Пептид, композиция для перорального введения, набор (варианты), способ уменьшения интенсивности симптома атеросклероза (варианты) и способ облегчения или предупреждения коронарного осложнения у млекопитающего (варианты)

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Пептид, уменьшающий интенсивность симптома атеросклероза, содержащий последовательность аминокислот D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F (SEQ ID NO: 5) и содержащий по меньшей мере один остаток D-аминокислоты.

2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он смешан с фармакологически приемлемым наполнителем.

3. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он смешан с фармакологически приемлемым наполнителем, пригодным для перорального введения млекопитающему.

4. Пептид по п.1, отличающийся тем, что все энантиомерные аминокислоты представлены D-аминокислотами.

5. Пептид по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит защитную группу, присоединенную к аминоконцу или карбоксильному концу.

6. Пептид по п.5, отличающийся тем, что указанная защитная группа представляет собой защитную группу, выбранную из группы, состоящей из ацетила (Ac), амида, алкильных групп, содержащих от 3 до 20 атомов углерода, Fmoc, t-бутоксикарбонила (Tboc), 9-флуоренацетильной группы, 1-флуоренкарбоксильной группы, 9-флуоренкарбоксильной группы, 9-флуоренон-1-карбоксильной группы, бензилоксикарбонила, ксантила (Xan), тритила (Trt), 4-метилтритила (Mtt), 4-метокситритила (Mmt), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (Mtr), мезитилен-2-сульфонила (Mts), 4,4-диметоксибензгидрила (Mbh), тозила (Tos), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонила (Pmc), 4-метилбензила (MeBzl), 4-метоксибензила (MeOBzl), бензилоксигруппы (BzlO), бензила (Bzl), бензоила (Bz), 3-нитро-2-пиридинсульфенила (Npys), 1-(4,4-диметил-2,6-диаксоциклогексилиден)этила (Dde), 2,6-дихлорбензила (2,6-ди-Cl-Bzl), 2-хлорбензилоксикарбонила (2-Cl-Z), 2-бромбензилоксикарбонила (2-Br-Z), бензилоксиметила (Bom), циклогексилоксигруппы (cHxO), t-бутоксиметила (Bum), t-бутоксигруппы (tBuO), t-бутила (tBu) и трифторацетила (TFA).

7. Пептид по п.5, отличающийся тем, что он содержит защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и указанная аминоконцевая защитная группа представляет собой защитную группу, выбранную из группы состоящей из ацетила, пропеонила и алкила, содержащего от 3 до 20 атомов углерода.

8. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он содержит защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу, и указанная карбоксильная концевая защитная группа представлена амидом.

9. Пептид по п.5, отличающийся тем, что дополнительно содержит первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу.

10. Пептид по п.9, отличающийся тем, что содержит первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, где указанная защитная группа представляет собой защитную группу, выбранную из группы, состоящей из ацетила, пропеонила и алкила, содержащего от 3 до 20 атомов углерода, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу, и указанная карбоксильная концевая защитная группа представлена амидом.

11. Пептид по п.10, отличающийся тем, что все энантиомерные аминокислоты представлены D-аминокислотами.

12. Пептид по п.1, отличающийся тем, что более чем половина энантиомерных аминокислот указанного пептида представлены D-аминокислотами.

13. Пептид по п.10, отличающийся тем, что указанная первая защитная группа представляет собой ацетильную группу и вторая защитная группа представляет собой амид.

14. Пептид по п.1, отличающийся тем, что указанный пептид имеет формулу: P1-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P2, где P1 и P2 являются защитными группами, и все указанные аминокислоты указанного пептида являются D-аминокислотами.

15. Пептид по п.14, отличающийся тем, что P1 представляет собой ацетильную группу и P2 представляет собой амид.

16. Композиция для введения млекопитающему, уменьшающая интенсивность симптома атеросклероза, отличающаяся тем, что она содержит фармакологически приемлемый наполнитель и пептид, содержащий аминокислотную последовательность D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F (SEQ ID NO: 5), при этом указанный пептид содержит по крайней мере один D-аминокислотный остаток и где указанный пептид содержит первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу.

17. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что указанная первая защитная группа и указанная вторая защитная группа независимо выбраны из группы, состоящей из ацетила (Ac), амида, алкильных групп, содержащих от 3 до 20 атомов углерода, Fmoc, t-бутоксикарбонила (Tboc), 9-флуоренацетильной группы, 1-флуоренкарбоксильной группы, 9-флуоренкарбоксильной группы, 9-флуоренон-1-карбоксильной группы, бензилоксикарбонила, ксантила (Xan), тритила (Trt), 4-метилтритила (Mtt), 4-метокситритила (Mmt), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (Mtr), мезитилен-2-сульфонила (Mts), 4,4-диметоксибензгидрила (Mbh), тозила (Tos), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонила (Pmc), 4-метилбензила (MeBzl), 4-метоксибензила (MeOBzl), бензилоксигруппы (BzlO), бензила (Bzl), бензоила (Bz), 3-нитро-2-пиридинсульфенила (Npys), 1-(4,4-диметил-2,6-диаксоциклогексилиден)этила (Dde), 2,6-дихлорбензила (2,6-ди-Cl-Bz1), 2-хлорбензилоксикарбонила (2-Cl-Z), 2-бромбензилоксикарбонила (2-Br-Z), бензилоксиметила (Bom), циклогексилоксигруппы (cHxO), t-бутоксиметила (Bum), t-бутоксигруппы (tBuO), t-бутила (tBu) и трифторацетила (TFA).

18. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что первая защитная группа представлена ацетилом.

19. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что вторая защитная группа представлена амидом.

20. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что более половины энантиомерных аминокислот, входящих в состав указанного пептида, представлены D-аминокислотами.

21. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что все энантиомерные аминокислоты, входящие в состав указанного пептида, представлены D-аминокислотами.

22. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что указанный наполнитель представляет собой наполнитель, пригодный для перорального введения.

23. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что указанный наполнитель представляет собой наполнитель, пригодный для инъекции.

24. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что указанный пептид состоит из множества остатков D-аминокислот.

25. Композиция по п.16, отличающаяся тем, что указанный пептид имеет формулу P1-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P2, где P1 и P2 являются защитными группами, и все указанные аминокислоты указанного пептида являются D-аминокислотами.

26. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что P1 представляет собой ацетильную группу и P2 представляет собой амид.

27. Способ уменьшения интенсивности симптома атеросклероза, отличающийся тем, что в организм перорально вводят пептид, содержащий аминокислотную последовательность D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 5), при этом указанный пептид содержит по крайней мере один D аминокислотный остаток.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что у указанного организма диагностирован по меньшей мере один симптом атеросклероза.

29. Способ по п.27, отличающийся тем, что у указанного организма диагностирован риск развития атеросклероза.

30. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный организм представлен человеком.

31. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный организм представлен млекопитающим животным.

32. Способ по п.27, отличающийся тем, что используют пептид, дополнительно содержащий защитную группу, присоединенную к аминоконцу или карбоксильному концу.

33. Способ по п.32, отличающийся тем, что указанную защитную группу выбирают из группы, состоящей из ацетила (Ac), амида, алкильных групп, содержащих от 3 до 20 атомов углерода, Fmoc, t-бутоксикарбонила (Tboc), 9-флуоренацетильной группы, 1-флуоренкарбоксильной группы, 9-флуоренкарбоксильной группы, 9-флуоренон-1-карбоксильной группы, бензилоксикарбонила, ксантила (Xan), тритила (Trt), 4-метилтритила (Mtt), 4-метокситритила (Mmt), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (Mtr), мезитилен-2-сульфонила (Mts), 4,4-диметоксибензгидрила (Mbh), тозила (Tos), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонила (Pmc), 4-метилбензила (MeBzl), 4-метоксибензила (MeOBzl), бензилоксигруппы (BzlO), бензила (Bzl), бензоила (Bz), 3-нитро-2-пиридинсульфенила (Npys), 1-(4,4-диметил-2,6-диаксоциклогексилиден)этила (Dde), 2,6-дихлорбензила (2,6-ди-Cl-Bzl), 2-хлорбензилоксикарбонила (2-Cl-Z), 2-бромбензилоксикарбонила (2-Br-Z), бензилоксиметила (Bom), циклогексилоксигруппы (cHxO), t-бутоксиметила (Bum), t-бутоксигруппы (tBuO), t-бутила (tBu) и трифторацетила (TFA).

34. Способ по п.27, отличающийся тем, что используют пептид, дополнительно содержащий первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, которая представляет собой ацетильную группу и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу, которая представляет собой амид.

35. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный пептид смешивают с фармакологическим наполнителем.

36. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный пептид смешивают с фармакологическим наполнителем, пригодным для перорального введения млекопитающему.

37. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный пептид имеет формулу P1-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P2, где P1 и P2 являются защитными группами, и все указанные аминокислоты указанного пептида являются D-аминокислотами.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что P1 представляет собой ацетильную группу и P2 представляет собой амид.

39. Способ уменьшения интенсивности симптома атеросклероза, отличающийся тем, что в организм перорально вводят пептид, содержащий аминокислотную последовательность D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-(SEQ ID NO: 5), при этом указанный пептид содержит по крайней мере один D аминокислотный остаток.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что используют пептид, дополнительно содержащий защитную группу, присоединенную к аминоконцу или карбоксильному концу.

41. Способ по п.40, отличающийся тем, что указанную защитную группу выбирают из группы, состоящей из ацетила, CH3-(CH2)n-CO-, где n находится в интервале от 1 до 20, и амида.

42. Способ по п.40, отличающийся тем, что указанный пептид дополнительно содержит первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу.

43. Способ по п.42, отличающийся тем, что указанная первая защитная группа и указанная вторая защитная группа независимо выбраны из группы, состоящей из ацетила (Ac), амида, алкильных групп, содержащих от 3 до 20 атомов углерода, Fmoc, t-бутоксикарбонила (Tboc), 9-флуоренацетильной группы, 1-флуоренкарбоксильной группы, 9-флуоренкарбоксильной группы, 9-флуоренон-1-карбоксильной группы, бензилоксикарбонила, ксантила (Xan), тритила (Trt), 4-метилтритила (Mtt), 4-метокситритила (Mmt), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (Mtr), мезитилен-2-сульфонила (Mts), 4,4-диметоксибензгидрила (Mbh), тозила (Tos), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонила (Pmc), 4-метилбензила (MeBzl), 4-метоксибензила (MeOBzl), бензилоксигруппы (BzlO), бензила (Bzl), бензоила (Bz), 3-нитро-2-пиридинсульфенила (Npys), 1-(4,4-диметил-2,6-диаксоциклогексилиден)этила (Dde), 2,6-дихлорбензила (2,6-ди-Cl-Bzl), 2-хлорбензилоксикарбонила (2-Cl-Z), 2-бромбензилоксикарбонила (2-Br-Z), бензилоксиметила (Bom), циклогексилоксигруппы (cHxO), t-бутоксиметила (Bum), t-бутоксигруппы (tBuO), t-бутила (tBu) и трифторацетила (TFA).

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что в качестве первой защитной группы используют ацетил.

45. Способ по п.43, отличающийся тем, что в качестве второй защитной группы используют амид.

46. Способ по п.43, отличающийся тем, что указанная первая защитная группа представляет собой ацетильную группу и вторая защитная группа представляет собой амид.

47. Способ по п.43, отличающийся тем, что более чем половина энантиомерных аминокислот указанного пептида представлены D-аминокислотами.

48. Способ по п.43, отличающийся тем, что все энантиомерные аминокислоты указанного пептида представлены D-аминокислотами.

49. Способ по п.46, отличающийся тем, что все энантиомерные аминокислоты указанного пептида представлены D-аминокислотами.

50. Способ уменьшения интенсивности симптома атеросклероза, отличающийся тем, что в организм перорально вводят пептид, содержащий аминокислотную последовательность D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F (SEQ ID NO: 5), при этом указанный пептид содержит по крайней мере один D аминокислотный остаток и где указанный пептид содержит первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу.

51. Способ по п.50, отличающийся тем, что у указанного организма диагностирован по меньшей мере один или более симптомов атеросклероза.

52. Способ по п.50, отличающийся тем, что у указанного организма диагностирован риск развития атеросклероза.

53. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанный организм представлен человеком.

54. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанный организм является млекопитающим животным.

55. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанную защитную группу выбирают из группы, состоящей из ацетила, CH3-(CH2)n-CO-, где n находится в интервале от 1 до 20, и амида.

56. Способ по п.50, отличающийся тем, что первая защитная группа представлена ацетилом.

57. Способ по п.50, отличающийся тем, что вторая защитная группа представлена амидом.

58. Способ по п.50, отличающийся тем, что в качестве указанной композиции используют композицию, дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый наполнитель.

59. Способ по п.58, отличающийся тем, что выбирают наполнитель, пригодный для перорального введения.

60. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанный пептид содержит множество остатков D-аминокислот.

61. Способ по п.50, отличающийся тем, что указанный пептид имеет формулу: P1-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P2, где P1 и P2 являются защитными группами и все указанные аминокислоты указанного пептида являются D-аминокислотами.

62. Способ по п.61, отличающийся тем, что P1 представляет собой ацетильную группу и P2 представляет собой амид.

63. Набор для уменьшения интенсивности симптома атеросклероза, отличающийся тем, что он включает в себя контейнер, содержащий пептид, содержащий последовательность аминокислот D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F (SEQ ID NO: 5) и содержащий по меньшей мере один остаток D-аминокислоты.

64. Набор по п.63, отличающийся тем, что указанный пептид объединен с фармацевтически приемлемым наполнителем в унифицированном лекарственном препарате.

65. Набор по п.64, отличающийся тем, что указанный унифицированный лекарственный препарат предназначен для перорального введения.

66. Набор по п.63, отличающийся тем, что он дополнительно содержит инструкционные материалы, разъясняющие применение указанного пептида для уменьшения интенсивности по меньшей мере одного симптома атеросклероза.

67. Набор для уменьшения интенсивности симптома атеросклероза, отличающийся тем, что он включает в себя контейнер, содержащий композицию, пригодную для перорального введения, уменьшающую интенсивность симптома атеросклероза, причем указанная композиция содержит пептид, содержащий аминокислотную последовательность D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F (SEQ ID NO: 5), при этом указанный пептид содержит по крайней мере один D аминокислотный остаток и где указанный пептид имеет первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу.

68. Набор по п.67, отличающийся тем, что указанный пептид объединен с фармацевтически приемлемым наполнителем в унифицированном лекарственном препарате.

69. Набор по п.67, отличающийся тем, что он дополнительно содержит инструкционные материалы, разъясняющие применение указанного пептида для уменьшения интенсивности по меньшей мере одного или более симптомов атеросклероза.

70. Набор по п.67, отличающийся тем, что указанный пептид имеет формулу: P1-D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-P2, где P1 и P2 являются защитными группами и все указанные аминокислоты указанного пептида являются D-аминокислотами.

71. Набор по п.70, отличающийся тем, что P1 представляет собой ацетильную группу и P2 представляет собой амид.

72. Способ облегчения или предупреждения коронарного осложнения, связанного с ответной реакцией острой фазы на воспаление у млекопитающего, где указанное коронарное осложнение является симптомом атеросклероза, отличающийся тем, что млекопитающему, у которого имеется ответная реакция острой фазы или с риском возникновения ответной реакции острой фазы, вводят полипептид по любому из пп.1-15.

73. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанное введение осуществляют методом, выбранным из группы, состоящей из перорального введения, назального введения, ректального введения, внутрибрюшинной инъекции и внутрисосудистой инъекции, подкожной инъекции, чрескожного введения и внутримышечной инъекции.

74. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанный полипептид вводят в комбинации с таким же полипептидом, содержащим только L-формы.

75. Способ по п.72, отличающийся тем, что указанный полипептид используют в виде унифицированного препарата в фармацевтически приемлемом наполнителе.

76. Способ по п.72, отличающийся тем, что ответная реакция острой фазы является воспалительной реакцией, связанной с рецидивом воспалительного заболевания.

77. Способ по п.73, отличающийся тем, что ответная реакция острой фазы связана с заболеванием, выбранным из группы, состоящей из лепры, туберкулеза, системной красной волчанки, ревматической полимиалгии, нодозного полиартериита, склеродермы, идиопатического легочного фиброза, хронического обструктивного легочного заболевания, болезни Альцгеймера, СПИДа, кальцификации коронарной артерии, кальцификационного аортального стеноза, остеопороза и ревматоидного артрита.

78. Способ по п.72, отличающийся тем, что ответная реакция острой фазы представлена воспалительной реакцией, связанной с состоянием, выбранным из группы, состоящей из бактериальной инфекции, вирусной инфекции, грибковой инфекции, трансплантатом органа, раной, имплантированным протезом, паразитарной инфекцией, сепсисом, синдромом эндотоксического шока и образованием биопленки.

79. Способ облегчения или предупреждения коронарного осложнения, связанного с ответной реакцией острой фазы на воспаление у млекопитающего, где указанное коронарное осложнение является симптомом атеросклероза, отличающийся тем, что у млекопитающего проводят анализ уровня белка острой фазы (APP), указывающего на ответную реакцию острой фазы или значительный риск возникновения ответной реакции острой фазы, и млекопитающему с уровнем белка острой фазы (APP), указывающим на ответную реакцию острой фазы, вводят полипептид по любому из пп.1-15.

80. Способ по п.79, отличающийся тем, что указанный белок острой фазы (APP) представляет собой положительный APR, выбранный из группы, состоящей из сывороточного амилоида A, c-реактивного белка, компонента сывороточного амилоида P, белка комплемента C2, белка комплемента C3, белка комплемента C4, белка комплемента C5, белка комплемента C9, белка комплемента B, ингибитора C1, связывающего белка C4, фибриногена, фактора фон Виллебранда, a1-антитрипсина, a1-антихимотрипсина, a1-антиплазмина, гепаринового кофактора II, ингибитора I активатора плазминогена, гаптоглобина, гемопексина, церулоплазмина, магний-супероксид-дисмутазы, a1-кислого гликопротеина, гемоксигеназы, маннозасвязывающего белка, лейкоцитарного белка I, липопротеина (a) и липополисахаридсвязывающего белка.

81. Способ по п.79, отличающийся тем, что указанный белок острой фазы (APP) является негативным APR, выбранным из группы, состоящей из альбумина, преальбумина, трансферина, apoAI, apoAII, a2-HS-гликопротеина, ингибитора интер-a-трипсина, гликопротеина, обогащенного гистидином.

 

Текст

Смотреть все

006488 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к области лечения атеросклероза. В частности, данное изобретение имеет отношение к идентификации класса пептидов, которые вводятся перорально и которые уменьшают интенсивность по крайней мере одного симптома атеросклероза. Уровень техники Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности, в особенности в Соединенных Штатах и странах Западной Европы. В развитии сердечно-сосудистого заболевания участвуют несколько этиологических факторов, включая наследственную предрасположенность к заболеванию, пол, факторы, связанные с образом жизни, такие как курение и питание, возраст,гипертензия и гиперлипидемия, в том числе гиперхолестеринемия. Некоторые из данных факторов, особенно гиперлипидемия и гиперхолестеринемия (высокие концентрации холестерина в крови) представляют собой существенный фактор риска, связанный с атеросклерозом. Холестерин присутствует в крови в виде свободного (неэтерифицированного) и этерифицированного холестерина в липопротеиновых частицах, обычно называемых хиломикронами, липопротеинах очень низкой плотности (VLDL), липопротеинах низкой плотности (LDL) и липопротеинах высокой плотности(HDL). На концентрацию общего холестерина в крови влияют (1) всасывание холестерина из пищеварительного тракта, (2) синтез холестерина из компонентов пищи таких как углеводы, белки, жиры и этанол,и (3) удаление холестерина из крови тканями, особенно печенью, и последующее превращение холестерина в желчные кислоты, стероидные гормоны и желчный холестерин. На поддержание концентраций холестерина в крови воздействуют генетические факторы и факторы окружающей среды. Генетические факторы включают в себя концентрацию ферментов, ограничивающих скорость в биосинтезе холестерина, концентрацию рецепторов для липопротеинов низкой плотности в печени, концентрацию ферментов, ограничивающих скорость для конверсии холестеринов желчных кислот, скорости синтеза и секреции липопротеинов и пол субъекта. Факторы окружающей среды,влияющие на гемостаз концентрации холестерина в крови у человека, включают в себя состав пищи, эффект курения, физическую активность и применение ряда фармацевтических агентов. Изменения в питании включают в себя количество и тип жира (насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты), количество холестерина, количество и тип волокна и, возможно, количества витаминов, таких как витамины С и D, и минералов, таких как кальций. Эпидемиологические исследования показывают обратную корреляцию уровней липопротеина высокой плотности (HDL) и аполипопротеина (аро) A-I и наличия атеросклеротических событий (см. статью Wilson и соавт., Arteriosclerosis, 8:737-741, (1988. Показано, что инъекция HDL кроликам, получавшим атерогенный корм, ингибирует образование атеросклеротических повреждений (см. статью Badimon и соавт., J. Clin. Invest., 85:1234-1241, (1990. Человеческий аро А-I являлся объектом интенсивных исследований, что обусловлено его антиатерогенными свойствами. Заменяемые аполипопротеины, включая аро А-I, имеют липид-ассоциированные домены (см. статьи Brouillette и Anantharamaiah, Biochim. Biophys. Acta, 1256:103-129, (1995); Segrest и соавт., FEBS Lett., 38:247-253, (1974. Принято считать, что аро А-I, имеет восемь тандемно повторяющихся 22-мерных последовательностей, большинство из которых потенциально способны к образованию амфипатических спиральных структур класса А (см. статью Segrest и соавт., FEBS Lett., 38:247-253,(1974. Характеристики амфипатической спирали класса А включают в себя присутствие положительно заряженных остатков на разделе полярной и неполярной поверхностей и отрицательно заряженных остатков в центре полярной поверхности (см. статьи Segrest и соавт., FEBS Lett., 38:247-253, (1974); Segrest и соавт., Proteins; Structure, Function, and Genetics, 8:103-117, (1990. Показано, что аро А-I сильно связывается с фосфолипидами с образованием комплексов и способствует оттоку холестерина из богатых холестерином клеток. Ранее считали, что доставка и поддержание сывороточных уровней аро А-I недостаточна для эффективного уменьшения по крайней мере одного симптома атеросклероза. Сущность изобретения В данном изобретении представлены новые пептиды, введение которых уменьшает интенсивность по крайней мере одного симптома атеросклероза. В частности, открытием, сделанным в данном изобретении, является то, что пептиды, содержащие амфипатическую спираль класса А, при наличии остатка(ов) D-аминокислот и/или защиты на амино- или карбоксильном конце могут быть введены в организм перорально, легко всасываются и доставляются в сыворотку и являются эффективными в плане уменьшения интенсивности по крайней мере одного симптома атеросклероза. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение представляет пептид, который уменьшает интенсивность симптома атеросклероза, где пептид имеет длину, которая лежит в интервале от приблизительно 10 до приблизительно 30 аминокислот, содержит по меньшей мере одну амфипатическую спираль класса А, содержит по меньшей мере один остаток D-аминокислоты, защищает фосфолипид от окисления окисляющим агентом и отличен от пептида D-18A (например, D-W-L-K-A-F-Y-DK-V-A-E-K-L-K-E-A-F (SEQ ID NO: 1), имеющим все остатки аминокислот D-формы). В особенно предпочтительных вариантах изобретения пептид дополнительно содержит защитную группу, присоединенную к аминоконцу и/или карбоксильному концу. Предпочтительные защитные группы включают в себя,-1 006488 без ограничения перечисленным, ацетил, амид и алкильные группы, содержащие от 3 до 20 атомов углерода, Fmoc, 9-флуоренацетильную группу, 1-флуоренкарбоксильную группу, 9-флуоренкарбоксильную группу, 9-флуоренон-1-карбоксильную группу, бензилоксикарбонил, ксантил (Хаn), тритил (Trt), 4 метилтритил (Mtt), 4-метокситритил (Mmt), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил (Mtr), мезитилен 2-сульфонил (Mts), 4,4-диметоксибензгидрил (Mbh), тозил (Tos), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6 сульфонил (Рmc), 4-метилбензил (MeBzl), 4-метоксибензил (MeOBzl), бензилоксигруппу (BzlO), бензил(TFA). В ряде особенно предпочтительных вариантов осуществления пептид дополнительно содержит первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу. Особенно предпочтительные пептиды близко напоминают амфипатическую спираль класса А человеческого или мышиного аро А-I. В ряде вариантов осуществления предпочтительные пептиды содержат последовательность аминокислот, идентичную более чем на 50% полипептиду, кодируемому экзоном, который кодирует амфипатическую спираль класса А человеческого или мышиного аро А-I. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 10%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50%, даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и даже 100% энантиомерных аминокислот представлено D-аминокислотами. Пептид может быть объединен с фармакологически приемлемым наполнителем (например, наполнителем, подходящим для перорального введения млекопитающему). В ряде особенно предпочтительных вариантов осуществления пептид содержит одну или более из следующих последовательностей аминокислот: укороченные варианты вышеуказанных последовательностей, мультимерные комбинации (например,предпочтительно находящиеся в интервале от димеров до тримеров, тетрамеров, 5-меров, 8-меров или 10-меров) вышеуказанных последовательностей, консервативные замены вышеуказанных последовательностей и/или вышеуказанные последовательности, содержащие аналоги аминокислот. Энантиомерные аминокислоты данных последовательностей предпочтительно содержат по меньшей мере одну Dаминокислоту. В ряде предпочтительных вариантов осуществления по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% и даже 100% энантиомерных аминокислот представлено D-аминокислотами, как описано в данном контексте. Данные пептиды могут также включать защитную группу (например, амид, ацетил, пропеонил и алкил, содержащий от 3 до 20 атомов углерода, и т.п.), присоединенную к аминоконцу или карбоксильному концу. В ряде вариантов осуществления защитная группа, присоединенная к карбоксильному концу, представлена амидом. В ряде вариантов осуществления защитная группа, присоединенная к аминоконцу, представлена ацетилом, пропеонилом или алкилом, содержащим от 3 до 20 атомов углерода. Некоторые пептиды содержат как карбокси-, так и аминоконцевую защитную группу. В одном из таких вариантов осуществления аминоконцевая защитная группа представляет собой защитную группу, выбранную из группы, состоящей из ацетила, пропеонила и алкила, содержащего от 3 до 20 атомов углерода, и карбокси концевая защитная группа представлена амидом. В ряде вариантов осуществления пептид представляет собой пептид, который защищает фосфолипид от окисления окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из окисляющих агентов, таких как пероксид водорода, 13(S)-HPODE, 15(S)-HPETE, HPODE, HPETE, HODE и НЕТЕ. Фосфолипид может быть представлен фосфолипидом, выбранным из группы, состоящей из 1-пальмитоил-2 арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолина (РАРС), 1-стеароил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолина (SAPC), 1-стеароил-2-арахидонил-sn-глицеро-3-фосфорилэтаноламина (SAPE). Таким образом пептид препятствует образованию липидов, таких как окисленный 1-пальмитоил-2-арахидоноил-snглицеро-3-фосфорилхолин(Ox-SAPE), 1-стеароил-2-оксовалероил-sn-глицеро-3-фосфорилэтаноламин (SOVРЕ), 1-стеароил-2 глутароил-sn-глицеро-3-фосфорилэтаноламин(SGРЕ) и 1-стеароил-2-эпоксиизопростан-sn-глицеро-3 фосфорилэтаноламин (SEIPE). В другом варианте осуществления данное изобретение представляет композицию, пригодную для перорального введения, которая облегчает симптом атеросклероза. Композиция содержит пептид, представляющий собой человеческий пептид аро А-I или его фрагмент, содержащий амфипатическую спираль класса А, или аналог человеческого пептида аро А-I, где указанный пептид имеет первую защитную группу, присоединенною к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу, и, кроме того, где указанный пептид содержит множество остатков Dаминокислот. Защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, защитные группы,описанные в данном контексте. В ряде вариантов осуществления больше половины, более предпочтительно больше, чем 80% и наиболее предпочтительно больше, чем 90% или даже все энантиомерные аминокислоты, входящие в состав пептида, представляют собой D-аминокислоты. Кроме того, композиция может содержать фармацевтически приемлемый наполнитель (например, наполнитель, пригодный для перорального введения, или наполнитель, пригодный для инъекций). Предпочтительные пептиды способны защищать фосфолипид [1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолина (РАРС),1-стеароил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолина (SAPC), 1-стеароил-2-арахидонил-sn-глицеро 3-фосфорилэтаноламина (SAPE)] от окисления окисляющим агентом (например, пероксидом водорода,13(S)-HPODE, 15(S)-HPETE, HPODE, HPETE, HODE и НЕТЕ). Таким образом, пептид препятствует образованию окисленного 1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолина (Ох-РАРС), 1 пальмитоил-2-оксовалероил-sn-глицеро-3-фосфорилхолина (POVPC), 1-пальмитоил-2-глутароил-snглицеро-3-фосфорилхолина (PGPC), 1-пальмитоил-2-эпоксиизопростан-sn-глицеро-3-фосфорилхолина(SGPE), 1-стеароил-2-эпоксиизопростан-sn-глицеро-3-фосфорилэтаноламина (SEIPE). Данное изобретение представляет также способы облегчения симптома атеросклероза. Способы предусматривают введение в организм (например, человека или млекопитающего животного) по крайней мере одного пептида,описанного в данном контексте. В особенно предпочтиельных вариантах осуществления данные пептиды содержат множество D-аминокислот и/или защищены, как описано в данном контексте. Пептид предпочтительно вводят в организм перорально, и организм предпочтительно представлен организмом с диагнозом или риском развития по крайней мере одного симптома атеросклероза. В ряде вариантов осуществления пептид может быть представлен в виде выделенного пептида или комбинации с фармакологическим наполнителем, как описано в данном контексте. Введение предпочтительно проводят в дозе, достаточной для облегчения по крайней мере одного симптома атеросклероза и/или существенного снижения вероятности появления по крайней мере одного симптома атеросклероза. В еще одном варианте осуществления в данном изобретении представлен набор для облегчения симптома атеросклероза. Предпочтительные наборы включают в себя контейнер, содержащий по крайней мере один пептид, описанный в данном контексте. Пептиды предпочтительно содержат множествоD-аминокислот и/или защищены, как описано в данном контексте. В ряде вариантов изобретения набор,кроме того, необязательно может включать в себя фармацевтически приемлемый наполнитель и/или пептид представлен в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем (например, в унифицированном лекарственном препарате). В предпочтительных наборах пептид(ы) представлен в виде унифицированного лекарственного препарата для перорального применения. Наборы также (необязательно) включают в себя инструкционные материалы, разъясняющие, как применять указанный пептид для облегчения по крайней мере одного симптома атеросклероза и/или снижения вероятности появления по крайней мере одного симптома атеросклероза. В ряде вариантов осуществления в данном изобретении исключены любые один или более пептидов, описанные в патенте США 4643988 и/или статье Garber и соавт., Arteriosclerosis and Thrombosis,12:886-894, (1992). В некоторых вариантах осуществления в данном изобретении исключены любые один или более пептидов, описанные в патенте США 4643988 и/или статье Garber и соавт., (1992), которые были синтезированы при использовании всех энантиомерных аминокислот в форме L-аминокислот или синтезированы при использовании D-аминокислот, когда пептиды являются блокирующими группами. В ряде вариантов осуществления в данном изобретении исключены пептиды, имеющие формулу А 1-В 1-В 2-С 1-D-В 3-В 4-А 2-С 2-В 5-В 6-А 3-С 3-В 7-С 4-А 4-В 8-В 9 (SEQ ID NO: 87), где A1, A2, А 3 и А 4 независимо представлены аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой или их гомологами или аналогами; В 1, В 2, В 3, В 4, В 5, В 6, В 7, В 8 и В 9 независимо представлены триптофаном, фенилаланином, аланином, лейцином, тирозином, изолейцином, валином или нафтилаланином или их гомологами или аналогами; С 1,-6 006488 С 2, С 3 и С 4 независимо представлены лизином или аргинином и D представлено серином, треонином,аланином, глицином, гистидином или их гомологами или аналогами, при условии, что, если А 1 и А 2 представлены аспарагиновой кислотой, то А 3 и А 4 представлены глутаминовой кислотой, В 2 и В 9 представлены лейцином, В 3 и В 7 - фенилаланином, В 4 - тирозином, В 5 - валином, В 6, В 8 и D - аланином, а С 1,С 2, С 3 и С 4 - лизином, и В 1 отличен от триптофана. Определения Термины "полипептид", "пептид" и "белок" в данном контексте используют взаимозаменяемо для обозначения полимера из остатков аминокислот. Термины применимы к полимерам аминокислот, в которых по крайней мере один остаток аминокислоты представлен искусственным химическим аналогом соответствующей природной аминокислоты, а также к полимерам природных аминокислот. Термин "амфипатическая спираль класса А" относится к белковой структуре, которая формирует спираль с образованием сегрегации полярных и неполярных поверхностей с положительно заряженными остатками, которые находятся на разделе полярной и неполярной поверхностей и отрицательно заряженными остатками, находящимися в центре полярной поверхности (см., например, статью Segrest и соавт.,Proteins: Structure, Function, and Genetics, 8:103-117, (1990. Термин "улучшение" при использовании в контексте "облегчение по крайней мере одного симптома атеросклероза" касается уменьшения, предупреждения или устранения по крайней мере одного симптома, характерного для атеросклероза и/или связанных с ним патологий. Данное уменьшение включает, без ограничения перечисленным, уменьшение или элиминацию окисленных фосфолипидов, уменьшение образования и разрушение атеросклеротических бляшек, уменьшение частоты клинических событий,таких как сердечный приступ, стенокардия или инсульт, снижение гипертензии, уменьшение биосинтеза воспалительного белка, снижение уровня холестерина в плазме и т.п. Термин "энантиомерные аминокислоты" относится к аминокислотам, которые могут существовать по меньшей мере в двух формах, которые не являются накладывающимися одно на другое зеркальными изображениями друг друга. Большинство аминокислот (за исключением глицина) являются энантиомерными и существуют в так называемой L-форме (L-аминокислота) или D-форме (D-аминокислота). Большинство природных аминокислот являются L-аминокислотами. Термины "D-аминокислота" и "Lаминокислота" используют в отношении абсолютной конфигурации аминокислоты, а не определенного направления вращения плоско-поляризованного света. Применение в данном контексте соответствует стандартному применению термина компетентными специалистами в данной области. Термин "защитная группа" относится к химической группе, которая, будучи присоединенной к функциональной группе в аминокислоте (например, к боковой цепи, -аминогруппе, -карбоксильной группе и т.п.), блокирует или маскирует свойства данной функциональной группы. Предпочтительные аминоконцевые защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, ацетил или аминогруппы. Другие аминоконцевые защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным,алкильные цепи, как в жирных кислотах, пропеонил, формил и другие. Предпочтительные карбоксиконцевые защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, группы, которые образуют амиды или сложные эфиры. Выражение "защищает фосфолипид от окисления окисляющим агентом" относится к способности соединения снижать скорость окисления фосфолипида (или количество образованного окисленного фосфолипида) при контактировании данного фосфолипида с окисляющим агентом (например, пероксидом водорода, 13-(S)-HPODE, 15-(S)-HPETE, HPODE, HPETE, HODE, НЕТЕ и т.п.). Термины "липопротеин низкой плотности" или "LDL" определены в соответствии с общепринятым применением компетентными специалистами в данной области. Как правило, термин LDL относится к липидно-белковому комплексу, который при выделении ультрацентрифугированием находится в диапазоне удельных масс от d = 1,019 до d = 1,063. Термины "липопротеин высокой плотности" или "HDL" определены в соответствии с общепринятым их применением компетентными специалистами в данной области. Как правило, термин LDL относится к липидно-белковому комплексу, который при выделении ультрацентрифугированием находится в диапазоне удельных масс от d = 1,063 до d = 1,21. Термин "HDL группы I" относится к липопротеину высокой плотности или его компонентам (например, аро А-I, параоксоназе, ацетилгидролазе тромбоцит-активирующего фактора и т.п.), которые восстанавливают окисленные липиды (например, в липопротеинах низкой плотности) или защищают окисленные липиды от окисления окисляющими агентами. Термин "HDL группы II" относится к HDL, которые обладают пониженной активностью или не имеют активности в плане защиты липидов от окисления или репарации (например, восстановления) окисленных липидов. Термин "компонент HDL" относится ккомпоненту (например, молекулам), который входит в состав липопротеина высокой плотности (HDL). Анализы на HDL, который защищает липиды от окисления или репарирует их (например, восстанавливает окисленные липиды), включают в себя также анализы компо-7 006488 нентов HDL (например, аро А-I, параоксоназы, ацетилгидролазы тромбоцит-активирующего фактора и т.п.), которые проявляют данную активность. Термин "человеческий пептид аро А-I пептид" относится к человеческому пептиду аро А-I полной длины, или его фрагменту, или домену, которые содержат амфипатическую спираль класса А. Термин "реакция моноцитов" (моноцитарная ракция), как используют в данном контексте, относится к активности моноцитов, характеризующей "воспалительную реакцию", связанную с образованием атеросклеротических бляшек. Реакция моноцитов характеризуется адгезией моноцитов к клеткам стенки сосуда (например, к клеткам сосудистого эндотелия) и/или хемотаксисом в субэндотелиальное пространство и/или дифференцировкой моноцитов в макрофаги. Термин "отсутствие изменений" касательно количества окисленного фосфолипида относится к отсутствию определяемого изменения, более предпочтительно к отсутствию статистически значимого изменения (например, при доверительном уровне по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% или 99%). Отсутствие определяемого изменения может также относиться к анализам, в которых уровень окисленного фосфолипида изменяется, но не на такую величину, как в отсутствие белка(ов),описанного в данном контексте, или со ссылкой на другие положительные или отрицательные контроли. В данном контексте используют следующие сокращения: РАРС: L1-пальмитоил-2-арахидоноилsn-глицеро-3-фосфорилхолин, POVPC: 1-пальмитоил-2-(5-оксовалерил)-sn-глицеро-3-фосфорилхолин,PGPC: 1-пальмитоил-2-глутарил-sn-глицеро-3-фосфорилхолин, PEIPC: 1-пальмитоил-2-(5,6-эпоксиизопростан Е 2)-sn-глицеро-3-фосфорилхолин, ChC18:2: холестерил линолеат, ChC18:2-OOH: холестерил линолеат гидропероксид, DMPC: 1,2-дитетрадеканоил-гас-глицерол-3-фосфохолин, PON: параоксоназа,HPF: стандартизованное поле зрения при большом увеличении микроскопа, BL/6: C57BL/6J;C3H:C3H/HeJ. Термин "консервативная замена" используют в отношении белков или пептидов с целью отражения замен аминокислот, которые практически не изменяютактивность (например, специфичность в отношении липопротеинов) или аффинность связывания (например, в отношении липидов или липопротеинов) молекулы. Как правило, консервативные замены аминокислот включают замену одной аминокислоты другой аминокислотой с близкими химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, представляющие собой типичные консервативные замены друг для друга: 1) аланин (А), серии (S), треонин (Т); 2) аспарагиновая кислота (D),глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (Т),лейцин (L), метионин (М), валин (V) и 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W). Термины "идентичный" или процент "идентичности" в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент остатков аминокислот или нуклеотидов, которые являются одинаковыми при сравнении и сопоставлении (выравнивании) для выявления максимального соответствия, которое измеряют с использованием следующих алгоритмов для сравнения последовательностей или посредством визуального изучения. Что касается пептидов, соответствующих данному изобретению, то идентичность определяют для пептида полной длины. При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность служит эталонной последовательностью, с которой сравнивают тест-последовательность. При использовании алгоритма для сравнения последовательностей данные о тест-последовательности и эталонной последовательности вводят в компьютер, при необходимости определяют координаты субпоследовательности и определяют параметры программы алгоритма. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей вычисляют процент идентичности последовательности для тест-последовательности(ей) относительно эталонной последовательности на основе заданных параметров программы. Оптимальный элайнмент (способ анализа первичной структуры последовательностей, основанный на сопоставлении, выравнивании последовательностей друг относительно друга) последовательностей с целью сравнения может быть проведен, например, с помощью алгоритма локальной гомологии, описанного в статье Smith и Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, (1981, алгоритма сопоставления гомологии,описанного в статье Needleman и Wunsch, J. Mol Biol., 48:443 (1970), способом поиска аналогий, описанным в статье Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444, (1988), путем компьютеризированного применения данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Пакете Программного оборудования Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или путем визуального изучения (см. в основном работу Ausubel и соавт., supra). Одним из примеров эффективного алгоритма является PILEUP. PILEUP проводит элайнмент (сопоставление) множества последовательностей из группы близких последовательностей, используя постепенные попарные сопоставления, чтобы показать близость и процент идентичности последовательностей. Он также рисует дерево или дендрограмму, демонстрирующие образование групп родства, которые используют для сопоставления. В PILEUP используют упрощение способа постепенного сопоставления,описанного в статье Feng и Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360, (1987). Используемый способ близок способу, описанному в статье Higgins и Sharp, CABIOS, 5:151-153, (1989). Программа может сопоставить до-8 006488 300 последовательностей с максимальной длиной 5000 нуклеотидов или аминокислот каждая. Процедура элайнмента (сопоставления) множества последовательностей начинается с попарного сопоставления(выравнивания) двух самых близких между собой последовательностей с получением кластера двух сопоставленных последовательностей. Затем данный кластер сопоставляют со следующей наиболее близкой последовательностью или кластером сопоставленных последовательностей. Два кластера последовательностей сопоставляют путем простого продолжения попарного сопоставления (выравнивания друг относительно друга) двух отдельных последовательностей. Заключительное сопоставление достигается в серии постепенных попарных сопоставлений. Программа работает путем определения специфических последовательностей и координат их аминокислот или нуклеотидов на участках сравнения последовательностей и посредством определения параметров программы. Например, эталонную последовательность можно сравнить с другими тест-последовательностями, с целью установления близости по проценту идентичности последовательностей с использованием следующих параметров: вес пропущенных гэпов (3,00), вес длины пропущенных гэпов (0,10) и взвешенные концевые гэпы. Другим примером алгоритма, который пригоден для определения процента идентичности последовательностей и близости последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан в статьеAltschul и соавт., J. Mol. Biol., 215:403-410, (1990). Программное обеспечение для проведения анализовBLAST имеется в открытом доступе в Национальном Центре Информации по Биотехнологии (the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Данный алгоритм включает в себя первую идентификацию часто встречающихся пар последовательностей (HSP) по идентификации коротких "слов" длины W в запрашиваемой последовательности, которая либо соответствует, либо удовлетворяет некоторому положительно оцениваемому пороговому значению Т при сопоставлении со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т считают пороговым значением соседнего слова (Altschul и соавт., supra). Данные исходные удачные находки соседних слов действуют как затравка для инициации поиска, с целью обнаружения содержащих их более длинных HSP. Удачные слова затем удлиняют в обоих направлениях каждой последовательности настолько далеко, насколько может быть продолжено кумулятивное сопоставление. Кумулятивные значения вычисляют, используя для нуклеотидных последовательностей параметры М (положительная величина для пары правильно спаренных остатков, всегда 0) и N (отрицательная величина для ошибочно спаренных остатков, всегда 0). Для последовательностей аминокислот используют ту же матрицу для вычисления кумулятивного значения. Удлинение удачных слов в каждом направлении тормозится, когда кумулятивное значение сопоставления уменьшается до количества X от его максимально достигнутой величины; кумулятивное значение доходит до нуля или ниже вследствие накопления одного или более сопоставлений остатков с отрицательным значением или при достижении конца какой-либо последовательности. Параметры алгоритмаBLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) в качестве пропусков используют длину слова (W) = 11, ожидание(Е) = 10, М = 5, N = -4 и сравнение обоих нитей. Для последовательностей аминокислот в программеBLASTP в качестве пропусков используют длину слова (W) = 3, ожидание (Е) = 10 и основу для подсчетаBLOSUM62 (см. статью Henikoff и Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915, (1989. Кроме вычисления процента идентичности последовательности, алгоритм BLAST проводит также статистический анализ близости двух последовательностей (см., например, статью Karlin и Altschul, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787, (1993. Одно измерение близости с помощью алгоритма BLAST представляет собой наименьшую суммарную вероятность (P(N, которая указывает на вероятность, с которой случайно могло бы встретиться соответствие между двумя последовательностями нуклеотидов или аминокислот. Например, нуклеиновую кислоту считают близкой эталонной последовательности,если минимальная суммарная вероятность при сравнении тест-нуклеиновой кислоты и эталонной нуклеиновой кислоты не превышает приблизительно 0,1, более предпочтительно не превышает приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно не превышает приблизительно 0,001. Термин "пептид D-18A" относится к пептиду, имеющему последовательность: D-W-L-K-A-F-Y-DK-V-A-E-K-L-K-E-A-F(SEQ ID NO:1), в котором все энантиомерные аминокислоты являются аминокислотами в D-форме. Перечень чертежей и иных материалов На фиг. 1, панели А, В, С и D, представлено связывание 14C-D-5F с компонентами крови у мышей,нуллисомных по АроЕ. Пептидный миметик Аро A-I - D-5F, меченный 14 С-аминокислотами, вводили перорально через зонд аро Е-дефицитным мышам (n=5) или инкубировали с их плазмой in vitro. Отбор крови проводили натощак через 6 ч после введения и определяли связывание 14 С с кровью, плазмой и липопротеинами. Фиг. 2 А и 2 В иллюстрируют, что перорально введенный пептид D обладает активностью. Пептидные миметики Аро A-I - D-5F и L-5F (в дозе 100 мкг/животное) вводили перорально через зонд мышам,нуллисомным по рецептору LDL (n=5). Отбор крови проводили через 6 ч, LDL и HDL выделяли гельфильтрацией (FPLC - жидкостная экспресс-хроматография белков) и исследовали в модельной системе артериальной стенки в отношении защитной способности HDL (фиг. 2 А) и устойчивости LDL (фиг. 2 В) к окислению путем определения генерации хемотактической активности моноцитов. Как видно, D-5F, но-9 006488 не L-5F значительно повышал защитные свойства HDL, a LDL после воздействия D-5F становился высокоустойчивым к окислению. На фиг. 3 А и 3 В представлены концентрации в плазме пептида D относительно L после введения через зонд. Пептидные миметики ApoA-I-D-4F (фиг. 3 В) и L-4F (фиг. 3 В) были помечены 125I и введены перорально через зонд мышам, нуллисомным по рецептору LDL (п=4). Отбор крови проводили через 3 ч,плазму фракционировали с помощью FPLC и определяли радиоактивность в элюированных фракциях. Меньше 15% пептида L элюировалось в виде интактного 18-мера, тогда как больше 70% D-4F было интактным. Данные исследования демонстрируют, что пептид D является значительно более устойчивым к деградации in vivo по сравнению с пептидом L. Фиг. 4 иллюстрирует отсутствие антитела против D-4F у леченых мышей. Никакое антитело (белая преципитационная линия) против D-4F не было обнаружено в плазме мышей, нуллисомных по рецептору LDL, через 6 недель после лечения пептидом в дозе 5 мг/сутки (нижняя панель). Положительный контроль (верхняя панель) демонстрирует наличие преципитационной линии для аро А-I в мышиной плазме. Верхняя панель: Центр: антитело кролика против Apo A-I и периферия: плазма мышей, содержащих D4F. Нижняя панель: Центр: Плазма мышей LDL R-/-, леченных D-4F, и Периферия: Очищенный пептидD-4F в концентрации 0-80 мкг. На фиг. 5 представлен случай поражений в виде жировых штрихов в корне аорты мышей, нуллисомных по рецептору LDL, получающих западный корм. Группы мышей, нуллисомных по рецепторуLDL, содержали на корме западного типа и вводили перорально носитель (контроль) (n= 9) или пептидD-4F (n=6), два раза в день в течение 6 недель. Впоследствии мышей умерщвляли, фиксировали дугу аорты, готовили срезы и количественно оценивали поражения в виде жировых штрихов. У мышей, получавших D-4F, площадь поражения уменьшалась на 81% (р 0,01). На фиг. 6 панели А, В и С иллюстрируют распределение в плазме пептида 5F или аро А-I после внутрибрюшинной инъекции. Человеческий аро А-I, мышиный аро А-I и пептид 5F метили 125I и инъецировали внутрибрюшинно мышам C57BL/6, которые получали атерогенный корм в течение по меньшей мере трех недель. Образцы отбирали во время кинетических исследований, описанных в табл. 3. Репрезентативные образцы анализировали способом CLiP и собирали фракции для определения радиоактивности. Объем элюции основывался только на скорости насоса колонки; объемом, обусловленным насосом с ферментативным реагентом, пренебрегали. Данные представляют холестерин (в виде поглощения при длине волны 500 нм в произвольных единицах, сплошная линия) и радиоактивность (в ударах/мин.; пунктир). На панелях представлено: А: человеческий аро А-I (один час после инъекции); В: мышиный аро А-I (один час), C: 5F (1,5 ч). На фиг. 7 на панелях А и В проиллюстрировано взаимодействие мышиных липопротеинов с человеческими клетками артериальной стенки. LDL и HDL выделяли с помощью FPLC из плазмы мышей,которые получали атерогенный корм и инъекции носителя (PBS - забуференный фосфатом солевой раствор) или пептида 5F в дозе 20 мкг/мышь/сутки. Кокультуры обрабатывают без использования (без добавления) или с использованием человеческого LDL (hLDL) в концентрации 200 мкг/мл белка LDL или мышиного LDL (MoLDL) в концентрации 200 мкг/мл или человеческого LDL в концентрации 200 мкг/мл+ человеческого HDL (hHDL) в дозе 350 мкг/мл белка HDL или мышиного HDL (MoHDL) в концентрации 300 мкг/мл. Кокультуры инкубировали с вышеуказанными добавками в течение 8 ч при 37 С в присутствии 10% сыворотки с пониженным содержанием липопротеина (LPDS). Супернатанты собирали и анализировали на содержание эквивалентов гидропероксидов липидов по Auerbach (панель А). Затем кокультуры промывали и инкубировали в свежей среде для культивирования без сыворотки или LPDS в течение дополнительных 8 ч. Кондиционированную среду собирали и анализировали на хемотактическую активность моноцитов (панель В). Для сравнения в обе панели включен контрольный образец без клеток (контроль без клеток). На фиг. 8 показаны средние площади поражений на поперечных срезах. Приведенные данные представляют среднюю площадь поражения на поперечном срезе для каждого животного (о и среднее значениеSEM (стандартная ошибка) для всех животных в каждой группе ) с границами ошибки. Сокращения: PBS - мыши получали атерогенный корм, и им ежедневно делали инъекцию 200 мкл забуференного фосфатом солевого раствора; 5F - мыши получали атерогенный корм и им ежедневно делали инъекцию 20 мкг 5F в 200 мкл PBS; MoAI - мыши получали атерогенный корм и им ежедневно делали инъекцию 50 мкг мышиного аро А-I в 200 мкл PBS.= р 0,002, как определено с помощью двустороннего критерия Стьюдента. Достоверная разница также была показана с использованием одностороннего анализа дисперсии в классах (р 0,001). На фиг. 9 показано, что как D-, так и L-изомеры пептидных миметиков аро А-I препятствуют хемотактической активности моноцитов, индуцируемой слабо окисленным LDL in vitro. Представлены следующие варианты: только среда (LDL при отсутствии клеток или клетки при отсутствии LDL), контрольLDL от нормальных субъектов в концентрации 250 мкг/мл (LDL) и LDL + контроль HDL от нормальных субъектов в концентрации 350 мкг/мл (+HDL). Другие кокультуры инкубировали с контролем LDL вместе с различными количествами (показано в мкг на оси абсцисс) D-2F либо L-2F (третья панель слева, 2F)- 10006488 или D-37-pA либо L-37 рА (последняя панель справа, 37 рА). Данные представляют среднее значениеSD (стандартное отклонение) значений, полученных на кокультурах в четырех повторностях. Все значения для HDL или добавленных пептидов достоверно отличались от LDL в виде монокомпонента (первая панель слева) на уровне р 0,01. Фиг. 10 А и 10 В иллюстрируют, что кормление мышей пептидными миметиками Аро А-I, соответствующими данному изобретению, делает красные клетки устойчивыми к лизису in vitro. На фиг. 10 А и 10 В приведены результаты анализа лизиса красных клеток in vitro на 18 ч (фиг. 10 А) и 48 ч (фиг. 10 В). Звездочки отражают наличие достоверной разницы (р 0,001) между лизисом красных клеток у животных, которые получали носитель, относительно животных, которые получали пептиды. На фиг. 11 показано, что кормление мышей D-пептидными миметиками Аро А-I, соответствующими данному изобретению, делает циркулирующий в крови LDL устойчивым к окислению. Группам мышей с дефицитом рецептора LDL (n=3) через зонд вводили D-пептиды или носитель в виде солевого раствора. Каждое животное получало 100 мкл солевого раствора, 100 мкг/100 мкл пептида D-2F или пептидаD-37pA. Забор крови проводили из ретроорбитального синуса под мягкой анестезией через 17 ч. LDL выделяли из плазмы с помощью FPLC. Кокультуры клеток артериальной стенки инкубировали со средой без добавок (БЕЗ ДОБАВОК), контролем LDL от нормальных субъектов (LDL), LDL+ контроль HDL от нормальных субъектов (+HDL). Другие кокультуры инкубировали с мышиным LDL после введения через зонд солевого раствора (SALINE LDL), с пептидом D-2F (D-2F LDL) или D-37pA (D-37pA LDL). Кокультуры инкубировали в течение 4 ч при температуре 37 С в присутствии 10% LPDS. Затем супернатанты отбрасывали, кокультуры промывали и инкубировали со средой для культивирования, не содержащей сыворотку или LPDS, в течение дополнительных 4 ч. Данную кондиционированную среду собирали и анализировали на хемотактическую активность моноцитов. Значения представлены, как среднееSD по кокультурам в четырех повторностях. Звездочки указывают на р 0,001. Фиг. 12 иллюстрирует результаты анализа хемотаксиса, в котором сравнивают липопротеины, полученные от мышей, которым вводили пептиды в D-форме и/или L-форме через зонд. Фиг. 13 А иллюстрирует результаты анализа хемотаксиса, в котором сравнивают контроли HDL иHDL, полученные от мышей, которым через зонд вводили пептид D. Фиг. 13 В иллюстрирует результаты анализа хемотаксиса, в котором сравнивают LDL и VLDL/IDL, полученные от мышей, которым через зонд вводили пептид D. На фиг. 14 А и 14 В представлены результаты электрофореза 2F, показывающие его самоассоциацию. На фиг. 14 А показаны результаты SDS PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) (18%) 2F. На дорожке 1 представлен стандарт молекулярной массы, а на дорожке 2 представлена полоса, соответствующая 2F (молекулярная масса составляет 2242), движущийся несколько медленнее, чем стандарт с самой низкой молекулярной массой (3,5-2,5 кД). На фиг. 14 В представлены результаты PAGE в неденатурирующих условиях (4-12%), показывающие подвижности 2F в концентрациях 100 мкг/мл (дорожка 2) и 250 мкг/мл (дорожка 1), указывающие на самоассоциацию в растворе. Дорожка 3 представляет подвижность высокомолекулярного стандарта. На фиг. 15 показано, что гомологичные серии пептидов стабилизируют шестифазовый переход двухслойного DiPoPE. Сдвиг в Тн DiPoPE показан как функция мольной фракции добавленного пептида. Измерено с помощью DSC (дифференциальный сканирующий калориметр) при тепловой скорости сканирования 37/ч. Обозначения:- 2F; о - 3F3;- 4F;- 5F;- 6F;- 7F;- аро A-I. На фиг. 16 представлено мониторирование с помощью относительного прямоугольного рассеяния света растворения MLV ЕРС гомологичными сериями пептидов как функции времени. Репрезентативная кривая осветления MLV ЕРС представлена для каждого из гомологичных пептидов. Использовали эквимолярную концентрацию пептида и ЕРС (105 мкМ). Длины волн возбуждения и эмиссии составляли 400 нм. При использовании Triton Х-100 достигали полного растворения в конечной концентрации 1 мМ. Обозначения:- EPS; о - 2F;- 3F3;- 3F14;- 4F;- 5F;- 6F;- 7F;- человеческий аро A-I;Triton X-100. Фиг. 17 иллюстрирует способность LCAT активировать гомологичные пептиды. Представлены гистограммы, представляющие активацию LCAT F-пептидами. Активность LCAT измеряли с использованием маленьких однослойных носителей ЕРС-холестерина и выражали данную активность в процентах относительно активности apo A-I, где активность apo A-I принимали за 100%. Каждое значение представляет собой среднее значение по трем повторностям. Используемая концентрация пептида составляла 20 мкг/мл. На фиг. 18 показано, что индуцируемый LDL хемотаксис моноцитов ингибируется гомологичными сериями пептидов. LDL в виде монокомпонента или LDL, инкубированный либо с человеческим HDL,либо с гомологичной серией пептидов добавляли в кокультуры человеческих клеток артериальной стенки на 8 ч в присутствии 10% LPDS. Супернатанты удаляли и кокультуры промывали средой для культивирования без добавления сыворотки или LPDS. Кондиционированную среду собирали и анализировали на хемотактическую активность моноцитов. Данные представляют среднее значениеSEM (n=9 в каждом случае). При попарных сравнениях с LDL все пептиды, за исключением пептидов 3F, были досто- 11006488 верно более эффективны (по меньшей мере р 0,001, отмечено и ). Сравнения всех пептидов между собой анализировали с помощью одностороннего ANOVA (вариационный анализ). Звездочка указывает,что пептиды 4F, 5F и 6F были значительно более эффективны, чем гомологи 2F и 7F (р 0,05 при сравнении методом Duckett). Скобка указывает на отсутствие достоверной разницы в способности ингибировать LDL-индуцированный хемотаксис среди трех данных пептидов. На фиг. 19 показано, что инфекция гриппа А вызывает повышение уровня окисленных фосфолипидов в печени через два дня после инфекции. Мышей C57BL/6, находящихся на смешанном корме, интраназально инфицировали дозой вируса гриппа А таким образом, чтобы не развивалась виремия, как описано в статье Van Lenten и соавт., Circulation, 103:2283-2288, (2001). На 0, 2, 3, 5, 7 и 9 сутки после инфекции удаляли печени и определяли содержание окисленных фосфолипидов с помощью ESI-MS. На фиг. 20 показано, что D-4F препятствует снижению активности параоксоназы после инфекции гриппа А. Нескольким мышам, приведенным на фиг. 19, ежедневно делали внутрибрюшинную инъекцию 20 мкг D-4F, а другим мышам делали инъекцию забуференного фосфатом солевого раствора (PBS). Активность параоксоназы (PON) измеряли в плазме на 0, 2, 7 и 9 сутки после инфекции. На фиг. 21 показано, что D-4F препятствует индукции окисленных фосфолипидов в аортах мышей,инфицированных вирусом гриппа А. Нескольким мышам, приведенным на фиг. 19, ежедневно делали внутрибрюшинную инъекцию 20 мкг D-4F, а другим мышам делали инъекцию забуференного фосфатом солевого раствора (PBS). Аорты мышей брали на 2, 7 и 9 сутки после инфекции и определяли содержание окисленных фосфолипидов с помощью ESI-MS. На фиг. 22 А-22 С показано, что после перорального введения D-4F в отличие от L-4F остается интактным в циркулирующей крови мышей, нуллисомных по рецептору LDL, повышает способность HDL защищать LDL от окисления человеческими клетками артериальной стенки и снижает индуцированнуюLDL хемотактическую активность моноцитов. На фиг. 22 А представлены пептиды L-4F и D-4F, в которые были введены радиоактивные метки с использованием реагента в виде иода, иммобилизованного на гранулах. Пептиды вводили перорально через зонд мышам, нуллисомным по рецептору LDL (100 мкл солевого раствора, содержащего 100 мкг немеченого пептида + пептид, меченный 125I со специфической активностью 11106 срm (число импульсов/мин)/мкг пептида/животное, n=3). Кровь отбирали через 4 ч,плазму отделяли, делипидировали и анализовали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано в ссылке 12. На панелях В и С представлено введение пептидов L-4F и D-4F (100 мкг в 100 мкл солевого раствора/животное) мышам с дефицитом рецептора LDL с помощью перорального зонда. Кровь отбирают через 6 ч, плазменный HDL и LDL выделяют гель-фильтрацией (FPLC) и исследуют на кокультурах. На фиг. 22 В представлена способность мышиного и человеческого HDL защищать контрольный человеческий (hLDL) от окисления человеческими клетками артериальной стенки и ингибировать индуцированную LDL хемотактическую активность моноцитов. Человеческий LDL в концентрации 200 мкг белка/мл добавляли в кокультуры человеческих клеток артериальной стенки вместе с человеческим HDL(hHDL) в концентрации 350 мкг белка/мл или мышиным HDL (mHDL) в концентрации 100 мкг холестерина/мл, взятого от мышей, которые получали солевой раствор (солевой раствор Rx), или L4F (L-4F Rx),или D-4F (D-4F Rx), хемотактическую активность моноцитов определяли, как описано в данном контексте. На фиг. 22 С показана способность мышиного LDL индуцировать хемотактическую активность моноцитов. Контроли анализа представлены слева на панели В. Справа представлено, что мышиный LDL(mLDL) выделен у мышей, получающих солевой раствор (солевой раствор Rx), или L-4F (L-4F Rx), илиD-4F (D-4F Rx) и добавлен в концентрации 100 мкг холестерина/мл в кокультуры клеток артериальной стенки, не содержащие HDL, и определена хемотактическая активность моноцитов. Значения представляют собой среднее SD для четырех лунок в двух независимых экспериментах. На фиг. 23 показано, что пероральное введение D-4F резко снижает поражения у мышей, нуллисомных по рецептору LDL, находящихся на западном корме. Группы мышей, нуллисомных по рецепторуLDL, выдерживали на западном корме и вводили им через зонд 100 мкл солевого раствора в виде монокомпонента (солевой раствор) (n = 4 животных) или 100 мкл липосом, не содержащих D-4F (липосомы)(n = 5 животных), или 2,5 мг пептида D-4F в 100 мкл липосом (D-4F в липосомах (n = 6 животных), два раза в день в течение 6 недель. У мышей забирали кровь, впоследствии умерщвляли, фиксировали корень аорты, делали срезы и определяли количество материала, окрашенного масляным красным О в повреждениях в виде жировых штрихов. На фиг. 24 показано, что пероральное введение D-4F резко снижает поражения у мышей, нуллисомных по рецептору LDL, находящихся на смешанном корме. В возрасте 4 недели в воде для питья нескольким мышам, нуллисомным по аро Е, добавляют D-4F в концентрации 1 мг/мл (n = 4 мыши). D-4F в концентрации 2 мг/мл добавляют в воду для питья другой группе мышей (n = 4 мыши) и никакой пептид на добавляют в воду для питья третьей группе мышей (n = 5 мышей). Все мыши употребляли приблизительно 2,5 мл воды в день, при этом первая группа не получала пептид (вода), вторая группа получала 2,5 мг D-4F/мышь/день (2,5 мг D-4F) и третья группа получала 5,0 мг D-4F/мышь/день (5,0 мг D-4F). Все группы продолжали получать смешанный корм в течение 5 недель, в течение которых у мышей забирали кровь, впоследствии их умерщвляли, фиксировали корень аорты, делали срезы и определяли количество материала, окрашенного масляным красным О в повреждениях в виде жировых штрихов.- 12006488 Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияI. Уменьшение интенсивности симптома атеросклероза. Данное изобретение касается обнаружения того, что синтетические пептиды, сконструированные для имитации мотива амфипатической спирали класса A (Segrest и соавт., Proteins: Structure, Function,and Genetics, 8:103-117, (1990, способны связываться с фосфолипидами и проявляют многие биологические свойства, близкие свойствам человеческого apo-A-I. В частности, в данном изобретении было обнаружено, что, когда данные пептиды получают с использованием D-аминокислот, пептиды демонстрируют резкое увеличение длительности полужизни в сыворотке и их можно даже вводить перорально, в особенности, когда аминоконцы и/или карбоксильные концы блокированы. Более того, удивительным фактом, обнаруженным в данном изобретении, было то, что данные Dформы пептидов сохраняют биологическую активность L-форм пептидов. Исследования на животных invivo с использованием данных D-форм пептидов показали эффективность пероральной доставки, увеличенный период полужизни в сыворотке и способность уменьшать интенсивность или предупреждать/подавлять по крайней мере один симптом атеросклероза. Обнаружено, что нормальный HDL ингибирует три стадии образования мягко окисленного LDL. В данных исследованиях (см. одновременно рассматриваемую заявку USSN 09/541,468, поданную 31 марта 2000 г.) продемонстрировано, что обработка человеческого LDL in vitro apo А-I или пептидным миметиком apo A-I (37 рА) удаляет из LDL затравочные молекулы, которые включали HPODE и НРЕТЕ. Данные затравочные молекулы были необходимы для кокультур человеческих клеток артериальной стенки, чтобы получить способность к окислению LDL, и для LDL, чтобы индуцировать в клетках стенок артерии продукцию хемотактической активности моноцитов. Было также продемонстрировано, что после инъекции мышам или инфузии человеку apo A-I LDL, выделенный у мышей и людей-добровольцев после данной инъекции/инфузии apo A-I, был устойчив к окислению человеческими клетками артериальной стенки и не индуцировал хемотактическую активность моноцитов в кокультурах клеток артериальной стенки. Защитная функция D-пептидов, соответствующих данному изобретению, проиллюстрирована на фиг. 1-5. На фиг. 1 на панелях А, В, С и D представлено связывание 14C-D-5F с компонентами крови мышей, нуллисомных по АроЕ. В данном контексте показано также, что HDL мышей, которые получали атерогенный корм и которым делали инъекцию PBS, не мог ингибировать окисление человеческого LDL и не мог ингибировать индуцированную LDL хемотактическую активность моноцитов в кокультурах человеческих клеток артериальной стенки. Напротив, HDL мышей, которые получали атерогенный корм и которым ежедневно инъецировали пептиды, описанные в данном контексте, был эффективным в плане ингибирования окисления человеческого LDL и предупреждения индуцированной LDL хемотактической активности моноцитов в кокультурах, как нормальный человеческий HDL (см. фиг. 2 А и 2 В). Кроме того, LDL, взятый от мышей, получавших атерогенный корм, которым ежедневно делали инъекцию PBS,легче окислялся и легче индуцировал хемотактическую активность моноцитов, чем LDL, взятый от мышей, получавших такой же корм, но которым ежедневно инъецировали 20 мкг пептида 5F. D-пептид,очевидно, не был иммуногенным (см. фиг. 4). Реакции in vitro человеческих клеток артериальной стенки на HDL и LDL мышей, получавших атерогенный корм, которым инъецировали пептид, соответствующий данному изобретению, соответствуют защитному действию, показанному данными пептидами in vivo. Несмотря на близкие уровни общего холестерина, DDL-холестерина, IDL+VLDL-холестерина и пониженный уровень HDL-холестерина в виде процента от общего содержания холестерина, у животных, получавших атерогенный корм, которым делали инъекции пептида, имели значительно более низкое число повреждений (см. фиг. 5). Пептиды,соответствующие данному изобретению, предупреждали таким образом развитие атеросклеротических повреждений у мышей, получавших атерогенный корм. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение представляет способы облегчения и/или предупреждения по крайней мере одного симптома атеросклероза. Способы предпочтительно включают введение в организм, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека,по крайней мере одного пептида, соответствующего данному изобретению (или миметика данного пептида). Пептид(ы) могут вводиться, как описано в данном контексте, в соответствии с любым из многочисленных стандартных способов, включая, без ограничения перечисленным, инъекцию, суппозиторий,назальный спрей, имплантат с замедленным выделением, чрескожный пластырь и т.п. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления пептид(ы) вводят перорально (например, в виде сиропа, капсулы или таблетки). Способы включают введение одного полипептида, соответствующего данному изобретению, или введение двух или более различных полипептидов. Полипептиды могут быть представлены в виде мономеров или в димерных, олигомерных или полимерных формах. В ряде вариантов осуществления мультимерные формы могут содержать ассоциированные мономеры (например, связанные ионными или гидрофобными связями), тогда как ряд других мультимерных форм содержит ковалентно связанные мономеры (связанные непосредственно или через линкер).- 13006488 Хотя изобретение описано в плане применения для человека, оно может быть также пригодно для животного, например, для ветеринарных нужд. Таким образом, предпочтительные организмы включают в себя, без ограничения перечисленным, человека, приматов, собак, лошадей, кошек, свиней, копытных,зайцеобразных и т.п. Способы, соответствующие данному изобретению, не ограничены человеком и животными, проявляющими по крайней мере один симптом атеросклероза (например, гипертензию, образование и разрушение бляшек, повторение таких клинических событий, как сердечный приступ, стенокардия или инсульт, высокие уровни холестерина в плазме, высокие уровни липопротеина низкой плотности, высокие уровни липопротеина очень низкой плотности или воспалительных белков и т.п.), но являются эффективными в контексте профилактики. Так, пептиды, соответствующие данному изобретению (или их миметики), можно вводить в организм с целью предупреждения начала/развития по крайней мере одного симптома атеросклероза. В данном контексте особенно предпочтительными являются субъекты с проявлениями одного или более факторов риска развития атеросклероза (например, семейный анамнез, гипертензия, ожирение, злоупотребление алкоголем, курение, высокий уровень холестерина в крови, высокий уровень триглицеридов в крови, повышенный уровень в крови LDL, VLDL, IDL, или низкий уровеньHDL, диабет или наличие диабета в семейном анамнезе, высокий уровень липидов в крови, сердечный приступ, стенокардия или инсульт и т.п.). Кроме способов с использованием подавляющих атеросклероз пептидов, соответствующих данному изобретению, в данном изобретении представлены также указанные пептиды, пептиды, приготовленные в виде фармацевтических препаратов, особенно для пероральной доставки, и наборы для лечения и/или предупреждения по крайней мере одного симптома атеросклероза.II. Уменьшение интенсивности симптома атеросклероза, связанного с острым воспалительным ответом. Пептиды, подавляющие атеросклероз, соответствующие данному изобретению, эффективны также в ряде других контекстов. В частности, отмечено, что сердечно-сосудистые осложнения (например, атеросклероз, инсульт и т.п.) часто сопровождают или следуют за началом воспалительной реакции острой фазы. Данная воспалительная реакция острой стадии часто ассоциируется с рецидивирующим воспалительным заболеванием (например, лепрой, туберкулезом, системной красной волчанкой и ревматоидным артритом), вирусной инфекцией (например, гриппом), бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией,трансплантатом органа, раной или иной травмой, имплантированным протезом, биопленкой и т.п. Удивительный факт, обнаруженный в данном изобретении, состоит в том, что введение по крайней мере одного пептида, описанного в данном контексте, может снижать или предотвращать образование окисленных фосфолипидов во время или после ответной реакции острой фазы и, вследствие этого,уменьшать или устранять сердечно-сосудистые осложнения, связанные с данным состоянием. Так, например, продемонстрировано, что последствием инфекции гриппа является снижение активности параоксоназы и тромбоцит-активирующей ацетилгидролазы в HDL. Не будучи связанными определенной теорией, авторы полагают, что в результате потери в HDL активностей данных ферментов, а также в результате связывания прооксидантных белков с HDL во время ответной реакции острой фазыHDL более не способен препятствовать окислению LDL и более неспособен препятствовать индуцированной LDL продукции хемотактической активности моноцитов в эндотелиальных клетках. Показано, что у субъекта, которому ежедневно делают инъекции очень низких доз полипептидов,соответствующих данному изобретению, (например, 20 мкг/мышь) после инфекции вируса гриппа А не падают уровни параоксоназы и не образуются биологически активные окисленные фосфолипиды на уровне, превышающем фоновый. Данные факты свидетельствуют о том, что D-4F (и/или другие пептиды, соответствующие данному изобретению) могут быть введены (например, перорально или путем инъекции) больным с установленным заболеванием коронарной артерии во время инфекции гриппа или других событий, которые могут создать воспалительную ответную реакцию острой фазы (например, вследствие вирусной инфекции, бактериальной инфекции, травмы, трансплантата, различных аутоиммунных состояний и т.п.), и таким образом можно посредством данного краткосрочного лечения предупредить повышенную вероятность сердечного приступа и инсульта, связанных с патологиями, которые приводят к созданию данных воспалительных состояний. Так, в некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предполагают введение по крайней мере одного пептида, соответствующего данному изобретению, субъекту с риском развития или в состоянии острой воспалительной реакции и/или с риском развития или с симптомом атеросклероза. Так, например, субъекту с коронарной болезнью или с риском развития данной болезни можно профилактически ввести полипептид, соответствующий данному изобретению, в течение периода повышенной заболеваемости гриппом. Человека (или животное) с рецидивирующим воспалительным состоянием, например, ревматоидным артритом, различными аутоиммунными заболеваниями и т.п., можно лечить полипептидом, соответствующим данному изобретению, с целью смягчения или предупреждения развития атеросклероза или инсульта. Человека (или животное) с травмой, например, острым повреждением, трансплантатом ткани и т.п. можно лечить полипептидом, соответствующим данному изобретению, с целью смягчения развития атеросклероза или инсульта.[076] В ряде случаев данные способы будут приводить к диагностике появления или риска развития острого воспалительного ответа. Острый воспалительный ответ, как правило, включает в себя изменения в метаболизме и регуляции генов в печени. Именно динамический гомеостатический процесс включает все главные системы организма в дополнение к иммунной, сердечно-сосудистой и центральной нервной системе. Обычно ответная реакция острой фазы продолжается только несколько дней, однако, в случаях хронического или рецидивирующего воспаления аберрантная продолжительность некоторых аспектов ответной реакции острой фазы может участвовать в повреждении основных тканей, которое сопровождает заболевание, и может также приводить к дальнейшим осложнениям, например сердечно-сосудистым заболеваниям или заболеваниям, связанным с отложением белка, таким как амилоидоз.[0077] Важным аспектом ответа острой фазы является измененный коренным образом биосинтетический профиль в печени. В нормальных условиях печень синтезирует характерный для нее круг белков плазмы в постоянных концентрациях. Многие из данных белков имеют важные функции, и необходимы повышенные уровни в плазме данных реагентов острой фазы (APR) или белков острой фазы (АРР) во время ответной реакции острой фазы, следующей после стимуляции воспаления. Хотя большинствоAPRs синтезируются гепатоцитами, некоторые образуются клетками других типов, включая моноциты,эндотелиальные клетки, фибробласты и адипоциты. Большинство APR индуцируются на уровне между 50% от нормы и превышением нормы в несколько раз. Напротив, уровни основных APR могут повышаться в 1000 раз относительно нормы. Данная группа включает в себя сывороточный амилоид A (SAA) и либо С-реактивный белок (CRP) у человека, либо его гомолог у мышей, сывороточный компонент амилоида Р (SAP). Концентрации в плазме так называемых негативных APR снижаются во время ответной реакции острой фазы, обеспечивая повышение способности печени синтезировать индуцированные APR. В ряде вариантов осуществления ответную реакцию острой фазы или риск ее развития оценивают путем измерения одного или более АРР. Измерение данных маркеров хорошо известно компетентным специалистам в данной области, и существуют компании-поставщики, которые проводят данное измерение (например, AGP, измеренное Cardiotech Services, Louisville, KY).III. Смягчение симптома или состояния, связанного с кальцификацией коронарной артерии и остеопорозом. Идентифицированы также окисленные липиды, которые являются причиной кальцификации коронарной артерии и остеопороза. Более того, не будучи связанными определенной теорией, авторы полагают, что те же самые механизмы участвуют в патогенезе кальцификационного аортального стеноза. Таким образом, в ряде вариантов осуществления данное изобретение предполагает использование пептидов, описанных в данном контексте, для подавления или предупреждения развития симптома заболевания, такого как ревматическая полимиалгия, нодозный полиартериит, склеродерма, идиопатический легочный фиброз, хроническое обструктивное легочное заболевание, болезнь Альцгеймера, СПИД,кальцификация коронарной артерии, кальцификационный аортальный стеноз, остеопороз и т.п.IV. Предпочтительные пептиды и их получение. Предпочтительные пептиды. В данном изобретении обнаружено, что пептиды класса А способны смягчать по крайней мере один симптом атеросклероза. Пептиды класса А характеризуются образованием -спирали, которая дает сегрегацию полярных и неполярных остатков, формируя таким образом полярную и неполярную поверхности с положительно заряженными остатками, находящимися на разделе полярной и неполярной поверхностей, и отрицательно заряженными остатками, находящимися в центре полярной поверхности (см.,например, статью Anantharamaiah, Meth. Enzymol., 128:626-668, (1986. Замечено, что четвертый экзон аро А-I при складывании с использованием 3,667 остатков/поворот спирали образует структуру амфипатической спирали класса А. Один особенно предпочтительный пептид класса А, обозначенный 18 А (см. табл. 1, а также статьюAnantharamaiah, Meth. Enzymol, 128: 626-668, (1986, был модифицирован, как описано в данном контексте, с целью получения пептидов, пригодных для перорального введения и высокоэффективных для подавления или предупреждения по крайней мере одного симптома атеросклероза. Вне связи с определенной теорией, полагают, что действие пептидов, соответствующих данному изобретению, in vivo может заключаться в улавливании затравочных молекул(ы), которые снижают окисление LDL. Определено, что повышение числа остатков Phe на гидрофобной поверхности 18 А теоретически должно было бы повысить аффинность к липидам, что установлено с помощью вычислений, описанных в статье Palgunachari и соавт., Arteriosclerosis, ThrombosisVascular Biology, 16: 328-338, (1996). Теоретически методичная замена остатков на неполярной поверхности 18 А на Phe могла бы привести к образованию шести пептидов. Пептиды с дополнительными 2, 3 и 4 Phe теоретическим имели бы значение аффинности к липидам 13, 14 и 15 единиц, соответственно. Однако значения 1 увеличились бы на четыре единицы, если бы число дополнительных Phe возросло от 4 до 5 (до 19 единиц). Увеличение до 6 или 7 Phe привело бы к менее резкому повышению (до 20 и 21 единиц, соответственно). Вследствие этого, было выбрано 5 дополнительных Phe (и поэтому пептиды обозначены, как 5F). В одном особенно- 15006488 предпочтительном варианте осуществления пептид 5F был блокирован тем, что аминоконцевой остаток был ацетилирован, а карбоксильный конец был амидирован. Новый пептидный аналог класса A, 5F, ингибировал развитие повреждения у чувствительных к атеросклерозу мышей. Новый пептидный аналог 5F сравнивали с мышиным аро А-I (МоА-I) по эффективности подавления индуцированного кормом атеросклероза у данных мышей, используя дозировки пептида, основанные на исследованиях, проведенных Levine и соавт. (см. статью Levine и соавт., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 90:12040-12044, (1993. Был также получен ряд других пептидов класса А, которые показали различные, но значительные степени эффективности в плане уменьшения интенсивности по крайней мере одного симптома атеросклероза. Ряд данных пептидов приведен в табл. 1. Таблица 1 Предпочтительные пептиды для использования в данном изобретении Хотя различные пептиды, приведенные в табл. 1, представлены с ацетильной группой, защищающей аминоконец, и амидной группой, защищающей карбоксильный конец, одна или обе защитные группы могут быть удалены и/или заменены другой защитной группой, как описано в данном контексте. В особенно предпочтительном варианте осуществления пептиды содержат одну или более аминокислот вD-форме, как описано в данном контексте. В ряде вариантов осуществления каждая аминокислота (например, каждая энантиомерная аминокислота) в пептидах, приведенных в табл. 1, является D-формой аминокислоты. Отмечено также, что табл. 1 не является полной. Используя описание, представленное в данном контексте, можно рутинным образом получить подходящие пептиды (например, путем консервативных или полуконсервативных замен (например, D заменить на Е), удлинений, делеций и т.п.). Так, например,в одном варианте осуществления используют укорочения любого по крайней мере одного пептида, идентифицированного в SEQ ID NONO: 2-20 и 39-85. Так, например, SEQ ID NO: 21 представляет пептид,содержащий 14 аминокислот С-конца 18 А, содержащий одну или более D-аминокислот, тогда как SEQID NONO: 22-38 представляют другие варианты укорочения. Более длинные пептиды также подходят. Данные более длинные пептиды могут полностью образовывать амфипатическую спираль класса А или амфипатическая спираль класса А может образовывать по крайней мере один домен пептида. Кроме того, в данном изобретении рассмотрены мультимерные варианты пептидов. Так, например, пептиды, приведенные в табл. 1, могут быть связаны друг с другом (непосредственно или через линкер (например,углеродный линкер или одну или более аминокислот) с одной или более промежуточных аминокислот). Иллюстративные полимерные пептиды включают в себя 18 А-Рrо-18 А и пептиды SEQ ID NONO:79-85,предпочтительно содержащие одну или более D-аминокислот, более предпочтительно содержащие каждую из аминокислот в форме D-аминокислоты, как описано в данном контексте, и/или имеющие один или оба защищенных конца. Неожиданный факт, соответствующий данному изобретению, состоит в том, что при инкорпорацииD-аминокислот в пептиды класса А (например, как показано в табл. 1) последние сохраняют свою активность, но при этом могут вводиться перорально. Более того, данное пероральное введение в результате обеспечивало относительно эффективное всасывание и значительный период полужизни, представляя таким образом эффективный способ смягчения по крайней мере одного симптома атеросклероза. При использовании представленного описания в данном контексте компетентный специалист в данной области может рутинным образом модифицировать проиллюстрированные пептиды класса А, с- 18006488 целью получения других пептидов класса А, соответствующих данному изобретению. Например, можно осуществить рутинные консервативные или полуконсервативные замены (например, Е на D) имеющихся аминокислот. Эффект различных замен на аффинность полученного в результате пептида в отношении липидов можно предсказать, используя вычислительный способ, описанный Palgunachari и соавт., Arteriosclerosis, ThrombosisVascular Biology, 16: 328-338, (1996). Пептиды можно удлинить или укоротить настолько, чтобы сохранилась структура -спирали класса А. Кроме того, можно осуществить замены,делающие конечный пептид более близким пептиду(ам), эндогенно образующемуся в организме субъекта. В ряде вариантов осуществления пептиды, соответствующие данному изобретению, содержат "Dформы пептидов, описанных в патенте США 4643988, более предпочтительно "D-формы, в которых один или оба конца связаны с защитными группами. Данные пептиды включают в себя пептиды, имеющие формулуА 1-В 1-В 2-С 1-D-В 3-В 4-А 2-С 2-В 5-В 6-А 3-С 3-В 7-С 4-А 4-В 8-В 9 (SEQ ID NO: 86), где A1, A2, А 3 и А 4 независимо представлены аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой или их гомологами или аналогами; В 1, В 2, В 3, В 4, В 5, В 6, В 7, В 8 и В 9 независимо представлены триптофаном, фенилаланином,аланином, лейцином, тирозином, изолейцином, валином или нафтилаланином или их гомологами или аналогами; С 1, С 2, С 3 и С 4 независимо представлены лизином или аргинином и D представлено серином,треонином, аланином, глицином, гистидином или их гомологами или аналогами, при условии, что, если А 1 и А 2 представлены аспарагиновой кислотой, то А 3 и А 4 представлены глутаминовой кислотой, В 2 и В 9 представлены лейцином, В 3 и В 7 - фенилаланином, В 4 - тирозином, В 5 - валином, В 6, В 8 и D - аланином, а С 1, С 2, С 3 и С 4 - лизином, и В 1 не является триптофаном, где одна из энантиомерных аминокислот находится в форме "D-аминокислоты. Предпочтительно, когда по меньшей мере 50% энантиомерных аминокислот находятся в "D-форме, более предпочтительно, когда по меньшей мере 80% энантиомерных аминокислот находятся в "D-форме и наиболее предпочтительно, когда по меньшей мере 90% или даже все энантиомерные аминокислоты находятся в "D"-форме. Хотя в предпочтительных вариантах осуществления в пептидах, соответствующих данному изобретению, используют природные аминокислоты или D-формы природных аминокислот, предусмотрены замены неприродными аминокислотами (например, метионинсульфоксидом, метионинметилсульфонием, норлейцином, эпсилон-аминокапроновой кислотой, 4-аминобутановой кислотой, тетрагидроизохинолин-3-карбоновой кислотой, 8-аминокапроновой кислотой, 4-аминомасляной кислотой, Lys(Nтрифторацетилом), -аминоизомасляной кислотой и т.п.). Кроме пептидов класса А в данном контексте предусмотрены пептидомиметики. Аналоги пептидов обычно используют в фармацевтической промышленности как непептидные лекарственные вещества со свойствами, аналогичными свойствам матричных пептидов. Данные типы непептидных соединений называют "миметиками пептидов" или "пептидомиметиками" (см. статьи Fauchere, Adv. Drug Res., т.15,стр.29, (1986); Veber и Freidinger, TINS, стр.392, (1985) и Evans и соавт., J. Med. Chem., т. 30, стр. 1229,(1987 и обычно создают с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования. Миметики пептидов со структурой, близкой терапевтически эффективным пептидам, могут быть использованы для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. В общем пептидомиметики являются близкими по структуре полипептиду-образцу (т.е. 5F, описанному в данном контексте), но они имеют одну или более пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(цис и транс),-СОСН 2-, -СН(ОН)СН 2-, -CH2SO-, и т.п., известными в данной области способами, далее описанными в следующих ссылках: главе, написанной Spatola в монографии под ред. В. Weinstein, Химия и биохимия аминокислот, пептидов и белков (Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins), Marcel Dekker, New York, стр. 267, (1983); работе Spatola, Vega Data 1(3) Модификации пептидного скелетаTrans., т. I, стр.307-314, (1982) (-CH-CH-, цис и транс); Almquist и соавт., J. Med. Chem., 23:1392-1398,(1980), (-COCH2-); Jennings-White и соавт., Tetrahedron Lett., 23:2533, (1982), (-COCH2-); заявка Szelke М. и соавт., European Appln. EP 45665, (1982), СА: 97:39405 (1982) (-СН(ОН)СН 2-); статье Holladay и соавт.,Tetrahedron Lett., 24:4401-4404, (1983) (-С(ОН)СН 2-) и Hruby, Life Sci., 31:189-199, (1982), (-CH2-S-. Особенно предпочтительной непептидной связью является -CH2NH-. Данные миметики пептидов могут иметь существенные преимущества перед полипептидными вариантами осуществления, включая,например, такие как более экономически выгодное получение, повышенную химическую стабильность,улучшенные фармакологические свойства (период полужизни, всасывание, активность, эффективность и т.п.), пониженную антигенность и др. Кроме того, круговые перестановки пептидов, описанные в данном контексте, или ограниченные пептиды (включая циклизованные пептиды), содержащие консенсусные последовательности или варианты, практически идентичные консенсусным последовательностям, могут быть получены способами, известными в уровне техники (см. статью Rizo и Gierasch, Ann. Rev. Biochem., т. 61, стр. 387, (1992; на- 19006488 пример, посредством введения внутренних остатков цистеина, способных к образованию внутримолекулярных дисульфидных мостиков, которые циклизуют пептид. Получение пептидов. Пептиды, используемые в данном изобретении, синтезированы химическим путем с использованием стандартных методик химического синтеза пептидов или, в особенности, в случаях, когда пептид не содержит остатки D-аминокислот, экспрессированы рекомбинантным образом. При рекомбинантной экспрессии полипептидов организм-хозяин (например, бактерию, растение, грибные клетки и т.п.) культивируют в среде, где одну или более аминокислот представляют организму исключительно в D-форме. Тогда рекомбинантно экспрессируемые в данной системе пептиды включают в себя данные Dаминокислоты. В предпочтительных вариантах осуществления пептиды синтезируют химическим путем с помощью ряда жидко- или твердофазных методик синтеза пептидов, известных компетентным специалистам в данной области. Предпочтительным способом химического синтеза полипептидов, соответствующих данному изобретению, является твердофазный синтез, в котором С-концевую аминокислоту последовательности присоединяют к нерастворимой основе с последующим последовательным добавлением остальных аминокислот последовательности. Методики твердофазного синтеза хорошо известны компетентным специалистам в данной области и описаны, например, в разделе, написанном Barany иMerrifield, Твердофазный синтез пептидов (Solid-Phase Peptide Synthesis) в монографии Пептиды: анализ,синтез, биология (The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology), т. 2 Специальные способы синтеза пептидов,(Special Methods in Peptide Synthesis), часть А, стр. 3-284, (1963); см. также статью Merrifield и соавт., J.Am. Chem. Soc, 85:2149-2156 (1963) и раздел, написанный Stewart и соавт. в монографии Твердофазный синтез пептидов (Solid Phase Peptide Synthesis), 2 изд., Pierce Chem. Co., Rockford, III, (1984). В наиболее предпочтительном варианте осуществления пептиды синтезируют с помощью процедуры твердофазного синтеза пептидов, используя в качестве твердого носителя бензгидриламинную смолу(Beckman Bioproducts, 0,59 ммоль NH2/г смолы). СООН-концевую аминокислоту (например, t-бутилкарбонил-Рhе) присоединяют к твердому носителю через 4-(оксиметил)фенацетильную группу. Данная связь более стабильна, чем принятая связь на основе бензилового сложного эфира, при этом конечный пептид можно таким же образом отщепить путем гидрирования. Для этой цели используют гидрирование с переносом при использовании муравьиной кислоты в качестве донора водорода. Детальные протоколы, используемые при синтезе пептидов и анализе синтезированных пептидов описаны в печатном приложении к статье Anantharamaiah и соавт., J. Biol. Chem., 260(16): 10248-10255, (1985). Отмечено, что при химическом синтезе пептидов, в частности, пептидов, содержащих Dаминокислоты, данный синтез часто приводит к образованию ряда укороченных пептидов в дополнение к желательному продукту полной длины. Процесс очистки (например, ВЭЖХ), как правило, приводит к потере значительного количества продукта полной длины. В данном изобретении обнаружено, что при синтезе D-пептидов (например, D-4) для того, чтобы предотвратить потерю при очистке самой длинной формы, можно провести диализ и использовать смесь,устраняя таким образом последнюю стадию очистки с использованием ВЭЖХ. При этом потери смеси составляют приблизительно 50% активности высокоочищенного продукта (например, от массы белкового продукта), но смесь содержит приблизительно в 6 раз больше пептида, обладая таким образом более высокой общей активностью.D-аминокислоты инкорпорируют в одно или более положений в пептиде, просто используя дериватизированный остаток D-формы аминокислоты в химическом синтезе. Остатки D-формы для твердофазного синтеза пептидов поставляются в продажу рядом фирм (см., например, Advanced Chem Tech, Louisville; Nova Biochem, San Diego; Sigma, St. Louis; Bachem California Inc., Torrance, и т.п.). D-формы аминокислот можно инкорпорировать в любое положение пептида, как это желательно. Так, например, в одном варианте осуществления пептид может содержать одну D-аминокислоту, тогда как в других вариантах осуществления пептид содержит по меньшей мере две, как правило, по меньшей мере три, более обыкновенно по меньшей мере четыре, наиболее обыкновенно по меньшей мере пять, предпочтительно по меньшей мере шесть, более предпочтительно по меньшей мере семь и наиболее предпочтительно по меньшей мере восемь D-аминокислот. В особенно предпочтительных вариантах осуществления практически каждая другая (энантиомерная) аминокислота является аминокислотой в D-форме. В ряде вариантов осуществления по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% энантиомерных аминокислот представлены D-формой аминокислот. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, практически каждая из энантиомерных аминокислот является D-формой аминокислоты. Защитные группы. В ряде вариантов осуществления одна или более R-групп на составляющих пептид аминокислотах и/или концевых аминокислотах блокированы защитной группой. Вне связи с определенной теорией в данном изобретении обнаружено, что блокирование, в особенности, амино- и/или карбоксиконцов дан- 20006488 ных пептидов, соответствующих данному изобретению, значительно улучшает пероральную доставку и существенно увеличивает период полужизни в сыворотке. Для этой цели используют широкий ряд защитных групп. Данные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, ацетил, амид и алкильные группы, при этом ацетильная и алкильная группы являются особенно предпочтительными для N-концевой защиты, а амидные группы являются предпочтительными для защиты карбоксильного конца. В ряде особенно предпочтительных вариантов осуществления защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, алкильные цепи, как в жирных кислотах, пропеонил, формил и др. Особенно предпочтительные карбоксилзащитные группы включают в себя амиды, сложные эфиры и образующие простой эфир защитные группы. В одном предпочтительном варианте осуществления ацетильную группу используют для защиты аминоконца, а амидную группу используют для защиты карбоксильного конца. Данные блокирующие группы усиливают тенденции пептидов к образованию спирали. Определенные особенно предпочтительные блокирующие группы включают в себя алкильные группы различной длины, например, группы, имеющие формулу: СН 3(СН 2)n-СО-, где n лежит в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 20, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 16 или 18, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 13 и наиболее предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 10. В ряде особенно предпочтительных вариантов осуществления защитные группы включают в себя,без ограничения перечисленным, алкильные цепи, как в жирных кислотах, пропеонил, формил и др. Особенно предпочтительные карбоксилзащитные группы включают в себя амиды, сложные эфиры и образующие простой эфир защитные группы. В одном предпочтительном варианте осуществления ацетильную группу используют для защиты аминоконца, а амидную группу используют для защиты карбоксильного конца. Данные блокирующие группы усиливают тенденции пептидов к образованию спирали. Определенные особенно предпочтительные блокирующие группы включают в себя алкильные группы различной длины, например, группы, имеющие формулу: СН 3-(СН 2)n-СО-, где n лежит в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 20, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 16 или 18, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 13 и наиболее предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 10. Другие защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, Fmoc, tбутоксикарбонил (Воc), 9-флуоренацетильную группу, 1-флуоренкарбоксильную группу, 9 флуоренкарбоксильную группу, 9-флуоренон-1-карбоксильную группу, бензилоксикарбонил, ксантил(Хаn), тритил (Trt), 4-метилтритил (Mtt), 4-метокситритил (Mmt), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил (Mtr), мезитилен-2-сульфонил (Mts), 4,4-диметоксибензгидрил (Mbh), тозил (Tos), 2,2,5,7,8 пентаметилхроман-6-сульфонил (Pmc), 4-метилбензил (MeBzl), 4-метоксибензил (MeOBzl), бензилоксигруппу (BzlO), бензил (Bzl), бензоил (Bz), 3-нитро-2-пиридинсульфенил (Npys), 1-(4,4-диметил-2,6 диоксоциклогексилиден)этил (Dde), 2,6-дихлорбензил (2,6-диСl-Bzl), 2-хлорбензилоксикарбонил (2-ClZ), 2-бромбензилоксикарбонил (2-Br-Z), бензилоксиметил (Воm), циклогексилоксигруппу (сНхО), tбутоксиметил (Bum), t-бутоксигруппу (tBuO), t-бутил (tBu), ацетил (Ас) и трифторацетил (TFA). Защитные/блокирующие группы хорошо известны компетентным специалистам, так же, как способы присоединения данных групп к соответствующему остатку(ам), входящему в состав пептидов, соответствующих данному изобретению (см., например, монографию Greene и соавт., Защитные группы в органическом синтезе (Protective Groups in Organic Synthesis), 2-ое изд., John WileySons, Inc. Somerset,N.J., (1991. В одном из предпочтительных вариантов осуществления, например, ацетилирование осуществляют во время синтеза, когда пептид находится на смоле, при использовании уксусного ангидрида. Амидная защита может достигаться посредством выбора подходящей смолы для синтеза. При синтезе пептидов, описанных в данном контексте, в примерах использовали амидную смолу. После окончания синтеза все полупостоянные защитные группы на кислых бифункциональных аминокислотах, таких какAsp и Glu, основной аминокислоте Lys и гидроксиле Tyr одновременно удаляют. Пептиды, снятые с данной смолы путем обработки кислотой, получают с N-концом, защищенным ацетилом и карбоксилом,защищенным NH2, и при одновременном удалении всех других защитных групп.V. Усиление всасывания пептидов. Удивительным фактом, обнаруженным в данном изобретении, является то, что при введении пептида, состоящего только из L-аминокислот (например, если бы это было не так, то он имел бы последовательность пептида, соответствующего данному изобретению), в сочетании с D-формой (т.е. пептидом,соответствующим данному изобретению,) всасывание D-формы пептида повышается. Так, в ряде вариантов осуществления данное изобретение предусматривает использование комбинаций D-форм и L-форм пептидов в способах, соответствующих данному изобретению. Пептид в D-форме и пептид в L-форме могут иметь различные последовательности аминокислот, однако, в предпочтительных вариантах осуществления они обе имеют последовательности аминокислот пептидов, описанных в данном контексте, и в еще более предпочтительном варианте осуществления они имеют одну и ту же последовательность аминокислот. Фактом, обнаруженным в данном изобретении, является то, что конкатамеры пептидов алифатической спирали класса А, соответствующих данному изобретению, также эффективны в плане смягчения- 21006488 по крайней мере одного симптома атеросклероза. Мономеры, входящие в состав конкатамеров, могут быть непосредственно связаны друг с другом или соединены с помощью линкера. В ряде вариантов осуществления линкер представлен аминокислотным линкером (например, пролином) или пептидным линкером (например, Gly4Ser3). В ряде вариантов осуществления конкатамер представляет собой 2-мер, более предпочтительно 3-мер, еще более предпочтительно 4-мер и наиболее предпочтительно 5-мер, 8-мер или 10-мер.VI. Фармацевтические препараты. Для реализации способов, соответствующих изобретению, по крайней мере один пептид или миметик пептидов, соответствующих данному изобретению, вводят, например, субъекту, у которого диагностирован по крайней мере один симптом атеросклероза или риск развития атеросклероза. Пептиды или миметики пептидов могут быть введены в "нативной" форме или, если это желательно, в форме солей,сложных эфиров, амидов, пролекарств, производных и т.п., при условии, что соль, сложный эфир, амид,пролекарство или производное являются фармакологически приемлемыми, т.е. эффективными в данном способе. Соли, сложные эфиры, амиды, пролекарства и другие производные активных агентов можно приготовить с использованием стандартных процедур, известных компетентным специалистам в области синтетической органической химии, как описано, например, в монографии March, Успехи органической химии, реакции, механизмы и структура (Advanced Organic Chemistry; Reactions, Mechanisms and Structure), 4-ое изд., N.Y., Wiley-Interscience, (1992). Например, соли, полученные добавлением кислоты, готовят из свободного основания с использованием традиционной методики, которая обычно включает в себя реакцию с подходящей кислотой. Как правило, лекарственное вещество в форме основания растворяют в полярном органическом растворителе, таком как метанол, и добавляют кислоту. Полученная в результате соль выпадает в осадок или может быть выделена из раствора при добавлении менее полярного растворителя. Подходящие кислоты для получения солей при добавлении кислот включают в себя как органические кислоты, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, яблочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту,метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, р-толуолсульфоновую кислоту, салициловую кислоту и т.п., так и неорганические кислоты, например, хлористо-водородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т.п. Соль, полученная добавлением кислоты, может быть снова превращена в свободное основание при обработке подходящим основанием. Особенно предпочтительными солями активных агентов, полученными добавлением кислоты, в данном контексте являются галиды, такие, которые могут быть получены при использовании хлористо-водородной и бромисто-водородной кислот. Напротив, получение основных солей пептидов или миметиков проводят аналогичным образом с использованием фармацевтически приемлемого основания,такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксидаммония, гидроксид кальция, триметиламин и т.п. Особенно предпочтительные основные соли включают в себя соли щелочных металлов, например,соль натрия, а также соли меди. Получение сложных эфиров, как правило, включает в себя функционализацию гидроксильных и/или карбоксильных групп, которые могут присутствовать в молекулярной структуре лекарственного вещества. Сложные эфиры обычно представляют собой ацилзамещенные производные свободных спиртовых групп, т.е. структуры, производные от карбоновых кислот формулы RCOOH, где R - алкил и предпочтительно низший алкил. Сложные эфиры, если это желательно, могут быть снова превращены в свободные кислоты посредством традиционных процедур гидрогенолиза или гидролиза. Амиды и пролекарства также могут быть приготовлены с использованием методик, известных компетентным специалистам в данной области или описанных в соответствующей литературе. Например,амиды можно получить из сложных эфиров, используя подходящие реагенты-амины, или они могут быть получены из ангидрида или кислого хлорида при реакции с аммиаком или амином низшего алкила. Пролекарства, как правило, готовят посредством ковалентного присоединения молекулы, которое приводит к образованию соединения, являющегося терапевтически неактивным до его модификации в метаболической системе субъекта. Пептиды или миметики, идентифицированные в данном контексте, используют для парентерального, наружного, перорального, назального (или иначе ингаляционного), ректального или местного введения, такого как с помощью аэрозоля или чрескожного, с целью профилактического и/или терапевтического лечения атеросклероза и/или его симптомов. Фармацевтические композиции могут применяться в множестве унифицированных лекарственных форм в зависимости от способа введения. Подходящие унифицированные лекарственные формы включают в себя, без ограничения перечисленным, порошки,таблетки, пилюли, капсулы, лепешки, суппозитории, пластыри, назальные спреи, инъекционные препараты, имплантационные препараты с задержанным выходом, липидные комплексы и т.п. Пептиды и/или миметики пептидов, соответствующие данному изобретению, обычно комбинируют с фармацевтически приемлемым носителем (наполнителем) для образования фармакологической компо- 22006488 зиции. Фармацевтически приемлемые носители могут содержать по крайней мере одно физиологически приемлемое соединение, действие которого заключается, например, в стабилизации композиции или усилении или снижении всасывания активного агента(ов). Физиологически приемлемые соединения могут включать, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион, хелатирующие агенты, низкомолекулярные белки, агенты, усиливающие зашиту и всасывание, такие каклипиды, композиции, которые снижают клиренс или гидролиз активных агентов, или наполнители или другие стабилизаторы и/или буферы. Другие физиологически приемлемые соединения включают в себя увлажняющие агенты, эмульгаторы, диспергирующие агенты или консерванты, которые в особенности эффективны для предупреждения роста микроорганизмов. Различные консерванты хорошо известны и включают в себя, например,фенол и аскорбиновую кислоту. Компетентный специалист в данной области должен понимать, что выбор фармацевтически приемлемого носителя(ей), включая физиологически приемлемое соединение, зависит, например, от способа введения активного агента(ов) и от специфических физико-химических характеристик активного агента(ов). Наполнители предпочтительно стерильны и, как правило, не содержат нежелательный материал. Данные композиции можно стерилизовать с помощью обычных хорошо известных способов. При терапевтическом применении композиции, соответствующие данному изобретению, вводят больному, страдающему по крайней мере от одного симптома атеросклероза или с риском развития атеросклероза, в количестве, достаточном для лечения или, по меньшей мере, частичного предупреждения или остановки развития заболевания и/или его осложнений. Количество, адекватное для осуществления этого, определяют, как "терапевтически эффективную дозу". Количества, эффективные для данного применения, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния здоровья больного. Может быть проведено одно или множество введений композиций в зависимости от дозы и частоты, необходимых для больного или переносимых им. В любом случае композиция должна обеспечивать достаточное количество активных агентов препаратов, соответствующих данному изобретению, для эффективного лечения (облегчения по крайней мере одного симптома) больного. Концентрация пептида или миметика может широко варьировать и будет выбрана в основном на базе объемов жидкостей, вязкостей, массы тела и т.п. в соответствии с определенным избранным способом введения и нуждами больного. Однако концентрации, как правило, будут выбраны, чтобы обеспечить дозировки, находящиеся в интервале от приблизительно 0,1 или 1 мг/кг/сутки до приблизительно 50 мг/кг/сутки или несколько выше. Обычные дозировки находятся в интервале от приблизительно 3 мг/кг/сутки до приблизительно 3,5 мг/кг/сутки, предпочтительно от приблизительно 3,5 мг/кг/сутки до приблизительно 7,2 мг/кг/сутки, более предпочтительно от приблизительно 7,2 мг/кг/сутки до приблизительно 11,0 мг/кг/сутки и наиболее предпочтительно от приблизительно 11,0 мг/кг/сутки до приблизительно 15,0 мг/кг/сутки. В ряде предпочтительных вариантов осуществления дозировки находятся в интервале от приблизительно 10 мг/кг/сутки до приблизительно 50 мг/кг/сутки. Будет понятно, что данные дозировки могут варьировать с целью оптимизации терапевтической схемы для определенного субъекта или группы субъектов. В ряде предпочтительных вариантов осуществления пептиды или миметики пептидов, соответствующие данному изобретению, вводят перорально (например, в виде таблеток) или в виде инъекций в соответствии со стандартными способами, хорошо известными компетентным специалистам в данной области. В других предпочтительных вариантах осуществления пептиды могут также доставляться через кожу с использованием принятых чрескожных систем доставки лекарственных веществ, т.е. чрескожных"пластырей", в которых активный агент(ы) обычно содержится в ламинированной структуре, служащей устройством для доставки лекарственного вещества, которое следует прикреплять к коже. В данной структуре лекарственная композиция обычно содержится в слое или "резервуаре", лежащем под последним снизу слоем. Будет понятно, что термин "резервуар" в данном контексте относится к количеству"активного ингредиента(ов)", которое в конечном счете имеется для доставки на поверхность кожи. Так,например, "резервуар" может включать активный ингредиент(ы) в клее на заднем слое пластыря или в любом из множества различных препаратов основы, известных компетентным специалистам в данной области. Пластырь может содержать один резервуар или он может содержать множество резервуаров. В одном из вариантов осуществления резеруар содержит полимерную основу из фармацевтически приемлемого для контактирования с кожей липкого материала, который служит для прикрепления системы к коже во время доставки лекарственного вещества. Примеры пригодных для контактирования с кожей липких материалов включают в себя, без ограничения перечисленным, полиэтилены, полисилоксаны, полиизобутилены, полиакрилаты, полиуретаны и т.п. Альтернативно содержащий лекарственное вещество резервуар и контактирующий с кожей клей присутствуют в виде индивидуальных отдельных слоев, при этом клей лежит под резервуаром, который в данном случае может представлять собой либо полимерную основу, как описано выше, либо может быть жидким или гидрогелевым резервуаром, либо может принимать какую-нибудь иную форму. Слой основы данных ламинатов, который служит верхней поверхностью устройства, предпочтительно действует как основной структурный элемент "пластыря" и в значительной степени обеспечивает гибкость устройства. Материал, выбранный для слоя основы, пред- 23006488 почтительно является практически непроницаемым для активного агента(ов) и любых других присутствующих материалов. Другие предпочтительные препараты для наружной доставки лекарственного вещества включают в себя, без ограничения перечисленным, мази и кремы. Мази представляют собой полутвердые препараты,основой которых, как правило, является вазелин или другие производные нефти. Кремы, содержащие выбранный активный агент, обычно представляют собой вязкие жидкие или полутвердые эмульсии, часто либо типа масло в воде, либо типа вода в масле. Основы кремов обычно смываются водой и содержат масляную фазу, эмульгатор и водную фазу. Масляная фаза, иногда называемая также "внутренней" фазой, в основном состоит из вазелина и жирного спирта, такого как цетиловый или стеариловый спирт; водная фаза обыкновенно, хотя не обязательно, превышает масляную фазу по объему и обычно содержит влагоудерживающее вещество. Эмульгатор в составе крема в основном представлен неионным, анионным, катионным или амфотерным поверхностно-активным веществом. Как это будет понятно компетентным специалистам в данной области, следует использовать специальную основу мази или крема,которая будет обеспечивать оптимальную доставку лекарственного вещества. Как и другие носители или средства переноса, основа мази должна быть инертной, стабильной, нераздражающей и несенсибилизирующей. В отличие от типичных пептидных препаратов, пептиды, соответствующие данному изобретению,содержащие D-формы аминокислот, можно вводить даже перорально без защиты от протеолиза желудочной кислотой и т.п. Тем не менее, в ряде вариантов осуществления доставка пептида может быть повышена за счет применения защитных наполнителей. Обычно это осуществляют либо путем комплексирования полипептида с композицией, чтобы сделать его устойчивым к кислотному и ферментативному гидролизу, либо путем упаковки полипептида в соответствующий устойчивый носитель, такой как липосома. Средства защиты полипептидов для пероральной доставки хорошо известны в уровне техники (см.,например, патент США 5391377, в котором описаны липидные композиции для пероральной доставки терапевтических агентов). Повышенная продолжительность полужизни в сыворотке может быть достигнута за счет использования систем "упаковки" белков с задержанным выходом. Данные системы с задержанным выходом хорошо известны компетентным специалистам в данной области. В одном предпочтительном варианте осуществления представлена система доставки для белков и пептидов на основе биодеградируемых микросфер ProLease (см. статьи Tracy, Biotechnol. Prog., т. 14, стр. 108, (1998); Johnson и соавт., Nature Med.,т. 2, стр. 795, (1996); Herbert и соавт., Pharmaceut. Res., т. 15, стр. 357, (1998 в виде сухого порошка, состоящего из биодеградируемых полимерных микросфер, содержащих белок в полимерной основе. Система может быть составлена из сухого препарата, содержащего или не содержащего другие агенты. Способ получения микросфер ProLease специально разработан для достижения высокой эффективности инкапсуляции белка при поддержании целостности белка. Способ состоит из (i) приготовления лиофилизированных белковых частиц из общего объема белка путем распылительной сушки с вымораживанием раствора лекарственного вещества без стабилизирующих наполнителей, (ii) приготовления суспензии лекарственного вещества и полимера с последующей обработкой ультразвуком или гомогенизацией, с целью уменьшения размера частиц лекарственного вещества, (iii) получения замороженных микросфер из лекарственного вещества и полимера путем разбрызгивания в жидком азоте, (iv) экстракции растворителя полимера этанолом и (v) фильтрации и вакуумной сушки, с целью получения конечного продукта в виде сухого порошка. Полученный в результате порошок содержит белок в твердой форме,который гомогенно и жестко диспергирован в пористых полимерных частицах. Полимер, который наиболее часто используют в данном процессе, поли(лактид-согликолид) (PLG), является как биосовместимым, так и биодеградируемым. Инкапсуляция может достигаться при низких температурах (например, при -40 С). При инкапсуляции белок поддерживают в твердом состоянии в отсутствие воды, минимизируя таким образом индуцируемую водой конформационную мобильность белка, препятствуя реакциям деградации белка, которые включают в себя воду в качестве реагента, и позволяя избежать образования границ разделов органических веществ и воды, на которых может происходить денатурация белков. В предпочтительном процессе используют растворители, в которых не растворимо большинство белков, что приводит таким образом к высокой эффективности инкапсуляции (например, больше чем 95%). В другом варианте осуществления по крайней мере один компонент раствора может быть представлен в виде "концентрата", например, в контейнере для хранения (например, в заранее отмеренном объеме) в готовом для разведения виде или в растворимой капсуле, готовой для введения в объем воды. Вышеописанные препараты и способы применения предназначены для иллюстрации, а не ограничения. Следует понимать, что при использовании представленного в данном контексте описания можно легко изобрести другие подходящие препараты и способы применения.VII. Препараты на основе липидов. В ряде вариантов осуществления пептиды, соответствующие данному изобретению, вводят в сочетании с одним или более липидов. Липиды могут быть приготовлены как наполнитель для защиты и/или усиления транспорта/поглощения пептидов или их можно вводить отдельно.- 24006488 Вне связи с определенной теорией в данном изобретении было обнаружено, что введение (например, пероральное введение) некоторых фосфолипидов может значительно повысить соотношенияHDL/LDL. Кроме того, полагают, что транспорт некоторых фосфолипидов средней длины осуществляется процессом, отличным от процесса, участвующего в основном транспорте липидов. Так, совместное введение некоторых фосфолипидов средней длины с пептидами, соответствующими данному изобретению, несет ряд преимуществ: они защищают фосфолипиды от разложения или гидролиза, они улучшают всасывание пептидов и они улучшают соотношения HDL/LDL. Липиды могут быть сформированы в виде липосом, которые инкапсулируют полипептиды, соответствующие данному изобретению, и/или они могут быть просто комплексированы/смешаны с полипептидами. Способы получения липосом и инкапсуляции реагентов хорошо известны компетентным специалистам в данной области (см., например, статьи Martin и Papahadjopoulos, J. Biol. Chem., 257:286288, (1982); Papahadjopoulos и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:11460-11464, (1991); Huang и соавт.,Cancer Res., 52:6774-6781, (1992); Lasic и соавт., FEBS Lett., 312:255-258, (1992) и т.п.). Предпочтительные для применения в данных способах фосфолипиды содержат жирные кислоты длиной от приблизительно 4 атомов углерода до приблизительно 24 атомов углерода в положениях sn-1 и sn-2. В ряде предпочтительных вариантов осуществления жирные кислоты являются насыщенными. В других предпочтительных вариантах осуществления жирные кислоты могут быть ненасыщенными. Различные предпочтительные жирные кислоты представлены в табл. 2. Таблица 2 Предпочтительные жирные кислоты в положении sn-1 и/или sn-2 предпочтительных фосфолипидов для введения D-полипептидовIUPAC - Международный союз по теоретической и прикладной химии Жирные кислоты в данных положениях могут быть одинаковыми или различными. Особенно предпочтительные фосфолипиды содержат фосфорилхолин в положении sn-3.VIII. Дополнительные фармакологически активные агенты. Дополнительные фармакологически активные агенты могут доставляться вместе с основными активными агентами, например, пептидами, соответствующими данному изобретению. В одном варианте осуществления данные агенты включают в себя, без ограничения перечисленным, агенты, которые снижают риск атеросклеротических событий и/или их осложнения. Данные агенты включают в себя, без ограничения перечисленным, -блокаторы, комбинации -блокаторов и тиазидных диуретиков, статины,аспирин, ингибиторы АПФ (ангиотензин-превращающего фермента), ингибиторы рецепторов АПФ(ARB) и т.п. Подходящие -блокаторы включают в себя, без ограничения перечисленным, кардиоселективные препараты (селективные 1-блокаторы), например, ацебутолол (Сектрал), атенолол (Тенормин), бетаксолол (Керлон), бисопролол (Цебета), метопролол (Лопрессор) и т.п. Подходящие неселективные блокаторы (блокируют в равной степени 1 и 2) включают в себя, без ограничения перечисленным,- 25006488 картеолол (Картрол), надолол (Коргард), пенбутолол (Леватол), пиндолол (Вискен), пропранолол (Индерал), тимолол (Блокадрен), лабеталол (Нормодин, Трандат) и т.п. Подходящие комбинации -блокаторов с тиазидными диуретиками включают в себя, без ограничения перечисленным, Лопрессор НСТ, ZIAC, Теноретик, Корзид, Тимолид, Индерал LA 40/25, Индерид,Нормозид и т.п. Подходящие статины включают в себя, без ограничения перечисленным, правастатин(Правахол/Bristol-Myers Squibb), симвастатин (Зокор/Merck), ловастатин (Мевакор/Merck), и т.п. Подходящие ингибиторы АПФ включают в себя, без ограничения перечисленным, каптоприл (например, Капотен, производимый Squibb), беназеприл (например, Лотензин, производимый Novartis),эналаприл (например, Вазотек, производимый Merck), фосиноприл (например, Моноприл, производимый Bristol-Myers), лизиноприл (например, Принивил, производимый Merck или Цестрил, производимый Astra-Zeneca), хинаприл (например, Аккуприл, производимый Parke-Davis), рамиприл (например, Альтаце, производимый Hoechst Marion Roussel, King Pharmaceuticals), имидаприл, периндоприл, эрбумин (например, Ацеон, производимый Rhone-Polenc Rorer), трандолаприл (например, Мавик, производимый Knoll Pharmaceuticals) и т.п. Подходящие АРВ(блокаторы рецептора АПФ) включают в себя, без ограничения перечисленным, лосартан (например, Козаар, производимый Merck), ирбесартан (например, Авапро, производимый Sanofi), кандесартан (например, Атаканд, производимый Astra Merck), валсартан (например, Диован, производимый Novartis) и т.п.IX. Наборы для облегчения по крайней мере одного симптома атеросклероза. В другом варианте осуществления данного изобретения представлены наборы для облегчения по крайней мере одного симптома атеросклероза или для профилактического лечения субъекта (человека или животного) с риском развития атеросклероза. Наборы предпочтительно включают в себя контейнер,содержащий по крайней мере один пептид или миметик пептидов, соответствующих данному изобретению. Пептид или миметик пептида может быть представлен в унифицированном лекарственном препарате (например, суппозитории, таблетке, капсуле, пластыре и т.п.) и/или необязательно может быть в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых наполнителей. Набор, кроме того, может необязательно содержать по крайней мере один другой агент, используемый при лечении сердечных заболеваний и/или атеросклероза. Данные агенты включают в себя, без ограничения перечисленным, -блокаторы, вазодилататоры, аспирин, статины, ингибиторы АПФ или ингибиторы рецепторов АПФ (ARB) и т.п., например, как описано выше. Кроме того, наборы необязательно включают в себя маркировку и/или инструкционные материалы,в которых представлены указания (т.е. протоколы) по реализации способов или применению терапевтических или профилактических препаратов, соответствующих данному изобретению. В предпочтительных инструкционных материалах описано применение по крайней мере одного полипептида, соответствующего данному изобретению, с целью смягчения по крайней мере одного симптома атеросклероза и/или для предупреждения появления или усиления по крайней мере одного такого симптома у субъекта с риском развития атеросклероза. В инструкционных материалах также могут быть необязательно описаны предпочтительные дозировки/схемы лечения, показания счетчика и т.п. Хотя инструкционные материалы, как правило, содержат письменные или печатные материалы, они не ограничены этим. Данным изобретением предусматриватся любая среда, способная хранить данные инструкции и передавать их конечному пользователю. Данные среды включают в себя, без ограничения перечисленным, электронные среды для хранения информации (например, магнитные диски, магнитофонную ленту, картриджи, чипы), оптические среды (например, CD ROM) и т.п. Данные среды могут включать адреса сайтов в Интернете, которые представляют такие инструкционные материалы. Примеры Следующие примеры представляют для иллюстрации, но не для ограничения заявленного объема изобретения. Пример 1. Показано, что несколько синтетических аналогов пептидов класса А имитируют многие свойства человеческого аро A-I in vitro. В данном примере новый пептид (5F) с повышенной амфипатией вводят путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 20 мкг/сутки в течение 16 недель мышам C57BL/6J, которые получают атерогенный корм. Другим мышам делают инъекции мышиного аро A-l (MoAl) (50 мкг/сутки) или забуференного фосфатом солевого раствора (PBS) в качестве контроля. Уровни общего холестерина в плазме и профили липопротеинов различаются незначительно между леченой группой и контрольными группами за исключением того, что у мышей, получающих 5F или MoAI, наблюдают пониженный уровень липопротеина высокой плотности (HDL)-холестерина при вычислении процента общего холестерина. Не наблюдают никакой токсичности или образования антител против инъецированных материалов.LDL, взятый у животных, которым делают инъекции 5F, и внесенный в человеческие клетки артериальной стенки in vitro, приводит к образованию меньшего количества гидропероксидов липидов и более низкой индуцированной LDL хемотактической активности, чем LDL, взятый от контролей. Кроме того,HDL, взятый у мышей, которым делают инъекции 5F, и внесенный в человеческие клетки артериальной- 26006488 стенки in vitro вместе с человеческим LDL, приводит к значительному снижению образования гидропероксидов липидов и значительному уменьшению индуцированной LDL хемотактической активности моноцитов. У мышей, получающих пептид 5F, отмечают значительное уменьшение площади атеросклеротического повреждения по сравнению с мышами, получающими PBS. Площадь повреждения у мышей,получающих MoAI, аналогична площади повреждения у мышей, которым делают инъекцию PBS. Делают заключение о том, что 5F может обладать активностью в плане профилактики и лечения атеросклероза. Материалы и способы. Пептиды. Пептид 5F (Ас-18 А [Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu Phe Phe]-NH2) синтезируют способом твердофазного синтеза пептидов (см., например, статьи Anantharamaiah и Garber,Meth. Enzymol., 263: 267-282, (1996); Palgunachari и соавт., Arteriosclerosis, ThrombosisVascularBiology, 16:328-338, (1996. Степень чистоты синтетического пептида определяют с помощью аналитической ВЭЖХ и электроспрей масс-спектометрии. Пептид диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют перед использованием.MoAI выделяют из плазмы мышей C57BL/6J (плазму в EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) приобретают в Harlan Bioproducts for Science, Indianapolis, IN). MoAI выделяют, используя комбинацию гель-фильтрации и колоночной хроматографии с обращенной фазой. Вкратце, удельную массу плазмы подводят до 1,21 г/мл добавлением KВr и центрифугируют при 50000 об./мин в течение 24 ч при 4 С (ротор Ti70, Beckman, Fullerton, CA). Верхнюю фракцию собирают, диализуют против воды для удаления KВr, лиофилизируют и делипидируют. Осадок растворяют в растворе Gn:DTT:Трис (3 М гуанидинHCl, 1 мМ дитиотреитол и 10 мМ Трис; рН=8,0), затем диализуют против того же раствора, используя диализные трубки, отсекающие вещества молекулярной массы 12000, с целью удаления из образца большей части аро А-II и аполипопротеинов С. Затем образец диализуют против воды и лиофилизируют. Осадок растворяют в свежем растворе Gn:DTT:Tris и выделяют белки с помощью гель-фильтрации и колоночной хроматографии, используя колонку ХK26/100 (2,6 X 100 см), заполненную насыпной фазойSuperose 12 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), уравновешенную раствором Gn:DTT:Трис. Скорость потока составляет 0,5 мл/мин, собирают фракции по 2,5 мл. Фракции, соответствующие пику аро A-I, анализируют с использованием SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) и затем очищают препаративной ВЭЖХ с С-18 обращенной фазой (см. статьюAnantharamaiah и Garber, Meth. Enzymol., 263:267-282, (1996. Мыши. Все эксперименты проводят с использованием самок мышей C57BL/6J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Мышей приобретают в возрасте шести недель, и исследования с различными диетами начинают проводить с мышами в возрасте восьми недель. В исследованиях метаболизма используют мышей с массой тела 20-22 г. Все исследования на животных заранее рецензируют и утверждают в Институционном Комитете по защите и использованию животных Алабамского университета в Бирмингеме. Исследования кинетики. Пептид 5F, MoAI и человеческий аро А-I метят 125I способом, предложенным Bilheimer и coaвт.,Biochim. Biophys. Acta, 260:212-221, (1972). Мыши получают модифицированный атерогенный кормThomas-Hartroft (TD88051; Teklad, Madison, WI) в течение четырех недель, в течение которых им начинают делать внутрибрюшинные инъекции пептида или белка, растворенного в 200 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS). Животным инъекционно вводят MoAI или человеческий аро А-I в дозе 50 мкг/животное; животные, которым инъецируют 5F, получают дозу 20 мкг. Для кинетических исследований животных не иммобилизуют, образцы крови берут из ретроорбитального синуса при анестезии ксилазином:кетамином на 15, 30 и 45 мин и 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 12 и 24 ч после инъекции. От каждого животного получают три образца крови в различные точки времени (все из ретроорбитального синуса при чередовании глаз) и в каждой точке времени отбирают по меньшей мере три образца (у разных животных). Образцы отбирают в гепаринизированные капиллярные трубки, затем помещают в пробирки для микроцентрифуги, плазму отделяют центрифугированием. Повторные аликвоты по 10 мкл каждого образца берут для определения радиоактивности с использованием счетчика -излучения (Cobra; PackardInstruments, Downers Grove, DL) в течение 10 мин/образец. Общий объем плазмы рассчитывают как 4,2% от массы тела. Каждый образец выражают как процент инъецированного СРМ в общем объеме плазмы. Свободный 125I определяют осаждением трихлоруксусной кислотой (ТСА) (1 мл 10% ТСА/10 мкл образца плазмы). Подбор кривой в соответствии с кинетической моделью проводят при использовании всех точек данных, а не средних значений по каждой временной точке (см. программу PKAnalyst, MicroMathScientific Software, Salt Lake City, UT). Протокол инъекций и сбор образцов для исследования повреждений. Мышей приобретают в возрасте шести недель и рандомизированным образом распределяют в группы по 20 животных, за исключением группы отрицательного контроля из 10 животных, которая не получает лечения и которой дают стандартный смешанный корм для грызунов. В возрасте восьми недель группы, предназначенные для лечения, переводят на модифицированный атерогенный корм Thomas- 27006488Hartroft (TD88051; Teklad, Madison, WI) и начинают инъекции. Корм хранят при 4 С и используют не больше трех месяцев после изготовления, чтобы снизить до минимума окисление липидов. Животным делают внутрибрюшинные инъекции ежедневно в течение 16 недель, включая выходные дни и праздники. Двадцати мышам в каждой группе ежедневно инъекционно вводят 200 мкл PBS (в качестве положительных контролей) или 20 мкг 5F в 200 мкл PBS или 50 мкг MoAI в 200 мкл PBS. Лиофилизированный пептид 5F готовят во флаконах, при этом каждый флакон содержит пептид в количестве, достаточном для инъекции на один день. Пептид 5F лиофилизируют в PBS и растворяют в автоклавированной воде Milli-Q (Millipore Corp., Bedford, MA) в день инъекции. Объем инъекции для всех групп поддерживают на уровне 200 мкл/мышь/сутки. Образцы крови берут под анестезией при кровотечении из ретроорбитального синуса при начале исследований (перед введением корма) и во время забора органов. В конце исследования (16 неделя) при последнем кровотечении вырезают сердце и печень. Сердца хранят в 0,9% солевом растворе в течение 1 ч для удаления крови и обеспечения релаксации сердечной мышцы. Затем их фиксируют в забуференном фосфатом 4% формальдегиде в течение по меньшей мере одной недели до получения срезов. Печени удаляют и взвешивают. Гистологическое определение. Гистологические определения проводят в соответствии со способом, предложенным Paigen и соавт.(см. статью Paigen и соавт., Arteriosclerosis, 10: 316-323, (1990 с некоторыми модификациями. Вкратце,сердца фиксируют в течение по меньшей мере одной недели в растворе формальдегида, забуференного фосфатом. После удаления нижних 2/3 сердец оставшуюся ткань замораживают в среде ОСТ (Tissue-Tek,Miles Inc., Elkhart, IN) и делают срезы в криостате при -20 С. Последовательность срезов толщиной 20 мкм хранят на предметных стеклах и наблюдают начало корня аорты. Затем отбирают срезы дополнительных 600 мкм или до округления поперечного среза аорты и до того уровня, пока не исчезнут створки клапанов. Препараты на стеклах окрашивают масляным красным О и контрастно окрашивают гематоксилином. Окрашенные площади поперечных срезов поражений измеряют на последовательных препаратах на предметных стеклах, отдаленных друг от друга на 80 мкм путем анализа изображения (SigmaScanPro, SPSS Scientific, Chicago, IL) и определяют среднюю площадь поражения для каждого синуса аорты на длине 400 мкм (пять препаратов), получая максимальную среднюю площадь поражения. Кокультуры. Выделение моноцитов. Выделение липопротеинов. Определение гидропероксидов липидов и хемотактической активности моноцитов Кокультуры человеческих клеток артериальной стенки, выделение моноцитов, выделение липопротеинов ультрацентрифугированием из плазмы здоровых людей-доноров или с помощью FPLC из мышиной плазмы и определение гидропероксидов липидов и хемотактической активности моноцитов проводят согласно стандартным способам. Участие всех людей проходите их информированного согласия,утвержденного Комитетом защиты человека Калифорнийского Университета в Лос-Анжелесе (UCLA)(UCLA Human Subjects Protection Committee). Протокол тестирования мышиных липопротеинов в кокультуре осуществляют следующим образом. Вкратце, LDL и HDL выделяют с помощью FPLC из мышиной плазмы, выделенной у мышей, получающих атерогенный корм и инъекции носителя (PBS) или пептида 5F в дозе 20 мкг/мышь/день. Кокультуры обрабатывают человеческим LDL в концентрации 200 мкг/ил белка LDL или мышиным LDL в концентрации 200 мкг/мл, или человеческим LDL в концентрации 200 мкг/мл + человеческим HDL в концентрации 350 мкг/мл белка HDL, или мышиным HDL в концентрации 300 мкг/мл, или мышиным HDL в виде монокомпонента в концентрации 300 мкг/мл. Кокультуры инкубируют с вышеуказанными добавками или без добавок в течение 8 ч при 37 С в присутствии 10% сыворотки, дефицитной по липопротеину (LPDS). Супернатанты собирают и анализируют на эквиваленты гидропероксидов липидов по Auerbach. Затем кокультуры промывают и инкубируют в свежей среде для культивирования без сыворотки или LPDS в течение дополнительных 8 ч. Кондиционированную среду собирают и анализируют на хемотактическую активность моноцитов. Химические и аналитические способы - профили липропротеинов холестерина, полученные на колонках (CLiP)Профили липопротеинов холестерина плазмы измеряют, используя недавно разработанный способCLIP (см. статью Garber и соавт., J. Lipid Res., 41:1020-1026, (2000. Вкратце, анализируют 5-10 мкл плазмы, используя одну колонку Superose 6 (Pharmacia, Piscataway NJ). Сразу после колонки реагент на холестерин вводят в Т-образную емкость для смешивания, и смесь элюента и реагента входит в реакционный змеевик, расположенный после колонки. Содержание холестерина в смеси элюента определяют спектрофотометрически при длине волны 500 нм и данные для построения точек вводят в компьютер. Полученные в результате профили разделяют по пикам компонентов и анализируют по относительной площади, используя программу PeakFit (SPSS Science, Chicago, IL); абсолютные величины холестерина для общего содержания холестерина и пика каждого компонента определяют путем сравнения с контрольным образцом с известными величинами. В ряде случаев фракции собирают, чтобы определить распределение радиоактивности. Способ CLiP позволяет анализировать образцы, полученные от отдельных мышей, избегая использования объединенных образцов.[148] Для определения, вызывают ли ежедневные инъекции пептидов иммунный ответ у мышей,проводят непрямое титрование способом ELISA (см. статью Engvall, Meth. Enzymol., 70:419-439, (1980 плазмы, взятой у мышей во время забора органов (после шестнадцати недель ежедневных инъекций). Платы покрывают инъецируемыми пептидами или MoAI (10 мкг/мл). Платы инкубируют в течение ночи. После тщательного промывания забуференным боратом солевым раствором (рН 8,2), содержащим 0,05%Tween 20, и блокирования буфером (0,1% желатина и 0,1% BSA в боратном буфере) в течение 1 ч, образцы по 200 мкл разведенной мышиной плазмы (разведение 1:100) серийно разводят 1:1 забуференным боратом солевым раствором. Затем биотинилированное козье антитело против мышиного IgG (0,1 мкг/мл) вносят в лунки и обрабатывают платы SA-HRP (комплексом стептавидина и пероксидазой корня хрена) в течение часа и проявляют с помощью ABTS пероксидазы в качестве субстрата. Платы инкубируют в течение ночи при комнатной температуре после каждого добавления антигена/антитела и тщательно промывают забуференным боратом солевым раствором (рН 8,2), содержащим 0,05% Tween 20, и блокируют буфером (0,1% желатин и 0,1% BSA в боратном буфере) в течение 1 ч перед добавлением следующего компонента. Статистические методы Группы лечения сравнивают с помощью двустороннего критерия Стьюдента или одностороннего анализа дисперсии (при нормальном распределении данных) или с помощью одностороннего анализа дисперсии в классах (SigmaStat; SPSS Science, Chicago, IL). Кинетику метаболизма пептида или белка анализируют путем подбора однокамерной кинетической модели первого порядка, допускающей неравные скорости входа и выхода (PKAnalyst; MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT). Результаты Кинетические исследования. Кинетика клиренса пептида 5F человеческого и мышиного аро А-I из мышиной плазмы после внутрибрюшинной инъекции суммирована в табл. 3. Таблица 3 Краткие итоги кинетических экспериментов на основании обработанных данных Приведенные данные представляют результаты, полученные при обработке данных в соответствии с однокамерной кинетической моделью первого порядка, допускающей неравные скорости входа и выхода (PKAnalyst; MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, UT). Сокращения: T 1/2 - половина периода клиренса из плазмы; Макс. % в плазме - процент инъецированной дозы, обнаруженный в общей плазме на уровне пиков; r2 - соответствие статистических данных кинетической модели. Клиренс человеческого и мышиного аро А-I сильно пролонгирован по сравнению с пептидом 5F. Человеческий аро А-I и 5F имеют более длительное время выхода на пик в плазме, чем мышиный аро АI, хотя уровни достигнутых пиков в основном близки (пик человеческого аро А-I достигает более высоких уровней, чем другие материалы). Анализ образцов плазмы с помощью колоночной хроматографии демонстрирует, что пептид 5F и аро A-I (как человеческие, так и мышиные) связываются с липопротеинами плазмы, особенно с частицами в области величины HDL (фиг. 6). Соотношение HDL:VLDL по радиоактивности пептидов через 1,5 ч после инъекции 5F составляет 4,190,58 (n = 3, р 0,05). Аналогичные результаты обнаруживают через 5 ч после инъекции 5F (6,441,10, р 0,02). Инъецированный пептид сначала содержит меньше 3% свободного 125I по данным осаждения ТСА. Однако через 1,5 ч после инъекции радиоактивность свободного 125I в плазме, выраженная как процент от общей элюированной радиоактивности, значительно повышается для 5F, составляя 26,99,4%, и к 5 ч составляет 34,44,8%, отражая ожидаемый клиренс липопротеинов и связанных с липопротеинами пептидов. Скорость увеличения радиоактивности, обусловленной свободным иодом, от 1,5 до 5 ч меньше, чем при инъекции, что,возможно, предполагает значительную исходную деградацию пептида в брюшной полости.- 29006488 Выживаемость и общая морфология при смешанном или атерогенном корме В ходе длительных диетических исследований только три мыши погибают по невыясненным причинам. Два животных получают MoAI и одно получает пептид 5F. Во время забора органов между группами не отмечают никаких различий в общей морфологии. У всех животных, получающих атерогенный корм, печени увеличены, но ни массы печеней, ни масса печени в процентах от массы тела не отличаются между группами (табл. 4). Все животные, получающие атерогенный корм (включая животных, которым делают инъекцию PBS), имеют более низкую массу тела, чем контрольные животные, получающие смешанный корм (см. табл. 4). Таблица 4 Массы тела и печени после лечения Приведенные данные представляют среднее значениеSEM масс, полученных во время забора органов (через 16 недель лечения). Животные, находящиеся на смешанном корме, не получают инъекции. Других мышей держат на атерогенном корме, как описано в разделе Способы. Группа PBS получает ежедневные внутрибрюшинные инъекции 200 мкл забуференного фосфатом солевого раствора. Группа 5F получает ежедневные внутрибрюшинные инъекции 20 мкг 5F в 200 мкл PBSP и группа MoAI ежедневно получает 50 мкг MoAI в 200 мкл PBS.р 0,05 в отношении 5F; двусторонний t-тест. Антигенность. Образцы крови, взятые в заключение 16-недельного периода инъекций, тестируют на присутствие антител против пептидов. Антитела против пептида 5F или против MoAI не обнаружены (данные не приводят). Перекрестные эксперименты, в которых платы для проведения ELISA покрывают пептидом или белком, которые не инъецируют серии животных, приводят к результатам, в основном идентичным результатам, полученным при прямом определении присутствия антител (данные не приводят). Характеризация липопротеина и аполипопротеина. Значения общего холестерина и липопротеинов холестерина, определенные способом CliP, представлены в табл. 3. Точность значения общего холестерина подтверждают путем анализа холестерина вручную (Cholesterol 1000; Sigma, St. Louis, МО) (данные не приводят). Между группами лечения не наблюдают значительной разницы в уровнях общего холестерина и липопротеиновых фракций холестерина. Однако когда липопротеиновые фракции выражают как процент от общего холестерина (см. табл. 5),HDL-холестерин составляет значительно более низкий процент в группах 5F и MoAI по сравнению с группой PBS.

МПК / Метки

МПК: A61K 38/03, C07K 4/00, A61P 9/10

Метки: композиция, предупреждения, интенсивности, осложнения, симптома, способ, млекопитающего, облегчения, атеросклероза, уменьшения, коронарного, набор, пептид, перорального, варианты, введения

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-6488-peptid-kompoziciya-dlya-peroralnogo-vvedeniya-nabor-varianty-sposob-umensheniya-intensivnosti-simptoma-ateroskleroza-varianty-i-sposob-oblegcheniya-ili-preduprezhdeniya-koronarnogo.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Пептид, композиция для перорального введения, набор (варианты), способ уменьшения интенсивности симптома атеросклероза (варианты) и способ облегчения или предупреждения коронарного осложнения у млекопитающего (варианты)</a>

Похожие патенты