно такую последовательность нуклеиновой кислоты получают из одного и того же биологического источника или из сходных биологических источников. В некоторых вариантах, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый и второй рекомбинантные полипептиды, получают из одного и того же источника, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый рекомбинантный полипептид, и второй рекомбинантный полипептид, могут быть природно слитыми. Согласно конкретному варианту, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и второй рекомбинантные полипептиды, получают из растительного источника. Избегающие поверхности масляного тельца линкеры. Полипептидные спейсеры или линкеры вариабельной длины и/или отрицательного заряда могут быть использованы здесь для отделения первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов, полипептидных цепей иммуноглобулинов,слитых редокс-полипептидов и/или первого и/или второго родственных тиоредоксину белков от находящегося в рамке считывания нацеливающего на масляные тельца белка для улучшения активности и/или доступности этого полипептида или комплекса. Например, в одном варианте, представленном здесь, между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей достаточную часть белка масляного тела,и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Избегающие поверхности масляного тельца линкеры расположены между нацеливающей на масляное тельце последовательностью и находящимся в рамке считывания представляющим интерес рекомбинантным полипептидом, например, мультимерным белковым комплексом, описанным здесь, они служат для увеличения расстояния и/или уменьшения взаимодействия между отрицательно заряженной поверхностью масляного тельца и представляющим интерес рекомбинантным полипептидом. Отрицательно заряженный линкер отталкивается отрицательно заряженной поверхностью масляного тельца, в свою очередь, увеличивая расстояние или уменьшая взаимодействие присоединенного к не- 12009181 му рекомбинантного полипептида с поверхностью масляного тельца. Вследствие увеличенного расстояния от поверхности масляного тельца, рекомбинантный полипептид будет более доступным, например,для его субстрата-мишени, белкового субстрата, белкового партнера, и на него будет меньше воздействовать заряженная поверхность масляного тельца. Примерами линкерных последовательностей для применения здесь могут быть отрицательно заряженный линкер или линкер, имеющий молекулярную массу по меньшей мере около 35 кД или более. В применении здесь "отрицательно заряженная линкерная" последовательность обозначает любой аминокислотный сегмент или нуклеиновую кислоту, кодирующую его, который имеет pI (изоэлектрическую точку), меньшую или равную pI масляного тельца. В некоторых вариантах pI отрицательно заряженного линкера находится на приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30% до приблизительно 25 или более ниже величины pI масляного тельца в конкретной используемой системе растения или клеток. Могут быть получены примеры отрицательно заряженных линкеров, содержащих любую комбинацию отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Например, в одном варианте отрицательно заряженный линкер содержит либо полиглутаматную, либо полиаспартатную последовательность или любую комбинацию обоих аминокислотных остатков. Отрицательно заряженный линкер обычно имеет длину по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более аминокислотных остатков. Отрицательно заряженные линкеры предпочтительно являются непротеолитическими(например, непротеолитическими линкерами), не имеющими сайта для эффективного протеолиза. Когда используют не заряд, а размер линкера для минимизации взаимодействия представляющего интерес рекомбинантного полипептида с поверхностью масляного тельца, этот линкер является непротеолитическим и имеет молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 35 кД до приблизительно 100 кД. Верхнюю границу размера выбирают таким образом, чтобы экспрессия, активность, конформация и/или доступ к мишени представляющего интерес рекомбинантного полипептида не подвергались значимому влиянию линкера. В некоторых вариантах, описанных здесь, где используют непротеолитическую линкерную аминокислотную последовательность, слияние генов или слитый белок (мультимерный слитый белок) может дополнительно содержать линкерную последовательность нуклеиновой кислоты или линкерную аминокислотную последовательность, кодирующую последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, где эта линкерная последовательность расположена между непротеолитической линкерной последовательностью и последовательностью, кодирующей желаемый участок рекомбинантного белка, такого как, например, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды,мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов,слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, представленные здесь. Когда используют расщепляемую линкерную последовательность, в конкретном варианте осуществления изобретения она находится ниже непротеолитической линкерной последовательности от участка нацеливающего на масляное тельце белка этого слитого белка. Благодаря расщепляемому линкеру,рекомбинантные слитые полипептиды, описанные здесь, такие как мультимерные слитые белки и слитые редокс-полипептиды, могут быть выделены и очищены введением фермента или химикалия, который отщепляет указанный мультимерный слитый белок и/или слитый редокс-полипептид от указанного масляного тельца с получением и/или выделением посредством этого желаемого белка. Здесь предполагается, что применение расщепляемой линкерной последовательности ниже непротеолитической линкерной/спейсерной последовательности будет улучшать выход извлечения белка при выделении или очистке белков с использованием обеспеченных здесь способов. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый или второй рекомбинантные полипептиды, могут быть изменены для улучшения уровней экспрессии, например, оптимизацией последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с предпочтительно используемым кодоном для конкретного типа клеток, который выбирают для экспрессии первого и второго рекомбинантных полипептидов,или изменением мотивов, которые, как известно, дестабилизируют мРНК (см., например, патентную заявку РСТ 97/02352). Сравнение использования кодонов первого и второго рекомбинантных полипептидов с использованием кодонов хозяина позволит идентифицировать кодоны, которые могут быть изменены. Например, обычно эволюция растений имеет тенденцию в направлении предпочтения обогащенных CG нуклеотидных последовательностей, в то время как бактериальная эволюция привела к смещению в направлении обогащенных AT нуклеотидных последовательностей. Посредством модификации последовательностей нуклеиновых кислот для включения последовательностей нуклеиновых кислот,предпочитаемых клеткой-хозяином, экспрессия может быть оптимизирована. Конструирование синтетических генов изменением использования кодонов описано, например, в патентной заявке РСТ 93/07278. Первый и второй рекомбинантые полипептиды могут быть изменены с использованием, например, направленного мутагенеза, случайного мутагенеза (Shiraishi et al. (1998) Arch. Biochem. Biophys. 358: 104115; Galkin et al. (1997) Protein Eng. 10: 687-690; Carugo et al. (1997) Proteins 28: 10-28; Hurley et al. (1996)Biochemistry 35: 5670-5678), перетасовки генов и/или добавлением органического растворителя (Holmberg et al. (1999) Protein Eng. 12: 851-856). Любые полипептидные спейсеры, которые используют в соот- 13009181 ветствии со способами и продуктами, обеспеченными здесь, могут быть изменены аналогичными путями. В особых вариантах, обеспеченных здесь, рекомбинантные полипептиды или родственные тиоредоксину белки, способные образовывать мультимерный белковый комплекс, способны к образованию гетеромультимерного белкового комплекса. Примеры гетеромультимерных белковых комплексов, которые содержат полипептидные цепи, которые периодически взаимодействуют, для активации, инактивации, окисления, восстановления, стабилизации и т.д., друг с другом, которые могут быть получены в ассоциации с масляными тельцами с использованием обеспеченных здесь способов, включают комплексы,представленные на фиг. 5. Таким образом, примеры белков для применения в гетеромультимерных белковых комплексах, и конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих их, обеспеченные здесь, включают,среди прочих, описанных здесь, гетеромультимерные белковые комплексы, представленные на фиг. 5. Другие полипептидные участки, которые могут быть использованы в первом и/или втором рекомбинантных полипептидах, мультимерных белковых комплексах, гетеромультимерных белковых комплексах, мультимерных слитых белках, гетеромультимерных слитых белках, иммуноглобулинах, полипептидных цепях иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидах или первом и/или втором родственных тиоредоксину белках, обеспеченных здесь, включают комплексы участков иммуноглобулинов,представленные в табл. 1. Таблица 1 Гетеродимеры антител Как представлено выше, в одном варианте примеры гетеромультимерных белковых комплексов и примеры гетеромультимерных слитых белков, обеспеченных здесь, содержат редокс-белки, такие как тиоредоксины и тиоредоксинредуктазы и иммуноглобулины. Нацеливающие на масляные тельца белки. Последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей нацеливающий на масляные тельца белок, которая может быть использована в способах и композициях данного изобретения, может быть любая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая нацеливающий на масляные тельца белок,фрагмент белка или пептид, способный связываться с первым рекомбинантным полипептидом, гетеромультимерными белковыми комплексами, мультимерными слитыми белками, гетеромультимерными слитыми белками, иммуноглобулинами, полипептидными цепями иммуноглобулинов, слитыми редоксполипептидами и/или первым и/или вторым родственными тиоредоксину белками и масляными тельцами. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая нацеливающий на масляные тельца пептид,может быть синтезирована или получена из любого биологического источника. Например, в одном варианте нацеливающим на масляные тельца белком является иммуноглобулин или произведенная из иммуноглобулина молекула, например биспецифическое одноцепочечное антитело. Получение одноцепочечных антител и биспецифических одноцепочечных антител известно в данной области (см., например, патенты США US 5763733, US 5767260 и US 5260203). Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие одноцепочечные антитела, функционирующие как нацеливающие на масляные тельца белки, могут быть получены из гибридомных клеточных линий, экспрессирующих моноклональные антитела, индуцированные против олеозина, как описано Alting-Mees et al. (2000) IBC'sAnnual International Conference on Antibody-Engineering, Poster 1. Для получения специфичности в отношении первого рекомбинантного полипептида, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второе одноцепочечное антитело, полученное из моноклональных антител, индуцированных против- 14009181 первого рекомбинантного полипептида, может быть получена и связана с одноцепочечным антителом против олеозина. В этом варианте масляное тельце связывается с первым рекомбинантным полипептидом через нековалентные взаимодействия нацеливающего на масляные тельца белка с первым рекомбинантным полипептидом и масляным тельцем. Альтернативно, первый рекомбинантный полипептид может быть получен в виде слитого белка с нацеливающим на масляные тельца белком. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая одноцепочечное антитело, индуцированное против олеозина, может быть слита с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид. Нацеливающие на масляные тельца белки, не основанные на иммуноглобулине, способные связываться с первым рекомбинантным полипептидом, могут быть обнаружены и получены с использованием,например, способов фагового представления (Pharmacia Biotech Catalogue Number 27-9401-001 Recombinant Phage Antibody System Expression Kit). Нацеливающие на масляные тельца белки могут быть также химически модифицированными. Например, олеозины могут быть модифицированы изменением химической модификации остатков лизина с использованием химических агентов, таких как биотинил-N-гидроксисукцинимидный эфир, приводящий к процессу, называемому биотинилированием. Это удобно выполнять биотинилированием in vitro масляных телец. Биотинилирование in vivo может выполняться с использованием пептидного домена биотинилирования из биотинкарбокси-белка-носителя ацетил-СоА-карбоксилазы Е. coli (Smith et al. (1998)Nucl. Acids. Res. 26: 1414-1420). Авидин или стрептавидин могут быть затем использованы для выполнения связывания этого редокс-белка с масляным тельцем. В конкретном варианте этим нацеливающим на масляные тельца белком является белок масляного тельца, такой как, например, олеозин или калеозин или их достаточная часть, способная нацеливать на масляное тельце. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие олеозины, известны в данной области. Они включают, например, олеозин Arabidopsis (van Rooijen et al. (1991) Plant Mol. Bio. 18: 11771179); (van Rooijen et al. (1991) Plant Mol. Bio. 18: 1177-1179); олеозин кукурузы (Qu and. Huang (1990) J.Biol. Chem. Vol. 265 4: 2238-2243); олеозин семян рапса (Lee and Huang (1991) Plant Physiol. 96: 13951397); и олеозин моркови (Hatzopoulos et al. (1990) Plant Cell Vol. 2, 457-467.). Последовательности нуклеиновых кислот калеозина также известны в данной области (Naested et al. (2000) Plant Mol Biol. 44 (4): 463-476; Chen et al. (1999) Plant Cell Physiol. 40 (10): 1079-1086). Белки масляных телец из клеток животных, которые могут также использоваться здесь, включают в себя адофилин (Brasaemle et al. (1997) J.Lipid Res., 38: 2249-2263; Heid et al. (1998) Cell Tissue Research 294: 309-321), перилипин (BlanchetteMackie et al. (1995), J. Lipid Res. 36: 1211-1226; Servetnick et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 16970-16973),аполипопротеины, такие как A-I, A-II, A-IV, C-I, C-II, C-III (Segrest et al. (1990), Proteins 8: 103-117) и апоВ (Chatterton et al. (1995) J. Lipid Res. 36: 2027-2037; Davis, RA in: Vance DE, Vance J. editors. Lipoprotein structure and secretion. The Netherlands, Elsevier, 191: 403-426. В одном варианте первый рекомбинантный полипептид слит с белком масляного тельца. Эта методология описана подробно в патенте США US 5650554, который включен здесь в качестве ссылки в его полном виде. Первый рекомбинантный полипептид может быть слит с N-концом, а также с С-концом белка масляного тельца (как описано в Moloney and van Rooijen (1996) INFORM 7: 107-113), и могут быть использованы фрагменты белка масляного тельца, такой как, например, центральный домен молекулы олеозина или модифицированные версии белка масляного тельца. В этом варианте второй рекомбинантный полипептид экспрессируется внутриклеточно и затем внутриклеточно связывается с первым рекомбинантным полипептидом с образованием мультимерного белкового комплекса в клетке. Затем масляные тельца, содержащие мультимерный белковый комплекс, подходящим образом выделяют из клеток. В следующем варианте как первый, так и второй рекомбинантные полипептиды по отдельности связывают с белком масляного тельца. В этом варианте последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и второй полипептиды, могут быть получены по отдельности и введены в отдельные клеточные линии, или они могут быть введены в одни и те же клеточные линии. Если эти последовательности нуклеиновых кислот введены в одну и ту же клеточную линию, эти последовательности нуклеиновых кислот могут быть получены с использованием двух отдельных экспрессирующих векторов,или они могут быть получены с использованием единственного вектора, содержащего последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый полипептид, слитый с белком масляного тельца, и второй полипептид, слитый с белком масляного тельца. Если используются отдельные клеточные линии, используют последующее "скрещивание" потомков (например, скрещивание растений) для получения поколения клеток, содержащих масляные тельца, которые содержат первый и второй рекомбинантные полипептиды, слитые с белком масляного тельца. В другом альтернативном варианте первый и второй рекомбинантные полипептиды сливают с образованием мультимерного слитого белка, содержащего мультимерный белковый комплес. В таком варианте первый и второй полипептиды связаны с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться со слитым белком и с масляным тельцем. В особом варианте слитый белок, содержащий мультимерный белковый комплекс, слит с белком масляного тельца, например,олеозином или калеозином.- 15009181 В представленных здесь вариантах, в которых мультимерный белковый комплекс является иммуноглобулином (например, мультимерным иммуноглобулиновым комплексом), особенно предпочтительным нацеливающим на масляные тельца белком является олеозин или калеозин, связанные с иммуноглобулинсвязывающим белком, таким как, например, белок А (патент США 5151350), белок L (патент СШАUS 5965390) и белок G (патент США US 4954618) или активные фрагменты таких иммуноглобулинсвязывающих белков. Новые белки масляных телец могут быть обнаружены, например, получением масляных телец(описанным более подробно ниже) и идентификацией белков в этих препаратах с использованием, например, электрофореза в ДСН-ПААГ. Могут быть индуцированы поликлональные антитела против этих белков и использованы для скрининга библиотек кДНК для идентификации последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки масляных телец. Эти методологии известны специалисту в данной области (Huynh et al. (1985) in DNA Cloning Vol. 1. a Practical Approach ed. DM Glover, IRL Press, pp 4978). Новые белки масляных телец могут быть также обнаружены с использованием известных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки масляных телец (например, последовательностей нуклеиновых кислот Arabidopsis, семян рапса, моркови и кукурузы) для зондирования, например, библиотек кДНК или геномных библиотек на присутствие последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки масляных телец. В одном варианте первый и второй полипептиды являются первым и вторым редокс-белками. Таким образом, один вариант, обеспеченный здесь, относится к новым и усовершенствованным способам для получения редокс-белков. Неожиданно было обнаружено, что редокс-белок при получении в виде слитого белка со вторым редокс-белком является полностью ферментативно активным при получении в связанном с масляным тельцом виде. В противоположность этому при получении редокс-белка без второго редокс-белка он имеет уменьшенную ферментативную активность. В одном варианте первый редокс-белок является по меньшей мере в 5 раз более активным при получении в виде слитого редоксполипептида в сравнении с получением в виде неслитого полипептида. Таким образом, здесь обеспечены способы получения масляного тельца, связанного с гетеромультимерным редокс-белковым комплексом, включающие:(a) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого редокс-белка и второго редокс-белка,где указанный первый редокс-белок способен взаимодействовать с указанным вторым редокс-белком,предпочтительно в клетке, с образованием указанного гетеромультимерного редокс-белкового комплекса; и(b) связывание указанного гетеромультимерного редокс-белкового комплекса с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и указанным гетеромультимерным редокс-белковым комплексом. В конкретном варианте первый и второй редокс-белки получают в виде слитого белка с образованием слитого редокс-полипептида. Таким образом, здесь обеспечены способы получения ферментативно активного редокс-белка, связанного с масляными тельцами, включающие:a) получение в клетке слитого редокс-полипептида, содержащего первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком;b) связывание указанного слитого редокс-полипептида с масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным слитым редокс-полипептидом и указанными масляными тельцами; иc) выделение указанных масляных телец, связанных с указанным слитым редокс-полипептидом. Масляные тельца, связанные с этим редокс-белком могут быть использованы для получения разнообразных полезных эмульсий. В данном контексте фраза редокс-белки или ее грамматические вариации, относится к любому белку или активному фрагменту белка, способному участвовать в переносе электронов. Например, редокс-белки способны катализировать перенос электрона от донора электрона (также называемого часто восстановителем) к акцептору электрона (также называемому часто окислителем). В процессе переноса электрона восстановитель (донор электрона) окисляется, а окислитель (акцептор электрона) восстанавливается. Примеры используемых здесь редокс-белков включают железосеросодержащие белки, цитохромы, редокс-активные тиол-белки и редокс-активные флавопротеины. Известно, например, что для выполнения их функции в качестве каналов для электронов, редокс-белки,такие как тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза, функционируют посредством взаимодействия или связывания друг с другом в мультимерных белковых комплексах (например, гетеромультимерных белковых комплексах). Термин "слитый редокс-полипептид" в данном контексте относится к любому слитому полипептиду, содержащему первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком (например, в виде трансляционного слияния в рамке считывания). Редокс-белки, которые могут быть использованы в способах и композициях данного изобретения, могут быть любым редокс-белком. В одном варианте первый и второй редокс-белки являются парой редокс-белков, которые могли бы в норме оба происходить из одного и того же источника в природе. В конкретном варианте первым редокс-белком является тиоредоксин, а- 16009181 вторым редокс-белком является тиоредоксинредуктаза. Слитый редокс-полипептид может быть получен в любой клетке, содержащей масляные тельца, в том числе в любой клетке животного, растительной клетке, клетке водорослей, грибковой клетке или бактериальной клетке. В некоторых вариантах слитый редокс-белок продуцируется в растительной клетке и в конкретных вариантах слитый редокс-полипептид продуцируется в клетках семян семенного растения. В специфических вариантах нацеливающий на масляные тельца белок, который используется, является белком масляного тельца. В вариантах данного изобретения, в которых используют белок масляного тельца, первый и второй редокс-белки предпочтительно являются ковалентно слитыми с белком масляного тельца. Таким образом, здесь обеспечены способы получения редокс-белка, связанного с масляным тельцем, включающие:a) введение в клетку химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей: 1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со 2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей:(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида на масляное тельце, связанную в рамке считывания со(ii) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид,содержащий первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком, функционально связанной с 3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию в указанной клетке;b) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного слитого редокс-полипептида в клетке-потомке, содержащей масляные тельца; иc) выделение указанных масляных телец, содержащих указанный слитый редокс-полипептид, из указанной клетки-потомка. Редокс-белки. В соответствии с различными способами и композициями, описанными здесь, может быть использована любая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая редокс-белок. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый и/или второй редокс-белки, может быть получена из любого биологического источника или может быть получена синтетически. В общем, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие редокс-белки, хорошо известны в данной области и являются легкодоступными. См., например, Cristiano et al. (1993) Genomics 17: (2) 348-354, Doyama et al. (1998) Plant Sci. 137: 53-62, Hoeoeg et al. (1984) Biosci. Rep. 4: 917-923; а также последовательности базы данных SwissProtein, приведенные в табл. 5. Известные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие редокс-белки, могут быть использованы для сборки и конструирования последовательностей зондов нуклеиновых кислот для обнаружения и идентификации ранее не обнаруженных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих редокс-белки, например, посредством скрининга библиотек кДНК или геномных библиотек. Таким образом, дополнительные последовательности нуклеиновых кислот могут быть открыты и использованы в соответствии с данным изобретением. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и/или второй редокс-белки, могут быть получены из разных источников или могут быть получены из одного и того же источника. Однако обычно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый редокс-полипептид, содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и второй редокс-белки, полученные из одного и того же источника или из сходных биологических источников. В некоторых приведенных здесь вариантах, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый и второй редокс-белки,получена из одного и того же источника, нуклеиновые кислоты, кодирующие первый редокс-белок и второй редокс-белок, могут быть природно слитыми. В соответствии с особым вариантом эти последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и второй редокс-белки, предпочтительно получают из растительного источника. Как описано выше, полипептидный спейсер или линкер вариабельной длины может отделять первый и второй редокс-белки друг от друга и/или от нацеливающего на масляные тельца белка; и дополнительные редокс-белки (например, один или более) могут быть слиты с первым и/или вторым редоксбелком. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие редокс-белки, могут быть изменены для улучшения уровней экспрессии, например, оптимизацией последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с предпочтительно используемым кодоном для конкретного типа клеток, который выбирают для экспрессии редокс-белков, или изменением мотивов, которые, как известно, дестабилизируют мРНК (см., например, патентную заявку РСТ 97/02352). Сравнение использования кодонов редоксбелков с использованием кодонов хозяина позволит идентифицировать кодоны, которые могут быть изменены. Например, обычно эволюция растений имеет тенденцию в направлении предпочтения обога- 17009181 щенных CG нуклеотидных последовательностей, в то время как бактериальная эволюция привела к смещению в направлении обогащенных AT нуклеотидных последовательностей. Экспрессия может быть оптимизирована модификацией последовательностей нуклеиновых кислот для включения последовательностей нуклеиновых кислот, предпочтительных для клетки-хозяина. Конструирование синтетических генов изменением используемых кодонов описано, например, в патентной заявке РСТ 93/07278. Редокс-белки могут быть изменены с использованием, например, направленного мутагенеза, случайного мутагенеза (Shiraishi et al. (1998) Arch. Biochem. Biophys. 358: 104-115; Galkin et al. (1997) Protein Eng.10: 687-690; Carugo et al. (1997) Proteins 28: 10-28; Hurley et al. (1996) Biochemistry 35: 5670-5678, и/или добавлением органического растворителя (Holmberg et al. (1999) Protein Eng. 12: 851-856). Полипептидные спейсеры между первым и вторым редокс-белками могут быть изменены аналогичными путями. Первый и второй редокс-белки могут быть выбраны для развития двухмерного матрикса и определения, какая комбинация первого и второго редокс-белков является наиболее эффективной в переносе электронов, с использованием, например, колориметрического анализа восстановления (Johnson et al.(1984) J. of Bact. Vol. 158 3: 1061-1069, Luthman et al. (1982) Biochemistry Vol. 21 26: 6628-2233). Комбинации тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы могут тестироваться определением восстановления запасных белков пшеницы и запасного белка молока бета-лактоглобулина in vitro (Del Val et al. (1999) J.Allerg. Clin. Immunol. 103: 690-697). С использованием той же самой стратегии полипептидные спейсеры между первым и вторым редокс-белками могут быть оценены на их эффективность. Первый и второй редокс-белки, которые могут быть использованы здесь, включают, без ограничения, любой первый редокс-белок и второй редокс-белок, выбранные из группы редокс-белков, состоящей из цитохромов, таких как цитохром а, цитохром b и цитохром с; порфиринсодержащих белков, например, гемоглобина; железо-серосодержащих белков, таких как ферредоксин; флавопротеинов, таких как тиоредоксинредуктаза, НАДФ-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, дигидролипоилдегидрогенза,ацил-СоА-дегидрогеназа, оксидаза D-аминокислот, ксантиноксидаза, оротатредуктаза и альдегидоксидаза; связанных с пиридином дегидрогеназ, например лактатдегидрогеназы, глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и бета-гидроксибутиратдегидрогеназы; и содержащих активный тиол редокс-белков, таких как тиоредоксин. В конкретных вариантах обеспеченными здесь белками являются тиоредоксин и восстанавливающая его тиоредоксинредуктаза (которые вместе называют здесь также родственными тиоредоксину белками. В данном контексте термин тиоредоксин относится к относительно малым белкам (обычно приблизительно 12 кДа), которые принадлежат к семейству тиолтрансфераз, катализирующих окисление-восстановление через образование или гидролиз дисульфидных связей, и распределены широко, если ни повсеместно, во всем царстве животных, растений и бактерий. Восстановленная форма тиоредоксина является превосходным катализатором для восстановления даже наиболее неподатливых дисульфидных связей. Для восстановления окисленного тиоредоксина, два клеточных восстановителя обеспечивают восстановительные эквиваленты: восстановленный ферредоксин и НАДФН. Эти восстановительные эквиваленты поставляются тиоредоксину через взаимодействие или ассоциацию с различными тиоредоксинредуктазами, в том числе НАДФН-тиоредоксинредуктазой и ферредоксин-тиоредоксинредуктазой. Подача этих восстановительных эквивалентов требует образования гетеромультимерного белкового комплекса, содержащего тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу. Ферредоксин-тиоредоксинредуктаза участвует в восстановлении растительных тиоредоксинов, обозначаемых Trxf и Trxm, которые участвуют в регуляции фотосинтетических процессов в хлоропласте. НАДФН/тиоредоксин, активный в семенах растений, обозначают Trxh (также называемый здесь тиоредоксином h-типа), и он способен восстанавливать широкий диапазон белков, функционируя в качестве важного клеточного окислительно-восстановительного (редокс) буфера. Обычно, в бактериальных клетках и клетках животных обнаруживается только один тип тиоредоксина, который аналогичен растительному типу Trxh. Тиоредоксины h-типа способны восстанавливаться НАДФН и НАДФНтиоредоксинредуктазой. Приводимые в качестве примеров тиоредоксины дополнительно характеризуются как белок, имеющий центральную часть из 5 -складок, окруженных 4-6 спиралями. Приводимые в качестве примеров тиоредоксины дополнительно характеризуются наличием активного центра, содержащего консенсусную аминокислотную последовательность: X С Y Y С Z, где Y является любой аминокислотой, такой как гидрофобные или неполярные аминокислоты, где X может быть любой из 20 аминокислот, предпочтительно гидрофобной аминокислотой, такой как триптофан, и Z может быть любой аминокислотой, предпочтительно полярными аминокислотами. В некоторых вариантах тиоредоксины для применения здесь содержат активный центр, имеющий аминокислотную последовательность X С G Р С Z. Когда цистеины в активном центре тиоредоксина или подобных тиоредоксину белков являются окисленными, они образуют внутримолекулярную дисульфидную связь. В восстановленном состоянии те же самые активные центры способны участвовать в окислительно-восстановительных (редокс) реакциях через обратимое окисление дитиола его активного центра до дисульфида и катализировать реакции дитиолсульфидного обмена. Примеры тиоредоксинов хорошо известны в данной области и могут быть получены из несколькихBiosci. Rep. 4: 917-923) и термофильных микроорганизмов, таких как Methanococcus jannaschii и Archaeoglobus fulgidus (патентная заявка РСТ 00/36126). Тиоредоксины были также рекомбинантно экспрессированы в нескольких системах-хозяевах, в том числе бактериях (Gautier et al. (1998) Eur J. Biochem. 252: 314-324) и растениях (патентная заявка РСТ WO 00/58453). Коммерческие препараты тиоредоксинов из Е. coli являются легкодоступными, например, из Sigma, Cat. No. T 0910 Thioredoxin (E. coli,рекомбинантный; экспрессируемый в Е. coli). Примеры последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды тиоредоксина, для применения в данном изобретении являются легкодоступными из множества различных биологических источников, в том числе Е. Coli (Hoeoeg et al. (1984) Biosci. Rep.: 4 917-923); Methanococcus jannaschii иal., Plant Cell 8: 1641-1650) и теленка (Terashima et al. (1999) DNA Seq. 10(3): 203-205) и т.д. В других вариантах примеры нуклеиновых кислот для применения здесь включают нуклеиновые кислоты, кодирующие тиоредоксин и подобные тиоредоксину полипептидные цепи, представленные в SEQ ID NO: 38,42, 46 и 50; и нуклеиновые кислоты, кодирующие тиоредоксин и подобные тиоредоксину цепи, представленные в табл. 5 в виде SEQ ID NO: 52-194. Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислоты, представленные в SEQ ID NO: 52-194, могут быть легко идентифицированы через идентификационные номера (номера доступа), приведенные в табл. 5 (в скобках). В данном контексте термин тиоредоксинредуктаза откосится к белку, который образует комплексы с флавином, таким как FAD. Соединение флавина служит в качестве донора электрона для активного центра белка тиоредоксинредуктазы. Тиоредоксинредуктазы имеют окислительно-восстановительно активный центр дисульфидной связи, способный восстанавливать тиоредоксин. Активный центр тиоредоксинредуктазы содержит 2 цистеина. Тип аминокислот, окружающих эти 2 остатка цистеина, образующих активный центр, может варьироваться в виде гидрофобных, неполярных и полярных аминокислот. Примером тиоредоксинредуктазы является НАДФН-тиоредоксинредуктаза (NTR), которая является цитозольным гомодимерным ферментом, содержащим обычно 300-500 аминокислот. Были получены кристаллические структуры тиоредоксинредуктазы как Е. coli, так и растений (Waksman et al. (1994) J. Mol. Biol. 236: 800-816; Dai et al.(Jacquot et al. (1994) J. Mol. Biol. 235: 1357-1363) и пшенице (патентная заявка РСТ 00/58453). Примеры последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки тиоредоксинредуктазы,могут быть легко получены из различных источников, таких как последовательность, изображенная в табл. 5 в представленном здесь Списке последовательностей, обеспеченном здесь, из Arabidopsis (RiveiraMadrid et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5620-5624), E. coli (Russel et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 9015-9019); ячменя (патентная заявка РСТ 00/58352) и пшеницы (Gautier et al. (1998), Eur. J. Biochem. 252: 314-324); и т.п. В других вариантах примеры нуклеиновых кислот для применения здесь включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные цепи тиоредоксинредуктаз, представленные в виде SEQ ID NO: 8, 9, 10, 40, 44, 48 и 50, и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные цепи тиоредоксинредуктаз, представленные в табл. 5 в виде последовательностей SEQ ID NO: 195-313. Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислоты, представленные в SEQ ID NO: 195-313, могут быть легко идентифицированы через идентификационные номера (номера доступа) базы данных Swiss Protein, приведенные в табл. 5 (в скобках). Предполагается также применение в способах и композициях, обеспеченных здесь, гомологов нуклеиновых кислот и аминокислот, которые являются "по существу гомологичными" нуклеиновым кислотам и аминокислотам тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы, представленным здесь, которые включают полипептиды тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы, кодируемые последовательностью нуклеотидов,которая гибридизуется в условиях низкой, умеренной или высокой жесткости с последовательностью нуклеотидов, кодирующей нуклеиновые кислоты и аминокислоты тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы, представленные здесь (например, в примерах, списке последовательностей и/или табл. 5). В применении здесь гомолог ДНК или нуклеиновой кислоты обозначает нуклеиновую кислоту, которая включает предварительно выбранную консервативную нуклеотидную последовательность, например, последовательность, кодирующую терапевтический полипептид. Под термином "по существу гомологичные" имеют в виду обладающие по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% гомологией с ней или более низкий процент гомологии или идентичности с сохранением биологической активности или функции. Термины "гомология" или "идентичность" часто используются взаимозаменяемо. В этом отношении, процент гомологии или идентичности может быть определен, например, сравнением информации- 19009181 последовательностей с использованием компьютерной программы GAP. Программа GAP использует способ сопоставления Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), пересмотренный Smith andWaterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981). Вкратце, программа GAP определяет сходство как число сопоставляемых символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, деленное на общее число символов в более короткой из двух сравниваемых последовательностей. Предпочтительные параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) унитарную матрицу сравнения(содержащую величину 1 для идентичностей и 0 для неидентичностей) и матрицу взвешенного сравнения Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), описанную Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS(1979); (2) штраф 3,0 за каждый пробел и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом пробеле; и (3) отсутствие штрафа за концевые пробелы. Посредством идентичности последовательностей, число консервативных аминокислот определяют с использованием стандартных программ алгоритмов сопоставления и используют со штрафами по умолчанию, устанавливаемыми каждым поставщиком. По существу, гомологичные последовательности нуклеиновых кислот будут гибридизоваться обычно при умеренной жесткости или при высокой жесткости вдоль всей длины представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Предпочтительно две молекулы нуклеиновых кислот будут гибридизоваться в условиях высокой жесткости. Обсуждаются также молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующейся молекуле нуклеиновой кислоты. Имеют ли любые две молекулы нуклеиновых кислот нуклеотидные последовательности, которые являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% "идентичными", может быть определено с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа "FAST А", с использованием, например, параметров по умолчанию, как описано в Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988). Альтернативно, может быть использована функция BLAST базы данных Национального центра информации биотехнологии для определения относительной идентичности последовательностей. Обычно последовательности сопоставляют таким образом, чтобы получить совпадение наивысшего порядка. "Идентичность" как таковая имеет общепринятое в данной области значение и может быть рассчитана с использованием опубликованных способов (см., например, Computational Molecular Biology,Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects,Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.,and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje,G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M StocktonPress, New York, 1991). Хотя существует ряд способов для измерения идентичности между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями, термин "идентичность" является хорошо известным специалистам в данной области (Carillo, H. and Lipton, D., SIAM J Applied Math 45: 1073(1988. Способы, обычно применяемые для определения идентичности или сходства между двумя последовательностями, включают в себя, но не ограничиваются ими, способы, описанные в руководстве Guide toJ Applied Math 48: 1073 (1988). Способы определения идентичности и сходства закодированы в компьютерных программах. Предпочтительные способы компьютерных программ для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются ими, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984, BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., JMolec Biol 215: 403 (1990. Таким образом, в применении здесь термин идентичность представляет сравнение между тестируемым и ссылочным полипептидами или полинуклеотидами. Например, тестируемый полипептид может быть определен как любой полипептид, который является на 90% или более идентичным ссылочному полипептиду. В применении здесь термин по меньшей мере на 90% идентичный обозначает процент идентичности от 90 до 99,99% относительно ссылочных полипептидов. Идентичность на уровне 90% или более свидетельствует о том факте, что, предположим с целью примера, сравнивают длину 100 аминокислот испытуемого (тест-)полипептида и ссылочного полипептида. Не более чем 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в тест-полипептиде отличаются от аминокислот ссылочных полипептидов. Аналогичные сравнения могут быть сделаны между тест- и ссылочным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точковых мутаций, случайным образом распределенных на протяжении всей длины аминокислотной последовательности, или они могут быть собраны в виде кластеров в одном или более местоположениях варьирующей длины вплоть до максимально допускаемого, например, 10/100 различия аминокислот (приблизительно 90% идентичности). Различия определяют как замены или делеции нуклеиновых кислот или аминокислот. В применении здесь жесткость гибридизации в определении процента ошибочного спаривания является следующей:- 20009181 1) высокая жесткость: 0,1SSPE, 0,1% ДСН, 65 С,2) умеренная жесткость: 0,2SSPE, 0,1% ДСН, 50 С,3) низкая жесткость: 1,0SSPE, 0,1% ДСН, 50 С. Специалисты в данной области знают, что стадию промывки используют для отбора стабильных гибридов, и также знают ингредиенты SSPE (см., например, Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), vol. 3, p. B.13, см. также многочисленные каталоги, в которых описаны обычно используемые лабораторные растворы). SSPE является забуференным фосфатом до рН 7,4 0,18 NaCl. Кроме того, специалисты в данной области знают, что стабильность гибридов определяется Tm, которая является функцией концентрации ионов натрия и температуры (Tm=81,5 С-16,6(log10[Na+])+0,41(%G+C)-600/l, так что единственными параметрами в условиях промывок, критическими для стабильности гибридов, являются концентрация ионов натрия в SSPE(или SSC) и температура. Понятно, что эквивалентные жесткости могут быть достигнуты с использованием альтернативных буферов, солей и температур. Например, без ограничения, процедурами, использующими условия низкой жесткости, являются следующие условия (см. также Shilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6789-6792 (1981: фильтры, содержащие ДНК, предобрабатывают в течение 6 ч при 40 С в растворе,содержащем 35% формамид, 5 Х SSC, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА, 0,1% ПВП, 0,1% фиколл,1% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося (10 Х SSC обозначает 1,5 М хлорид натрия и 0,15 М цитрат натрия, доведенные до рН 7). В конкретном варианте гетеромультимерный белковый комплекс получают в виде слитого белка между первым и вторым редокс-белками, где первым редокс-белком является тиоредоксин, а вторым редокс-белком является тиоредоксинредуктаза. В одном варианте второй рекомбинантный полипептид,например тиоредоксинредуктаза, расположен N-терминально относительно первого рекомбинантного полипептида, например тиоредоксина. Таким образом, любой белок, который классифицирован как тиоредоксин, такой как тиоредоксиновый компонент системы НАДФН-тиоредоксина и тиоредоксин, присутствующий в системе ферредоксин/тиоредоксин, также известные как TRx и TRm, может быть использован в комбинации с любой тиоредоксинредуктазой, такой как НАДФН-тиоредоксинредуктаза и ферредоксин-тиоредоксинредуктаза и любыми другими белками, обладающими способностью восстанавливать тиоредоксин. В конкретных вариантах тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза получены из растения. В альтернативном варианте используют природно встречающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слияние белков тиоредоксин/тиоредоксинредуктаза, получаемых из Mycobacterium leprae (Wieles et al. (1995) J. Biol. Chem. 27: 25604-25606), как описано в примерах здесь. Иммуноглобулины. В другом варианте данного изобретения мультимерными белковыми комплексами являются иммуноглобулины. В применении здесь полипептидная цепь иммуноглобулина обозначает первый полипептид, который способен связываться со вторым полипептидом с образованием иммунологически активного (т.е. способного связывать антиген) мультимерного белкового комплекса. Типы иммуноглобулинов и полипептидных цепей иммуноглобулинов, обсуждаемые для применения здесь, включают иммунологически активные (т.е. антигенсвязывающие) части легкой и тяжелой цепей. Примеры иммуноглобулинов и полипептидных цепей иммуноглобулинов для применения здесь включают, по существу,интактные иммуноглобулины, в том числе любой из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, а также любую часть иммуноглобулина, в том числе части, хорошо известные как Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')2.sub2.фрагменты и Fv-фрагменты. В этом варианте первым рекомбинантным полипептидом может быть тяжелая цепь любого иммуноглобулина, в том числе тяжелая цепь любого из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, а вторым рекомбинантным полипептидом может быть легкая цепь каппа или лямбда иммуноглобулина. Таким образом, здесь обеспечены способы получения иммуноглобулина, включающие: (а) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первой полипептидной цепи иммуноглобулина и второй полипептидной цепи иммуноглобулина, где указанная первая полипептидная цепь иммуноглобулина способна связываться с указанной второй полипептидной цепью иммуноглобулина с образованием указанного иммуноглобулина; и (b) связывание указанного иммуноглобулина с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и с указанной первой полипептидной цепью иммуноглобулина. Как показано здесь, мультимерный иммуноглобулин связан с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок. В конкретных вариантах нацеливающим на масляные тельца белком может быть слитый полипептид, содержащий белок масляного тельца и иммуноглобулинсвязывающий белок, такой как, например, белок А, белок L и белок G. Еще в одном варианте с участием иммуноглобулинов первый и второй рекомбинантные полипептиды (иммуноглобулины) по отдельности слиты с белком масляного тельца, например, олеозином или калеозином. Например,a) первым рекомбинантным полипептидом может быть тяжелая цепь иммуноглобулина, в том числе- 21009181 тяжелая цепь любого из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM, а вторым рекомбинантным полипептидом может быть легкая цепь каппа или лямбда иммуноглобулина; илиb) первым рекомбинантным полипептидом может быть вариабельный и первый константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а вторым рекомбинантным полипептидом может быть легкая цепь каппа или лямбда иммуноглобулина; илиc) первым рекомбинантным полипептидом может быть вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а вторым рекомбинантным полипептидом может быть вариабельный домен легкой цепи каппа или лямбда иммуноглобулина. В некоторых вариантах слитые полипептиды конструируют или отбирают для обеспечения возможности образования гетеромультимерного белкового комплекса между последовательностями легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина на масляных тельцах в клетке, содержащей масляные тельца. Получение экспрессирующих векторов, содержащих нацеливающие на масляные тельца белки и первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки. В соответствии с данным изобретением, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки,гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, и нацеливающий на масляные тельца белок подходящим образом продуцируются в клетке. Для получения рекомбинантных полипептидов или мультимерных белковых комплексов последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую либо первый и/или второй рекомбинантые полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды,либо первый и/или второй родственные тиоредоксину белки; и/или нацеливающий на масляные тельца белок, включают в рекомбинантный экспрессирующий вектор. Таким образом, здесь обеспечены рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие химерные нуклеиновые кислоты, обеспеченные здесь, пригодные для экспрессии нацеливающего на масляные тельца белка и первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов, полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов или первого и/или второго родственных тиоредоксину белков, пригодные для выбранной клетки. Термин "пригодные для экспрессии в выбранной клетке" означает, что рекомбинантный экспрессирующий вектор содержит все последовательности нуклеиновых кислот, требующиеся для осуществления экспрессии в выбранной клетке. Таким образом, рекомбинантные экспрессирующие векторы содержат дополнительно регуляторные последовательности нуклеиновых кислот, выбранные на основе клетки, которую используют для экспрессии и осуществления инициации и терминации транскрипции, функционально связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный полипептид или мультимерный белковый комплекс и/или нацеливающий на масляные тельца белок. Регуляторные последовательности нуклеиновых кислот включают промоторы, энхансеры, "молчащие" элементы, сайты связывания рибосом,последовательности Шайна-Далгарно, интроны и другие элементы экспрессии. "Функционально связанные" означает, что последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие регуляторные участки, связанные с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими рекомбинантный полипептид или мультимерный белковый комплекс и/или нацеливающий на масляные тельца белок, делают возможной экспрессию в данной клетке. Типичная конструкция нуклеиновой кислоты содержит в направлении 5'-3' промоторный участок, способный направлять экспрессию, участок, кодирующий первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки и/или нацеливающий на масляные тельца белок, и участок терминации, функциональный в выбранной клетке. Выбор регуляторных последовательностей будет зависеть от организма и типа клеток, в которых экспрессируются первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки и/или нацеливающий на масляные тельца белок, и может влиять на уровни экспрессии данного полипептида. Регуляторные последовательности известны в данной области, и их выбирают для регуляции экспрессии нацеливающего на масляные тельца белка и рекомбинантных полипептидов или мультимерных белковых комплексов в клетке. Промоторы, которые могут быть использованы в бактериальных клетках, включают промотор lac(Blackman et al. (1978) Cell: 13: 65-71), промотор trp (Masuda et al. (1996) Protein Eng: 9: 101-106) и промо- 22009181 торы Т 7 (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130). Промоторы, функциональные в клетках растений,которые могут быть использованы здесь, включают конститутивные промоторы, такие как промоторCaMV 35S (Rothstein et al. (1987) Gene: 53: 153-161), промотор актина (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171) и промотор убиквитина (европейская патентная заявка 0342926). Другие промоторы являются специфическими для определенных тканей или органов (например, корней, листьев, цветков или семян) или типов клеток (например, эпидермальных клеток, мезофильных клеток листьев или клеток коры корня) и/или в отношении определенных стадий развития растений. Тайминг экспрессии может контролироваться выбором индуцируемого промотора, например, промотора PR-a, описанного в патенте США 5614395. Таким образом, выбор промотора зависит от желаемого местоположения и времени накопления желаемого полипептида. В особом варианте, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки,гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, и/или нацеливающий на масляные тельца белок, экспрессируются в клетке семени и используют семеноспецифические промоторы. Семеноспецифические промоторы, которые могут быть использованы здесь, включают, например,промотор фазеолина (Sengupta-Gopalan et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 82: 3320-3324) и промотор олеозина 18 кДа Arabidopsis (van Rooijen et al. (1992) Plant. Mol. Biol. 18: 1177-1179). Постоянно открываются новые промоторы, применимые в различных типах клеток растений. Многочисленные примеры растительных промоторов могут быть найдены в Ohamuro et al. (Biochem of Pl. (1989) 15: 1-82). Генетические элементы, способные усиливать экспрессию полипептида, могут быть включены в экспрессирующие векторы. В клетках растений они включают, например, нетранслируемые лидерные последовательности из вирусов, такие как лидерная последовательность AMV (Jobling and Gehrke (1987)Nature: 325: 622-625) и интрон, связанный с промотором убиквитина кукурузы (см. патент США US 5504200). Терминаторы транскрипции являются общепризнанными в данной области и наряду с функционированием в качестве сигнала для терминации транскрипции служат в качестве защитного элемента, служащего для удлинения полужизни мРНК (Guarneros et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 79: 238-242). В последовательностях нуклеиновых кислот для экспрессии в растительных клетках терминатор транскрипции обычно имеет длину приблизительно 200 нуклеотидов - приблизительно 1000 нуклеотидов. Последовательности терминатора, которые могут быть использованы здесь, включают, например,участок терминации нопалинсинтазы (Bevan et al. (1983) Nucl. Acid. Res.: 11: 369-385), терминатор фазеолина (van der Geest et al. (1994) Plant J.: 6: 413-423), терминатор гена октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens или другие подобным образом функционирующие элементы. Терминаторы транскрипции могут быть получены, как описано An (1987) Methods in Enzym. 153: 292. Выбор терминатора транскрипции может оказывать влияние на скорость транскрипции. Таким образом, здесь обеспечены химерные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки. В одном варианте указанная нуклеиновая кислота содержит:(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нацеливающий на масляные тельца белок, функционально связанную в рамке считывания со(b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, полипептидную цепь иммуноглобулина или редокс-белок, связанной в рамке считывания с(c) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид, полипептидную цепь иммуноглобулина или редокс-белок, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды, полипептидные цепи иммуноглобулина или редокс-белки способны образовывать мультимерный белковый комплекс. В другом варианте здесь обеспечен экспрессирующий вектор, содержащий: 1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со 2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей (i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида на масляное тельце, связанную в рамке считывания с (ii) последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей мультимерный слитый белок, такой как слитый редокс-полипептид или иммуноглобулин, содержащий первый рекомбинантный полипептид, такой как редокс-белок или полипептидная цепь иммуноглобулина, связанный со вторым рекомбинантным полипептидом, таким как второй редокс-белок или вторая полипептидная цепь иммуноглобулина, функционально связанной с 3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию в указанной клетке.- 23009181 Рекомбинантный экспрессирующий вектор может дополнительно содержать маркерный ген. Маркерные гены, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, включают все гены, которые позволяют отличать трансформированные клетки от нетрансформированных клеток, в том числе все селектируемые и скринированные маркерные гены. Маркером может быть маркер устойчивости, такой как маркер устойчивости к антибиотику, например, к канамицину, ампициллину, G418, блеомицину, гигромицину, хлорамфениколу, который позволяет производить отбор признака химическими средствами, или маркер устойчивости, например, к химическому агенту, такому как в норме фитотоксичный сахар манноза (Negrotto et al. (2000) Plant Cell Rep. 19: 798-803). В растительных рекомбинантных экспрессирующих векторах могут быть удобным образом использованы маркеры устойчивости к гербицидам, например, маркеры, придающие устойчивость к глифозату (патенты США 4940935 и 5188642) или фосфинотрицину (White et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 1062; Spencer et al. (1990) Theor.,Appl. Genet. 79: 625-631). Маркеры устойчивости к гербициду, при связывании вблизи редокс-белка или нацеливающего на масляные тельца белка, могут быть использованы для поддержания давления отбора на популяции клеток растений или популяции растений для тех растений, которые не потеряли представляющий интерес белок. Скринируемые маркеры, которые могут быть использованы для идентификации трансформантов посредством визуального наблюдения, включают -глюкуронидазу (GUS) (см. патенты США 5268463 и 5599670) и зеленый флуоресцентный белок (GFP) (Niedz et al. (1995) Plant CellRep.: 14: 403). Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут дополнительно содержать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие нацеливающие сигналы, обеспечивающие нацеливание на компартмент клетки или органеллу. Подходящие нацеливающие сигналы, которые могут быть использованы здесь, включают сигналы, которые способны нацеливать полипептиды на эндомембранную систему. Примеры нацеливающих сигналов, которые могут быть использованы здесь, включают нацеливающие сигналы, способные направлять данный белок в периплазму, цитоплазму, аппарат Гольджи, апопласт(Sijmons et al., 1990, Bio/Technology, 8: 217-221), хлоропласт (Comai et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 1510415109), митохондрию, пероксисому (Unger et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 411-418), эндоплазматический ретикулум (ЭР), вакуоль (Shinshi et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 357-368) и масляное тельце. Посредством включения подходящих нацеливающих последовательностей можно направлять нацеливающий на масляные тельца белок или первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редоксполипептиды и/или родственные тиоредоксину белки в желаемые органеллу или клеточный компартмент. Рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения могут быть получены в соответствии с методологиями, хорошо известными специалистам в области молекулярной биологии (см., например, Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Press). Получение этих конструкций может включать в себя такие способы, как рестрикционное расщепление, лигирование, гельэлектрофорез, секвенирование ДНК и ПЦР. Большое разнообразие клонирующих векторов доступно для выполнения необходимых стадий клонирования, приводящих к получению рекомбинантного экспрессирующего вектора, обеспечивающего экспрессию полипептида. Особенно подходящими для этой цели являются векторы с системой репликации, которая является функциональной в Escherichia coli, такие какpBR322, серия векторов PUC, серия векторов M13mp, pBlueScript и т.д. Обычно эти векторы содержат маркер, позволяющий проводить отбор трансформированных клеток, например, приданием устойчивости к антибиотику. Последовательности нуклеиновых кислот могут быть введены в эти векторы, и векторы могут быть введены в Е. coli, выращенную в подходящей среде. Векторы могут быть извлечены из клеток после сбора и лизиса этих клеток. Рекомбинантные экспрессирующие векторы, подходящие для введения последовательностей нуклеиновых кислот в клетки растений, включают векторы на основе Agrobacterium и Rhizobium, такие какTi- и Ri-плазмиды. Векторы на основе Agrobacterium обычно несут по меньшей мере одну пограничную последовательность Т-ДНК и включают векторы, такие как pBIN 19 (Bevan (1984) Nucl Acids Res. Vol. 12, 22: 8711-8721) и другие бинарные векторные системы (например, патент США US 4940838). Получение клеток, содержащих первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки и нацеливающие на масляные тельца белки. В соответствии с данным изобретением, рекомбинантные экспрессирующие векторы вводят в клетку, которую подвергают отбору, и отобранные клетки выращивают для получения первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов,полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов, первого и/или второго родственных тиоредоксину белков; и нацеливающего на масляные тельца белка либо непосредственно, либо в- 24009181 клетке-потомке. Методологии для введения рекомбинантных экспрессирующих векторов в клетку, называемые также "трансформацией", хорошо известны в данной области и варьируются в зависимости от выбранного типа клеток. Обычные способы для переноса рекомбинантных экспрессирующих векторов в клетку включают электропорацию; химически опосредованные способы, например, CaCl2-опосредованное поглощение нуклеиновых кислот; бомбардировку частицами (баллистику); применение природно инфекционных последовательностей нуклеиновых кислот, например, происходящих из вирусов последовательностей нуклеиновых кислот или, при использовании клеток растений, произведенных из Agrobacterium или Rhizobium последовательностей нуклеиновых кислот; ПЭГ-опосредованное поглощение нуклеиновых кислот, микроинъекцию и применение карборундовых усов (нитевидных монокристаллов)(Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9: 415-418), все из которых могут применяться здесь. Введение рекомбинантного экспрессирующего вектора в клетку может приводить к интеграции посредством его полного или частичного поглощения в геном клетки-хозяина, в том числе хромосомную ДНК или пластидный геном. Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может не интегрироваться в геном и реплицироваться независимо от геномной ДНК клетки-хозяина. Обычно используют геномную интеграцию последовательности нуклеиновой кислоты, так как она обеспечит возможность стабильного наследования введенных последовательностей нуклеиновых кислот последующими поколениями клеток и создание линий клеток растений или животных. Конкретные варианты включают применение растительных клеток. Конкретные используемые здесь клетки растений включают клетки, получаемые из американского ореха (Bertholletia excelsa); клещевины (Riccinus communis); кокосового ореха (Cocus nucifera); кориандра (Coriandrum sativum); хлопчатника (Gossypium spp.); земляного ореха, арахиса (Arachis hypogaea); джоджобы (SimmondsiaSinapis alba); гвинейской масличной пальмы (Elaeis guineeis); маслины европейской (Olea europea); семян рапса (Brassica spp.); сафлора (Carthamus tinctorius); сои (Glicine max); тыквы (Cucurbita maxima); ячменя(Hordeum vulgare); пшеницы (Triticum aestivum) и подсолнечника (Helianthus annuus). Методологии трансформации для двудольных видов растений хорошо известны. Обычно используют опосредованную Agrobacterium трансформацию вследствие ее высокой эффективности, а также общей восприимчивости многими, если ни всеми, видами двудольных растений. Трансформация с использованием Agrobacterium обычно включает перенос бинарного вектора (например, pBIN19), содержащего представляющую интерес ДНК, в подходящий штамм Agrobacterium (например, CIB542), например, посредством трехродительского скрещивания со штаммом Е. coli, несущим рекомбинантный бинарный вектор, и штаммом Е. coli, несущим хелперную плазмиду, способную мобилизовать бинарный вектор в штамм Agrobacterium, или посредством трансформации ДНК штамма Agrobacterium (Hofgen etal. Nucl. Acids. Res. (1988) 16: 9877. Другие методологии трансформации, которые могут быть использованы для трансформации видов двудольных растений, включают баллистику (Sanford (1988) Trends inBiotechn. 6: 299-302); электропорацию (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828); ПЭГ-опосредованное поглощение ДНК (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genetics 199: 169-177); микроинъекцию (Reich et al. Bio/Techn. (1986) 4: 1001-1004) и применение карборундовых усов (нитевидных монокристаллов) (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9: 415-418). Конкретные методологии трансформации обычно варьируются в некоторой степени в зависимости от используемого вида растений. В особом варианте масляные тельца получают из сафлора и рекомбинантные белки экспрессируются в сафлоре. Трансформация сафлора описана Baker and Dyer (Plant Cell Rep. (1996) 16: 106-110). Однодольные виды растений могут быть теперь тоже трансформированы с использованием множества методологий, в том числе бомбардировки частицами (Christou et al. (1991) Biotechn. 9: 957-962;Weeks et al. Plant Physiol. (1993) 102: 1077-1084; Gordon-Kamm et al. Plant Cell (1990) 2: 603-618), ПЭГопосредованного поглощения ДНК (ЕР 0292435; 0392225) или опосредованной Agrobacterium трансформации (Goto-Fumiyuki et al. (1999) Nature-Biotech. 17 (3): 282-286). Трансформация пластид описана в патентах США 5451513; 5545817 и 5545818 и в заявках на патент РСТ 95/16783; 98/11235 и 00/39313). Основная трансформация хлоропластов включает введение клонированной пластидной ДНК, фланкирующей селектируемый маркер, вместе с представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, в подходящую ткань-мишень с использованием, например, баллистики или трансформации протопластов. Селектируемые маркеры, которые могут быть использованы, включают, например, бактериальный ген aadA (Svab et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917). Пластидные промоторы, которые могут быть использованы, включают, например, промотор гена табака clpP (заявка на патент РСТ 97/06250). В другом варианте химерные конструкции нуклеиновых кислот данного изобретения, обеспеченные здесь, трансформируют непосредственно в пластидный геном. Технология трансформации пластид подробно описана в патентах США 5451513, 5545817, 5545818 и 5576198; в заявках РСТ с номерами WO 95/16783 и WO 97/32977; и McBride et al., Proc Natl Acad Sci USA 91: 7301-7305 (1994), полные описания которых включены здесь в качестве ссылки. В одном варианте трансформация пластид достигается посредством баллистики, впервые проведенной в одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonasreinhardtii (Boynton et al. (1988) Science 240: 1534-1537 и затем распространенной на Nicotiana tabacum(Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530), в комбинации с отбором на цис-действующие локусы устойчивости к антибиотику (устойчивости к спектиномицину или стрептомицину) или комплементацией нефотосинтетических мутантных фенотипов. В другом варианте трансформацию пластид табака проводят бомбардировкой частицами ткани листа или каллуса или опосредованным полиэтиленгликолем (ПЭГ) поглощением плазмидной ДНК протопластами с использованием клонированной пластидной ДНК, фланкирующей селективный маркер устойчивости к антибиотику. Например, фланкирующие участки 1-1,5 т.п.н., называемые нацеливающими последовательностями, облегчают гомологичную рекомбинацию с пластидным геномом и позволяют заменять или модифицировать специфические участки 156 т.п.н. пластидного генома табака. В одном варианте точковые мутации в пластидной рДНК 16S и генах rpsl2, придающие устойчивость к спектиномицину и/или стрептомицину, могут быть использованы в качестве селектируемых маркеров для трансформации (Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530); Staub et al. (1992) Plant Cell 4: 3945, полные описания которых включены здесь в качестве ссылки), и они приводят к образованию стабильных гомоплазматических трансформантов при частоте приблизительно один на 100 бомбардировок листьев-мишеней. Присутствие сайтов клонирования между этими маркерами позволяет создать нацеливающий на пластиду вектор для введения чужеродных генов (Staub et al. (1993) EMBO J 12: 601-606, полное описание которого включено здесь в качестве ссылки). В другом варианте существенные увеличения частоты трансформации могут быть получены заменой рецессивных генов устойчивости к антибиотику рРНК или р-белка доминантным селектируемым маркером, бактериальным геном aadA, кодирующим детоксифицирующий спектиномицин фермент аминогликозид-3'-аденилтрансферазу (Svab et al. (1993) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90: 913-917, полное описание которой включено здесь в качестве ссылки). Этот маркер был успешно использован также для трансформации с высокой частотой пластидного генома зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl Acids Res 19, 4083-4089,полное описание которой включено здесь в качестве ссылки). В других вариантах трансформация пластид протопластов табака и мха Physcomitrella может быть достигнута ПЭГ-опосредованным поглощением ДНК (O'Neill et al. (1993) Plant J 3: 729-738; Koop et al. (1996) Planta 199: 193-201, полные описания которых включены здесь в качестве ссылки). Как бомбардировка частицами, так и трансформация протопластов также обсуждаются для применения здесь. Трансформация пластид масличных растений успешно проводилась в родах Arabidopsis иBrassica (Sikdar et al. (1998) Plant Cell Rep. 18: 20-24; заявка РСТ WO 00/39313, полные описания которых включены здесь в качестве ссылки). Химерную конструкцию нуклеиновой кислоты встраивают в пластидную экспрессионную кассету,включающую промотор, способный экспрессировать конструкцию в пластидах растений. Конкретным промотором, способным к экспрессии в пластиде растения, является, например, промотор, выделенный из 5'-фланкирующего участка выше кодирующего участка пластидного гена, который может происходить из того же самого или отличающегося вида и нативный продукт которого обычно обнаруживается в большинстве типов пластид, в том числе пластид, присутствующих в незеленых тканях. Экспрессия генов в пластидах отличается от экспрессии ядерных генов и является родственной экспрессии генов в прокариотах (Stern et al. Trends in Plant Sci 2: 308-315), полное описание которой включено здесь в качестве ссылки). Пластидные промоторы содержат обычно элементы -35 и -10, типичные для прокариотических промоторов, и некоторые пластидные промоторы, называемые промоторами PEP (кодируемой пластидой РНК-полимеразы), распознаются Е. coli-подобной РНК-полимеразой, в большинстве случаев кодируемой в пластидном геноме, тогда как другие пластидные промоторы, называемые промоторами NEP, распознаются ядерно-кодируемыми РНК-полимеразами. Оба пластидных промотора являются пригодными для применения здесь. Примеры пластидных промоторов включают промоторы генов clpP, такие как промотор гена clpP табака (WO 97/06250, полное описание которого включено здесь в качестве ссылки) и промотор гена clpP Arabidopsis (заявка США 09/038878, полное описание которой включено здесь в качестве ссылки). Другой промотор, способный управлять экспрессией химерной конструкции нуклеиновой кислоты в пластидах растений, происходит из регуляторного участка оперона рибосомной РНК 16S (Harris et al. (1994) Microbiol Rev 58: 700-754; Shinozaki et al. (1986) EMBO J 5: 2043-2049, полные описания которых включены здесь в качестве ссылки). Другими примерами промоторов, способных управлять экспрессией конструкции нуклеиновой кислоты в пластидах растений, включают промоторpsbA и промотор rbcL. Пластидная экспрессионная кассета предпочтительно включает в себя дополнительно 3'-нетранслируемую последовательность (3'UTR) пластидного гена, функционально связанную с химерной конструкцией нуклеиновой кислоты данного изобретения. Роль нетранслируемых последовательностей заключается скорее в том, чтобы управлять 3'-процессингом транскрибируемой РНК, а не терминировать транскрипцию. Примером 3'UTR является 3'-нетранслируемая последовательность пластидного гена rps16 или 3'-нетранслируемая последовательность пластидного гена psbA Arabidopsis. В дополнительном варианте пластидная экспрессионная кассета включает поли-G-участок 3'-нетрансли- 26009181 руемой последовательности. Пластидная экспрессионная кассета предпочтительно включает также 5'нетранслируемую последовательность (5'UTR), функционирующую в пластидах растений, функционально связанную с химерной конструкцией нуклеиновой кислоты, обеспеченной здесь. Пластидная экспрессионная кассета содержится в пластидном трансформирующем векторе, который предпочтительно дополнительно включает фланкирующие участки для интеграции в геном пластиды посредством гомологичной рекомбинации. Пластидный трансформирующий вектор может необязательно включать один пластидный сайт инициации репликации. Данное изобретение включает также пластиду растения, трансформированную таким пластидным трансформирующим вектором, где химерная конструкция нуклеиновой кислоты является экспрессируемой в пластиде растения. Здесь описаны также растение или клетка растения, в том числе ее потомство, содержащие эту пластиду растения. В конкретном варианте это растение или клетка растения, в том числе их потомство, является гомоплазматическим в отношении трансгенных пластид. Другие промоторы, способные управлять экспрессией химерной конструкции нуклеиновой кислоты в пластидах растений, включают регулируемые трансактиватором промоторы, предпочтительно гетерологичные в отношении растения или субклеточной органеллы или компонента клетки растения, в которой осуществляется экспрессия. В этих случаях молекулу ДНК, кодирующую трансактиватор, встраивают в подходящую кассету ядерной экспрессии, которую трансформируют в растительную ядерную ДНК. Трансактиватор нацелен на пластиды посредством пластидного транзитного белка. Трансактиватор и управляемая трансактиватором молекула ДНК объединяются вместе либо скрещиванием выбранной линии с трансформированными пластидами с трансгенной линией, содержащей молекулу ДНК, кодирующую трансактиватор, дополненную нацеливающей на пластиды последовательностью и функционально связанную с ядерным промотором, либо прямой трансформацией пластидного трансформирующего вектора, содержащего желаемую молекулу ДНК, в трансгенную линию, содержащую химерную конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую трансактиватор, дополненной нацеливающей на пластиды последовательностью, функционально связанной с ядерным промотором. Если ядерный промотор является индуцируемым промотором, в частности химически индуцируемым вариантом, экспрессия химерной конструкции нуклеиновой кислоты в пластидах растений активируется посредством нанесения на листья химического индуктора. Такая индуцируемая опосредованная трансактиватором экспрессионная система растений является предпочтительно строго регулируемой, без детектируемой экспрессии перед индукцией и чрезвычайно высокой экспрессией и высоким накоплением белка после индукции. Конкретным трансактиватором является, например, вирусная РНК-полимераза. Конкретными промоторами этого типа являются промоторы, распознаваемые односубъединичной РНК-полимеразой, такие как промотор гена 10 Т 7, который распознается ДНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага Т 7. Ген, кодирующий полимеразу Т 7 предпочтительно трансформируют в ядерный геном и полимеразу Т 7 нацеливают на пластиды с использованием пластидного транзитного пептида. Промоторы, пригодные для ядерной экспрессии гена, например, гена, кодирующего вирусную РНК-полимеразу, такую как полимераза Т 7, описаны выше и в другом месте в данной заявке. Экспрессия химерных конструкций нуклеиновых кислот в пластидах может быть конститутивной или может быть индуцируемой, и такая пластидная экспрессия может быть органо- или тканеспецифической. Примеры различных систем экспрессии подробно описаны в WO 98/11235, полное описание которого включено здесь в качестве ссылки. Таким образом, в одном аспекте данное изобретение использует сопряженную экспрессию в ядерном геноме нацеленной на хлоропласт РНК-полимеразы фага Т 7 под контролем химически индуцируемого промотора PR-1a, например, промотора PR-1 табака, функционально связанного с хлоропластным репортерным трансгеном, регулируемым промоторной/терминаторной последовательностями гена 10 Т 7, например, как описано в патенте США US 5614395, полное описание которого включено здесь в качестве ссылки. В другом варианте, когда пластидные трансформанты, гомоплазматические в отношении наследуемых по материнской линии генов TR или NTR, опыляются линиями, экспрессирующими полимеразу Т 7 в ядре, получают растения F1, которые несут обе трансгенные конструкции, но не зкспрессируют их,пока синтез больших количеств ферментативно активного белка в пластидах не запускается нанесением на листья индукторного соединения PR-la S-метилового эфира бензо(1,2,3)тиадиазол-7-карботиокислоты(ВТН). В конкретном варианте два или более генов, например, гены TR и NTR, транскрибируются из пластидного генома от единственного промотора в оперонподобном полицистронном гене. В одном варианте оперонподобный полицистронный ген включает промежуточную ДНК-последовательность между двумя генами в оперонподобном полицистронном гене. В конкретном варианте промежуточная ДНК не присутствует в пластидном геноме во избежание гомологичной рекомбинации с пластидными последовательностями. В другом варианте ДНК-последовательность является производной 5'-нетранслируемого(UTR) участка неэукариотического гена, предпочтительно вирусного 5'-UTR, предпочтительно 5'-UTR,производного бактериального фага, такого как фаг Т 7, Т 3 или SP6. В одном варианте часть ДНКпоследовательности может быть модифицирована для предотвращения образования вторичных структур РНК в РНК-транскрипте оперонподобного полицистронного гена, например, между ДНКпоследовательностью и RBS ниже расположенного гена. Такие вторичные структуры могут ингибиро- 27009181 вать или репрессировать экспрессию ниже расположенного гена, в частности, инициацию трансляции. Такие вторичные структуры РНК предсказываются посредством определения их температур плавления с использованием компьютерных моделей и программ, таких как программа "mfold", версия 3 (доступная из Zuker and Turner, Washington University School of Medicine, St-Louis, MO), и другими способами, известными специалисту в данной области. Присутствие промежуточной ДНК-последовательности в оперонподобном полицистронном гене увеличивает доступность RBS ниже расположенного гена, приводя к более высоким скоростям экспрессии. Такая стратегия применима к любому из двух или более генов, которые должны транскрибироваться из пластидного генома от единственного промотора оперонподобного химерного гетеромультимерного гена. После трансформации клетки выращивают обычно в селективной среде, позволяющей идентифицировать трансформанты. Клетки могут собираться в соответствии с известными в данной области методологиями. Для связывания масляных телец с первым и/или вторым рекомбинантными полипептидами,мультимерными белковыми комплексами, гетеромультимерными белковыми комплексами, мультимерными слитыми белками, гетеромультимерными слитыми белками, иммуноглобулинами, полипептидными цепями иммуноглобулинов, слитыми редокс-полипептидами и первым и/или вторым родственными тиоредоксину белками, целостность клеток может разрушаться с использованием любой физической,химической или биологической методологии, позволяющей разрушать целостность клеток. Эти методологии обычно зависят от типа клеток и являются известными специалисту в данной области. При использовании растений их можно регенерировать в зрелые растения с использованием способов культуры ткани растений, обычно известных специалисту в данной области. Семена могут быть собраны из зрелых трансформированных растений и использованы для размножения линии растения. Растения могут быть также скрещены, и, следовательно, здесь обсуждается разведение клеточных линий и трансгенных растений, которые варьируются по их генетическому фону. Можно также скрестить линию растения, содержащую первый рекомбинантный полипептид, с линией растения, содержащей второй рекомбинантный полипептид. Таким образом, здесь обеспечены способы получения в растении рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающие:(a) получение первого растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и первый рекомбинантный полипептид, такой как редокс-белок (например, родственный тиоредоксину белок и т.п.) или полипептидная цепь иммуноглобулина, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок;(b) получение второго растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и второй рекомбинантный полипептид, такой как второй редокс-белок (например, родственный тиоредоксину белок и т.п.) или вторая полипептидная цепь иммуноглобулина; и(c) половое скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением с получением растения-потомка, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца, где указанные масляные тельца способны связываться с указанным первым рекомбинантным полипептидом,а указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса. Второй рекомбинантный полипептид может быть также связан с масляными тельцами. Таким образом здесь обеспечены также способы получения в растении рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающие:(a) получение первого растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и первый рекомбинантный полипептид, такой как редокс-белок (или родственный тиоредоксину белок) или полипептидная цепь иммуноглобулина, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок;(b) получение второго растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и второй рекомбинантный полипептид, такой как второй редокс-белок (или родственный тиоредоксину белок) или вторая полипептидная цепь иммуноглобулина, где указанный второй рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок; и(с) половое скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением с получением растения-потомка, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца, где указанные масляные тельца способны связываться с указанным первым рекомбинантным полипептидом,а указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса. Выделение масляных телец. Масляные тельца, описанные здесь, могут быть получены из любой клетки, содержащей масляные- 28009181 тельца, в том числе из любой клетки животного; клетки растения; грибковой клетки, например дрожжевой клетки, клетки водорослей; или бактериальной клетки. Здесь может быть использован любой способ,пригодный для выделения масляных телец из клеток. Способы для выделения масляных телец из клеток семян растений были описаны в патентах США (6146645 и 6183762), а выделение масляных телец из клеток дрожжей было описано Ting et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 3699-3706). В некоторых вариантах масляные тельца получают из клетки растения, например, из клетки пыльцы; клетки плода; клетки споры; клетки ореха; клетки мезокарпия; например, клетки мезокарпия, получаемой из маслины европейской (Olea europaea) или авокадо (Persea americana); или клетки семени. В конкретном варианте масляные тела получают из клетки семени растения. Семена могут быть получены из трансгенного растения данного изобретения. В конкретных вариантах семя трансгенного растения в соответствии с данным изобртением содержит первый и/или второй рекомбинантные полипептиды,мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов,слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5% общего клеточного белка семени. В дополнительных вариантах семя трансгенного растения, обеспеченного здесь, содержит рекомбинантный полипептид или мультимерный белковый комплекс в концентрации по меньшей мере 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0,2,25, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% или более общего клеточного белка семени. Верхние границы концентрации рекомбинантного полипептида или мультимерного белкового комплекса могут быть до приблизительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15%. Таким образом, диапазоны по меньшей мере от около 0,5 до около 15%; по меньшей мере от около 1,0 до около 10% и по меньшей мере от около 5 до около 8% находятся среди обсуждаемых здесь различных диапазонов. Среди семян растений, применимых в этом отношении, находятся семена растений, получаемые из группы видов растений, состоящей из американского ореха (Bertholletia excelsa); клещевины (Riccinusspp.); земляного ореха, арахиса (Arachis hypogaea); джоджобы (Simmondsia chinensis); льняного семени/льна (Linum usitatissimum); кукурузы (Zea mays); горчицы (Brassica spp. и Sinapis alba); гвинейской масличной пальмы (Elaeis guineeis); маслины европейской (Olea europaea); семени рапса (Brassica spp.),сафлора (Carthamus tinctorius); сои (Glicine max); тыквы (Cucurbita maxima); подсолнечника (Helianthusannuus), ячменя (Hordeum vulgare); пшеницы (Triticum aestivum) и их смесей. В особом варианте масляные тельца могут быть получены из семян, получаемых из сафлора (Carthamus tinctirius). Для получения масляных телец из семян растений растения выращивают и дают им образовать семена в соответствии с обычной сельскохозяйственной практикой. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также семена, содержащие масляные тельца, где указанные масляные тельца дополнительно содержат мультимерные белковые комплексы данного изобретения, описанные здесь. При сборе семян и, если требуется, удалении больших нерастворимых материалов, таких как косточки или скорлупки семян, например, просеиванием или промыванием, здесь может быть использован любой способ, пригодный для выделения масляных телец из семян. Типичный способ включает измельчение семян с последующим процессом водной экстракции. Измельчение семян может выполняться любым измельчающим способом, приводящим к существенному разрушению клеточных мембран и клеточных стенок семян без ухудшения структурной целостности масляных телец, присутствующих в клетках семян. Подходящие способы измельчения в этой связи включают прессование и размалывание семян. Особенно применимы в этой связи способы мокрого помола, такие как описанные для хлопчатника (Lawhon et al. (1977) J. Am. Oil Chem. Soc. 63: 533-534) и сои (US Patent 3971856; Carter et al. (1974) J. Am. Oil Chem. Soc. 51: 137-141). Подходящее оборудование для размола, позволяющее размалывание семян в промышленном масштабе, включает коллоидные мельницы, дисковые дробилки, штифтовые дробилки, орбитальные мельницы, IKA-мельницы и гомогенизаторы промышленного масштаба. Выбор оборудования для размола будет зависеть от семян, которые выбраны, а также от требований производительности. Затем твердые примеси, такие как скорлупа, волокнистый материал, нерастворенные углеводы,белки и другие нерастворимые примеси, предпочтительно удаляют из фракции размолотых семян с использованием разделения по размеру на основе таких методологий, как способы на основе фильтрования или гравитации, такие как способ разделения на основе центрифугирования. Центрифугирование может выполняться с использованием, например, декантирующей центрифуги, такой как 2-фазная декантирующая центрифуга HASCO 200 или NX31OB (Alpha Laval). Условия эксплуатации выбирают таким образом, чтобы значительная часть нерастворимых примесей и осадков могла быть отделена от растворимой фракции. После удаления нерастворимых веществ фракция масляных телец может быть отделена от водной фракции. Могут быть использованы основанные на гравитации способы, а также технологии разделения по размеру. Основанные на гравитации способы, которые могут быть использованы, включают центрифугирование с использованием, например, центрифуги с трубчатым ротором, такой как Sharples AS-16 или AS-46 (Alpha Laval), центрифуги с набором центробежных дисков или гидроциклона или разделение- 29009181 фаз под действием природной гравитации. Методологии разделения по размеру, которые могут быть использованы, включают мембранную ульрафильтрацию и микрофильтрацию с поперечным потоком. Отделение твердых веществ и отделение фазы масляных телец от водной фазы может также проводиться одновременно с использованием способов разделения на основе гравитации или способов на основе раздения по размеру. Препараты масляных телец, полученные на этой стадии в данном процессе, являются обычно относительно неочищенными, и в зависимости от применения масляных телец может быть желательным удаление дополнительных загрязнений. В этой связи может быть использован любой способ, позволяющий удалить дополнительные примеси семян. Удобным образом удаление этих примесей из препарата масляных телец может выполняться повторным суспендированием препарата масляных телец в водной фазе и повторным центрифугрованием ресуспендированной фракции, способом, называемым здесь "промыванием масляных телец". Выбираемые условия промывания могут варьироваться в зависимости от желаемой чистоты фракций масляных телец. Например, при использовании масляных телец в фармацевтических композициях может быть обычно желательной более высокая степень чистоты, чем при использовании масляных телец в пищевых препаратах. Масляные тельца могут промываться один или более раз в зависимости от желаемой чистоты, и ионная сила, рН и температура могут варьироваться. Могут быть использованы аналитические способы для мониторинга удаления загрязняющих веществ. Например, для мониторинга удаления белков семян может использоваться ДСН-электрофорез. Весь процесс выделения масляных телец может выполняться периодическим образом или в виде непрерывного режима. В особом варианте используют процессы непрерывного режима промышленного масштаба. Посредством применения этих и подобных способов специалист может получать масляные тельца из любых клеток, содержащих масляные тельца. Специалисту будет понятно, что обычно этот способ будет в некоторой степени варьироваться в зависимости от выбранного типа клеток. Однако такие вариации могут производиться без отклонения от объема и идеи данного изобретения. Связывание первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов, полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редоксполипептидов и первого и/или второго родственных тиоредоксину белков с масляными тельцами. В соответствии с данным изобретением масляные тельца связывают с первым и/или вторым рекомбинантными полипептидами, мультимерными белковыми комплексами, гетеромультимерными белковыми комплексами, мультимерными слитыми белками, гетеромультимерными слитыми белками, иммуноглобулинами, полипептидными цепями иммуноглобулинов, слитыми редокс-полипептидами, первым и/или вторым родственными тиоредоксину белками посредством связывания с нацеливающим на масляные тельца белком, способным связываться с мультимерными белковыми комплексами и с масляными телами. В применении здесь фраза "связывание масляных телец с мультимерным белковым комплексом" означает, что масляные тельца приближают к мультимерным белковым комплексам таким образом, чтобы обеспечить возможность связывания масляных телец либо с первым и/или вторым рекомбинантными полипептидами, мультимерными белковыми комплексами, гетеромультимерными белковыми комплексами, мультимерными слитыми белками, гетеромультимерными слитыми белками, иммуноглобулинами,полипептидными цепями иммуноглобулинов, слитыми редокс-полипептидами, либо с первым и/или вторым родственными тиоредоксину белками. Связывание масляных телец с мультимерными белковыми комплексами выполняют связыванием нацеливающего на масляные тельца белка как с масляным тельцем, так и с мультимерным белковым комплексом. В конкретных вариантах клетки, экспрессирующие мультимерный белковый комплекс, связываются с масляными тельцами, которые могут быть получены из тех же самых клеток, что позволяет удобным образом получить и выделить мультимерный белковый комплекс, в том числе первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины,полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки в содержащей масляные тельца системе клетки-хозяина. Таким образом, в одном варианте связывание масляного тельца с мультимерным белковым комплексом выполняется внутриклеточно во время роста клеток. Например, слитый редокс-полипептид может быть слит с белком масляного тельца, и этот химерный белок может быть экспрессирован в содержащих масляные тельца семенах растений. Выделение масляных телец из семян в этом случае приводит к выделению масляных телец,содержащих либо первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды,либо первый и/или второй родственные тиоредоксину белки. В другом варианте, в котором мультимерный белковый комплекс связывается с масляными тельцами, получаемыми из тех же самых клеток, в которых продуцируется этот комплекс, связывание масляных телец с мультимерным белковым комплексом выполняют после разрушения целостности клеток. Например, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплек- 30

МПК / Метки

МПК: C12N 15/12, C12N 15/82, C12N 15/79

Метки: содержащие, композиции, тельцами, телец, способы, получения, комплексы, мультимерные, комплексов, масляных, указанных, белковые, масляными, продукты, связанные, рекомбинантные

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-9181-rekombinantnye-multimernye-belkovye-kompleksy-svyazannye-s-maslyanymi-telcami-sposoby-polucheniya-ukazannyh-kompleksov-i-maslyanyh-telec-i-soderzhashhie-ih-produkty-i-kompozicii.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Рекомбинантные мультимерные белковые комплексы, связанные с масляными тельцами, способы получения указанных комплексов и масляных телец и содержащие их продукты и композиции</a>

Похожие патенты