Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

2. Способ по п.1, где стадию (b) и стадию (c) последовательно повторяют.

3. Способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (b);

(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (c), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от использованного на стадии (a) праймера, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (a), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (e), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (e).

4. Способ по любому из пп.1-3, где соответствующие стадии осуществляют в изотермических условиях.

5. Способ по любому из пп.1-4, где используют такую ДНК-полимеразу, которая обладает активностью по вытеснению цепи.

6. Способ по любому из пп.1-5, где ДНК-полимеразу выбирают из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I Escherichia coli, ДНК-полимеразу Bst, лишённую 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus stearothermophilus и ДНК-полимеразу Bca, лишённую 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus caldotenax.

7. Способ по любому из пп.1-6, где эндонуклеаза является эндорибонуклеазой.

8. Способ по п.7, где эндорибонуклеазой является РНКаза-H.

9. Способ полюбому из пп.1-8, где химерный олигонуклеотидный праймер включает два или большее число расположенных подряд рибонуклеотидных остатков.

10. Способ по любому из пп.1-9, где химерный олигонуклеотидный праймер включает один или большее число модифицированных рибонуклеотидов.

11. Способ по п.10, где химерный олигонуклеотидный праймер включает (a-S)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с атомом фосфора по a-положению рибонуклеотида, заменён на атом серы.

12. Способ по любому из пп.1-11, который осуществляют в буфере, содержащем буферный компонент, выбранный из группы, включающей трицин, фосфат и Трис.

13. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, причём праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и

(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

14. Способ по п.13, где реакционную смесь инкубируют в изотермических условиях.

15. Способ по п.13 или 14, где реакционная смесь дополнительно содержит химерный олигонуклеотидный праймер, характеризующийся последовательностью, которая, по существу, гомологична нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей.

16. Способ по любому из пп.13-15, где ДНК-полимеразу выбирают из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I Escherichia coli, ДНК-полимеразу Bst, лишённую 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus stearothermophilus и ДНК-полимеразу Bca, лишённую 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus caldotenax.

17. Способ по любому из пп.13-16, где эндонуклеаза является эндорибонуклеазой.

18. Способ по п.17, где эндорибонуклеазой является РНКаза-H.

19. Способ по любому из пп.13-18, где химерный олигонуклеотидный праймер включает два или большее число расположенных подряд рибонуклеотидных остатков.

20. Способ по любому из пп.13-19, где химерный олигонуклеотидный праймер включает один или большее число модифицированных рибонуклеотидов.

21. Способ по п.20, где химерный олигонуклеотидный праймер включает (a-S)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с атомом фосфора по a-положению рибонуклеотида, заменён на атом серы.

22. Способ по любому из пп.13-21, который осуществляют в буфере, содержащем буферный компонент, выбранный из группы, включающей трицин, фосфат и Трис.

23. Способ по любому из пп.1-22, где нуклеиновая кислота, служащая матрицей, является одноцепочечной ДНК или двухцепочечной ДНК.

24. Способ по п.23, который осуществляют после конверсии двухцепочечной ДНК, служащей матрицей, в одноцепочечные ДНК.

25. Способ по п.23 или 24, где нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, является кДНК, полученная эр материале РНК в реакции обратной транскрипции.

26. Способ по п.25, который осуществляют после синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы.

27. Способ по п.26, где праймер, выбранный из группы, которая включает олиго-дТ-праймер, случайный праймер и специфичный праймер, используют в качестве праймера в реакции обратной транскрипции.

28. Способ по п.26 или 27, где химерный олигонуклеотидный праймер используют в качестве праймера в реакции обратной транскрипции.

29. Способ по любому из пп.26-28, где ДНК-полимеразу, обладающую обратнотранскриптазной активностью, используют в качестве обратной транскриптазы.

30. Способ по любому из пп.26-29, где реакцию обратной транскрипции и синтез достроенной цепи, которая комплементарна матрице, осуществляют с использованием такой ДНК-полимеразы, которая обладает активностью обратной транскриптазы и активностью по вытеснению цепи.

31. Способ по п.28, где ДНК-полимеразой является ДНК-полимераза Bst, лишённая 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus stearothermophilus или ДНК-полимераза Bca, лишённая 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus caldotenax.

32. Способ по любому из пп.25-31, где РНК, служащая матрицей в реакции обратной транскрипции, является РНК, амплифицированной в реакции амплификации нуклеиновых кислот.

33. Способ по п.32, который осуществляют после синтеза амплифицированного РНК-фрагмента с помощью реакции амплификации нуклеиновых кислот, используя РНК в качестве матрицы.

34. Способ по п.32 или 33, где реакцию амплификации нуклениновых кислот выбирают из группы, которая включает метод с транскрипционной амплификационной системой (TAS), метод самоподдерживающейся репликации последовательности (3SR), специфичный по конкретной последовательности метод амплификации (NASBA), метод амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), и метод с репликазой Qb.

35. Способ по п.23 или 24, где нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, является ДНК, полученная в реакции амплификации нуклеиновых кислот.

36. Способ по п.35, который осуществляют после синтеза амплифицированного ДНК-фрагмента в реакции амплификации нуклеиновых кислот с использованием ДНК в качестве матрицы.

37. Способ по п.36, где реакцию амплификации нуклеиновых кислот выбирают из группы, которая включает метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), метод лигазной цепной реакции (ЛЦР) и метод амплификации с вытеснением цепи (SDA).

38. Способ по любому из пп.32-37, где случайный праймер или вырожденный праймер используют в реакции амплификации нуклеиновых кислот.

39. Способ по п.38, где случайный праймер или вырожденный праймер является праймером, характеризующимся случайной последовательностью или вырожденной последовательностью по крайней мере с 3'-конца или со стороны 3'-конца.

40. Набор, используемый в способе амплификации нуклеотидной последовательности по любому из пп.1-39, который находится в упакованной форме и содержит инструкции, которые объясняют использование ДНК-полимеразы и эндонуклеазы в реакции вытеснения цепи.

41. Набор по п.40, который содержит ДНК-полимеразу и/или эндонуклеазу.

42. Набор по п.41, который упакован и содержит:

(a) ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи;

(b) эндонуклеазу; и

(c) буфер для реакции вытеснения цепи.

43. Набор, используемый в способе амплификации нуклеотидной последовательности по любому из пп.1-39, который содержит ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи и/или эндонуклеазу.

44. Набор по любому из пп.41-43, который содержит ДНК-полимеразу, выбранную из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I Escherichia coli, ДНК-полимеразу Bst, лишённую 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus stearothermophilus и ДНК-полимеразу Bca, лишённую 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus caldotenax.

45. Набор по любому из пп.41-43, который содержит РНКазу-H в качестве эндонуклеазы.

46. Способ выявления нуклеиновой кислоты-мишени в образце, отличающийся тем, что способ включает

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по любому из пп.1-39; и

(b) выявление нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на стадии (a).

47. Способ по п.46, где амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень выявляют с использованием рибонуклеотидного (РНК) зонда, помеченного двумя или большим числом флуоресцентных веществ, расположенных на таком расстоянии, которое обеспечивает тушение сигнала.

48. Набор, используемый для способа выявления нуклеиновой кислоты-мишени по п.46 или 47, который находится в упакованной форме и содержит инструкции, которые объясняют использование ДНК-полимеразы и эндонуклеазы в реакции вытеснения цепи.

49. Набор по п.48, который содержит ДНК-полимеразу и/или эндонуклеазу.

50. Набор по п.48, который упакован и содержит

(a) ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи;

(b) эндонуклеазу и

(c) буфер для реакции вытеснения цепи.

51. Набор по любому из пп.48-50, который содержит ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи и/или эндонуклеазу.

52. Набор по любому из пп.49-51, который содержит ДНК-полимеразу, выбранную из группы, которая включает фрагмент Клёнова ДНК-полимеразы I Escherichia coli, ДНК-полимеразу Bst, лишённую 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus stearothermophilus и ДНК-полимеразу Bca, лишённую 5'® 3'-экзонуклеазной активности, от Bacillus caldotenax.

53. Набор по любому из пп.49-51, который содержит РНКазу-H в качестве эндонуклеазы.

54. Способ получения продукта, имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором нуклеиновая кислота размещена в заданном участке, отличающийся тем, что способ включает

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты, которая должна быть иммобилизована, с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по любому из пп.1-39 и

(b) размещение и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной на стадии (a), в заданном участке субстрата.

55. Способ по п.54, где одноцепочечную нуклеиновую кислоту, которая, по существу, свободна от комплементарной ей цепи, амплифицируют, размещают и иммобилизуют в заданном участке субстрата.

56. Способ выявления нуклеиновой кислоты-мишени в образце, отличающийся тем, что способ включает

(a) приготовление образца нуклеиновых кислот, в котором предполагается наличие нуклеиновой кислоты-мишени;

(b) контактирование образца нуклеиновых кислот с продуктом, имеющим иммобилизованную нуклеиновую кислоту, которая размещена в заданном участке и который получен способом по любому из пп.54-55; и

(c) выявление нуклеиновой кислоты-мишени в образце нуклеиновых кислот, которая гибридизует с нуклеиновой кислотой на продукте.

57. Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, отличающийся тем, что способ включает

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечэющ нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с обеспечением вытеснения цепи.

58. Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (b);

(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (c), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (a), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (a), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (e), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (e).

59. Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, отличающийся тем, что способ включает

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную с праймера цепь, причём праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и

(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

60. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (a), по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (b), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(d) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (c), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

61. Способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (a), по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (b), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(d) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (c), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (c);

(e) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (d), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (b), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (b), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;

(f) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (e), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(g) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (f), отщепляют с целью вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (f).

62. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает

(a) амплификацию нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;

(b) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (a), дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид помещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и

(c) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

63. Способ по любому из пп.60-62, где реакцию амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, выбирают из группы, которая включает метод TAS, метод 3SR, метод NASBA, метод ТМА, метод с репликазой Qb, метод ПЦР, метод ЛЦР и метод SDA.

64. Способ по п.63, где случайный праймер или вырожденный праймер используют в реакции амплификации нуклеиновой кислоты.

65. Способ по п.64, где случайный праймер или вырожденный праймер является праймером, имеющим случайную последовательность или вырожденную последовательность, по крайней мере, на 3'-конце или со стороны 3'-конца.

66. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

67. Способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (b);

(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (c), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (a), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (a), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;

(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (e), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (e).

68. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера; и

(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

69. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи.

70. Способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, отличающийся тем, что способ включает

(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (a), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;

(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную эр стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (b);

(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (c), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который отличается от праймера, использованного на стадии (a), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причём праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (a), является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;

(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причём достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (e), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причём двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (e).

71. Способ амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что способ включает

(a) приготовление реакционной смеси путём смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причём праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причём рибонуклеотид размещён на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причём эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид; и

(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции.

72. Способ определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, отличающийся тем, что способ включает амплификацию нуклеотидной последовательности в соответствии со способом по любому из пп.1-39 и 60-71.

 

Текст

Смотреть все

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу синтеза ДНК, который применим в области генетической инженерии. Оно относится к способу амплификации нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, и к способу выявления нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью указанного способа. Уровень техники Синтез ДНК применяют для различных целей при исследованиях в области генетической инженерии. В большинстве случаев синтез ДНК, за исключением синтеза короткоцепочечных ДНК, таких как олигонуклеотид, осуществляют с помощью каталитических способов, в которых используют ДНК-полимеразу. Примером таких способов является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), подробно описанный в патентах США 4683195, 4683202 и 4800159. Другим примером является метод ПЦР с ревертированием (с обратной транскрипцией)(ОТ-ПЦР), который представляет собой сочетание метода ПЦР и реакции обратной транскрипции, что описано в Trends in Biotechnology,1992, 10, 146-152. Развитие упомянутых выше способов позволяет амплифицировать представляющий интерес участок из состава ДНК или РНК. Упомянутые выше способы синтеза ДНК осуществляют, например, с использованием реакции, состоящей из трх стадий. Тремя стадиями являются стадия диссоциации (денатурации) двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК, стадия отжига (присоединения) праймера на одноцепочечные ДНК и стадия синтеза (достройки) комплементарной цепи от праймера с целью амплификации интересующего участка ДНК. Как альтернатива, они могут быть осуществлены с использованием реакции, обозначаемой как челночная ПЦР (PCR ho saizensenand Enzyme, supplement), 41 (5), 425-428 (1996,в которой две из трх стадий, а именно стадию отжига и стадию достройки, проводят при одной и той же температуре. Как альтернатива, могут быть использованы способ лигазной цепной реакции (ЛЦР) в соответствии с описанным в европейской патентной заявке ЕР 320-308, опубликованной 14 июня 1989 г., или транскрипционная амплификационная система (TAS), описанная в "PCRProtocols", Academic Press Inc., 1990, pp. 245252. В четырх способах, упоминавшихся выше,необходимым является повтор реакции при высокой температуре, а также несколько раз при низкой температуре с целью регенерации одноцепочечной молекулы-мишени для следующего цикла амплификации. Реакционная система должна быть реализована с использованием 2 дискретных фаз или циклов, потому что реакция ограничена указанной выше температурой. Таким образом, для таких способов необходимо использование дорогостоящего амплификатора (термоячейки), который позволяет по ходу процесса быстро и точно корректировать температуру в широком диапазоне. Более того, в реакции требуется время для корректировки температуры до двух или трх заранее определнных значений. Потери времени повышаются пропорционально числу циклов. С целью решения указанных проблем были разработаны способы амплификации нуклеиновых кислот, которые можно проводить в изотермическом режиме. Их примерами являются способ амплификации с вытеснением(смещением) цепи (SDA) в соответствии с описанным в японской патентной заявке JP-B 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (3SR), способ специфичной по конкретной последовательности амплификации нуклеиновой кислоты (NASBA) в соответствии с описанным в японском патенте 2650159, способ амплификации, опосредованной транскрипцией (ТМА), способ с репликазой Q в соответствии с описанным в японском патенте 2710159 и различные модификации способа SDA в соответствии с описанным в патенте США 5824517 и международных патентных заявках WO 99/09211, WO 95/25180 и WO 99/49081. Способ изотермического каталитического синтеза олигонуклеотида описан в патенте США 5916777. В реакции в соответствии с данными способами изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтеза олигонуклеотида достройка с праймера и/или отжиг праймера на одноцепочечный продукт достройки (или на исходную последовательность-мишень) с последующей достройкой с праймера происходит параллельно в реакционной смеси, инкубируемой при постоянной температуре. Среди способов изотермической амплификации нуклеиновых кислот способ SDA является примером систем, в которых конечным результатом является амплификация ДНК. СпособSDA представляет собой способ амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты (и комплементарной ей цепи) в образце за счт вытеснения двойных цепей с использованием ДНК-полимеразы и рестриктазы. Способ требует использования четырх праймеров для амплификации, два из которых должны быть сконструированы так, чтобы включать рестрикционные сайты для рестриктаз. Способ требует использования модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в качестве субстрата для синтеза ДНК в больших количествах. Примером модифицированных дезоксирибонуклеотидтрифосфатов является (-S)-дезоксирибонуклеотидтрифосфат, в котором атом кислорода 3 фосфатной группы по -положению заменн на атом серы (S). Проблема текущих расходов, связанная с использованием модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата, становится серьзной тогда, когда реакцию проводят как стандартную процедуру, например, при генетическом тестировании. Более того, включение модифицированного нуклеотида, такого как (S)-дезоксирибонуклеотид, в состав амплифицированного фрагмента ДНК в данном способе может исключить отщепляемость амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой, например, если его подвергают анализу методом ПДРФ (выявление полиморфизма длин рестрикционных фрагментов). Модифицированный способ SDA в соответствии с описанным в патенте США 5824517 представляет собой способ амплификации ДНК, в котором используют химерный праймер, который состоит из РНК и ДНК и который характеризуется ключевым структурным элементом, в котором ДНК располагается на самом 3'-конце. Модифицированный способSDA в соответствии с описанным в международной патентной заявке WO 99/09211 требует использования рестриктазы, которая образует 5'-выступающий конец. Модифицированный способ SDA в соответствии с описанным в международной патентной заявке WO 95/25180 требует использования по крайней мере двух пар праймеров. Модифицированный способ SDA в соответствии с описанным в международной патентной заявке WO 99/49081 требует использования по крайней мере двух пар праймеров и по крайней мере одного модифицированного дезоксирибонуклеотидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотида в соответствии с описанным в патенте США 5916777 включает синтез ДНК с использованием праймера, имеющего на 3'-конце рибонуклеотид, завершение реакции с использованием праймера, внесение с помощью эндонуклеазы ника между праймером и достроенным праймером в составе достроенной с праймера цепи с целью е отделения, отщепление матрицы и выделение праймера для его повторного использования. Необходимым для данного способа является выделение праймера из реакционной системы и затем снова отжиг его на матрицу с целью повторного использования праймера. Как было описано выше, стандартные способы изотермической амплификации нуклеиновых кислот создают ряд различных проблем. Следовательно, желательным является способ амплификации нуклеотидной последовательности при низкой стоимости расходов, в котором получают фрагмент ДНК, который может быть далее использован в генетической инженерии. Объекты изобретения Основным объектом настоящего изобретения является удобный и эффективный способ 4 амплификации нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что реакцию синтеза ДНК проводят в присутствии олигонуклеотидного праймера, а также способ получения амплифицированного фрагмента ДНК в больших количествах для создания его запасов. Сущность изобретения В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения сконструировали эффективную систему для реакции амплификации гена. Конструирование было осуществлено путм разработки способа, в котором представляющий интерес участок ДНК амплифицируют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера, включающего рибонуклеотид, расположенный на 3'-конце или со стороны 3'-конца, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. Таким образом, настоящее изобретение было завершено. Способ по настоящему изобретению был определн как способ изотермической амплификации нуклеиновой кислоты (ICAN) с использованием химерного праймера, который является способом амплификации нуклеотидной последовательности, в котором химерный олигонуклеотидный праймер используют в изотермических условиях. Первый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем,что способ включает(а) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3 '-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи. Второй аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующегося тем, что способ включает(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним прай 5 мером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером,который отличается от использованного на стадии (а) праймера, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причм праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который,по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид,причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(е). Способ по первому и второму аспектам настоящего изобретения может быть осуществлн в изотермических условиях. Нуклеотидная 6 последовательность, служащая матрицей, может быть последовательностью ДНК. Стадия получения одноцепочечной кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы и РНК в качестве матрицы может быть выполнена до стадии (а) первого и второго аспектов. Одноцепочечная кДНК может быть использована в качестве нуклеотидной последовательности, служащей матрицей. И одноцепочечная ДНК, и двухцепочечная ДНК могут быть предпочтительно использованы в качестве ДНК-матрицы в первом и втором аспектах настоящего изобретения. Если в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК, то способ по настоящему изобретению может быть осуществлн после стадии предварительной обработки по денатурации двухцепочечной ДНК в одноцепочечные ДНК. В названных выше аспектах достройку с праймера осуществляют с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи. ДНК-полимераза, выбранная из группы, которая включает фрагмент Клнова ДНК-полимеразы I Escherichia coli, ДНКполимеразу Bst Bacillus stearothermophilus, лишнную экзонуклеазной активности 5'3', и ДНК-полимеразу Вса Bacillus caldotenax, лишнную экзонуклеазной активности 5'3', может быть предпочтительно использована для настоящего изобретения. Дополнительно в качестве эндонуклеазы можно предпочтительно использовать эндорибонуклеазу. Эндорибонуклеазой, которую можно использовать, является,например, тем самым не ограничиваясь, РНКаза-Н. Третий аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем,что способ включает(a) приготовление реакционной смеси путм смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции. Примером нуклеотидных последовательностей, служащих матрицами, которые можно использовать в третьем аспекте изобретения, 7 является нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, которая включает одноцепочечную ДНК, двухцепочечную ДНК, денатурированную на одноцепочечные ДНК, и кДНК,полученную в реакции обратной транскрипции на материале РНК. В состав реакционной смеси могут входить два или большее число химерных олигонуклеотидных праймеров. Предпочтительно в данном аспекте изобретения можно использовать ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи, и эндонуклеазу, использованные в первом и втором аспектах изобретения. Праймер, использованный в первом, втором и третьем аспектах настоящего изобретения, является химерным олигонуклеотидным праймером. Например, может быть использован химерный олигонуклеотид, в структуре которого имеется по крайней мере один, предпочтительно два или большее число последовательно расположенных рибонуклеотидных остатков,присоединнных к 3'-концу или со стороны 3'конца праймера. Матрицей, использованной в первомтретьем аспектах настоящего изобретения, может являться нуклеиновая кислота, которая заранее была амплифицирована с помощью способа амплификации нуклеиновых кислот. Например, способ TAS, способ 3SR, способNASBA, способ ТМА, способ с репликазой Q,способ ПЦР, способ ЛЦР и способ SDA может быть использован в качестве способа амплификации нуклеиновой кислоты, хотя могут быть использованы без какого-либо ограничения любые способы амплификации нуклеиновых кислот. Способ по настоящему изобретению может быть использован в сочетании с этими способами амплификации нуклеиновых кислот. Случайный праймер или вырожденный праймер может быть использован в реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, предпочтительно без каких-либо ограничений может быть использован праймер, имеющий случайную последовательность или вырожденную последовательность, находящуюся на самом 3'-конце или со стороны 3'-конца. Четвртый аспект настоящего изобретения касается химерного олигонуклеотидного праймера, который можно использовать в первомтретьем аспектах. Праймер отличается тем, что он включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид и обладает структурой, в которой рибонуклеотид располагается на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера. Например, может быть использован химерный олигонуклеотидный праймер, который включает по крайней мере один, предпочтительно два или большее число расположенных подряд остатков рибонуклеотидов и который обеспечивает достройку цепи ДНК от своего 3'-конца. Такой праймер конструируют таким образом, чтобы он отщеплялся 8 действием рибонуклеазы, такой как РНКаза-Н,по 3 '-концу рибонуклеотидного остатка. Пятый аспект настоящего изобретения касается ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, эндонуклеазы и набора, который содержит их и используется в первом-третьем аспектах изобретения. Шестой аспект настоящего изобретения касается способа выявления нуклеиновой кислоты-мишени, характеризующегося тем, что способ включает амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по первому-третьему аспектам настоящего изобретения с последующим выявлением нуклеиновой кислоты. Способы выявления включают способ,в котором нуклеиновую кислоту-мишень выявляют с использованием рибонуклеотидного(РНК) зонда, помеченного двумя или большим числом флуоресцентных красителей, расположенных на таком расстоянии, которое обеспечивает гашение сигнала. Седьмой аспект настоящего изобретения касается ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, эндонуклеазы и набора, который содержит их, используемого в способе выявления нуклеиновой кислотымишени по шестому аспекту настоящего изобретения. Восьмой аспект настоящего изобретения касается способа получения продукта, имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором нуклеиновую кислоту располагают в заранее определнном участке, характеризующегося тем, что способ включает размещение и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по первому-третьему аспектам настоящего изобретения, в заданном участке субстрата. В частности,предпочтительным является способ, в котором амплифицируют, размещают и иммобилизуют в заданном участке одноцепочечную нуклеотидную кислоту, которая, по существу, свободна от комплементарных ей последовательностей. Девятый аспект настоящего изобретения касается продукта, имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, причм нуклеиновая кислота размещена в заданном участке и получена с помощью способа по восьмому аспекту настоящего изобретения. В частности, предпочтительным является продукт, имеющий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором размещают и иммобилизуют в заданном участке одноцепочечную нуклеиновую кислоту,которая, по существу, свободна от комплементарных ей цепей. Десятый аспект настоящего изобретения касается способа выявления нуклеиновой кислоты-мишени в образце, характеризующегося тем, что в способе используют продукт, имеющий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, 9 причм нуклеиновая кислота размещена в заданном участке в соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, с целью выявления нуклеиновой кислоты, которая гибридизует с нуклеиновой кислотой, размещнной и иммобилизованной в заданном участке данного продукта. Одиннадцатый аспект настоящего изобретения касается способа получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, характеризующегося тем, что способ включает(а) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи. Двенадцатый аспект настоящего изобретения касается способа получения нуклеиновой кислоты в больших количествах с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующегося тем, что способ включает(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеи 004327 10 новой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером,который отличается от использованного на стадии (а) праймера, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причм праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который,по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид,причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(е). Тринадцатый аспект настоящего изобретения касается способа получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, характеризующегося тем, что способ включает(a) приготовление реакционной смеси путм смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции. Четырнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает(а) амплификацию нуклеиновой кислоты,включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;(b) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (b), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(d) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (с), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи. Пятнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующегося тем, что способ включает(a) амплификацию нуклеиновой кислоты,включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;(b) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, полученной на стадии (а), по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со 12 стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(c) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (b), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;(d) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (с), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(e) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (d), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером,который отличается от праймера, использованного на стадии (b), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причм праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (b), является химерным олигонуклеотидным праймером, который,по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид,причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(f) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (е), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(g) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (f), отщепляют с целью вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии (f). Шестнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает(a) амплификацию нуклеиновой кислоты,включающей последовательность, предназначенную для амплификации, с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты, служащей матрицей;(b) приготовление реакционной смеси путм смешивания нуклеиновой кислоты, служа 13 щей матрицей, полученной на стадии (а), дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы,обладающей активностью по вытеснению цепи,по крайней мере одной праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой; и(с) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции. В четырнадцатом-шестнадцатом аспектах настоящего изобретения нуклеиновую кислоту,включающую последовательность, которая должна быть амплифицирована, амплифицируют до проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты. После этого продукт амплификации используют в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, в способе по первому-третьему аспектам настоящего изобретения. Например, способ TAS, способ 3SR, способNASBA, способ ТМА, способ с репликазой Q способ ПЦР, способ ЛЦР и способ SDA могут быть использованы в качестве способа амплификации нуклеиновой кислоты, используемого в четырнадцатом-шестнадцатом аспектах, хотя любые способы амплификации нуклеиновой кислоты могут быть применены без какого-либо ограничения. В реакции амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать случайный праймер или вырожденный праймер. Например, предпочтительно может быть использован праймер,имеющий без какого-либо ограничения случайную последовательность или вырожденную последовательность на самом 3'-конце или со стороны 3'-конца. Семнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеа 004327(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи. Восемнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующийся тем, что способ включает(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером,который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причм праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который,по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид,причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера;(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(е). Девятнадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает(a) приготовление реакционной смеси путм смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера; и(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции. Двадцатый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем,что способ включает(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера,причм эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера 16 цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи. Двадцать первый аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров, характеризующегося тем, что способ включает(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером,включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера,причм эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером,который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причм праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который,по существу, комплементарен нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид,причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причм эндонуклеаза отщепляет по сайту, который включает рибонуклеотид;(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца 17 праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью обеспечения вытеснения цепи, причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту, включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(е). Двадцать второй аспект настоящего изобретения касается способа амплификации нуклеотидной последовательности, характеризующегося тем, что способ включает(a) приготовление реакционной смеси путм смешивания нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, дезоксирибонуклеотидтрифосфата, ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, по крайней мере одного праймера и эндонуклеазы, которая отщепляет достроенную цепь, образованную от праймера, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера, причм эндонуклеаза отщепляет по сайту,который включает рибонуклеотид; и(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции. Двадцать третий аспект настоящего изобретения касается способа определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, характеризующегося тем, что способ включает амплификацию нуклеотидной последовательности в соответствии со способом по любому из первого-третьего и четырнадцатогодвадцать второго аспектов изобретения. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показана схема, иллюстрирующая пример способа по настоящему изобретению, в котором используют одноцепочечную ДНК. На фигуре высвобожденная цепь ДНК,обозначенная закрашенным кружочком, выполняет роль ДНК-матрицы для (6). На фиг. 2 показаны результаты электрофореза в агарозном геле в отношении ДНКфрагментов, амплифицированных с помощью способа по настоящему изобретению при различном времени реакции. Подробное описание изобретения В данном тексте термин дезоксирибонуклеотид (также обозначаемый как dN) обозначает нуклеотид, сахарный компонент которого представлен D-2-дезоксирибозой. Дезоксирибонуклеотиды включают, например, те дезоксирибонуклеотиды, основаниями в которых являются аденин, цитозин, гуанин или тимин. Рибонуклеотид (также обозначаемый как N) обозначает нуклеотид, сахарный компонент которого представлен D-рибозой. Рибо 004327 18 нуклеотиды включают, например, те рибонуклеотиды, основаниями в которых являются аденин, цитозин, гуанин или урацил. Рибонуклеотиды также включают модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода в составе фосфатной группы по -положению заменн на атом серы (также обозначается как(-S)-рибонуклеотид или как (-S)-N), или другие производные. Химерный олигонуклеотидный праймер обозначает праймер, который включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Праймер может включать немодифицированный дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный дезоксирибонуклеотид. Как альтернатива, он может включать немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид. Используемые в настоящем изобретении химерные олигонуклеотидные праймеры включают любой химерный олигонуклеотидный праймер, который включает рибонуклеотид,размещнный на 3'-конце или со стороны 3'конца праймера, может быть использован для достройки цепи нуклеиновой кислоты в способе по настоящему изобретению, может быть отщеплн эндонуклеазой и может быть использован для осуществления реакции вытеснения цепи. Выражение со стороны 3'-конца указывает на участок от середины до 3'-конца нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Таким же образом выражение со стороны 5'-конца указывает на участок от середины до 5'-конца нуклеиновой кислоты. Эндонуклеаза может являться любой эндонуклеазой, которая действует на двухцепочечную ДНК, образованную в результате достройки ДНК от химерного олигонуклеотидного праймера, присоединнного к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, и которая специфическим образом отщепляет е по праймерному сегменту, включающему рибонуклеотид. ДНК-полимераза обозначает фермент,который синтезирует цепь ДНК de novo с использованием цепи ДНК в качестве матрицы. ДНК-полимеразой являются, тем самым не ограничиваясь, ДНК-полимераза pol I-го типа (например, ДНК-полимераза I Escherichia coli,фрагмент Клнова и ДНК-полимераза Taq),ДНК-полимеразы -типа (например, ДНКполимераза Pyrococcus furiosus (Stratagene),ДНК-полимераза VENT (New England Biolabs),ДНК-полимераза KOD (Toyobo) и ДНКполимераза DEEP VENT (New England Biolabs и ДНК-полимеразы, не относящиеся к -типу или polI-типу (например, ДНК-полимераза в соответствии с описанным в международной патентной заявке WO 97/24444). ДНКполимеразы, обладающие активностью по вытеснению цепи, включают ДНК-полимеразы 19 термофильных бактерий рода Bacillus, таких какBacillus caldotenax (здесь и далее обозначаемой как В.са) и Bacillus stearothermophilus (здесь и далее обозначаемая как B.st), а также варианты этих ДНК-полимераз, утратившие свою 5'3'экзонуклеазную активность. Более того, ДНКполимеразы с активностью по вытеснению цепи включают ДНК-полимеразы, например, фрагмент Клнова, которые имеют активность по вытеснению цепи и не имеют 5'3'экзонуклеазной активности. Кроме того, ДНКполимераза может являться смесью нескольких ДНК-полимераз, такой как без каких-либо ограничений смесь ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, и ДНКполимеразы, которая не имеет активности по вытеснению цепи. Выражение активность по вытеснению цепи указывает на активность, которая может обусловливать вытеснение цепи, а именно активность, которая может обеспечивать удвоение ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, путм вытеснения цепи ДНК с высвобождением комплементарной цепи, которая была присоединена к цепиматрице. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная в результате вытеснения цепи с нуклеотидной последовательности, являющейся матрицей,обозначается здесь как вытесненная цепь. Далее настоящее изобретение будет описано подробно.(1) Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении. Праймер, используемый в способе по настоящему изобретению, является химерным олигонуклеотидным праймером, который включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Такие праймеры включают олигонуклеотидный праймер, который включает немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид. Химерный олигонуклеотидный праймер,используемый в способе по настоящему изобретению, может быть любым химерным олигонуклеотидным праймером, имеющим нуклеотидную последовательность, которая, по существу, комплементарна части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, который можно использовать для достройки цепи ДНК от его 3'-конца и который имеет сайт на 3'-конце или со стороны 3'конца, по которому эндонуклеаза отщепляет его в процессе реакции синтеза ДНК. Например,может быть использован химерный олигонуклеотидный праймер, включающий рибонуклеотид,размещнный на 3'-конце или со стороны 3'конца. Праймер обычно конструируют таким образом, чтобы он был комплементарен участку, расположенному выше сегмента, предназначенного для амплификации, т.е. участку, находящемуся с 3'-стороны нуклеотидной последо 004327 20 вательности, соответствующей сегменту, предназначенному для амплификации, в составе нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. В данном тексте выражение по существу комплементарная нуклеотидная последовательность обозначает нуклеотидную последовательность, которая может соединиться с ДНК,являющейся матрицей, в используемых условиях проведения реакции. Такой химерный олигонуклеотидный праймер или олигонуклеотидный праймер может быть сконструирован специалистом в данной области техники в соответствии с известными процедурами, например, в соответствии со ссылкой на Labo Manual PCR (TakaraShuzo, pp. 13-16, 1996). Можно использовать имеющийся в продаже программный пакет для конструирования праймера, такой как компьютерная программа OLIGO Primer Analysis (Takara Shuzo). Химерный олигонуклеотидный праймер,используемый в настоящем изобретении, может включать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. Рибонуклеотид может быть либо немодифицированным рибонуклеотидом, либо модифицированным рибонуклеотидом, который может быть размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера и который распознатся эндонуклеазой или отщепляется ею. Рибонуклеотиды включают и немодифицированный рибонуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид в соответствии с описанным выше. Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание могут быть использованы для химерного олигонуклеотидного праймера по настоящему изобретению, лишь бы они не нарушали функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются, тем самым не ограничиваясь, (-S)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменн на атом серы, и рибонуклеотид, в котором гидроксильная группа во 2 положении в составе рибозы заменена на метоксигруппу. Такой химерный олигонуклеотидный праймер, включающий модифицированный рибонуклеотид,может быть получен с использованием, например, (-S)-рибонуклеотидтрифосфата, который получают с помощью способа, описанного в патенте США 5003097, с использованием реагента для реакции сульфирования (Glen Research) или 2-ОМе-RNА-СЕ-фосфоамидитного реагента (Glen Research). Химерный олигонуклеотидный праймер,который можно использовать в способе амплификации по настоящему изобретению, может быть сконструирован так, чтобы он включал модифицированный рибонуклеотид, который обеспечивает устойчивость к отщеплению эндонуклеазой. Такой праймер применим для того, чтобы можно было контролировать сайт от 21 щепления эндонуклеазой в процессе стадий реакции амплификации. В способе по настоящему изобретению могут быть использованы один или два химерных олигонуклеотидных праймера, что зависит от желательной формы ДНК-фрагмента, получаемого в результате амплификации (одноцепочечного или двухцепочечного). В частности, один химерный олигонуклеотидный праймер используют тогда, когда желательной является одноцепочечная ДНК, в то время как два праймера используют тогда, когда желательной является двухцепочечная ДНК. Длина химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, конкретным образом не ограничивается, но предпочтительно составляет от примерно 12 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 15 нуклеотидов до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида была, по существу, комплементарна нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, таким образом, чтобы он соединялся с нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, при используемых условиях проведения реакции. Праймер включает последовательность, распознаваемую эндонуклеазой, которую используют на стадии,описанной далее, находящуюся на 3'-конце или со стороны 3'-конца. Например, олигонуклеотид, имеющий структуру, представляемую нижеследующей общей формулой, можно использовать в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению в качестве праймера, хотя она и не призвана ограничить настоящее изобретение. Общая формула: 5'-dNa-Nb-dNc-3', где (а целое число от 11 или больше; b - 0 или целое число от 1 или больше; с - 0 или целое число от 1 или больше, при условии, что b и с одновременно не могут быть равны 0; dN - дезоксирибонуклеотид; N - немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид). Например, в настоящем изобретении предпочтительно может быть использован химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, в которой а является целым числом 11 или больше; и b = 1 и с = 0, b = 2 и с = 0, b = 3-5 и с = 0 или b = 2 и с= 0-5. Длина рибонуклеотидов на 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, предпочтительно является от мономерной до 15-мерной, более предпочтительно от мономерной до 10-мерной,наиболее предпочтительно от мономерной до пентамерной. Число с в базовой формуле конкретным образом не ограничивается, но можно выбрать любое число, которое может быть использовано в способе по настоящему 22 изобретению. Обычно предпочтительным является 5 или меньше. Лучшие результаты получают в реакции, выбирая для с 3, нежели 4, выбирая 2, нежели 3, и выбирая 1, нежели 2. В частности, наиболее эффективно реакция может быть осуществлена в случае с=0. Химерный олигонуклеотидный праймер,используемый в настоящем изобретении, имеет структуру, в которой эндонуклеаза отщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера с использованием ДНК-полимеразы (достроенная с праймера цепь), по сайту, который включает рибонуклеотид. Другими словами, рибонуклеотид размещают на 3'-конце или со стороны 3'-конца химерного олигонуклеотидного праймера для отщепления эндонуклеазой. Например, когда РНКаза-Н действует на двухцепочечную ДНК,образованную в результате достройки ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, представленного общей формулой, который был присоединн к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, то химерный олигонуклеотидный праймер отщепляется по рибонуклеотидному участку. Затем получают двухцепочечную ДНК,в которую ник внесн между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезированной в результате достройки. Затем реакция вытеснения цепи с участием ДНК-полимеразы происходит от сайта внеснного ника. Таким образом, в способе по настоящему изобретению можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достройки цепи нуклеиновой кислоты от 3'конца праймера, который может быть отщеплн эндонуклеазой и с помощью которого ДНКполимераза может осуществлять реакцию вытеснения цепи. Химерный олигонуклеотидный праймер может быть синтезирован так, чтобы иметь любую нуклеотидную последовательность, с использованием, например, ДНК-синтезатора модели 394 от фирмы Applied Biosystems Inc.(ABI) в соответствии с фосфоамидитным методом. Как альтернатива, любые способы, включая фосфотриэфирный метод, Н-фосфонатный метод и тиофосфонатный метод, могут быть использованы для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера.(2) Эндонуклеаза, используемая в настоящем изобретении. Любая эндонуклеаза, которая действует на двухцепочечную ДНК, образованную в результате достройки ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера в соответствии с описанным выше в (1), который был соединн с нуклеиновой кислотой, служащей матрицей, и которая отщепляет достроенную цепь, обеспечивая реакцию вытеснения цепи, может быть использована в настоящем изобретении. Таким образом,эндонуклеаза является ферментом, который создат ник (разрыв) на участке химерного олигонуклеотидного праймера в составе двухцепо 23 чечной ДНК. Примерами эндонуклеаз, которые можно использовать в настоящем изобретении,являются, тем самым не ограничиваясь, рибонуклеазы. Среди них предпочтительно может быть использована эндорибонуклеаза-Н (РНКаза-Н), которая действует на РНК-часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, составленной ДНК и РНК. Любая рибонуклеаза, которая обладает указанными выше активностями, может быть предпочтительно использована в настоящем изобретении, включая мезофильные и устойчивые к нагреванию рибонуклеазы. Например, РНКаза-Н Е.соli может быть использована в реакции при температуре от примерно 50 до примерно 70 С в способе по настоящему изобретению в соответствии с описанным далее в примерах. Также предпочтительно можно использовать имеющуюся в продаже термоустойчивую рибонуклеазу термостабильную РНКазуН Hybridase (Epicenter Technologies). Более того, рибонуклеаза может являться встречающейся в нативных условиях или быть вариантом. Единица каталитической активности указанной здесь РНКазы-Н представляет собой величину, определнную в соответствии со способом измерения единицы каталитической активности, описанном в сравнительных примерах. Эффективность реакции отщепления с участием эндонуклеазы, такой как РНКаза-Н,используемой в способе по настоящему изобретению, может зависеть от нуклеотидной последовательности вблизи от 3'-конца праймера и влиять на эффективность амплификации желательной ДНК. Следовательно, вполне естественно конструировать праймер, оптимальный для используемой РНКазы-Н. В данном тексте термин внесение ника(разрыва) или никинг обозначает внутреннее отщепление одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза-Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и содержащей рибонуклеотиды ДНК, избирательным среди двух цепей образом расщепляя содержащую рибонуклеотид цепь на участке присутствия рибонуклеотидов, тем самым внося ник в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту.(3) ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении. ДНК-полимераза, обладающая активностью по вытеснению цепи в ДНК, может быть использована в настоящем изобретении. В частности, предпочтительно может быть использована ДНК-полимераза, по существу, лишнная 5'3'-экзонуклеазной активности. Выражение активность по вытеснению цепи обозначает активность, которая может обеспечивать вытеснение цепи, т.е. тем самым может обеспечивать удвоение ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, путм вытеснения цепи ДНК с вы 004327 24 свобождением комплементарной цепи, которая была присоединена к цепи-матрице. Кроме того,цепь ДНК, высвобожденная в результате вытеснения цепи с нуклеотидной последовательности, являющейся матрицей, обозначается здесь как вытесненная цепь. В настоящем изобретении могут быть использованы любые ДНК-полимеразы, обладающие активностью по вытеснению цепи. Их примерами являются варианты ДНК-полимераз,лишнные 5'3'-экзонуклеазной активности,происходящие от термофильных бактерий родаBacillus, таких как Bacillus caldotenax (здесь и далее обозначается как В.са) и Bacillusstearothermophilus (здесь и далее обозначается как B.st), равно как и крупный фрагмент(фрагмент Клнова) ДНК-полимеразы I Escherichia coli (E.coli). И мезофильные, и термоустойчивые ДНК-полимеразы могут быть предпочтительно использованы в настоящем изобретении. В.са является термофильной бактерией,характеризующейся оптимальной температурой роста примерно 70 С. ДНК-полимераза В.са от этой бактерии известна, как обладающая ДНКзависимой ДНК-полимеразной активностью,РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратно-транскриптазной активностью),5'3'-экзонуклеазной активностью и 3'5'экзонуклеазной активностью. Фермент может быть либо ферментом,очищенным из его оригинального источника,либо рекомбинантным белком, полученным с использованием методов генетической инженерии. Фермент может быть подвергнут модификации, такой как замена, делеция, добавление или вставка, с применением методов генетической инженерии или иных способов. Примером модифицированных ферментов являются ДНКполимераза Вса BEST (Takara Shuzo), которая является ДНК-полимеразой Вса, лишнной 5'3'-экзонуклеазной активности.(4) Состав реакционного буфера, используемого в настоящем изобретении. Реакционный буфер, который содержит буферный компонент, соль магния и dNTPs,используют в настоящем изобретении. Примерами буферных компонентов, которые предпочтительно можно использовать, являются, тем самым не ограничиваясь, трицин, Трисгидрохлорид и фосфат (такой как фосфат натрия и фосфат калия). Среди них предпочтительным для настоящего изобретения является буфер,который содержит трицин или фосфат в качестве буферного компонента. Конечная концентрация буферного компонента находится в диапазоне 5-100 мМ, предпочтительно 20-50 мМ. Диапазон рН составляет 6,0-9,5, предпочтительно 7,0-9,2. Например, предпочтительно используют буфер, содержащий 22-46 мМ трицина,при рН=7,5-9,2 или буфер, содержащий 25-50 25 мМ фосфата калия, при рН=7,0-8,0. Примерами солей магния, которые можно предпочтительно использовать, являются, тем самым не ограничиваясь, хлорид магния, ацетат магния или сульфат магния. Конечная концентрация соли магния находится в диапазоне 1-20 мМ, предпочтительно 2-10 мМ. Конечная концентрацияdNTPs (dATP, dCTP, dGTP и dTTP) в смеси, являющихся субстратами для реакции достройки ДНК, находится в диапазоне 0,1-3,0 мМ, предпочтительно 0,2-1,2 мМ. Содержание праймеров, используемых в реакционном объме 50 мкл, составляет 1-1000 пкмоль, предпочтительно 10-100 пкмоль. Кроме того, реакционная смесь может содержать добавки, обеспечивающие, например, стабилизацию реакции амплификации. Могут быть добавлены БСА в конечной концентрации 0,1% или меньше, диметилсульфоксид в конечной концентрации 10% или меньше, путресцина дигидрохлорид в конечной концентрации 4 мМ или меньше или пропилендиамин в концентрации 0,01% или меньше. Как альтернатива, могут включаться NMP (1-метил 2-пирролидинон), глицерин, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид и/или формамид. Ожидается, что добавление таких органических растворителей снижает неспецифический отжиг олигонуклеотидных праймеров. Количество РНКазы-Н E.coli, являющейся примером эндонуклеаз, в реакционном объме 50 мкл находится в диапазоне предпочтительно 3-200 ед., более предпочтительно 15-60 ед. Количество ДНК-полимеразы Вса BEST, являющейся примером ДНК-полимераз, в реакционном объме 50 мкл составляет предпочтительно 0,5-100 ед., более предпочтительно 1-22 ед. Предпочтительно количество единиц эндонуклеазы в этих диапазонах может варьироваться в зависимости от е типа. В таком случае состав буфера и количество фермента, которое необходимо добавить, корректируют таким образом,чтобы количество продукта амплификации достигало максимума. В любом случае естественной является оптимизация состава реакционного буфера и подобного с учтом типа используемого фермента.(5) Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Способ по настоящему изобретению может быть осуществлн с использованием по крайней мере одного олигонуклеотидного праймера в соответствии с описанным выше в(1) в сочетании с эндонуклеазой в соответствии с описанным выше в (2) и ДНК-полимеразой в соответствии с описанным выше в (3). dNTPs,используемые в методе ПЦР или подобном(смесь dATP, dCTP, dGTP и dTTP), могут быть предпочтительно использованы в качестве нуклеотидтрифосфатов, служащих субстратами для реакции достройки в данном способе. dNTPs 26 могут включать аналог dNTP, такой как 7-деазаdGTP, лишь бы он выполнял роль субстрата для используемой ДНК-полимеразы. В данном способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер может быть получен, например, с использованием ДНК-синтезатора в соответствии со стандартным методом синтеза. В способе по настоящему изобретению можно использовать сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и нормального олигонуклеотидного праймера. Нуклеиновая кислота (ДНК или РНК), используемая в качестве матрицы в способе по настоящему изобретению, может быть получена или выделена из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, тем самым не ограничиваясь, образцы, взятые от организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитарная плнка, моча, фекалии, спинно-мозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или лимфатический узел) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или бактериальная клеточная культура), образцы, которые содержат нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, грибок, дрожжи, растение и животное, образцы, для которых предполагается загрязнение или инфицирование микроорганизмом, таким как вирус или бактерия (например, пища или биологический препарат), и образцы, которые могут содержать организм, такие как почва и сточные воды. Образец может являться препаратом, содержащим нуклеиновую кислоту, полученным в результате обработки образцов,описанных выше, в соответствии с известным методом. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются продукт разрушения клеток или образец,полученный в результате фракционирования продукта, нуклеиновая кислота из образца или конкретные молекулы нуклеиновых кислот, такие как образец, обогащнный по содержанию мРНК. Более того, предпочтительно может быть использована нуклеиновая кислота, такая как ДНК или РНК, полученная в результате амплификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце, с помощью известных способов. Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, может быть приготовлен из упоминавшихся выше материалов с помощью, например,лизиса действием детергента, ультразвука,встряхивания/перемешивания со стеклянными шариками или французского пресса без какихлибо ограничений. В некоторых случаях предпочтение имеет дополнительная обработка препарата с целью очистки нуклеиновой кислоты(например, в случае, когда имеется эндогенная эндонуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают с помощью известных методов, таких как фенольная экстракция, хромато 27 графия,ион-обменные реакции,гельэлектрофорез или центрифугирование в градиенте плотности. Когда желательно амплифицировать нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, производную от РНК, способ по настоящему изобретению может быть осуществлн с использованием в качестве матрицы кДНК, синтезированной в реакции обратной транскрипции, в которой РНК используется в качестве матрицы. Любая РНК, для которой можно сформировать праймер для реакции обратной транскрипции, может быть использована в способе по настоящему изобретению, включая молекулы РНК, такие как тотальная РНК, мРНК, тРНК и рРНК в образце, равно как и конкретные виды РНК. Любой праймер, который соединяется с РНК, служащей матрицей, в используемых условиях реакции, может быть использован в реакции обратной транскрипции. Праймер может являться праймером, характеризующимся нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна конкретной РНК, служащей матрицей (специфичный праймер), олиго-дТ (олиготиминовым) праймером и праймером, имеющим случайную последовательность (случайный праймер). С точки зрения специфичности отжига длина праймера для обратной транскрипции составляет предпочтительно 6 нуклеотидов или больше, более предпочтительно 9 нуклеотидов или больше. С точки зрения синтеза олигонуклеотидов длина предпочтительно составляет 100 нуклеотидов или меньше, более предпочтительно 30 нуклеотидов или меньше. Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер можно использовать в качестве праймера для обратной транскрипции. Химерный олигонуклеотидный праймер также можно использовать в качестве праймера для реакции вытеснения цепи в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с использованием кДНК, полученной в результате обратной транскрипции, в качестве матрицы. Такой праймер может быть любым праймером, который обладает свойствами, описанными выше в (1), и который можно использовать в реакции обратной транскрипции на материале РНК. В реакции обратной транскрипции может быть использован любой фермент, который обладает активностью по синтезу кДНК с использованием РНК в качестве матрицы. Их примерами являются обратные транскриптазы, происходящие от различных источников, такие как обратная транскриптаза, происходящая от вируса миелобластоза птиц (ОТаза AMV), обратная транскриптаза, происходящая от вируса лейкоза Молони мышей (ОТаза MMLV), и обратная транскриптаза вируса-2, ассоциированного с вирусом саркомы Рауса (ОТаза RAV-2). Кроме 28 того, может быть использована ДНКполимераза, которая также обладает обратнотранскриптазной активностью. Предпочтительным для настоящего изобретения является фермент, обладающий обратно-транскриптазной активностью при высокой температуре, такой как ДНК-полимераза бактерии рода Thermus(например, ДНК-полимераза Tth) и ДНКполимераза термофильной бактерии рода Bacillus. Например, предпочтительны ДНК-полимеразы термофильных бактерий рода Bacillus, такие как ДНК-полимераза B.st (ДНК-полимеразаBst) и ДНК-полимераза Вса (ДНК-полимераза Вса), хотя это не призвано ограничить настоящее изобретение. Например, для ДНКполимеразы Вса необязательно присутствие иона магния для реакции обратной транскрипции. Более того, она может синтезировать кДНК, подавляя при этом образование вторичной структуры РНК, служащей матрицей, в условиях высокой температуры. И встречающийся в нативных условиях, и вариантный фермент,обладающий обратнотранскриптазной активностью, может быть использован, лишь бы он проявлял такую активность. При амплификации нуклеиновой кислоты в способе по настоящему изобретению представляющая интерес нуклеиновая кислота может быть более эффективно амплифицирована путм предварительной амплификации нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. Например,когда амплифицируют нуклеотидную последовательность, присутствующую в геномной ДНК в следовых количествах, то ДНК-фрагмент,включающий интересующую нуклеотидную последовательность, сначала амплифицируют с помощью подходящего способа амплификации нуклеиновых кислот. Полученный таким образом амплифицированный ДНК-фрагмент затем используют в качестве матрицы для осуществления способа амплификации по настоящему изобретению. Стадия первой амплификации может быть осуществлена с помощью способа по настоящему изобретению. Как альтернатива,е можно осуществить с помощью известного способа амплификации нуклеиновых кислот,такого как метод ПЦР. Более того, специфическая нуклеотидная последовательность может быть добавлена со стороны 5'-конца праймера,предназначенного для использования на стадии амплификации. Когда фрагмент, амплифицированный с использованием такого праймера, используют в качестве матрицы, способ амплификации по настоящему изобретению может быть осуществлн с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, имеющего конкретную нуклеотидную последовательность, добавленную к указанному выше праймеру. Другими словами, возможно осуществить стадию амплификации нуклеиновой кислоты в соответствии со способом по настоящему изобретению, на которой ПЦР-амплифицированный ДНК 29 фрагмент используют в качестве матрицы, с использованием общего химерного олигонуклеотидного праймера, независимо от нуклеотидной последовательности участка, предназначенного для амплификации. Это осуществляют путм сочетания способа по настоящему изобретению и ПЦР с использованием праймера,включающего конкретную нуклеотидную последовательность, добавленную со стороны 5'конца в соответствии с описанным выше. Обычно необходимо сформировать пару праймеров, специфичных для интересующей нуклеотидной последовательности, с целью специфичной амплификации последовательности на первой стадии амплификации нуклеиновой кислоты. Однако нуклеиновая кислота,служащая матрицей, может быть амплифицирована без использования праймера, специфичного для интересующей нуклеотидной последовательности, путм использования случайного праймера, который амплифицирует фрагменты нуклеиновой кислоты по неспецифичному типу,или использования пары праймеров, выбранных из набора уже имеющихся вырожденных праймеров. Число пар праймеров, необходимых для амплификации множества нуклеиновых кислот,служащих матрицами, может быть сокращено. Сокращение обеспечивают путм использования, например, метода ПЦР со случайным праймером, включающим последовательностьметку (Nucleic Acids Research, 1996, 24 [19],3778-3783), или метода ПЦР с праймированием вырожденными праймерами (ВП-ПЦР: Genomics, 1992, 13, 718-725), в котором используется вырожденный праймер с последовательностью-меткой. Каждый из таких праймеров включает случайную последовательность или вырожденную последовательность на 3'-конце. Если способ амплификации по настоящему изобретению осуществляют с использованием в качестве матрицы нуклеиновой кислоты, амплифицированной с помощью праймера, имеющего последовательность-метку, то способ по настоящему изобретению может быть осуществлн с использованием одного химерного олигонуклеотидного праймера. Такой химерный олигонуклеотидный праймер характеризуется нуклеотидной последовательностью, идентичной таковой у последовательности-метки. За счт использования такого праймера все нуклеиновые кислоты, которые были амплифицированы с использованием праймера, имеющего такую же последовательность-метку, используют в качестве матриц. Следовательно, различные нуклеотидные последовательности могут быть получены при очень низкой стоимости и в больших количествах путм сочетания способа по настоящему изобретению со способом амплификации нуклеиновых кислот, в котором используют случайный праймер или вырожденный праймер. 30 Любая ДНК-полимераза, которая синтезирует цепь ДНК de novo с использованием цепи ДНК в качестве матрицы, может быть использована в способе амплификации нуклеиновой кислоты. Такими ДНК-полимеразами являются ДНК-полимеразы pol I-типа (например, ДНКполимераза I E.coli, фрагмент Клнова и ДНКполимераза Taq), ДНК-полимеразы -типа (например, ДНК-полимераза Pyrococcus furiosus,ДНК-полимераза VENT, ДНК-полимераза KOD и ДНК-полимераза DEEP VENT) и ДНКполимеразы, не относящиеся к - или polIтипам (например, ДНК-полимераза, описанная в международной патентной заявкеWO 97/24444). Кроме того, предпочтительно может быть использована смесь по крайней мере двух ДНК-полимераз, таких как ДНК-полимеразаTaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) или ДНКполимераза KOD-dash (Toyobo). Более того,предпочтительно могут быть использованы ДНК-полимеразы, такие как ДНК-полимераза В.са, ДНК-полимераза B.st, варианты этих ДНКполимераз,лишнные своей 5' 3'экзонуклеазной активности, ДНК-полимераза 9N, ДНК-полимераза Pfu (экзо-) (Stratagene),ДНК-полимераза Tth (Toyobo) и ДНКполимераза Tfl (Promega). Если линейный фрагмент ДНК (например,ПЦР-амплифицированный фрагмент) используют в способе амплификации по настоящему изобретению в качестве матрицы, то включение последовательности, сконструированной в качестве спейсерного участка, может повышать эффективность амплификации. Спейсерный участок расположен между 3'-концом линейного ДНК-фрагмента, являющегося матрицей, и сайтом отжига на 5'-конце праймера, использованного в способе по настоящему изобретению. Например, предпочтительным является конструирование праймера для способа амплификации по настоящему изобретению таким образом, чтобы длина спейсерного участка составляла без какого-либо ограничения от 1 до примерно 70 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 5 до примерно 60 нуклеотидов. Предпочтительное число нуклеотидов в спейсерном участке может варьироваться в зависимости от последовательности праймера, предназначенного для способа амплификации по настоящему изобретению. Оптимальный спейсерный участок может быть определн в соответствии с описанным в примерах настоящей заявки. Фрагмент, предварительно амплифицированный с помощью, например, ПЦР, таким образом, что спейсерный участок добавлен с 3'-стороны к участку отжига амплификационного праймера по настоящему изобретению, может быть использован в качестве матрицы в способе амплификации по настоящему изобретению. В одном варианте нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, амплифицируют заранее с использовани 31 ем праймера. Такой праймер в ориентации 5'3' имеет сегмент спейсерного участка, сегмент амплификационного праймера по настоящему изобретению и сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты. Амплифицированный таким образом фрагмент может быть затем использован в качестве матрицы в способе амплификации по настоящему изобретению. Сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты может являться любым сегментом праймера для способа амплификации нуклеиновой кислоты, такого как метод ПЦР. Как альтернатива, сегмент другого праймера для амплификации нуклеиновой кислоты может являться сегментом другого амплификационного праймера по настоящему изобретению. И двухцепочечная ДНК, такая как выделенная геномная ДНК или ПЦР-фрагмент, и одноцепочечная ДНК, такая как кДНК, полученная в реакции обратной транскрипции на материале тотальной РНК, или мРНК могут быть предпочтительно использованы в качестве ДНК-матрицы в настоящем изобретении. Предпочтительно двухцепочечную ДНК используют после е денатурации на одноцепочечные ДНК. Стадия денатурации может быть исключена из способа амплификации по настоящему изобретению, если в качестве матрицы используют линейную двухцепочечную ДНК, такую как ПЦР-амплифицированный продукт. Исключение может быть осуществлено размещением сайта отжига праймера по настоящему изобретению примерно на 50 нуклеотидах внутрь от конца ДНК. Если должна быть амплифицирована нуклеиновая кислота, характеризующаяся последовательностью РНК, то реакция обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы и реакция амплификации ДНК с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции, могут быть осуществлены с одной ДНКполимеразой в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению. Такая ДНК-полимераза обладает обратно-транскриптазной активностью и активностью по вытеснению цепи. Подходящей длиной матрицы является такая длина, которая обеспечивает достаточное связывание праймерной последовательности вследствие присутствия полной последовательности-мишени или, по крайней мере, достаточной части последовательности-мишени в составе фрагмента. Если ДНК, служащая матрицей, является двухцепочечной ДНК, то такую ДНК денатурируют на одноцепочечные ДНК, чтобы обеспечить связывание праймера с цепью ДНК, служащей матрицей, в способе по настоящему изобретению. Предпочтительным для денатурации является выдерживание двухцепочечной ДНК при температуре, при которой она денатурируется (например, при примерно 95 С). Другими 32 подходами являются такие, при которых используют повышение рН. В этом случае величина рН должна быть снижена с целью обеспечения связывания олигонуклеотидного праймера с мишенью в реакции амплификации. Нуклеотидная последовательность последовательно амплифицируется в изотермических условиях после денатурации двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК или, если в качестве матрицы используют РНК, после получения кДНК(одноцепочечной ДНК) в реакции обратной транскрипции. Последовательно означает то, что реакция проходит без изменения температуры реакции или состава реакционной смеси. Понятие изотермические указывает на условия по существу постоянной температуры, при которой фермент и цепь нуклеиновой кислоты функционируют на каждой стадии. Не ограничиваясь какой-либо теорией,предусматривается, что следующие стадии последовательно и повторяющимся образом протекают параллельно (например, в изотермических условиях) в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению:[1] стадия отжига ДНК, служащей матрицей, по крайней мере на один олигонуклеотидный праймер;[2] стадия осуществления реакции достройки ДНК, которая комплементарна ДНКматрице, от 3'-конца праймера;[3] стадия отщепления цепи ДНК, достроенной на стадии [2], действием эндонуклеазы;[4] стадия осуществления реакции достройки ДНК от 3'-конца сайта отщепления стадии [3], при том, что высвобождение цепи ДНК,достроенной на стадии [2], происходит без отделения от ДНК, служащей матрицей; и[5] стадия повтора стадии [3] и стадии [4] с использованием двухцепочечного полинуклеотида, полученного на стадии [4]. Упоминавшаяся выше реакция может быть проведена при нормальной температуре (например, 37 С) с использованием мезофильной ДНК-полимеразы, такой как фрагмент Клнова. Она также может быть проведена при высокой температуре (например, 50 С или выше или 60 С или выше) с использованием термостабильного фермента (эндонуклеазы и ДНКполимеразы). В этом случае неспецифический отжиг праймера подавлен, в результате чего повышается специфичность амплификации ДНК. Более того, решается проблема формирования вторичной структуры ДНК, являющейся матрицей, результатом чего является повышение способности к достройке у ДНКполимеразы. В одном варианте реакция обратной транскрипции и амплификация нуклеотидной последовательности могут быть проведены последовательно в данном способе. В этом случае ДНК, имеющая последовательность, произ 33 водную от РНК, может быть амплифицирована путм объединнного использования обратной транскриптазы с упомянутой выше реакцией или путм использования ДНК-полимеразы,обладающей обратно-транскриптазной активностью. Первым аспектом настоящего изобретения является способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием одноцепочечной ДНК в качестве матрицы и по крайней мере одного химерного олигонуклеотидного праймера. Этот способ амплификации нуклеотидной последовательности включает(a) обработку нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна матрице, причм праймером является химерный олигонуклеотидный праймер, включающий дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенная с праймера цепь, полученная на стадии (b), отщеплена с обеспечением эффекта вытеснения цепи. Вторым аспектом настоящего изобретения является способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием одноцепочечной ДНК в качестве матрицы и по крайней мере двух химерных олигонуклеотидных праймеров по настоящему изобретению. Этот способ амплификации нуклеотидной последовательности с использованием по крайней мере двух праймеров включает(а) обработку нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, по крайней мере одним праймером, который, по существу, комплементарен части нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи,которая комплементарна матрице, причм праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, включающим дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'-конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(b) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид;(c) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (b), отщепляют с целью обеспечения эффекта вытеснения цепи,причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту,включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(d) обработку высвобожденной вытесненной цепи, полученной на стадии (с), служащей матрицей, по крайней мере одним праймером,который отличается от праймера, использованного на стадии (а), и ДНК-полимеразой с целью синтеза достроенной с праймера цепи, которая комплементарна вытесненной цепи, причм праймер, который отличается от праймера, использованного на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером, который по существу комплементарен части нуклеотидной последовательности вытесненной цепи и включает дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид, причм рибонуклеотид размещн на 3'конце или со стороны 3'-конца праймера и предназначен для отщепления эндонуклеазой;(e) отщепление достроенной с праймера цепи в составе двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (d), эндонуклеазой по сайту, который включает рибонуклеотид; и(f) достройку нуклеотидной последовательности, которая комплементарна матрице, с использованием ДНК-полимеразы, обладающей активностью по вытеснению цепи, от 3'-конца праймерного участка двухцепочечной нуклеиновой кислоты, причм достроенную с праймера цепь, полученную на стадии (е), отщепляют с целью достижения эффекта вытеснения цепи,причм двухцепочечную нуклеиновую кислоту,включающую регенерированную достроенную с праймера цепь, повторно используют на стадии(е). Третьим или четвртым аспектом настоящего изобретения является способ, в котором амплификацию нуклеотидной последовательности в соответствии с первым или вторым аспектом проводят с использованием в качестве матрицы одноцепочечной ДНК, полученной после стадии предварительной денатурации двухцепочечной ДНК на одноцепочечные ДНК. Пятым или шестым аспектом настоящего изобретения является способ, в котором амплификацию нуклеотидной последовательности в соответствии с первым или вторым аспектом проводят с использованием в качестве матрицы 35 кДНК, полученной после стадии синтеза одноцепочечной кДНК в реакции обратной транскрипции, используя РНК в качестве матрицы. В данном тексте выражение регенерированная достроенная с праймера цепь обозначает цепь ДНК, комплементарную нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, которая достроена от олигонуклеотидного праймера,заново используемого для удвоения, являющегося результатом вытеснения цепи. Термин повторное использование обозначает то, что двухцепочечную ДНК, составленную нуклеотидной последовательностью матрицы и регенерированной достроенной с праймера цепью, используют снова на стадии вытеснения цепи. В каждом из упоминавшихся выше аспектов настоящего изобретения химерный олигонуклеотидный праймер, который комплементарен одноцепочечной ДНК, служащей матрицей,сначала отжигают на ДНК. ДНК, которая комплементарна ДНК-матрице (достроенная с праймера цепь), затем достраивают вдоль оставшейся последовательности ДНК-матрицы,начиная от 3'-конца праймера, за счт действия ДНК-полимеразы с целью синтеза двухцепочечной ДНК. Эндонуклеаза действует на двухцепочечную ДНК, расщепляя е по сайту со стороны 3'-конца рибонуклеотидной части химерного олигонуклеотидного праймера. Эндонуклеаза не расщепляет ДНК по другим сайтам. Таким образом, эндонуклеаза действует как никвносящий фермент, который вносит ник (одноцепочечный разрыв) в двухцепочечную ДНК. Эндонуклеаза способна изменять структуру двухцепочечной ДНК, составленной химерным олигонуклеотидным праймером и ДНК,служащей матрицей, хотя настоящее изобретение не ограничено какой-либо теорией. ДНКполимераза, обладающая активностью по вытеснению цепи, повторно достраивает цепь ДНК от 3'-конца ника, внеснного в двухцепочечную ДНК, в результате чего образуется новая достроенная с праймера цепь, приводя к высвобождению ДНК вниз от 3'-конца ника. Следовательно, новая достроенная с праймера цепь замещает ранее синтезированную достроенную с праймера цепь. Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть осуществлн с использованием двух праймеров, а именно химерного олигонуклеотидного праймера, который комплементарен нуклеиновой кислоте, являющейся матрицей, и другого химерного олигонуклеотидного праймера, который комплементарен вытесненной цепи. В этом случае один праймер связывается с цепью ДНК, являющейся матрицей, инициируя реакцию вытеснения цепи, в то время как другой праймер связывается с вытесненной цепью,высвобожденной в результате реакции вытеснения цепи, инициируя следующую реакцию вы 004327 36 теснения цепи. Ясно, что продукт реакции, проводимой с одним праймером, может служить матрицей для другого праймера в случае использования данного аспекта изобретения. Таким образом, количество продукта амплификации возрастает в нелинейной зависимости по мере возрастания количества матрицы. В случае, когда способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению осуществляют с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК,химерный олигонуклеотидный праймер, четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата(dNTPs),ДНК-полимеразу и эндонуклеазу добавляют в реакционную смесь перед денатурацией двухцепочечной ДНК или после не. Если для денатурации двухцепочечной ДНК используют нагревание и при этом не используют теплоустойчивый фермент, то предпочтительно добавлять фермент после проведения денатурации. Как было описано выше в (2), эндонуклеаза для использования в способе должна быть выбрана таким образом, чтобы она отщепляла цепь по рибонуклеотидному сайту праймера. Предпочтительно цепь отщепляют по 3'-сайту рибонуклеотида. Необходимо выбрать ДНКполимеразу так, чтобы она с подходящей скоростью диссоциировала цепь ДНК, в которую был внесн ник. ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении, должна синтезировать достроенную цепь от сайта ника в направлении 3',тем самым вытесняя ранее достроенную цепь ДНК. Важно, чтобы ДНК-полимераза не проявляла экзонуклеазной активности 5'3', которая могла бы разрушить вытесненную цепь. Например, фрагмент Клнова, который представляет собой дефицитный по экзонуклеазной активности вариант ДНК-полимеразы I E.coli, сходный фрагмент, происходящий от ДНК-полимеразыBst (New England Biolabs), и ДНК-полимераза Вса BEST от В.са (Takara Shuzo) применимы в качестве такой ДНК-полимеразы. Также могут быть использованы Sequenase 1.0 и Sequenase 2.0 (United States Biochemical), a также ДНКполимераза фага Т 5 и ДНК-полимераза фага 29 в соответствии с описанным в Gene, 97, 1319 (1991). Полимераза, которая в норме обладает экзонуклеазной активностью, может быть использована в способе синтеза ДНК по настоящему изобретению, если включение подходящего ингибитора сможет подавить такую активность. Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть осуществлн при различной температуре или он может быть осуществлн в изотермических условиях. Варьирование температур означает, что температура реакции изменяется на соответствующих стадиях таким образом, что такое изменение не препятствует реак 37 циям на этих стадиях. В частности, варьирующиеся температуры указывают на изменение до такой температуры, которая подходит, например, для каждого этапа отжига праймера, реакции синтеза комплементарной цепи, внесения ника в комплементарную цепь и реакции вытеснения цепи. С другой стороны, изотермия означает, что температура реакции на каждой из стадий остатся неизменной, и каждую стадию осуществляют, по существу, при постоянной температуре. В обоих случаях естествен выбор такой температуры, которая является оптимальной для условий проведения реакции. Одним из свойств способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению является то, что способ не требует повышающей и понижающей корректировки температуры в ходе синтеза нуклеиновой кислоты. Следовательно, настоящее изобретение представляет способ изотермического синтеза нуклеотидной последовательности. Многие из стандартных способов амплификации нуклеиновых кислот требуют повышающей и понижающей корректировки температуры с целью диссоциации мишени от синтезированной цепи. В этих способах для решения такой задачи необходимо специальное оборудование, такое как амплификатор (термоячейка). Однако способ по настоящему изобретению может быть осуществлн с использованием только такого оборудования, которое поддерживает постоянную температуру. Как было описано выше, способ по настоящему изобретению может быть осуществлн при одной и той же температуре. Предпочтительно его осуществляют путм выбора температуры реакции и степени жсткости таким образом, чтобы неспецифический отжиг праймера был снижен, и таким образом, чтобы праймер специфически соединялся с нуклеотидной последовательностью, служащей матрицей. Хотя это и не призвано в чм-либо ограничить настоящее изобретение, способ по настоящему изобретению может быть осуществлн при условиях высокой температуры с использованием термоустойчивого фермента в соответствии с описанным выше. Кроме того, предпочтительно осуществлять способ по настоящему изобретению при температуре, подходящей для сохранения достаточной активности используемого фермента с целью поддержания эффективности реакции на высоком уровне. Так, температура реакции предпочтительно составляет примерно от 20 до примерно 80 С, более предпочтительно от примерно 30 до примерно 75 С, наиболее предпочтительно от примерно 50 до примерно 70 С,хотя это варьируется в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию осуществляют при условиях высокой температуры, в частности, предпочтительно использовать более 38 длинный праймер, чем тот, который используется в реакции при нормальной температуре. Последовательность и длина праймера, подходящие для температуры реакции, можно определить, например, с учтом величины Тm. Как альтернатива, для конструирования праймера можно использовать имеющиеся в продаже программные продукты, такие как программаOLIGO Primer Analysis (Takara Shuzo). Например, когда используют температуру реакции от 55 до 60 или 65 С, то праймер, используемый в способе по настоящему изобретению, может,например, иметь без какого-либо ограничения длину 12-100 нуклеотидов, предпочтительно 1450 нуклеотидов в длину, более предпочтительно 15-40 нуклеотидов в длину. Примером эффекта,обусловливаемого повышением температуры реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры у ДНК, служащей матрицей. Повышенная температура реакции обеспечивает амплификацию желательной нуклеиновой кислоты, даже если в качестве матрицы используется нуклеиновая кислота с высоким содержанием пары GC. Более того, это в одинаковой степени эффективно при амплификации длинноцепочечного участка. Такой эффект наблюдается в диапазоне от примерно 100 п.н. до примерно 20 т.п.н., в частности от примерно 200 п.н. до примерно 4,3 т.п.н., более конкретно от примерно 250 п.н. до примерно 1500 п.н. Использование ДНК-полимеразы, обладающей обратно-транскриптазной активностью(например, ДНК-полимеразы Вса BEST), в способе по настоящему изобретению делает осуществимой стандартным образом амплификацию нуклеотидной последовательности на материале РНК, которая включает стадию получения кДНК на матрице РНК (в реакции обратной транскрипции). Как альтернатива, продукт, полученный на независимо проведнной стадии получения кДНК на матрице РНК, т.е. кДНК,может быть использован в способе по настоящему изобретению в качестве ДНК, служащей матрицей. В каждом случае реакцию в способе по настоящему изобретению повторяют до тех пор,как е останавливают подходящим путм, например, с помощью инактивации фермента или снижения температуры реакции, или до тех пор,как в реакции не закончится один из реагентов. На фиг. 1 показан один вариант, в котором используют одноцепочечную ДНК в качестве матрицы и два праймера. Соответствующие стадии, которые проводят последовательно, описаны далее:(1) стадия отжига одноцепочечной ДНК,служащей матрицей, на химерный олигонуклеотидный праймер;(2) стадия осуществления реакции достройки ДНК от 3'-конца праймера с образованием достроенной с праймера цепи;(3) стадия отщепления эндонуклеазой по сайту праймера, который включает рибонуклеотид;(4) стадия осуществления вытеснения цепи с использованием ДНК-полимеразы от сайта отщепления стадии (3);(5) стадия повторного использования двухцепочечной ДНК, которая составлена матрицей, полученной на стадии (4), и регенерированной достроенной с праймера цепью стадии(3), с последующим использованием высвобожденной вытесненной цепи в реакции на стадии(6) стадия отжига олигонуклеотидного праймера, который отличается от праймера стадии (1), на высвобожденную вытесненную цепь стадии (5), служащую матрицей;(7) стадия осуществления реакции достройки ДНК от 3'-конца праймера с образованием достроенной с праймера цепи;(8) стадия отщепления эндонуклеазой по сайту праймера, который включает рибонуклеотид;(9) стадия осуществления вытеснения цепи с использованием ДНК-полимеразы от сайта отщепления стадии (8); и(10) стадия повторного использования матрицы, полученной на стадии (9), и регенерированной достроенной с праймера цепи стадии(8). В случае, когда в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК, каждая из одноцепочечных ДНК, полученных после денатурации двухцепочечной ДНК, служит матрицей для стадии (1). Следовательно, количество продукта амплификации больше, чем то количество, которое получают при использовании в качестве матрицы одноцепочечной ДНК. Кроме того, выявление продукта амплификации может быть осуществлено за более короткое время по сравнению с тем временем, которое требуется при использовании в качестве матрицы одноцепочечной ДНК. Способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть использован в различных экспериментальных процедурах, в которых используется амплификация нуклеотидной последовательности, включая выявление, мечение и секвенирование нуклеиновых кислот. Более того, способ амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть использован в способе амплификации нуклеиновой кислоты in situ, в способе амплификации нуклеиновой кислоты на тврдом субстрате, таком как ДНК-чип, или в способе множественной амплификации нуклеиновых кислот, в котором одновременно амплифицируется значительное число сегментов. Одним из свойств способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению является способность полу 004327 40 чать в нм одноцепочечную ДНК. Для данной цели в способе можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера. Например, если используются два олигонуклеотидных праймера, то способ по настоящему изобретению может быть осуществлн с применением отношения праймеров в соответствии с использованием т.н. способа асимметричной ПЦР, в котором реакцию амплификации проводят с использованием избыточного количества одного олигонуклеотидного праймера по отношению ко второму. В результате количество продукта, вытесненного с одной цепи, становится выше по сравнению с продуктом другой цепи. В соответствии со способом амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению может быть получена одноцепочечная ДНК, по существу свободная от цепи, которая ей комплементарна. Например,одноцепочечная ДНК для получения продукта,имеющего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, такого как ДНК-чип, одноцепочечный ДНК-зонд для выявления нуклеиновой кислотымишени или мегапраймер для метода ПЦР длинных цепей могут быть легко получены за короткое время. Избирательным образом только смысловая последовательность или антисмысловая последовательность могут быть амплифицированы с использованием способа по настоящему изобретению. Следовательно, настоящее изобретение применимо в качестве способа получения нуклеиновой кислоты,имеющей смысловую последовательность или антисмысловую последовательность. Более того, способы амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению не требуют использования оборудования для реакции, которое может корректировать температуру в зависимости от времени. Следовательно, реакцию амплификации можно проводить в большом объме реакционной смеси. Это значит, что нуклеиновая кислота (например, для медицинского применения) может быть получена в больших количествах на промышленном уровне. Эффективность использования праймера,используемого в способе амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, составляет примерно 100%, что может быть в 5-10 раз выше, чем в стандартном способе, таком как метод ПЦР.(6) Набор для способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Настоящее изобретение представляет набор, используемый в способе амплификации нуклеотидной последовательности по первомушестому аспектам, описанным выше. В одном варианте набор представлен в упакованной форме и содержит инструкции, касающиеся использования ДНК-полимеразы и эндонуклеазы в 41 реакции вытеснения цепи. Также набор, который содержит ДНК-полимеразу, обладающую активностью по вытеснению цепи, эндонуклеазу и буфер для реакции вытеснения цепи, предпочтительно используют в способе по настоящему изобретению. Как альтернатива, имеющаяся в продаже ДНК-полимераза, обладающая активностью по вытеснению цепи, и/или эндонуклеаза могут быть выбраны и использованы в соответствии с инструкциями. Кроме того, набор может содержать реагент для реакции обратной транскрипции, который используют тогда, когда роль матрицы выполняет РНК. ДНК-полимераза может быть выбрана из ДНК-полимераз, предназначенных для использования в настоящем изобретении в соответствии с описанным выше в (3). Эндонуклеаза может быть выбрана из эндонуклеаз в соответствии с описанным выше в(2). Буфер реакции, характеризующийся композицией, описанной выше в (4), может предпочтительно быть использован в качестве буфера для реакции вытеснения цепи. Инструкциями является печатный материал, описывающий способ использования набора, например, способ приготовления раствора реагента для реакции вытеснения цепи, рекомендуемые условия реакции и подобное. Инструкции включают руководство в форме брошюры или листовки, этикетку к набору и описание на поверхности упаковки, в которой находится набор. Инструкции также включают информацию, предоставляемую электронными средствами связи, такими как Интернет.(7) Способ выявления нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению и набор для этого способа. Нуклеиновая кислота-мишень в образце может быть выявлена с использованием способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Способ выявления включает(a) амплификацию нуклеиновой кислотымишени с помощью способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в соответствии с описанным выше; и(b) выявление нуклеиновой кислотымишени, амплифицированной на предыдущей стадии. Способ может быть использован для выявления или количественной оценки конкретного гена в образце. Другими словами, конкретный ген может быть выявлен или количественно оценен во всех образцах, в которых предполагается присутствие нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. Примерами образцов, в которых конкретный ген может быть выявлен или количественно оценен, являются, тем самым не ограничиваясь, образцы из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитарная плнка, моча, фекалии, спинномозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (напри 004327 42 мер, раковая ткань или лимфатический узел) и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, которые содержат нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия,грибок, дрожжи, растение и животное, образцы,которые, как предполагается, загрязнены или инфицированы микроорганизмом, таким как вирус или бактерия (например, пища или биологический препарат), и образцы, которые могут содержать организм, такие как почва или сточные воды. Например, вироид, вирус, грибок,бактерия или другой микроорганизм в образце могут быть выявлены или количественно оценены на основании присутствия или содержания конкретного гена, являющегося мишенью, происходящего от вироида, вируса, грибка, бактерии или других микроорганизмов. Более того,способ по настоящему изобретению может быть использован для определения генотипа организма или для определения уровня экспрессии гена. Предпочтительно в способе выявления и РНК, и ДНК могут быть использованы в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. Известные способы выявления нуклеиновой кислоты могут быть использованы на стадии (b). Примерами таких способов являются выявление продукта реакции, имеющего конкретный размер, с помощью электрофореза и выявление с помощью гибридизации с зондом. Флуоресцентное вещество, такое как бромистый этидий, используют для выявления с помощью электрофореза. Гибридизация с зондом может быть объединена с электрофоретическим выявлением. Зонд может быть помечен радиоактивным изотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование помеченного нуклеотида на стадии (а) может облегчить выявление продукта амплификации. Для выявления можно использовать метод флуоресцентной поляризации, метод переноса энергии флуоресценции или подобное. Нуклеиновая кислота-мишень может быть выявлена автоматически или количественно оценена с помощью создания подходящей системы выявления. Рибонуклеотидный (РНК) зонд, помеченный двумя или несколькими флуоресцирующими веществами, расположенными на расстоянии, обеспечивающем эффект гашения флуоресценции, могут быть использованы в способе выявления по настоящему изобретению. Зонд не флуоресцирует. Когда проводят его отжиг на ДНК, амплифицированную с нуклеиновой кислоты-мишени, которая комплементарна зонду,РНКаза-Н расщепляет зонд. В результате расстояние между флуоресцирующими веществами в зонде увеличивается, что приводит к флуоресценции. Следовательно, флуоресценция указывает на присутствие нуклеиновой кислотымишени. Если РНКаза-Н используется в способе амплификации нуклеотидной последовательно 43 сти по настоящему изобретению, то нуклеиновая кислота-мишень может быть выявлена только при добавлении зонда в реакционную смесь. Например, сочетание флуоресцентных веществ 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) и N,N,N',N'тетраметил-6-карбоксиродамина (TAMRA) может быть предпочтительно использовано для мечения зонда. Способ амплификации нуклеотидной последовательности в изотермических условиях по настоящему изобретению не требует использования такого оборудования как амплификатор. Число праймеров, используемых в способе амплификации по настоящему изобретению,может составлять один или два, что меньше того, что используется в стандартном способе. Поскольку такие реагенты, как dNTPs, используемые в ПЦР и подобных методах, могут быть использованы в способе по настоящему изобретению, то расходы могут быть снижены по сравнению со стандартным способом. Следовательно, способ по настоящему изобретению предпочтительно может быть использован в области, включающей генетическое тестирование, в котором проводят рутинное выявление. Способ по настоящему изобретению предоставляет большее количество амплифицированного продукта за более короткое время по сравнению с методом ПЦР. Следовательно, способ по настоящему изобретению может быть использован в качестве удобного, быстрого и чувствительного способа выявления гена. Далее настоящее изобретение представляет набор, используемый в способе выявления нуклеиновой кислоты-мишени. Набор для способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в соответствии с описанным выше может быть использован в качестве указанного набора. Набор может дополнительно содержать олигонуклеотидный праймер для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и реагент для выявления амплифицированной нуклеиновой кислотымишени, являющейся зондом.(8) Продукт по настоящему изобретению,имеющий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, размещнную в заданном участке, и способ его получения. ДНК-чип (также называемый микроматрицей ДНК или матрицей ДНК) является продуктом, несущим иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором различные фрагменты генов или ДНК размещены и иммобилизованы в заданном участке или в заранее определнных положениях на тврдом субстрате, таком как предметное стекло. ДНК-чип используют для анализа присутствия нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновых кислот, характеризущейся последовательностью, которая комплементарна размещнной и иммобилизованной ДНК на заданном участке ДНК-чипа. Анализ проводят путм контактирования ДНК-чипа с образцом 44 нуклеиновых кислот, приготовленным для гибридизации на материале образца, предпочтительно образца помеченных нуклеиновых кислот. Поскольку ДНК-чип может быть использован для выявления или количественного анализа ряда нуклеиновых кислот в образце в одной процедуре, то он является весьма эффективным средством, которое в значительной степени ускоряет анализ экспрессии генов или анализ мутаций или полиморфизма. ДНК-чип, на котором в заданном участке размещена и иммобилизована двухцепочечная ДНК, используют для гибридизации после того, как его подвергают соответствующей денатурации. ДНК-чип, на котором в заданном участке размещена и иммобилизована одноцепочечная ДНК, комплементарная нуклеиновой кислоте-мишени, которую предстоит выявить, является конкретно предпочтительным для выявления нуклеиновой кислоты-мишени. Как было описано выше, желательная ДНК может быть амплифицирована в одноцепочечной форме с помощью способа по настоящему изобретению. Хотя может быть использован любой способ очистки продукта амплификации,предпочтительной является очистка с помощью преципитации изопропанолом. Полученную таким путм ДНК, предпочтительно одноцепочечную ДНК, которая, по существу, свободна от комплементарной ей цепи, предпочтительно можно использовать в качестве ДНК-фрагмента,который необходимо иммобилизовать на ДНКчип. Таким образом, способ по настоящему изобретению предпочтительно используется в качестве способа получения ДНК, предназначенной для размещения и иммобилизации в заданном участке с целью конструирования ДНКчипа. Любой нерастворимый субстрат можно использовать в качестве субстрата, на котором полученную таким путм ДНК размещают и иммобилизуют в заданном участке, но предпочтительно используют имеющий плоскую поверхность субстрат, изготовленный из стекла или пластмассы, и субстрат в форме мембраны,изготовленный из нитроцеллюлозы или нейлона. Известный способ иммобилизации нуклеиновых кислот можно использовать для иммобилизации. ДНК может быть иммобилизована на субстрат так, как она есть. Как альтернатива,ДНК может быть иммобилизована с помощью подходящего линкера или после лигирования нескольких молекул ДНК. Нуклеиновая кислота-мишень, которая гибридизует с нуклеиновой кислотой на продукте, имеющим иммобилизованную нуклеиновую кислоту, на котором ДНК, амплифицированная с помощью способа по настоящему изобретению, размещена и иммобилизована в заданном участке (например, ДНК-чип), может быть выявлена или оценена количественно. Такие выявление или количественная оценка могут быть осуществлены путм контактирования 45 с целью гибридизации продукта с образцом нуклеиновых кислот, приготовленным на материале образца, для которого предполагается присутствие нуклеиновой кислоты. В связи с этим ДНК-чип, на котором одноцепочечная ДНК, амплифицированная с помощью способа по настоящему изобретению, размещена и иммобилизована в заданном участке, обеспечивает выявление нуклеиновой кислоты-мишени с большим удобством процедуры, более высокой чувствительностью и более высокой воспроизводимостью данных по сравнению со стандартным продуктом.(9) Способ получения нуклеиновой кислоты в больших количествах по настоящему изобретению. В соответствии с описанным выше один из аспектов настоящего изобретения представляет способ амплификации нуклеотидной последовательности, который может быть осуществлн в изотермических условиях. Желательная нуклеиновая кислота может быть получена с помощью данного способа путм смешивания нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей для нуклеиновой кислоты, которая должна быть амплифицирована, с различными компонентами,необходимыми для реакции, и проведения реакции в смеси при изотермических условиях. Поскольку метод ПЦР требует изменения температуры реакционной смеси в зависимости от времени, то объм реакции ограничен таким объмом, в котором можно контролировать температуру (обычно 200 мкл или меньше). Следовательно, трудно промасштабировать объм в сторону увеличения. С другой стороны, такого ограничения не существует в способе по настоящему изобретению. Большое количество нуклеиновой кислоты может быть получено путм увеличения объма реакционной смеси. В способе по настоящему изобретению ряд молекул комплементарной цепи синтезируют с одной молекулы-матрицы. Более того, нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием таких молекул комплементарных цепей,взятых в качестве матриц. Следовательно, желательная нуклеиновая кислота может быть эффективно выработана в больших количествах путм соответствующего подбора матрицы и праймера. Помимо того, тот факт, что, в отличие от метода ПЦР, способ по настоящему изобретению не требует специального оборудования или сложного цикла изменений температуры, делает такой способ преимущественным с точки зрения стоимости оборудования и затрат энергии. Следовательно, способ является прекрасным промышленным способом получения нуклеиновой кислоты в больших количествах. Более того, способ по настоящему изобретению применим в качестве способа предоставления ряда ДНК-фрагментов в больших количествах, таких как количества, необходимые для иммобилизации на ДНК-чип. В частности, 004327 46 фрагменты ДНК могут быть получены в больших количествах в простых стадиях реакций одного варианта. В другом варианте ограниченное число праймеров может быть использовано для получения ряда фрагментов ДНК. Стадия предварительной амплификации нуклеиновой кислоты, которая служит матрицей в способе по настоящему изобретению, с помощью известного способа амплификации нуклеиновых кислот,такого как метод ПЦР, может быть включена в последний вариант. Все типы нуклеиновых кислот, являющихся матрицами, могут быть амплифицированы с использованием ограниченного числа праймеров, например, основываясь на способе амплификации нуклеиновых кислоты с использованием случайного праймера,включающего последовательность-метку (Nucleic Acids Research, 1996, 24 (19), 3778-3783),или на способе олигонуклеотид-праймируемой ПЦР (DOP-ПЦР: Genomics, 1992, 13, 718-725), в котором используют вырожденный праймер. Способ амплификации по настоящему изобретению может быть осуществлн с использованием одного или нескольких праймеров для всех нуклеиновых кислот, служащих матрицами, полученных на упомянутой выше стадии. Это можно осуществить путм конструирования праймера, используемого в способе по настоящему изобретению, таким образом, чтобы он соответствовал последовательности-метке, добавляемой к случайному или вырожденному праймеру. Следовательно, сочетание подходящей стадии получения нуклеиновой кислоты,являющейся матрицей, и способа по настоящему изобретению может предоставить ряд фрагментов ДНК в больших количествах при меньшей стоимости по сравнению со стандартным способом. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, может содержать двухцепочечную ДНК для экспрессии полезного полипептида в клетке или одноцепочечную антисмысловую ДНК для подавления экспрессии интересующего гена. Такую нуклеиновую кислоту вводят в организм с использованием подходящего средства, например, носителя для переноса гена, такого как липосома. Способ получения нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению является предпочтительным для получения в больших количествах одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, предназначенной для медицинского применения. Кроме того, нуклеиновая кислота,включающая аналог dNTP, который, например,подавляет разрушение нуклеиновой кислоты invivo, может быть легко получена с помощью способа по настоящему изобретению. Поскольку ДНК-фрагмент, амплифицированный в настоящем изобретении, составлен нормальными нуклеотидами, то амплифицированная ДНК может быть субклонирована в состав подходящего вектора с использованием 47 рестрикционного сайта в составе ДНК. Более того, ДНК без каких-либо проблем может быть обработана рестриктазой, например, с целью выявления ПДРФ. Следовательно, ДНК может быть широко использована в области генетического тестирования. Поскольку фрагмент ДНК,амплифицированный в настоящем изобретении,составлен нормальными нуклеотидами, то промоторная последовательность для РНКполимеразы может быть встроена в состав амплифицированного фрагмента. Амплифицированный фрагмент может быть использован в качестве матрицы для синтеза РНК, которую можно использовать в качестве, например, зонда. Понятно, что флуоресцентным образом помеченный ДНК-зонд может быть получен путм осуществления способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с использованием флуоресцентно помеченного dNTP вместо нормального dNTP. Поскольку фрагмент, в конечном счте амплифицированный в способе по настоящему изобретению, не имеет нуклеотидной последовательности, комплементарной амплификационному праймеру по обоим его концам, то может быть снижено загрязнение из-за переноса амплификационного продукта. Следовательно,способ по настоящему изобретению применим в генетическом тестировании и подобном, где такой же участок амплифицируется стандартным образом. Свойства способа амплификации нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению перечислены ниже. 1. Он способен амплифицировать большое количество нуклеиновой кислоты из малого количества матрицы. При использовании двух праймеров количество амплифицированного продукта возрастает в квадратичной зависимости. 2. Он может быть проведн в изотермических условиях. В этом случае для него не требуется использование такого оборудования, как амплификатор. Следовательно, объм реакции может быть легко промасштабирован в сторону увеличения. 3. Обычно реакцию амплификации осуществляют с использованием одного или двух химерных олигонуклеотидных праймеров и двух ферментов (ДНК-полимеразы и эндонуклеазы). 4. Поскольку несколько цепей ДНК синтезируется с одной молекулы праймера, то количество праймера не ограничивает количество амплификационного продукта. Более того, эффективность использования праймера равна примерно 100%, что намного выше, чем в методе ПЦР. 5. Исходя из конкретной цели, избирательным образом может быть амплифицирована одноцепочечная или двухцепочечная ДНК. 6. Поскольку нет необходимости в использовании аналога dNTP, такого как (-S)-dNTP, 004327 48 для реакции амплификации, то стоимость реагентов низка. Более того, может быть получена нуклеиновая кислота в нативной форме, т.е. без аналога dNTP в составе. 7. Он может предоставить амплифицированный фрагмент ДНК при низкой себестоимости и в больших количествах путм сочетания способа по настоящему изобретению с другим способом амплификации нуклеиновых кислот. Как было описано выше, способ по настоящему изобретению пригоден для получения нуклеиновой кислоты в промышленном масштабе. Примеры Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение более подробно, но не призваны ограничить его объем. Референсный пример. Величина единицы активности РНКазы-Н,использованной в способе по настоящему изобретению, была определена в соответствии со следующим способом.(1) Приготовление использованных растворов реагентов. Реакционная смесь для определения активности. Следующие вещества при указанных конечных концентрациях содержались в стерильной воде: 40 мМ Трис-гидрохлорида(рН=7,7 при 37 С), 4 мМ хлорида магния, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), 0,003% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 4% глицерина и 24 мкМ поли-dT. Раствор поли[8-3 Н]адениловой кислоты: раствор 370 кБк поли[8-3 Н]адениловой кислоты растворяли в 200 мкл стерильной воды. Раствор полиадениловой кислоты: полиадениловую кислоту растворяли до концентрации 3 мМ в стерильной сверхчистой воде. Раствор разведения фермента. Следующие вещества при указанных конечных концентрациях содержались в стерильной воде: 25 мМ Трис-гидрохлорида (рН=7,5 при 37 С), 5 мМ 2 меркаптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА (рН=7,5 при 37 С), 30 мМ хлорида натрия и 50% глицерина. Приготовление денатурированной нагреванием ДНК вилочковой железы телнка: 200 мг ДНК вилочковой железы телнка суспендировали и переливали в 100 мл буфера ТЕ. Раствор разбавляли до концентрации 1 мг/мл стерильной сверхчистой водой, исходя из уровня поглощения, измеренного в УФ при 260 нм. Разведнный раствор нагревали до 100 С на 10 мин и затем быстро охлаждали на ледяной бане.(2) Способ измерения активности. 7 мкл раствора поли[8-3 Н]адениловой кислоты добавляли к 985 мкл реакционной смеси для определения активности, приготовленной в(1) выше. Смесь инкубировали при 37 С в течение 10 мин. 8 мкл полиадениловой кислоты добавляли к смеси до достижения конечной концентрации 24 мкМ. Далее смесь инкубировали при 37 С в течение 5 мин. В результате было 49 получено 1000 мкл реакционной смеси поли[83 Н]rА-поли-dТ. Затем 200 мкл реакционной смеси инкубировали при 30 С в течение 5 мин. К полученному добавляли 1 мкл соответствующего серийного разведения фермента. В течение времени по 50 мкл каждого из образцов отбирали из реакционной смеси для использования в последующем измерении. Время в минутах после добавления фермента к образцу определяли как Y. 50 мкл реакционной смеси для общей величины СРМ или для пустого контроля приготавливали добавлением 1 мкл раствора разведнного фермента вместо раствора фермента. К образцу добавляли 100 мкл 100 мМ пирофосфата натрия, 50 мкл раствора денатурированной нагреванием ДНК вилочковой железы телнка и 300 мкл 10%-ной трихлоруксусной кислоты (300 мкл сверхчистой воды для измерения общего СРМ). Смесь инкубировали в течение 5 мин при 0 С и затем центрифугировали при 10000 об./мин в течение 10 мин. После центрифугирования 250 мкл полученной в результате надосадочной фракции помещали в мкость. К этому добавляли 10 мл Aquasol-2 (NENLife Science Products). СРМ (имп/мин) определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счтчика.(3) Подсчт единиц. Величину единиц активности для каждого фермента подсчитывали в соответствии со следующим уравнением: Ед./мл = (измеренный СРМ - контрольный СРМ)1,2201000 уровень разведения 200(1) Синтез ДНК-матрицы и праймеров. Одноцепочечная ДНК из 99 нуклеотидов,являющаяся матрицей, и праймеры, используемые в данном примере, были синтезированы с использованием ДНК-синтезатора (Applied Biosystems). Нуклеотидная последовательность одноцепочечной ДНК из 99 нуклеотидов показана в SEQ ID NO 1 списка последовательностей. Основные нуклеотидные последовательности прямого праймера и обратного праймера показаны в SEQ ID NO 2 и 3 списка последовательностей соответственно. Структура праймеров, использованных в данном примере, описана далее подробно. Пара праймеров 1: комбинация праймеров,характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQ ID NO 2 или 3 списка последовательностей, и полностью состоящих из дезоксирибонуклеотидов; 50 пара праймеров 2: комбинация праймеров,в которых первый и второй дезоксрибонуклеотиды с 3'-конца заменены рибонуклеотидами, а фосфатная связь со стороны 5'-конца второго с 3'-конца рибонуклеотида заменена на фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1; пара праймеров 3: комбинация праймеров,в которой дезоксирибонуклеотид на 3'-конце заменн рибонуклеотидом, а фосфатная связь со стороны 5'-конца рибонуклеотида заменена фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1; пара праймеров 4: комбинация праймеров,в которых первый и второй дезоксирибонуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды в каждом из праймеров в паре праймеров 1; и пара праймеров 5: комбинация праймеров,в которых третий и четвртый дезоксирибонуклеотиды от 3'-конца заменены на рибонуклеотиды, а фосфатная связь со стороны 5'-конца четвртого рибонуклеотида 3'-конца заменена на фосфотиоатную связь в каждом из праймеров в составе пары праймеров 1.(2) Реакция амплификации. ДНК-полимеразу Вса BEST (Takara Shuzo),которая является ДНК-полимеразой, не имеющей экзонуклеазной 5'3'-активности, от Bacillus caldotenax, и клонированную рибонуклеазу-Н (Takara Shuzo), которая является РНКазойН E.coli, использовали для анализа реакционных систем в моделях 1-7, описанных далее. Реакционную смесь приготавливали следующим образом. 35 мМ Трис-гидрохлоридного буфера(рН=7,5), 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2,7% глицерина, 5% диметилсульфоксида, по 1,4 мМ каждого из dNTPs, 10 мМ хлорида магния, 20 пкмоль одного или обоих праймеров из одной из пар праймеров в соответствии с описанным выше в (1), 0,6 нг синтетической одноцепочечной ДНК, служащей матрицей, 5 ед. ДНК-полимеразы Вса BEST и 60 ед. клонированной рибонуклеазы-Н при конечном объме 50 мкл. Реакционную смесь смешивали до гомогенного состояния, инкубировали при 55 С в течение 60 мин и затем нагревали до 90 С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле NuSieve 3:1(Takara Shuzo). Праймеры, использованные в соответствующих моделях, описаны далее. Модели 1-5: использовали одну из пар праймеров 1-5; модель 6: использовали только обратный праймер из пары праймеров 2; и модель 7: пару праймеров 4 использовали без добавления РНКазы-Н. В результате амплифицированные фрагменты, характеризующиеся размером в интересующем диапазоне от примерно 40 пар нуклеотидов (п.н.) до примерно 90 п.н., были получены 51 тогда, когда использовали реакционную смесь моделей 2-5: это указывает на то, что при использовании этих схем реакции ДНК были амплифицированы. Амплифицированный фрагмент, который характеризовался ожидаемой длиной примерно 70 нуклеотидов (н.) (фрагмент одноцепочечной ДНК), был получен в модели 6,в которой использовали только один из двух праймеров. Не происходило амплификации ДНК при проведении реакций в моделях 1 или 7.(3) Подтверждение продуктов амплификации. Реакционную смесь, полученную с помощью реакции в модели 4 в соответствии с описанным в (2), отфильтровывали с использованием Microcon-100 (Takara Shuzo) с выделением амплифицированного фрагмента ДНК, улавливаемого фильтром. Нуклеотидную последовательность данного фрагмента ДНК определяли с помощью метода (дизокси) Сэйнджера. В результате для фрагмента, амплифицированного с помощью указанной выше реакции, было подтверждено наличие ДНК, характеризующейся той же нуклеотидной последовательностью, как в ДНК, служащей матрицей.(4) Анализ времени реакции. Реакционную смесь модели 2 в соответствии с описанным выше в (2) приготавливали с целью анализа изменения количества амплифицированного продукта в случае, когда взаимодействие происходило в течение разного времени. Реакционную смесь инкубировали в течение 0, 15, 30, 60, 90 или 120 мин при 55 С. Затем смесь нагревали до 90 С в течение 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси анализировали методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле NuSieve 3:1. Результаты электрофореза показаны на фиг 2. Числа от 1 до 6 на фигуре представляют дорожки, которые соответствуют взаимодействию в реакционной смеси в течение 0, 15, 30, 60, 90 или 120 мин соответственно. М обозначает дорожку, на которую внесн ступенчатый маркр молекулярной массы ДНК 100 п.н. (Takara Shuzo). Как показано на фиг. 2, при времени реакции в 0 мин продукт амплификации не выявляется. Было подтверждено, что количество продукта амплификации увеличивалось со временем реакции, которое возрастало от 15 до 30 или 60 мин. Однако количество продукта амплификации по данным электрофореза было практически неизменным при времени реакции 60 мин или больше: это указывает на то, что амплификация в использованной системе реакции примерно за 60 мин выходит на плато-фазу. Пример 2.(1) Приготовление РНК. РНК, использованная в качестве матрицы в данном примере, была приготовлена из культивируемых клеток НТ 29 человека (АТСС НТВ 38) (Dainippon Pharmaceutical) с использованием 52 реагента TRIzol (Life Technologies). Концентрацию полученного в результате тотального пула РНК доводили до 1 мкг/мкл. ВеличинаOD260/OD280 составила 1,8: это указывает на спектрофотометрическую чистоту РНК.(2) Реакция амплификации. ДНК-полимеразу Вса BEST, которая обладает активностью обратной транскриптазы и активностью ДНК-полимеразы, а также эндонуклеазу РНКазу-Н использовали для определения того, амплифицировалась ли кДНК на матрице РНК. Реакционную смесь, состав которой был описан в примере 2, приготавливали добавлением 1 мкг упомянутой выше тотальной РНК. Сегмент-мишень, кодирующий рецептор трансферрина человека (GenBank: депозитарныйХ 01060), амплифицировали с использованием в качестве праймеров пары праймеров 2 из примера 1. Реакционную смесь инкубировали при 55 С в течение 60 мин и затем нагревали до 90 С на 2 мин с целью инактивации ферментов. Когда 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном гелеNuSieve 3:1, был получен амплифицированный фрагмент, характеризующийся ожидаемым размером 56 п.н. Более того, Саузерн-блотгибридизацию проводили с использованием зонда, соответствующего мишени нуклеотидной последовательности. ДНК-зонд, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную вSEQ ID NO 4 списка последовательностей, помеченный биотином по 5'-концу, использовали для проведения гибридизации по Саузерну. В результате этот зонд гибридизовал с упомянутым выше амплифицированным фрагментом: это подтверждает, что участок-мишень был безошибочно амплифицирован с помощью способа по настоящему изобретению. Пример 3.(1) Синтез праймеров. Способ амплификации по настоящему изобретению был протестирован с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК. Использованные праймеры были синтезированы на ДНК-синтезаторе (Applied Biosystems). Основные нуклеотидные последовательности праймеров показаны в SEQ ID NO 5-13 списка последовательностей. Структура праймеров,использованных в данном примере, подробно описана далее. ДНК плазмиды pUC19 (TakaraShuzo) использовали в качестве матрицы для пар праймеров A-F. Нуклеотидная последовательность pUC19 доступна из базы данных(GenBank: депозитарныйL09137). Амплифицированный фрагмент двухцепочечной ДНК использовали в качестве матрицы для пары праймеров G. Фрагмент был сформирован на материале тотального пула РНК человека, полученного в примере 2, с использованием праймеров, имеющих последовательность, показаннуюKit (AMV), vers. 2.1 (Takara Shuzo) в соответствии с прилагающейся стандартной прописью. Пара праймеров А (длина амплифицированного фрагмента примерно 450 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQID NO 5 или 6 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Пара праймеров В (длина амплифицированного фрагмента примерно 250 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQID NO 5 или 7 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Пара праймеров С (длина амплифицированного фрагмента примерно 520 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQID NO 5 или 8 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Пара праймеров D (длина амплифицированного фрагмента примерно 890 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQID NO 5 или 9 списка последовательностей, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Пара праймеров Е (длина амплифицированного фрагмента примерно 130 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQID NO 10 или 6 списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с 3 'конца заменены на рибонуклеотиды. Пара праймеров F (длина амплифицированного фрагмента примерно 220 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQID NO 11 или 6 списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с 3'конца заменены на рибонуклеотиды. Пара праймеров G (длина амплифицированного фрагмента примерно 320 п.н.): комбинация праймеров, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQID NO 12 или 13 списка последовательностей, в которых нуклеотиды с первого по третий с 3'конца заменены на рибонуклеотиды.(2) Реакция амплификации. Реакционную смесь приготавливали следующим образом. 35 мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,5),0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина(БСА), 5% диметилсульфоксида, по 1,4 мМ каждого из dNTPs, 10 мМ хлорида магния, 60 пкмоль каждого праймера из одной из пар праймеров в соответствии с описанным выше в(1), 100 нг ДНК pUC19, являющейся матрицей,5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса BEST и 60 ед. РНКазы-Н до конечного объма реакции 50 мкл. Условия реакции были следующими. Реакционную смесь без ДНК-полимеразы или РНКазы-Н денатурировали нагреванием до 98 С на 1 мин и затем охлаждали до 55 С. Затем добавляли ДНК-полимеразу и РНКазу-Н, и полученную смесь инкубировали при 55 С в течение 60 мин. По завершении реакции смесь нагревали до 90 С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси затем подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном гелеNuSieve 3:1. В результате было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент образовывался с использованием любой из пар праймеров. Таким образом, было подтверждено,что двухцепочечную ДНК можно использовать в качестве матрицы для осуществления реакции амплификации в способе амплификации по настоящему изобретению.(3) Отщепление продукта амплификации рестриктазой. Было проанализировано рестрикционное отщепление амплифицированного фрагмента,полученного с использованием способа амплификации по настоящему изобретению. В качестве ДНК-матрицы использовали ДНК плазмидыpUC19. Использовали прямой праймер pUC19NN в соответствии с показанным в SEQ ID NO 5 и 6 списка последовательностей, соответственно. В этих праймерах первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Состав реакционной смеси был следующим. Реакционная смесь А: 35 мМ калийфосфатного буфера (рН=7,5), 10 мМ хлорида магния, по 1,4 мМ каждого dNTPs, 0,01% БСА,5% ДМСО, 2,7% глицерина, по 100 пкмоль каждого из праймеров pUC19 upper (2) NN и pUC19lower NN, 500 нг ДНК pUC19 и стерильная дистиллированная вода до объма реакции 48 мкл. Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98 С на 1 мин и затем охлаждали до 55 С. Затем добавляли 60 ед. РНКазы-НE.coli и 5,5 ед. Вса BEST с доведением объма реакции до 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 55 С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь нагревали до 90 С на 2 мин с целью инактивации ферментов. Реакционную смесь подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле с целью очистки полученного в результате амплифицированного продукта. Выделенный продукт амплификации ресуспендировали в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. Раствор полученной таким образом ДНК использовали для отщепления рестриктазой. Использованными рестриктазами были АссII 55 Состав реакционной смеси был следующим. 3 мкл раствора ДНК, 1 мкл буфера 10 хАссII или буфера 10 хВсnI, прилагающегося к каждой из рестриктаз, 1 мкл рестриктазы АссII или BcnI и стерильная дистиллированная вода до объма реакции 10 мкл. Реакцию в реакционной смеси проводили при 37 С в течение 30 мин. К полученному добавляли 1,5 мкл 10 х загрузочного буфера, 6 мкл полученной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле NuSieve. В результате интересующие отщеплнные рестриктазой фрагменты ДНК были получены при использовании обеих рестриктаз - и АссII, и(4) Выявление мутаций. Анализировали выявление мутации с помощью способа амплификации по настоящему изобретению. В качестве матрицы использовалиpUC19. Основные нуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеровpUC19 upper (2) NN primer и pUC19 lower NN показаны в SEQ ID NO 5 и 6 списка последовательностей, соответственно. Оба этих праймера являются химерными олигонуклеотидными праймерами, в которых первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеиновые кислоты. Кроме того, были сконструированы четыре праймера, в которых 3'-концевой нуклеотид праймера pUC19 upper (2) NN заменн на U (который комплементарен соответствующему нуклеотиду в матрице) или А, С или G(который является неправильно встроенным нуклеотидом), обозначенные как pUC19 upper(2) NN-C или pUC19 upper (2) NN-G, соответственно. Комбинации праймеров были следующими. Пара праймеров 1: прямой pUC19 upper (2)NN-G и обратный pUC19 lower NN. Реакционную смесь приготавливали следующим образом. 30 мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,3),0,01% бычьего сывороточного альбумина(БСА), 5% ДМСО, по 1 мМ каждого dNTPs, 8 мМ ацетата магния, по 60 пкмоль каждого праймера, 50 нг ДНК-матрицы и стерильная дистиллированная вода до объма реакции 48 мкл. Реакционную смесь денатурировали нагреванием до 98 С на 1 мин и затем охлаждали до 55 С. Затем в нее добавляли 5,5 ед. ДНКполимеразы Вса BEST и 60 ед. РНКазы-Н E.coli,и реакционную смесь инкубировали при 55 С в 56 течение 60 мин. Затем смесь нагревали до 90 С на 2 мин с целью инактивации ферментов. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 4%-ном агарозном геле NuSieve 3:1 (TakaraShuzo). В результате интересующий амплифицированный фрагмент длиной примерно 450 п.н. был выявлен только в случае использования комбинации праймеров, которая включает праймер, имеющий комплементарный нуклеотид на 3'-конце pUC19 upper (2) NN. С другой стороны, амплифицированный фрагмент отсутствовал в случае комбинаций, включающих праймер, имеющий ошибочный нуклеотид на 3'конце pUC19 upper (2) NN. Пример 4.(1) Реакция в микропробирке. Анализировали реакционный объм для способа амплификации по настоящему изобретению. Участок, кодирующий рецептор трансферрина человека, был выбран в качестве сегмента для амплификации. Использовали праймеры, характеризующиеся последовательностью, показанной в SEQ ID NO 12 или 13 списка последовательностей. В составе праймеров первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены на рибонуклеотиды. Фрагмент длиной примерно 750 п.н., амплифицированный методом ОТПЦР, использовали в качестве ДНК-матрицы. Реакционный объм доводили до 50, 100, 300 или 500 мкл. Состав реакционной смеси был следующим. Реакционная смесь А: 10 мкл 5 х специального буфера (135 мМ калийфосфатного буфера рН=7,5, 0,5 мг/мл БСА, 2,5% ДМСО), 4 мкл 100 мМ ацетата магния, по 5 мкл 10 мМ dNTPs, 10 мкл 10 мкМ АТФ, 1 мкл ДНК-полимеразы ВсаBEST (22 ед./мкл), 1 мкл РНКазы-Н (60 ед./мкл) и стерильная дистиллированная вода до 39 мкл. Реакционная смесь В: 3 мкл 20 мкМ праймера S для рецептора трансферрина человека(SEQ ID NO 12) и 20 мкМ праймера для рецептора трансферрина человека (SEQ ID NO 13) каждого, примерно 100 нг ДНК, служащей матрицей, и стерильная дистиллированная вода до 11 мкл. Если объм становился 50 мкл или больше, то его масштабировали так, чтобы обеспечить указанный выше состав. Для реакции амплификации реакционную смесь В нагревали до 98 С на 2 мин и затем инкубировали при 55 С в течение 3 мин. Реакционную смесь В добавляли к реакционной смеси А, которая была предварительно проинкубирована в 1500-мкл микропробирке при 55 С. После смешивания реакционную смесь инкубировали при 55 С в течение 1 ч. По завершении реакции смесь переносили на ледяную баню. 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле. В результате интересующий фрагмент длиной примерно 300 п.н. был эффективно амплифицирован с использованием каждого из 57 объмов реакции. Кроме того, было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент может быть получен без проблем с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента в качестве ДНК-матрицы.(2) Реакция в чашке Петри. Анализировали использование чашки Петри с целью предотвращения неоднородности температуры в реакционной смеси, которая могла бы быть вызвана большим объмом реакции. Участок, кодирующий рецептор трансферрина человека, был выбран как участок, который предстояло амплифицировать. Использовали праймеры, характеризующиеся последовательностью, показанной в SEQ ID NO 12 или 13 списка последовательностей. В составе праймеров первый и второй нуклеотиды с 3'-конца заменены рибонуклеотидами. Фрагмент длиной примерно 750 п.н., амплифицированный методом ОТ-ПЦР, использовали в качестве ДНКматрицы. Объм реакции доводили до 10 мл. Состав реакционной смеси был следующим. Реакционная смесь А: 2000 мкл 5 х специального буфера (135 мМ калий-фосфатного буфера - рН=7,5; 0,5 мг/мл БСА, 2,5% ДМСО), 800 мкл 100 мМ ацетата магния, 1000 мкл 10 мМdNTPs и стерильная дистиллированная вода до 9,1 мл. Реакционная смесь В: по 200 мкл 60 мкМ праймера S рецептора трансферрина человека(SEQ ID NO 12) и 60 мкМ праймера рецептора трансферрина человека (SEQ ID NO 13) каждого, примерно 10 мкг ДНК, служащей матрицей,и стерильная дистиллированная вода до 500 мкл. Реакционная смесь С: 200 мкл ДНКполимеразы Вса BEST (22 ед./мкл) и 200 мкл РНКазы-Н (60 ед./мкл). Для реакции амплификации реакционную смесь B нагревали до 98 С на 1 мин и затем инкубировали при 55 С в течение 3 мин. Реакционную смесь В добавляли к реакционной смеси А, которая была предварительно проинкубирована в 60-мм (диаметр) пластиковой чашке Петри при 55 С. Далее к полученному добавляли реакционную смесь С. После смешивания реакционную смесь инкубировали при 55 С в течение 1 ч. По завершении реакции реакционную смесь переносили на ледяную баню. Затем 8 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле. В результате был эффективно амплифицирован фрагмент длиной примерно 300 п.н., причм даже тогда, когда объм реакции составлял 10 мл. Кроме того, было подтверждено, что интересующий амплифицированный фрагмент можно без проблем получить с использованием ПЦР-амплифицированного фрагмента в качестве ДНК-матрицы. Таким образом, было подтверждено, что способ по настоящему изобретению предпочтительно по сравнению со стан 004327 58 дартным методом ПЦР можно использовать для изготовления ДНК-чипа, для чего требуется значительное количество ДНК-фрагмента. Пример 5.(1) Отношение между типом буфера и количеством используемой РНКазы-Н. Исследовали отношение между типом буфера и количеством используемой РНКазы-Н. Плазмидные ДНК (обозначенные как pUC19249 и pUC19-911), представляющие собой вектор pUC19, в состав которого был клонирован фрагмент размером 249 п.н. или 911 п.н., использовали в качестве матриц. В качестве праймеров использовали химерные олигонуклеотидные праймеры, в которых были заменены на рибонуклеотиды первые три нуклеотида с 3'конца праймера MF2N3 (24) или праймераMR1N3 (24), характеризующихся последовательностью, показанной в SEQ ID NO 16 или 17 списка последовательностей. При использовании комбинации этих праймеров для pUC 19249 и pUC 19-911 были получены амплифицированные фрагменты длиной примерно 450 п.н. и примерно 1100 п.н. соответственно. Трис-гидрохлоридный буфер,калийфосфатный буфер и трициновый буфер были выбраны в качестве буферных систем для исследования. Анализируемые количества РНКазы-Н представляли е отсутствие и конечные концентрации в диапазоне от 0,3 до 1,2 ед./мкл. Трис-гидрохлоридная буферная система была приготовлена в соответствии с описанным в примере 1 (2), за исключением того, что использовали 10 нг pUC19-249 или 200 нг pUC19-911,по 60 пкмоль каждого из праймеров и 11 ед. ДНК-полимеразы Вса BEST на 50 мкл реакционной смеси. Калий-фосфатный буфер был приготовлен так, чтобы иметь сходный состав. Трициновая буферная система была приготовлена таким образом, чтобы содержать следующее с указанием конечных концентраций: 34 мМ трицинового буфера (рН=8,7), 10 мМ хлорида калия, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% БСА, 1% ДМСО, 4 мМ ацетата магния и по 0,5 мМ каждого из dNTPs. К данной буферной системе добавляли 10 нг плазмиды pUC19-249 на 50 мкл объма реакции или 200 нг плазмидыpUC19-911 на 50 мкл объма реакции, по 60 пкмоль каждого из праймеров на 50 мкл объма реакции, РНКазу-Н в заданной концентрации и 11 ед. ДНК-полимеразы Вса BEST на 50 мкл объма реакции. Для реакции амплификации смесь являющихся матрицами pUC19-249 или pUC19-911 и соответствующих праймеров денатурировали нагреванием до 98 С на 1 мин и затем охлаждали до 55 С. К полученному добавляли смесь остальных компонентов реакции. Реакцию в полученной смеси проводили при 55 С в течение 60 мин. По завершении реакции смесь охлаждали до 4 С и к полученному добавляли 1/10 объма 0,5 М ЭДТА с целью остановки реакции. 59 3 мкл реакционной смеси подвергали электрофорезу в 3%-ном агарозном геле NuSieve 3:1(Takara Shuzo). В результате при использовании pUC 19249 в качестве матрицы увеличение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от использованной буферной системы в следующем порядке: Трис-гидрохлоридныйкалий-фосфатныйтрициновый. При использовании pUC19-911 в качестве матрицы увеличение эффективности амплификации было выявлено в зависимости от использованной буферной системы в следующем порядке: Трисгидрохлоридныйтрициновыйкалийфосфатный. Использование РНКазы-Н в конечной концентрации в диапазоне 0,3-1,2 ед./мкл приводило в результате к получению интересующего амплифицированного фрагмента, хотя при отсутствии добавления РНКазы-Н интересующий продукт амплификации отсутствовал.(2) Анализ количества праймера. Анализировали влияние количества использованного праймера на способ амплификации по настоящему изобретению. Систему реакционной смеси, в состав которой входит(1). Для калий-фосфатной буферной системы использовали 60 ед. РНКазы-Н на 50 мкл объма реакции, в то время как для Трисгидрохлоридной или трициновой буферной системы использовали 30 ед. РНКазы-Н на 50 мкл объма реакции. Анализируемые концентрации праймера варьировались в пределах от 10 до 100 пкмоль на 50 мкл. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1). В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен при использовании каждой из буферных систем, содержащих праймер в концентрации в диапазоне 10-100 пкмоль на 50 мкл.(3) Влияние рН реакционного буфера. Анализировали влияние рН реакционной смеси на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (2). Исследованные рН составляли 7,0-8,0 для калий-фосфатной буферной системы, 7,5-9,2 для трициновой буферной системы и 7,5-9,0 для Трисгидрохлоридной буферной системы. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1). В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен в использованном диапазоне рН для соответствующих буферных систем.(ДМСО) анализировали с использованием состава реакционной смеси с фосфатной буферной системой (рН=7,5) в соответствии с описанным 60 выше в (3). Кроме того, также исследовали влияние добавления полиамина. Анализируемое количество добавляемого ДМСО варьировалось от 0 до 10%. С другой стороны, в качестве полиамина использовали спермина тетрагидрохлорид (Sigma), спермидина тригидрохлорид(Nacalai Tesque) и диаминометана дигидрохлорид (Nacalai Tesque). Количество добавляемых пропилендиамина и триметилендиамина колебалось от 0 до 2%. Другие полиамины использовали в диапазоне концентраций от 0 до 5 мМ. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (1). В результате интересующий ДНКфрагмент был эффективно амплифицирован с использованием добавки в концентрации в пределах указанных диапазонов: от 0 до 5% ДМСО; от 0 до 200 мкМ спермина тетрагидрохлорида или спермидина; от 40 мкМ до 40 мМ ацетилпутресцина или путресцина дигидрохлорида; 0,002-0,02% триметилендиамина; 0,0001-0,01% пропилендиамина; и 0,1-10 мкМ диаминометана дигидрохлорида.(5) Анализ типа соли магния. Исследовали влияние типа соли магния на способ амплификации по настоящему изобретению. ДНК pUC19 использовали в качестве матрицы. В качестве праймеров использовали праймер pUC19 upper NN 249 и праймер pUC19lower NN, характеризующиеся последовательностями, показанными в SEQ ID NO 11 и 6 списка последовательностей, соответственно. Амплифицированный фрагмент длиной примерно 225 п.н. был получен с использованием пары этих праймеров. В качестве солей магния использовали хлорид магния, ацетат магния и сульфат магния. Состав реакционной смеси был следующим. 35 мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,3),8 мМ (конечная концентрация) хлорида магния,ацетата магния или сульфата магния, по 1,0 мМ(конечная концентрация) каждого dNTPs, 50 нг ДНК pUC19, по 60 пкмоль каждого из праймеров, 60 ед. РНКазы-Н, 5,5 ед. ДНК-полимеразы Вса BEST и стерильная дистиллированная вода до объма реакции 50 мкл. Условия реакции и подтверждения амплификации соответствовали описанному выше в (3). В результате интересующий амплифицированный фрагмент был получен с использованием каждой из солей магния.(6) Анализ концентраций магния и dNTPs. Анализировали влияние концентраций магния и dNTPs на способ амплификации по настоящему изобретению. Состав реакционной смеси соответствовал описанному выше в (5), за исключением того, что использовали 25 нг ДНКpUC19 и различные концентрации магния и

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/68, C12N 15/10

Метки: последовательности, нуклеиновой, способ, кислоты, амплификации

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-4327-sposob-amplifikacii-posledovatelnosti-nukleinovojj-kisloty.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты</a>

Похожие патенты