Способ определения стволовых клеток рака молочной железы и применение антагонистов cxcr1 для лечения рака

Номер патента: 23466

Опубликовано: 30.06.2016

Авторы: Джинестьер Кристоф, Уича Макс С.

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ определения наличия стволовых клеток злокачественной солидной опухоли у пациента с раком молочной железы, где способ включает определение экспрессии белка CXCR1 в образце ткани опухоли, взятом у пациента с раком молочной железы, где наличие белка CXCR1 в образце ткани указывает на наличие стволовых клеток злокачественной солидной опухоли в молочной железе.

2. Способ по п.1, где указанная стадия определения включает приведение указанного образца ткани в контакт с антителом или фрагментом антитела.

3. Способ по п.1, где указанная стадия определения включает приведение указанного образца ткани в контакт с репертаксином.

4. Способ по п.2, где указанное антитело или фрагмент антитела конъюгированы с сигнальной молекулой.

5. Способ по п.4, где указанная сигнальная молекула представляет собой флуоресцирующую молекулу или фермент, который может катализировать цветную реакцию в присутствии колориметрического субстрата.

6. Способ лечения пациента с раком молочной железы, при котором опухоль содержит стволовые клетки, включающий введение антагониста CXCR1 или FBXO21 или антагониста пути передачи сигнала IL-8/CXCR1 указанному пациенту.

7. Способ лечения пациента с раком молочной железы, включающий введение антагониста CXCR1 или FBXO21 или антагониста пути передачи сигнала IL-8/CXCR1 в сочетании с химиотерапевтическим средством указанному пациенту.

8. Способ по п. 6 или 7, где указанный антагонист представляет собой репертаксин или его производное.

9. Способ по п.6 или 7, где антагонист состоит из антитела или фрагмента антитела.

10. Способ по любому из пп.1-5, при котором также определяют по меньшей мере один маркер, выбранный из CD44, CD24, ESA, ALDH, TPRXL, NOTCH2, RBM15, ST3GAL3, NFYA, PCNX, GIPC3, RAD51L1, ARID1B.

11. Применение антагониста CXCR1 или антагониста пути передачи сигнала IL-8/CXCR1 для лечения пациента с раком молочной железы, при котором опухоль содержит стволовые клетки.

12. Применение антагониста CXCR1 или антагониста пути передачи сигнала IL-8/CXCR1 в сочетании с химиотерапевтическим средством для лечения пациента с раком молочной железы.

13. Применение по п.11 или 12, где указанный антагонист представляет собой репертаксин или его производное.

14. Применение по п.11 или 12, где указанный антагонист состоит из антитела или фрагмента антитела.

Текст

Смотреть все

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ПРИМЕНЕНИЕ АНТАГОНИСТОВ CXCR1 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Изобретение относится к способу определения наличия стволовых клеток злокачественной солидной опухоли у пациента с раком молочной железы, где способ включает определение экспрессии белка CXCR1 в образце ткани опухоли, взятом у пациента с раком молочной железы,где наличие белка CXCR1 в образце ткани указывает на наличие стволовых клеток злокачественной солидной опухоли в молочной железе.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЗЕ РИДЖЕНТС ОФ ДЗЕ ЮНИВЕРСИТИ ОФ МИЧИГАН (US) Перекрестная ссылка на родственные заявки Данная заявка претендует на приоритет временной заявки США 61/113458 от 11 ноября 2008 г.,описание которой целиком включено сюда в качестве ссылок. Положение об исследовании или разработке, финансируемых из федерального бюджета Данное изобретение было выполнено при поддержке правительственных грандовСА 66233,СА 101860 и 5 Р 30 СА 46592, присужденных Национальными институтами здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на изобретение. Область техники Настоящее изобретение предоставляет способы лечения рака путем введения ингибитора ИЛ-8CXCR1 (например, антитела к CXCR1 или репертаксина) в качестве монотерапии или в сочетании с дополнительным препаратом химиотерапии, что приводит к гибели неопухолеобразующих и опухолеобразующих раковых клеток. Настоящее изобретение также описывает композиции и способы определения наличия стволовых клеток солидной опухоли у пациента (например, на основе присутствия CXCR1 илиFBXO21). Предшествующий уровень техники Рак остается второй по количеству причиной смертности в указанной стране, составляющей свыше 500000 смертей ежегодно. Даже при наличии прогресса в определении и лечении, смертность от рака остается высокой. Несмотря на значительный прогресс в понимании молекулярных основ рака такое знание еще не было переведено в эффективные стратегии лечения. В частности, рак молочной железы наиболее часто встречается среди женщин Америки, при этом он возникает примерно у одной из девяти женщин в течение всей жизни. К несчастью, метастатический рак молочной железы все еще остается неизлечимым заболеванием. Большинство женщин с раком молочной железы умирает в результате заболевания. Будучи полезными, традиционные методы лечения (лучевая терапия, химиотерапия и гормональная терапия) ограничены возникновением устойчивых к лечению раковых клеток. Очевидно, что необходимы новые способы для выявления мишеней для лечения метастатического рака молочной железы и рака в целом. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение предоставляет способы лечения рака путем введения ингибитора ИЛ-8CXCR1 (например, антитела к CXCR1 или репертаксина) в качестве монотерапии или в сочетании с дополнительным препаратом химиотерапии, что приводит к гибели неопухолеобразующих и опухолеобразующих раковых клеток. Настоящее изобретение также описывает композицию и способы лечения и диагностики наличия стволовых клеток солидной опухоли у пациента (например, на основе присутствияCXCR1 или FBXO21). В некоторых вариантах исполнения изобретение представляет способы лечения рака, включающие введение антагониста ИЛ-8-CXCR1 и дополнительного препарата химиотерапии пациенту. В некоторых вариантах исполнения настоящее изобретение содержит способы по снижению или элиминации стволовых клеток рака и неопухолеобразующих раковых клеток у пациента, включающие введение репертаксина или его производного соединения пациенту при условии гибели как минимум части стволовых клеток рака и как минимум части неопухолеобразующих раковых клеток. В других вариантах исполнения настоящее изобретение содержит способы по снижению или элиминации стволовых клеток рака и неопухолеобразующих раковых клеток у пациента, включающие введение антагониста ИЛ-8-CXCR1 и дополнительного химиотерапевтического препарата пациенту при условии гибели как минимум части стволовых клеток рака и как минимум части неопухолеобразующих раковых клеток. В отдельных вариантах исполнения настоящее изобретение описывает композиции или наборы, включающие антагонист ИЛ-8-CXCR1 и дополнительный химиотерапевтический препарат. В некоторых вариантах исполнения антагонист ИЛ-8-CXCR1 включает агент, блокирующий связывание ИЛ-8 и CXCR1. В некоторых вариантах исполнения агент связывается (является специфичным) сCXCR1, но не связывается с CXCR2. В других вариантах исполнения агент связывается с CXCR1. В отдельных вариантах исполнения агент включает антитело к CXCR1 или его фрагмент. В дополнительных вариантах исполнения агент включает репертаксин или его производное. В других вариантах исполнения дополнительный химиотерапевтический препарат включает антимитотическое соединение. В определенных вариантах исполнения антимитотическое соединение выбирается из группы, включающей доцетаксел, доксорубицин, паклитаксел, фторурацил, винкристин, винбластин, нокодазол, колхицин, подофиллотоксин, стеганацин и комбретастатин. В других вариантах исполнения антимитотическое соединение представлено алкалоидами катарантуса (например, винкристином и винбластином), или бензимидазола карбаматами (например, нокодазолом), или колхицином, или родственными соединениями, например подофиллотоксином, стеганацином или комбретастатином, или таксаном, например паклитакселем и доцетакселем. В определенных вариантах исполнения дополнительный химиотерапевтический препарат представлен доцетакселем. В отдельных вариантах исполнения пациент имеет рак такого типа, который при проведении химиотерапии приводит к повышенной выработке ИЛ-8 (например, это приводит к увеличению подвижно-1 023466 сти стволовых раковых клеток). В некоторых вариантах исполнения изобретения пациент имеет тип рака, выбранный из группы, включающей рак предстательной железы, рак яичников, рак молочной железы,меланому, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и аденокарциному пищевода. В других вариантах исполнения настоящее изобретение содержит способы определения стволовых клеток солидной опухоли; а) обеспечивающие i) образец, отобранный из опухоли пациента, и ii) антитело или фрагмент антитела (или другой связывающей молекулы), специфичные относительно белкаCXCR1 или белка FBXO21 (или другого белка, представленного в табл. 1); и б) контакт образца ткани с антителом или фрагментом антитела при условии, что определено присутствие или отсутствие CXCR1+ или FBXO21+ стволовых клеток солидной опухоли. В отдельных вариантах исполнения изобретения антитело или фрагмент антитела конъюгирован с сигнальной молекулой. В дальнейших вариантах исполнения изобретение предусматривает, что сигнальная молекула состоит из флуоресцирующей молекулы. В других вариантах исполнения сигнальная молекула состоит из фермента, который может катализировать цветную реакцию в присутствии колориметрического субстрата. В определенных вариантах исполнения способ в дальнейшем описывает контакт образца с вторичным антителом или фрагментом вторичного антитела, специфичного для антитела или фрагмента антитела. В других вариантах исполнения вторичное антитело или фрагмент вторичного антитела состоит из сигнальной молекулы. В отдельных вариантах исполнения анализу не подвергаются другие белки или нуклеиновые кислоты, с тем чтобы определить присутствие или отсутствие CXCR1 или FBXO21+ стволовых клеток солидных опухолей. В дополнительных вариантах исполнения опухоль выбирается из группы, включающей рак предстательной железы, рак яичников, рак молочной железы,меланому, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и аденокарциному пищевода. В некоторых вариантах исполнения настоящее изобретение содержит способы увеличения популяции стволовых клеток солидной опухоли, содержащие: а) разъединение солидной опухоли для образования разъединенных клеток; б) контакт разъединенных клеток с реагентом, связывающим CXCR1 илиFBXO21 (или другой белок из табл. 1); и в) выбор клеток, связывающихся с реагентом при условии образования популяции с увеличенным числом стволовых клеток солидной опухоли. В некоторых вариантах исполнения не используются дополнительные реагенты для генерации популяции с увеличенным количеством стволовых клеток солидной опухоли. В некоторых вариантах исполнения опухоль выбирается из группы, включающей рак предстательной железы, рак яичников, рак молочной железы, меланому, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и аденокарциному пищевода. В дальнейшем варианте исполнения изобретение описывает, что реагент является антителом или фрагментом антитела (например, Fab-фрагментом). В дополнительных вариантах исполнения реагент конъюгирован с флуорохромом или магнитными частицами. В других вариантах исполнения выбор клеток осуществляется путем проточной цитометрии, флуоресцентной сортировки клеток, способом пеннинга, разделением с использованием колонки для аффинной хроматографии или магнитным отбором. В отдельных вариантах исполнения данное изобретение описывает увеличенную популяцию стволовых клеток солидной опухоли, изолированную по представленным способам. В некоторых вариантах исполнения данное изобретение описывает изолированные популяции стволовых клеток солидной опухоли со следующими свойствами: а) опухолеобразующие; и б) CXCR1+ или FBXO21+. В некоторых вариантах исполнения стволовые раковые клетки являются стволовыми раковыми клетками, выбранными из группы, состоящей из стволовых клеток рака предстательной железы,стволовых клеток рака яичника, стволовых клеток рака молочной железы, стволовых клеток рака кожи,стволовых клеток немелкоклеточного рака легкого, стволовых клеток мелкоклеточного рака легкого и стволовых клеток аденокарциномы пищевода. В других вариантах исполнения популяция состоит как минимум на 60% из стволовых раковых клеток и менее чем на 40% из неопухолеобразующих клеток опухоли. Далее изобретение описывает, что стволовые раковые клетки обогащены примерно в два раза в сравнении с нефракционными неопухолеобразующими клетками опухоли (например, в 2, 3, 4,5,10,100,1000 раз). В некоторых вариантах исполнения данное изобретение содержит способы получения клеточной композиции из опухоли, состоящей из стволовых клеток опухоли и неопухолеобразующих клеток опухоли, из них как минимум 60% представлены опухолеобразующими стволовыми клетками и 40% или менее представлены неопухолеобразующими клетками опухоли, при этом способ включает: а) получение диссоциированной смеси клеток опухоли из опухоли; б) разделение смеси клеток опухоли на первую фракцию, состоящую как минимум на 60% из стволовых раковых клеток и на 40% или менее из неопухолеобразующих клеток опухоли, и вторую фракцию клеток опухоли, обедненных стволовыми раковыми клетками, при этом разделение фракций осуществляется путем контакта смеси с реагентом против CXCR1 или FBXO21; в) доказательство опухолеобразуемости первой фракции путем: i) серийного введения ее первому животному-хозяину; доказательство неопухолеобразуемости второй фракции путем серийного ее введения второму животному-хозяину. В определенных вариантах исполнения разделение осуществляется путем проточной цитометрии, флуоресцентно активированной сортировки клеток (ФАСК), способом пеннинга, разделением с использованием колонки для аффинной хроматографии или магнитным отбором. В некоторых вариантах исполнения разделение выполняется с использованием анализа клеточного сортировщика с активацией флуоресценции (ФАСК). В отдельных вариантах исполнения данное изобретение содержит способы для выбора лечения пациента, имеющего солидную опухоль, включающие: (а) получение образца у пациента; (б) выявление наличия CXCR1+ или FBXO21+ стволовой клетки солидной опухоли в образце; (в) выбор лечения пациента, нацеленного на CXCR1+ или FBXO21+ стволовые клетки солидной опухоли (например, выбор использования антител или фрагментов антител к CXCR1). В некоторых вариантах исполнения, CXCR1+ или FBXO21+ стволовые клетки солидной опухоли являются стволовыми раковыми клетками, выбранными из группы следующих клеток: стволовые клетки рака предстательной железы, стволовые клетки рака яичника, стволовые клетки рака молочной железы, стволовые клетки рака кожи, стволовые клетки немелкоклеточного рака легкого, стволовые клетки мелкоклеточного рака легкого и стволовые клетки аденокарциномы пищевода. В некоторых вариантах исполнения изобретения последнее описывает способы скрининга соединения, включая следующее: а) воздействие на образец, включающий CXCR1+ или FBXO21+ стволовую раковую клетку для определения кандидата противоопухолевого соединения, при этом такой кандидат противоопухолевого соединения включает антагонист CXCR1 или FBXO21 или сигнальный антагонист ИЛ 8-CXCR1; и б) определение изменения в клетке в ответ на соединение. В определенных вариантах исполнения образец состоит из несклеивающихся маммосфер. В дальнейшем изобретение описывает, что антагонист CXCR1 или FBXO21 или сигнальный антагонист ИЛ 8CXCR1 состоит из антитела или фрагмента антитела. В некоторых вариантах исполнения изобретения антагонист CXCR1 является производным репертаксина. В других вариантах исполнения определение изменения в клетке состоит из выявления смерти опухолеобразующих клеток молочной железы. В дальнейшем изобретение описывает способы, включающие выявление кандидата противоопухолевого средства в качестве агента, способного убить опухолеобразующие клетки и неопухолеобразующие раковые клетки. В некоторых вариантах исполнения данное изобретение содержит способы определения способности изучаемого соединения ингибировать опухолеобразование стволовыми клетками солидной опухоли,включающие: а) получение большого количества стволовых клеток солидной опухоли, при этом стволовые клетки солидной опухоли i) обогащены как минимум в два раза в сравнении с нефракционированными клетками опухоли и ii) экспрессируют CXCR1 или FBXO21; б) воздействие исследуемым соединением на первую (но не вторую) серию стволовых клеток солидной опухоли; в) введение первой серии стволовых клеток солидной опухоли первому животному-хозяину и введение второй серии стволовых клеток солидной опухоли второму животному-хозяину; и г) сравнение опухоли (при ее наличии) у первого животного с опухолью, образованной у второго животного, для определения способности исследуемого соединения ингибировать образование опухоли. В отдельных вариантах исполнения изобретения, исследуемое вещество представлено ингибитором CXCR1 или FBXO21 или ингибитором ИЛ 8CXCR1. В дальнейших вариантах данное изобретение содержит способы определения способности изучаемого соединения ингибировать опухолеобразование стволовыми клетками солидной опухоли, включая следующее: а) получение образца, содержащего как минимум 60% стволовых клеток солидной опухоли,при этом стволовые клетки солидной опухоли экспрессируют CXCR1 или FBXO21; б) введение стволовых клеток солидной опухоли первому и второму животным-хозяинам; в) лечение первого животногохозяина с помощью исследуемого соединения и отсутствие лечения второго животного-хозяина с помощью исследуемого соединения; и г) сравнение опухоли (при ее наличии) у первого животного с опухолью, образованной у второго животного, для определения способности исследуемого соединения ингибировать образование опухоли. В других вариантах исполнения изобретения исследуемое вещество представлено ингибитором CXCR1 или FBXO21 или ингибитором ИЛ 8-CXCR1. Описание фигур На фиг. 1 представлены популяции ALDEFLUOR-положительных клеток из клеточных линий рака молочной железы (MDA-MB-453, SUM159), которые имеют свойства стволовых раковых клеток. А-В, GH. Репрезентативный анализ ферментной активности ALDH в клетках MDA-MB-453 (А-В) и SUM159(G-H) методом проточной цитометрии. Анализ с использованием ALDEFLUOR проводился в соответствии с описанием, представленным в примере 1 ниже. (С, I). Отмечалось, что ALDEFLUORположительная популяция была способна генерировать опухоли у мышей линии NOD/SCID с повторением фенотипической гетерогенности первичной опухоли. (F, L). Кривые роста опухолей были построены для разных типов введенных клеток (для MDA-MB-453: 50000, 5000 и 500 клеток и для SUM159: 100000, 10000 и 1000 клеток) и для каждой популяции (ALDEFLUOR-положительной ALDEFLUORотрицательной, неразделенной). Кинетика роста опухоли коррелировала с латентным периодом, размером образовавшейся опухоли и количеством ALDEFLUOR-положительных клеток. (F, L). (D, J). Окрашивание гематоксиллином и эозином места введения ALDEFLUOR-положительных клеток позволило выявить присутствие опухолевых клеток (D: место введения MDA-MB-453 ALDEFLUORположительных клеток и J: место введения SUM59 ALDEFLUOR-положительных клеток). (Е, К). Место введения ALDEFLUOR-отрицательных клеток содержало только остаточные покрытые матригелем апоптозные клетки и ткань мыши (Е: место введения MDA-MB-453 ALDEFLUOR-отрицательных клеток и К: место введения SUM59 ALDEFLUOR-отрицательных клеток). Данные представлены в виде среднего значения СО. На фиг. 2 представлена классификация популяций ALDEFLUOR-положительных и ALDEFLUORотрицательных клеток, изолированных из клеточных линий рака молочной железы, основываясь на "сигнатуре стволовых раковых клеток". Фиг. 2 А. Иерархическая кластеризация 16 образцов на основе сигнатуры экспрессии 413 генов. Каждый ряд матрицы данных представляет собой ген, а каждый столбец образец. Обратите внимание на разделение между ALDEFLUOR-положительными (названия подчеркнуты) и отрицательными образцами (названия не подчеркнуты) в 413 генах для 15 из 16 образцов. Некоторые гены, включенные в сигнатуру, представлены по аббревиатуре HUGO согласно указанию в базе данных "Entrez Gene" (гены со сниженной экспрессией в ALDEFLUOR-положительных популяциях представлены зеленым, а гены с повышенной экспрессией в ALDEFLUOR-положительных популяциях представлены красным). Фиг. 2 В-С. Для подтверждения результатов экспрессии гена в наборе из пяти клеточных линий рака молочной железы, отобранных по фенотипу ALDEFLUOR, экспрессия пяти генов была избыточной в ALDEFLUOR-положительных популяциях (CXCR1/IL8RA, FBXO21, NFYA,NOTCH2 и RAD51L1), что было измерено методом количественной ОТ-ПЦР. Уровни экспрессииCXCR1 и FBXO21, определенные количественно методом ОТ-ПЦР, представлены на этой фигуре. Уровни экспрессии гена, измеренные количественно методом ОТ-ПЦР, подтверждают результаты, полученные с помощью микроматриц ДНК с повышением уровня мРНК CXCR1 и FBXO21 в ALDEFLUORположительной популяции в сравнении с ALDEFLUOR-отрицательной популяцией (р 0,05). На фиг. 3 представлена роль оси ИЛ-8/CXCR1 в регуляции стволовых клеток рака молочной железы. А. Клетки, экспрессирующие CXCR1, содержатся в ALDEFLUOR-положительной популяции. ALDEFLUOR-положительная и DEFLUOR-отрицательная популяции из четырех разных клеточных линий рака молочной железы (НСС 1954, SUM159, MDA-MB-453, BrCa-MZ-01) были изолированы методом ФАСК, фиксированы и подвергнуты анализу на предмет экспрессии белка CXCR1 с использованием иммунного окрашивания и анализа ФАСК. ALDEFLUOR-положительные клетки содержали большое количество CXCR1-положительных клеток в сравнении с ALDEFLUOR-отрицательной популяцией. В. Эффект лечения ИЛ-8 относительно образования опухоли в трех разных клеточных линиях (НСС 1954,SUM159, MDA-MB-453). Лечение ИЛ-8 привело к повышению образования первичных и вторичных опухолей с наличием дозозависимого эффекта. С. Эффект лечения ИЛ-8 на ALDEFLUORположительную популяцию четырех разных клеточных линий, культивированных в соответствующих условиях. ИЛ-8 увеличивал ALDEFLUOR-положительную популяцию дозозависимым образом в каждой из четырех проанализированных клеточных линиях ( р 0,05/ р 0,01, статистически значимая разница в сравнении с группой контроля). На фиг. 4 представлены ALDEFLUOR-положительные клетки, имеющие повышенный метастатический потенциал. А. Ось ИЛ-8/CXCR1 задействована в инвазии стволовых клеток рака. Роль оси ИЛ 8/CXCR1 в инвазии была оценена методом инвазии матригеля с использованием сыворотки или ИЛ-8 в качестве аттрактанта для трех разных клеточных линий (НСС 1954, MDA-MB-453, SUM159). Для ALDEFLUOR-положительных клеток показатель инвазии был в 6-20 раз больше, чем для ALDEFLUORотрицательных клеток (р 0,01). При использовании ИЛ-8 (100 нг/мл) в качестве аттрактанта было отмечено, что значительное увеличение ALDEFLUOR-положительных клеток происходило посредством матригеля в сравнении с использованием в качестве аттрактанта сыворотки (р 0,05). В отличие от этого ИЛ 8 не обладал никаким эффектом относительно инвазивности ALDEFLUOR-отрицательной популяции. ВМ. ALDEFLUOR-положительная популяция имеет повышенный метастатический потенциал. B-D. Количественное определение нормализованного потока фотонов, измеренного с еженедельными интервалами,с последующей инокуляцией 100000 клеток, инфицированных люциферазой, из каждой группы (ALDEFLUOR-положительной. ALDEFLUOR-отрицательной, неразделенной). E-J. Выявление метастазов с использованием программного обеспечения для обработки изображений биолюминесценции (Е, G, I: мыши в положении на брюшке; F, H, J: мыши в положении на спине). У мышей, инокулированных ALDEFLUOR-положительными клетками, отмечалось возникновение нескольких метастазов, локализированных в разных местах (кость, мышцы, легкое, мягкие ткани), кроме того, у таких мышей отмечалась большая эмиссия фотонов, чем у мышей, инокулированных неразделенными клетками, среди которых отмечалось не более одного метастаза в каждой мыши. В отличие от этого у мышей, инокулированныхALDEFLUOR-отрицательными клетками, были выявлены только случайные небольшие метастазы, ограниченные лимфатическими узлами. К-М. Гистологическое подтверждение окрашиванием гематоксиллином и эозином метастазов в кости (К), мягких тканях (L) и мышцах (М) в результате введения ALDEFLUOR-положительных клеток. На фиг. 5 представлен эффект ингибирования CXCR1 жизнеспособности клеток опухоли (фиг. 5 А) и жизнеспособности стволовых раковых клеток (фиг. 5 В). На фиг. 6 показано, что воздействие репертаксином индуцирует "эффект свидетеля", опосредованный сигнальным лигандом FAS/FAS; кроме того, показано, что ингибирование роста клеток, индуциро-4 023466 ванное воздействием репертаксина, частично было сохранено путем добавления антагониста FAS, и клетки, подвергнутые воздействию агониста FAS, имели подобный показатель ингибирования роста клеток, что и клетки, подвергнутые воздействию репертаксина. На фиг. 7 представлена активация FAK, AKT и FOXOA3 без воздействия репертаксина (7 А) и в присутствии репертаксина (7 В). На фиг. 8 представлен эффект репертаксина, доцетаксела или их комбинации на клеточную линию рака молочной железы (8 А, SUM 159) и три ксенотрансплантата, полученные из молочной железы разных пациентов (8 В, МС 1;8 С, UM2; 8D, UM3). На фиг. 9 представлен эффект репертаксина, доцетаксела или их комбинации на популяцию стволовых клеток рака в соответствии с анализом ALDEFLUOR различных клеточных линий, включая SUM159(9 А), МС 1 (9 В), UM2 (9 С), UM3 (9D). На фиг. 10 представлен эффект репертаксина, доцетаксела или их комбинации на серийные разведения первичных опухолей (10 А. SUM159, 10 В. МС 1, 10 С. UM2, 10D. UM3), которые были имплантированы в жировую подушку молочной железы вторичных мышей NOD-SCID. На фиг. 11 показано, что воздействие репертаксином снижает метастатический потенциал клеточной линии SUM159. На фиг. 11 А представлено количественное определение нормализованного потока фотонов, измеренное с еженедельными интервалами после внутрисердечной инокуляции клеток SUM 159. Образование метастазов отслеживалось с помощью визуализации биолюминесценции (11 В: мыши,обработанные физиологическим раствором; 11 С: мыши, которым был введен репертаксин). На фиг. 12 представлено наложение клеток SUM159 ALDEFLUOR-положительной субпопуляции иCXCR1-положительной субпопуляции (вверху) или CXCR2-положительной субпопуляции (внизу). В-С. Клетки SUM159 были культивированы в соответствующих условиях и подвергнуты воздействию репертаксина (100 нмоль) или двух специфичных блокирующих антител к CXCR1 (10 мкг/мл) или CXCR2 (10 мкг/мл). Спустя три дня был проанализирован эффект на популяцию стволовых клеток рака с использованием анализа ALDEFLUOR (В); клеточная жизнеспособность оценивалась спустя пять дней после обработки с использованием МТТ-теста (С). После воздействия репертаксином или антителом к CXCR1,отмечалось значительное уменьшение ALDEFLUOR-положительной популяции и жизнеспособности клеток. В отличие от этого при воздействии антителом к CXCR2 какого-либо значительного эффекта не отмечалось. D. Спустя 4 дня после воздействия количество апоптозных клеток оценивалось с использованием TUNEL-теста. Среди подвергнутых действию репертаксина клеток 36% клеток были апоптозными (окрашены зеленым цветом) в сравнении с контролем, где большинство клеток были жизнеспособными (окрашены синим цветом). E-F. Определение опосредованности гибели клеток "эффектом свидетеля". CXCR1-положительные и CXCR1-отрицательные популяции были отсортированы методом потока,и каждая популяция была подвергнута действию различных концентраций репертаксина. (D). Было выявлено снижение жизнеспособности клеток в CXCR1-положительных и неотсортированных популяциях,в то время как в CXCR1-отрицательной популяции какого-либо эффекта не отмечалось. (Е). Для воздействия на отсортированные CXCR1-положительные, CXCR1-отрицательные и неотсортированные популяции использовалась диализированная кондиционированная среда (dCM) от CXCR1-положительных клеток, обработанных в течение трех дней. Использовались серийные разведения диализированной кондиционированной среды (контроль, dCM 1/4, dCM 1/2, dCM 3/4, dCM). Спустя два дня после воздействия жизнеспособность клеток была оценена с использованием МТТ-теста. Сильное снижение жизнеспособности клеток отмечалось в CXCR1-отрицательных и неразделенных популяциях, в то время как вCXCR1-положительной популяции какого-либо эффекта не отмечалось (F). На фиг. 13 представлена онкогенность ALDEFLUOR-положительных/CXCR1-положительных иALDEFLUOR-положительных/CXCR1-отрицательных популяций клеток из клеточной линии SUM159. А. Кривые роста опухоли были построены для разного количества введенных клеток (50000, 5000, 1000 и 500 клеток) и для каждой популяции (ALDEFLUOR-положительная/CXCR1-положительная и ALDEFLUOR-положительная/CXCR1-отрицательная). Обе клеточные популяции оказались опухолеобразующими. Кинетика роста опухоли коррелировала с латентным периодом, размером образовавшейся опухоли и количеством введенных клеток. В-С. Опухоли,образованныеALDEFLUORположительной/CXCR1-положительной популяцией, имели фенотипическую гетерогенность первичной опухоли при серийных пассажах, в то время как ALDEFLUOR-положительная/CXCR1-отрицательная популяция привела к образованию опухолей, содержащих только ALDEFLUOR-положительные/CXCR1 отрицательные клетки. Нами была проведена трансплантация обеих клеточных популяций в ходе трех пассажей. На фиг. 14 представлен эффект блокады CXCR1 на образование опухоли. Клетки SUM159 и НСС 1954 были культивированы в соответствующих условиях и подвергнуты воздействию в течение трех дней репертаксина (100 нмоль), блокирующего антитела к CXCR1 (10 мг/мл) или блокирующего антитела к CXCR2 (10 г/мл). Спустя три дня после воздействия клетки были разделены и культивированы в суспензии. Было оценено количество опухолей, образованных спустя 5 дней после культивации. Подобные результаты были получены для обеих клеточных линий со значительным снижением образования первичных и вторичных опухолей в условиях воздействия репертаксином и антителами к CXCR1 в срав-5 023466 нении с контролем. В отличие от этого блокирующие антитела к CXCR2 не обладали каким-либо эффектом на образование опухоли. На фиг. 15 представлен эффект воздействия репертаксином относительно жизнеспособности клеток линий SUM159, НСС 1954 и MDA-MB-453. Три разные клеточные линии (SUM159, НСС 1954, MDA-MB453) были культивированы в соответствующих условиях и подвергнуты воздействию репертаксина (100 нмоль). Жизнеспособность клеток оценивалась спустя 1, 3 и 5 дней после воздействия с использованием МТТ-теста. Снижение жизнеспособности клеток отмечалось спустя 3 дня после воздействия на клеточные линии SUM159 и НСС 1954. Однако репертаксин не обладал каким-либо эффектом на жизнеспособность клеток MDA-MB-453. На фиг. 16 представлен эффект блокады CXCR1 на ALDEFLUOR-положительную популяцию в условиях in vitro. А-В. Клетки НСС 1954 (А) и MDA-МВ-453 (В) были культивированы в соответствующих условиях и подвергнуты воздействию репертаксина (100 нмоль) или двух специфичных блокирующих антител к CXCR1 (10 мг/мл) или CXCR2 (10 мг/мл). Спустя три дня был проанализирован эффект на популяцию стволовых раковых клеток с использованием теста ALDEFLUOR. После воздействия репертаксином или антителом к CXCR1 отмечалось значительное уменьшение ALDEFLUOR-положительной популяции и жизнеспособности клеток НСС 1954. В отличие от этого для антитела к CXCR2 какого-либо значительного эффекта не отмечалось (А). Для клеток MDA-MB-453 не отмечалось никакого эффекта наALDEFLUOR-положительную популяцию (В). На фиг. 17 показано, что воздействие репертаксином индуцирует "эффект свидетеля", опосредованный сигнальным лигандом FAS/FAS. A. Для выявления того, возможно ли индуцирование губительного эффекта свидетеля воздействием репертаксина с медиатором, представленным FAS-лигандом, с использованием ИФА был измерен уровень растворимого FAS-лиганда, содержащегося в среде. Спустя 4 дня после воздействия в среде клеток, подвергнутых воздействию репертаксина, количество растворимыхFAS-лигандов было в 4 раза больше, чем в не подвергнутом воздействию контроле. В. Уровень FASлиганда мРНК измерялся методом ОТ-ПЦР и подтвердил повышение выработки FAS-лигандов после воздействия репертаксином. Подобные результаты отмечались спустя 4 дня после воздействия агонистомFAS, активирующим передачу сигнала FAS, т.е. повышение количества FAS-лигандов мРНК было в 5 раз больше в сравнении с контролем. С. Клетки SUM159 были культивированы в соответствующих условиях и подвергнуты воздействию репертаксина или комбинации репертаксина с анти-FAS-лигандом. Ингибирование клеточного роста, опосредованное воздействием репертаксина, было частично сохранено путем добавления анти-FAS-лиганда. Клетки, подвергнутые воздействию агонистом FAS, характеризовались подобными показателями ингибирования роста в сравнении с клетками, подвергнутыми воздействию только репертаксина. D-E. Был проанализирован эффект воздействия репертаксина или комбинации репертаксина и анти-FAS-лиганда и воздействия агониста FAS на CXCR1-положительную и ALDEFLUOR-положительную популяции. Усиленное снижение CXCR1-положительной и ALDEFLUORположительной популяции, опосредованное воздействием репертаксина, не было сохранено при действии анти-FAS-лиганда, и воздействие агонистом FAS привела к десяти- и трехкратному увеличению процента CXCR1-положительной и ALDEFLUOR-положительной популяции соответственно. На фиг. 18 представлен эффект агониста FAS на CXCR1-положительные и CXCR1-отрицательные клетки. CXCR1-положительные и CXCR1-отрицательные популяции были отсортированы методом потока, и каждая популяция была подвергнута воздействию различных концентраций агониста FAS. Было выявлено снижение жизнеспособности клеток в CXCR1-отрицательных и неотсортированных популяциях, в то время как в CXCR1-положительной популяции какого-либо эффекта не отмечалось. На фиг. 19 представлен анализ экспрессии белка CXCR1 в популяции здоровых клеток молочной железы/клеток-предшественников, а также эффект лечения ИЛ-8 на образование маммосфер. А. ALDEFLUOR-положительная и ALDEFLUOR-отрицательная популяции из здоровых эпителиальных клеток молочной железы (изолированная форма) были изолированы с помощью ФАСК, фиксированы и проанализированы на предмет экспрессии белка CXCR1 методом иммунного окрашивания и анализа ФАСК.ALDEFLUOR-положительные клетки содержали большое количество CXCR1-положительных клеток в сравнении с ALDEFLUOR-отрицательной популяцией. В-С. Эффект лечения ИЛ-8 на образование маммосфер. Лечение ИЛ-8 повышало образование первичных (В) и вторичных (С) маммосфер дозозависимым образом. На фиг. 20 представлен эффект воздействия репертаксина на здоровые эпителиальные клетки молочной железы. А. Здоровые эпителиальные клетки молочной железы, изолированные в ходе редукционной маммопластики, были культивированы в соответствующих условиях и подвергнуты воздействию репертаксина (100 или 500 нмоль) или агониста FAS (500 нг/мл). Спустя пять дней после воздействия,жизнеспособность клеток была оценена с использованием МТТ-теста. Воздействие репертаксином или агонистом FAS не обладало каким-либо эффектом на жизнеспособность здоровых эпителиальных клеток молочной железы, культивированных в соответствующих условиях, даже при использовании высоких концентраций репертаксина (500 нмоль). В. Уровень растворимого FAS-лиганда оценивался методом ИФА в среде здоровых эпителиальных клеток молочной железы, обработанных репертаксином. Спустя 4 дня после воздействия в среде обработанных клеток отмечалось повышение количества растворимогоFAS-лиганда. С. Анализ экспрессии FAS/CD95 в здоровых эпителиальных клетках молочной железы методом ФАСК. В здоровых эпителиальных клетках молочной железы, культивированных в соответствующих условиях, не было выявлено экспрессии FAS/CD95. D. Эффект воздействия репертаксина на образование маммосфер. Здоровые эпителиальные клетки молочной железы были культивированы в соответствующих условиях и подвергнуты воздействию в течение 4, 8, 11 и 15 дней репертаксина (100 нмоль). После воздействия репертаксином клетки были разделены и культивированы в суспензии. После воздействия репертаксином отмечалось значительное снижение клеток, способствующих образованию маммосфер. На фиг. 21 представлен эффект воздействия репертаксина на активацию FAK, AKT и FOXO3a. Для оценки эффекта воздействия репертаксина на нисходящую передачу сигнала, использовались две разные вирусные модели, одна из которых подавляла экспрессию PTEN посредством PTEN-миРНК, а вторая приводила к избыточной экспрессии FAK (Ad-FAK). A. Клетки контроля SUM159, SUM159 PTENмиРНК и SUM159 Ad-FAK культивировались в соответствующих условиях в течение двух дней при отсутствии/наличии репертаксина 100 нмоль, а активация пути FAK/AKT оценивалась методом вестернблоттинга. Воздействие репертаксином привело к снижению фосфорилирования FAK Tyr397 и AKTSer473, в то время как делеция PTEN и гиперэкспрессия FAK блокировали эффект воздействия репертаксином на активность FAK и AKT. В. С использованием иммунофлуоресцирующего окрашиванияCXCR1-положительных клеток мы подтвердили, что воздействие репертаксином приводит к исчезновению фосфо-FAK (окрашивание мембраны красным цветом) и фосфо-AKT экспрессии (окрашивание цитоплазмы красным цветом). Иммунофлуоресцирующее окрашивание с использованием анти-FOXO3A позволило выявить цитоплазматическое расположение FOXO3A (красным цветом) в необработанных клетках, в то время как воздействие репертаксином индуцировало повторную локализацию FOXO3A в ядре. В отличие от этого клетки с делецией PTEN или гиперэкспрессией FAK имеют высокий уровень фосфо-FAK, фосфо-AKT и цитоплазматической экспрессии FOXO3A в клетках, подвергнутых и не подвергнутых воздействию репертаксина. Во всех образцах ядра были окрашены контрастно с помощьюDAPI в синий цвет. C-D. Эффект репертаксина на жизнеспособность клеток SUM159 PTEN-миРНК иSUM159 Ad-FAK, а также на популяцию стволовых клеток рака оценивался при помощи МТТ-теста и анализа ALDEFLUOR соответственно. Спустя 3 дня после воздействия клетки с делецией PTEN или гиперэкспрессией FAK были резистентны к репертаксину (С). Воздействие репертаксином не изменило соотношение ALDEFLUOR-положительных SUM159 PTEN клеток, обладающих нокдаун-эффектом. (D). На фиг. 22 представлен эффект воздействия репертаксина на активацию FAK/AKT в клетках линий НСС 1954 и MDA-MB-453. Для оценки эффекта воздействия репертаксина на нисходящую передачу сигнала CXCR1 мы использовали лентивирусную модель, подавляющую экспрессию PTEN посредствомPTEN-миРНК А. Клетки контроля НСС 1954 и НСС 1954 PTEN-миРНК были культивированы в соответствующих условиях при отсутствии или присутствии репертаксина 100 нмоль, а активация путиFAK/AKT оценивалась методом вестерн-блоттинга. Воздействие репертаксином привело к снижению фосфорилирования FAK Tyr397 и AKT Ser473, в то время как делеция PTEN блокировала эффект воздействия репертаксина на активность FAK и AKT. В. Воздействие репертаксином не имело какого-либо эффекта на жизнеспособность клеток линии MDA-MB-453, несущих мутацию PTEN. Путем использования анализа по методу вестерн-блоттинга мы подтвердили, что путь FAK/AKT не был подвергнут изменению при воздействии репертаксином. На фиг. 23 представлен эффект репертаксина на жизнеспособность клеток НСС 1954 PTEN-миРНК,оцененную с помощью МТТ-теста. Спустя 3 дня после воздействия клетки с делецией PTEN были резистентны к репертаксину. На фиг. 24 представлена экспрессия FAS-лиганда и мРНК ИЛ-8 после воздействия доцетакселем или репертаксином, измеренная с помощью количественной ОТ-ПЦР. А-В. Клетки SUM159, культивированные в соответствующих условиях, были подвергнуты воздействию репертаксина (100 нмоль), агониста FAS (500 нг/мл) или доцетаксела (10 нмоль). Спустя три дня после воздействия клетки были собраны и из них была выделена РНК. Доцетаксел индуцировал FAS-лиганд (А) и мРНК ИЛ-8 (В) в клеткахSUM159. После воздействия агонистом FAS или доцетакселем было выявлено 4-кратное повышение уровня мРНК ИЛ-8 (В). На фиг. 25 представлена оценка активации PTEN/FAK/AKT в трех разных ксенотрансплантатах рака молочной железы. Анализ методом вестерн-блоттинга выявил, что в обоих трансплантатах присутствует экспрессия PTEN и активация пути FAK/AKT, как это показано фосфорилированием FAK Tyr397 иAKT Ser473. На фиг. 26 представлен эффект воздействия репертаксина на популяцию стволовых клеток рака молочной железы в условиях in vivo. A-C. Для оценки эффекта воздействия репертаксина на образование опухоли и популяцию стволовых клеток рака в условиях in vivo использовалась клеточная линия рака молочной железы (SUM159) и три ксенотрансплантата рака молочной железы, полученные у трех разных пациентов (МС 1, UM2, UM3). А. Для каждого образца 50000 клеток были введены в гуманизированную жировую подушку молочной железы мышей линии NOD/SCID, после чего проводился мониторинг размера опухоли. Когда опухоли имели размер около 4 мм, были начаты подкожные инъекции репертаксина(15 мг/кг) два раза в день в течение 28 дней или интраперитонеальные инъекции доцетаксела (10 мг/кг) 1 раз в неделю или их комбинации (репертаксин/доцетаксел). На графике показан размер опухоли до и после курса каждого назначенного лечения (стрелка, начало лечения). Подобные результаты отмечались для каждого образца со статистически значимым снижением размера опухоли при введении доцетаксела или комбинации доцетаксела/репертаксина в сравнении с группой контроля, в то время как разницы между ростом контрольных опухолей и опухолей при воздействии репертаксином не было выявлено. В-С. Оценка лечения репертаксином, доцетакселем или комбинированного лечения относительно популяции стволовых клеток рака с помощью анализа ALDEFLUOR (В) и повторной имплантации вторичным мышам (С). Для подвергнутых лечению доцетакселем опухолей ксенотрансплантата отмечался подобный или повышенный процентный показатель ALDEFLUOR-положительных клеток в сравнении с контролем, в то время как лечение репертаксином или его комбинацией с доцетакселем позволило получить статистически значимое снижение количества ALDEFLUOR-положительных клеток от 65 до 85% в сравнении с контролем (р 0,01) (В). Серийные разведения клеток, полученных из первичных опухолей,не подвергнутых лечению (контроль) и подвергнутых лечению мышей, были имплантированы в жировую подушку молочной железы вторичных мышей линии NOD/SCID, которые в дальнейшем лечения не получали. Контроль и подвергнутые лечению доцетакселем опухоли сформировали вторичные опухоли при всех разведениях, в то время как только большие количества клеток, полученные из первичных опухолей, подвергнутых лечению репертаксином или его комбинацией с доцетакселем, были способны сформировать опухоли. Кроме того, рост опухолей был значительно замедлен, и образовавшиеся опухоли были значительно меньше по размеру, чем контроль или подвергнутые лечению доцетакселем опухоли (С). D. Были собраны ксенотрансплантаты из каждой группы, затем было проведено иммуногистохимическое окрашивание для определения экспрессии фосфо-FAK, фосфо-AKT, FOXO3A и ALDH1. Мембранная экспрессия фосфо-FAK и цитоплазматическая экспрессия фосфо-AKT (стрелка) была выявлена в контроле и подвергнутых лечению доцетакселем опухолях, в то время как подобная экспрессия отсутствовала в опухолях, подвергнутых лечению репертаксином или его комбинации с доцетакселем. Ядерная экспрессия FOXO3A (коричневым цветом) была выявлена в клетках, подвергнутых лечению доцетакселем или репертаксином или их комбинацией. Снижение экспрессии ALDH1 (стрелка) было выявлено в опухолях, подвергнутых лечению репертаксином или его комбинацией в сравнении с контролем и подвергнутых лечению доцетакселем опухолями. На фиг. 27 представлен эффект лечения репертаксином на популяцию стволовых клеток рака молочной железы в условиях in vivo. A-C. Для оценки эффекта лечения репертаксином на рост опухоли и популяцию стволовых клеток рака в условиях in vivo была получена клеточная линия рака молочной железы (SUM159, А) и три ксенотрансплантата рака молочной железы от трех разных пациентов. Для каждого образца 50000 клеток вводились в гуманизированную жировую подушку молочной железы мышей линии NOD/SCID, затем проводился мониторинг размера опухоли. Когда опухоли имели размер около 4 мм, были начаты подкожные инъекции репертаксина (15 мг/кг) два раза в день в течение 28 дней или интраперитонеальные инъекции доцетаксела (10 мг/кг) 1 раз в неделю или их комбинации (репертаксин/доцетаксел). На графике показан размер опухоли до и после курса каждого назначенного лечения(стрелка, начало лечения). Подобные результаты отмечались для каждого образца со статистически значимым снижением размера опухоли при введении доцетаксела или комбинации доцетаксела/репертаксина в сравнении с группой контроля, в то время как разницы между ростом контрольных опухолей и опухолей, подвергнутых воздействию репертаксином, не было выявлено. Оценка лечения репертаксином, доцетакселем или комбинированного лечения относительно популяции стволовых клеток рака проводилась с помощью анализа ALDEFLUOR и повторной имплантации вторичным мышам. Для подвергнутых лечению доцетакселем опухолей ксенотрансплантата отмечался подобный или повышенный процентный показатель ALDEFLUOR-положительных клеток в сравнении с контролем, в то время как лечение репертаксином или его комбинацией с доцетакселем позволило получить статистически значимое снижение количества ALDEFLUOR-положительных клеток от 65 до 85% в сравнении с контролем (р 0,01). Серийные разведения клеток, полученных из первичных опухолей, не подвергнутых лечению (контроль) и подвергнутых лечению мышей, были имплантированы в жировую подушку молочной железы вторичных мышей линии NOD/SCID, которые в дальнейшем лечения не получали. Контроль и подвергнутые лечению доцетакселем опухоли сформировали вторичные опухоли при всех разведениях, в то время как только большие количества клеток, полученных из первичных опухолей, подвергнутых лечению репертаксином или его комбинацией с доцетакселем, были способны сформировать опухоли. Рост опухолей был значительно замедлен, и образовавшиеся опухоли были значительно меньше по размеру, чем контроль или подвергнутые лечению доцетакселем опухоли. На фиг. 28 представлен эффект лечения репертаксином на популяцию стволовых клеток рака молочной железы, который был оценен по фенотипу CD44+/CD24-. А-В. Оценка лечения репертаксином,доцетакселем или комбинированного лечения на популяцию стволовых клеток рака анализировалась по наличию клеток CD44+/CD24-. В остаточных опухолях, подвергнутых лечению доцетакселем, нами постоянно отмечалось либо отсутствие изменений, либо повышенный процент клеток CD44+/CD24-, в то время как лечение репертаксином или его комбинацией с доцетакселем приводило к снижению популя-8 023466 ции клеток CD44+/CD24-. А. Представлен анализ диаграммы для ксенотрансплантата UM3. В. Подобные результаты были получены для МС 1, UM2 и UM3. Практически все клетки SUM159 являютсяCD44+/CD24- клетками при всех условиях лечения. На фиг. 29 показано, что лечение репертаксином снижает развитие системных метастазов. Для оценки эффекта лечения репертаксином на образование метастазов клеточные линии рака молочной железы НСС 1954 (A), SUM159 (В), MDA-MB-453 (С) были инфицированы лентивирусом, экспрессирующим люциферазу, и мышам линии NOD/SCID посредством интракардиального введения были инокулированы 250000 зараженных люциферазой клеток. После интракардиального введения мыши были подвергнуты лечению в течение 12 ч с использованием подкожных инъекций физиологического раствора или подкожных инъекций репертаксина (15 мг/кг) два раза в день в течение 28 дней. Мониторинг образования метастазов проводился с использованием визуализации биолюминесценции. Количественное определение нормализованного потока фотонов, измеренное при еженедельных интервалах после инокуляции, выявило статистически значимое снижение образования метастазов при использовании репертаксина в сравнении с контролем относительно мышей, инокулированных клетками НСС 1954 или SUM159(А-В). В отличие от этого, лечение репертаксином не обладало каким-либо эффектом на образование метастазов у мышей, которым были введены клетки MDA-MB-453. (С). Гистологическое подтверждение окрашиванием гематоксилином и эозином наличия метастазов в кости и мягких тканях, полученных у мышей, не подвергнутых воздействию репертаксином (D). На фиг. 30 представлена передача сигнала ИЛ-8/CXCR1 в стволовых раковых клетках, подвергнутых лечению химиотерапией или комбинацией химиотерапии и репертаксина. А. Представление потенциальной передачи сигнала ИЛ-8/CXCR1 в стволовых раковых клетках. Активация CXCR1 после связывания ИЛ-8 индуцирует фосфорилирование киназы фокальной адгезии (FAK). Активная FAK фосфорилирует AKT и активирует путь WNT, что регулирует самообновление стволовых клеток и FOXO3A, что, в свою очередь, регулирует выживаемость клеток. Активация FAK защищает стволовые раковые клетки от опосредованного FAS-лиганд/FAS эффекта свидетеля путем ингибирования FADD, нижележащего эффектора сигнальной цепи FAS. В присутствии химиотерапии к лечению чувствительны только скопления опухолевых клеток, которые высвобождают большое количество ИЛ-8 и белки FAS-лиганда в ходе процесса апоптоза. Стволовые клетки рака молочной железы стимулируются посредством опосредованного ИЛ-8 эффекта свидетеля и устойчивы к губительному эффекту свидетеля, опосредованного FAS-лигандом. В. Лечение репертаксином блокирует передачу сигнала ИЛ-8/CXCR1 и ингибирует самообновление и выживание стволовых клеток рака молочной железы. При сочетании лечения репертаксином с химиотерапией стволовые клетки рака становятся чувствительными к убийственному эффекту свидетеля, опосредованного FAS-лигандом. Определения Для облегчения понимания данного изобретения ниже даны определения терминов и фраз. В данном изобретении термины "противораковый препарат", "обычно используемый противораковый препарат" или "лекарственное средство для лечения рака" относятся к любому лекарственному средству (например, соединения для химической терапии и/или молекулярные лекарственные соединения),лучевой терапии или хирургическим вмешательствам, используемым для лечения рака (например, у млекопитающих). В данном изобретении термины "препарат" и "химиотерапевтический препарат" относятся к фармакологически активным молекулам, используемым для диагностики, лечения или предотвращения заболеваний или патологических состояний в физиологической системе (например, у пациента, в условиях invivo, in vitro или ex vivo относительно клеток, тканей и органов). Препараты действуют путем изменения физиологии живого организма, ткани, клетки или in vitro системы, относительно которых и был введен препарат. Подразумевается, что термины "препарат" и "химиотерапевтический препарат" включают антигиперпролиферативные и антинеопластические соединения, а также другие биологические лекарственные соединения."Эффективное количество" является количеством, достаточным для получения полезного эффекта или желаемого результата. Эффективное количество может быть введено за один или несколько раз. В данном изобретении термин "введение" относится к действию введения препарата, пролекарства,антитела или другого агента или терапевтического лечения в физиологическую систему (например, пациенту, в условиях in vivo, in vitro или ex vivo относительно клеток, тканей и органов). Примеры путей введения в организм человека включают введение в глаза (глазное), через рот (пероральное), кожу (чрескожное), нос (интраназальное), легкое (ингаляция), слизистую рта (буккальное), уши, путем инъекции"Совместное введение" относится к введению более одного химического препарата или метода лечения (например, лучевой терапии) в физиологическую систему (например, пациенту, в условиях in vivo,in vitro или ex vivo относительно клеток, тканей и органов). "Совместное введение" соответствующих химических препаратов (например, антагониста пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1 и дополнительной химиотерапии) может быть одновременным или проводится в порядке очередности или физической комбинации. В данном изобретении термин "регрессия" относится к возврату больного пациента, клетки, ткани или органа в непатологическое или менее болезненное состояние в сравнении с исходным непатогенным состоянием пациента, клетки, ткани или органа. Например, регрессия опухоли включает снижение массы опухоли и полное исчезновение опухоли или опухолей. В данном изобретении термин "in vitro" относится к искусственной среде и процессам или реакциям, которые происходят в такой искусственной среде. Среды in vitro могут включать, но не ограничиваться, пробирки для испытаний и клеточные культуры. Термин "in vivo" относится к естественной среде(например, у животного или в клетке) и процессам или реакциям, которые происходят в такой естественной среде. В данном изобретении термин "клеточная культура" относится к любой in vitro культуре клеток. Данный термин включает непрерывные клеточные линии (например, клетки с бессмертным фенотипом),первичные клеточные культуры, перевиваемые линии клеток (например, нетрансформируемые клетки) и любые другие популяции клеток, содержащиеся в условиях in vitro, включая ооциты и эмбрионы. В данном изобретении термин "организм" или "пациент" относится к организмам, подвергнутым лечению способами данного изобретения. Такие организмы включают, но не ограничиваются, людей и животных, используемых в ветеринарии (собак, кошек, лошадей, свиней, крупный рогатый скот, овец,козлов и т.п.). В контексте изобретения термин "организм" или "пациент" обычно относится к индивидууму, который будет принимать или был подвергнут лечению. В данном изобретении термин "диагностированный" относится к распознаванию болезни по ее признакам и симптомам или генетическому анализу, патологическому анализу, гистологическому анализу и т.д. В данном изобретении термин "антисмысловой" используется относительно последовательностей нуклеиновой кислоты (например, РНК, фосфотиоат ДНК), которые комплементарны специфической последовательности РНК (например, мРНК). Данное определение включает природные или синтетические антисмысловые молекулы РНК, включая молекулы, которые регулируют экспрессию генов, например малые интерферирующие РНК или микроРНК. Одним из типов антисмысловой последовательности, который может использоваться данным изобретением, является тип, специфичный для CXCR1 мРНК. Термин "исследуемое соединение" или "кандидатное соединение" относится к любому химическому веществу, фармацевтическому препарату, препарату и т.п., которое может использоваться для лечения или предотвращения болезни, заболевания, слабости или расстройства функции организма или другим образом изменять физиологический или клеточный статус образца. Исследуемые соединения включают известные и потенциальные терапевтические соединения. Исследуемое соединение может определяться как терапевтическое путем использования методов скрининга данного изобретения. "Известное терапевтическое соединение" относится к терапевтическому соединению, чья эффективность в лечении или предотвращении заболевания была доказана (например, посредством исследований на животных или перед введением людям). В предпочитаемых вариантах исполнения "исследуемые соединения" являются противораковыми препаратами. В отдельных предпочитаемых вариантах исполнения "исследуемые соединения" являются противораковыми препаратами, индуцирующими апоптоз в клетках. В данном изобретении термин "антигенсвязывающий белок" относится к белкам, связывающимся со специфическим антигеном. "Антигенсвязывающие белки" включают, но не ограничиваются, иммуноглобулины, включая поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные и гуманизированные антитела, Fab фрагменты, F(ab')2 фрагменты и Fab экспрессионные библиотеки. Известные науке различные процедуры используются для получения поликлональных антител. Для получения антител могут быть иммунизированы разные животные-хозяева путем инъекции пептида, соответствующего желаемому эпитопу; такие животные могут включать, не ограничиваясь представленными, кроликов, мышей, крыс, овец, козлов и т.д. В предпочитаемых вариантах исполнения пептид конъюгирован с иммуногенным носителем (например, дифтерийным токсином, бычьим сывороточным альбумином (БСА) или гемоцианином фиссуреллы (KLH. Для повышения иммунологического ответа используются различные адъюванты в зависимости от вида-хозяина, которые могут включать, не ограничиваясь представленными, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, например алюминия гидроксид, поверхностно-активные вещества, например лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды,масляные эмульсии, гемоцианин фиссуреллы, динитрофенол, и потенциально полезные для человека адъюванты, например бациллу Кальмета-Герена и Corynebacterium parvum. Для приготовления моноклональных антител может использоваться любой метод, позволяющий получить молекулы антитела с использованием непрерывных клеточных линий в культуре (см. Harlowand Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Они включают, но не ограничиваются представленными, метод гибридомы, который был разработанKuhler и Milstein (Kuhler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975, а также метод триомы, метод человеческой гибридомы В-клеток (см. Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983, и метод ВЭБ-гибридомы для выработки человеческих моноклональных антител (Cole et al., в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., с. 77-96 (1985. Согласно изобретению способы, описанные для получения одноцепочечных антител (US 4946778; включено в текст посредством ссылки), могут быть адаптированы для получения специфических одно- 10023466 цепочечных антител в соответствии с необходимостью. В дополнительных вариантах исполнения изобретение использует способ, известный в науке для построения Fab экспрессионных библиотек (Huse etal., Science, 246:1275-1281 (1989, что позволяет быстро и легко идентифицировать моноклональные Fab фрагменты с желаемой специфичностью. Фрагменты антитела, содержащие идиотип (антигенсвязывающий участок) молекулы антитела, могут быть получены известными способами. Например, такие фрагменты включают, не ограничиваясь,следующее: F(ab')2 фрагмент, который может быть получен при расщеплении пепсином молекулы антитела; Fab' фрагменты, которые могут быть получены при снижении количества дисульфидных мостиков в F(ab')2 фрагменте, и Fab фрагменты, которые могут быть получены при обработке молекулы антитела папаином и восстанавливающим агентом. Гены, кодирующие антигенсвязывающие белки, могут быть выделены способами, известными науке. В производстве антител скрининг необходимого антитела может сопровождаться известными науке способами (например, радиоиммунный анализ, ИФА (иммуноферментный анализ, сэндвич-имунный анализ, количественный радиоиммунный анализ, реакции преципитации при диффузии в геле, иммунодиффузия, in situ иммуноанализы (с использованием коллоидного золота, фермента или радиоизотопных меток, например), вестерн-блоттинг, реакции преципитации, тесты агглютинации (например, анализ агглютинации в геле, тесты гемагглютинации, и т.д.), анализы связывания комплемента, анализы иммунофлуоресценции, анализ белка А, иммуноэлектрофорез и т.д.) и т.д. В данном изобретении термин "модулировать" относится к активности соединения затрагивать (например, для способствования или замедления) аспект клеточной функции, включая, но не ограничиваясь,рост клеток, пролиферацию, инвазию, ангиогенез, апоптоз и т.п. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение предоставляет способы лечения рака путем введения ингибитора ИЛ 8/CXCR1 (например, антитела к CXCR1 или репертаксина) в качестве монотерапии или в сочетании с дополнительным препаратом химиотерапии, что приводит к гибели неопухолеобразующих и опухолеобразующих раковых клеток. Настоящее изобретение также описывает композицию и способы лечения и диагностики наличия стволовых клеток солидной опухоли у пациента (например, на основе присутствияI. Ингибирование опухолеобразующих раковых клеток, ALDH, CXCR1 и CXCR1. Эволюция здоровой клетки в полностью трансформированную клетку требует дерегуляции множества клеточных процессов (1, 2). Согласно классической модели карциногенеза, такие явления могут возникать в любой клетке. В отличие от этого "гипотеза стволовой раковой клетки" гласит о том, что доминирующими мишенями онкогенной трансформации являются стволовые клетки, или клетки ткани,или клетки-предшественники, которые приобрели потенциал самообновления (3-6). Такие "опухолеобразующие клетки" или "стволовые раковые клетки" (СРК), в свою очередь, характеризуются своей способностью к самовосстановлению, т.е. процессу, запускающему образование опухоли и дифференциацию,способствующую клеточной гетерогенности опухоли. Последнее доказательство, выступающее в поддержку гипотезы стволовых раковых клеток, было получено с помощью ксенотрансплантатов первичных опухолей человека. Такие исследования позволили предположить, что опухоли состоят из клеточной иерархии, запускаемой компонентом стволовых раковых клеток. Кроме того, полученные недавно данные указывают, что иммортализированные линии клеток из тканей мыши и человека также содержат клеточную популяцию, имеющую свойства стволовых клеток. Большинство таких исследований были основаны на in vitro свойствах, включающих клоногенный потенциал, образование онкосферы и потенциал смешанной дифференциации (7-10). Много ограниченных исследований, использующих функциональную трансплантацию иммортализированных линий клеток в ксенотрансплантаты, также указывают на существование подобной иерархии. Такие исследования обычно использовали краситель Хехст для выявления так называемой "боковой популяции" (БП) (7, 9, 11). Кроме того, маркеры на поверхности клеток, определенные с помощью ксенотрансплантатов первичной опухоли, таких как CD44 и CD133,также использовались для выявления подобных популяций в установленных клеточных линиях (7, 8). Как это описано в примерах ниже, экспрессия маркера стволовой клетки альдегиддегидрогеназы(ALDH) изучалась на серии 33 линий клеток, полученных из клеток рака молочной железы человека и нетрансформированных клеток молочной железы. ALDH является ферментом детоксикации, ответственным за окисление внутриклеточных альдегидов и играющим роль в дифференциации стволовых клеток посредством метаболизма ретиналя в ретиноевую кислоту (12, 13). Активность ALDH, оцененная с помощью флуоресцентного анализа ALDEFLUOR, с успехом использовалась для изоляции стволовых раковых клеток при множественной миеломе и остром миелоидном лейкозе (ОМЛ), а также из опухолей мозга (14-16). Недавно было показано, что активность ALDH может использоваться для изоляции субпопуляции клеток, обладающих свойствами стволовых клеток, из здоровой ткани молочной железы человека и карцином молочной железы (17). ALDEFLUOR-положительная популяция, выделенная из ткани в ходе операции по уменьшению молочной железы, способна восстановить альвеолярные структуры протоков в жировой подушке молочной железы гуманизированных мышей линии NOD/SCID. Более того,ALDEFLUOR-положительные клетки, выделенные из карцином молочной железы человека, обладают свойствами стволовых клеток, о чем свидетельствует их способность восстановить опухоли при серийных пассажах у мышей линии NOD/SCID, a также образование фенотипической гетерогенности в первичных опухолях (17). В представленных ниже примерах показано, что большинство линий клеток рака молочной железы содержит ALDEFLUOR-положительную популяцию с отличительным молекулярным профилем, обладающим свойствами стволовых клеток рака. Как это описано в примерах ниже, работа, проведенная во время разработки вариантов исполнения изобретения, определила CXCR1 (являющийся рецептором для воспалительного хемокина ИЛ-8) в качестве маркера стволовых раковых клеток. Только клетки в ALDEFLUOR-положительной популяции экспрессируют CXCR1. Более того, было показано, что данный рецептор играет функциональную роль в увеличении рекомбинантным ИЛ-8 соотношения клеток в линиях клеток, как это было выявлено анализами ALDEFLUOR и возникновения новообразований. Несмотря на то что сообщалось о связи ИЛ-8 и агрессивного рака молочной железы и его содержание повышено у женщин с метастазирующими опухолями, считается, что данное изобретение является первым, которое доказывает функциональную связь между ИЛ-8 и его рецептором CXCR1 в стволовых клетках. Как это описано в дальнейшем в примерах, было показано, что можно выборочно поражать стволовые раковые клетки путем блокады рецептора CXCR1 на таких клетках. В одном способе, описанном в примерах, клеточные линии рака молочной железы были подвергнуты воздействию моноклональных антител к CXCR1, но не к другому рецептору ИЛ-8 CXCR2. Подобное воздействие избирательно поражает стволовые раковые клетки, как это доказано снижением ALDEFLUOR-положительных популяций. Примечательно, что было обнаружено, что CXCR1 экспрессируется на очень небольшом количестве клеток (т.е. менее 1%), что блокирует индуцируемую рецептором CXCR1 гибель клеток на большинстве других раковых клеток, несмотря на небольшое количество рецепторов CXCR1. Был изучен молекулярный путь, который опосредует эффекты ИЛ-8 на стволовые раковые клетки и ответственен за так называемый "эффект свидетеля" в гибели других клеток. ИЛ-8 стимулирует самовосстановление стволовых клеток путем связывания с CXCR1, что, в свою очередь, активирует очагово-адгезивную киназу (Fak). Это приводит к активации Akt, что запускает процесс самовосстановления стволовых клеток. При блокировании этого процесса в стволовых раковых клетках снижение способности передачи сигнала Akt вызывает секвестрацию цитоплазмы факторов транскрипции Foxo, приводя к увеличению синтеза лиганда Fas. Fas-лиганд секретируется стволовыми раковыми клетками и индуцирует гибель окружающих клеток, содержащих Fas-рецептор. В то время как данное изобретение не ограничено каким-либо особым механизмом и понимание такого механизма не является обязательным условием для практического применения данного изобретения считается, что CXCR1 опосредует самовосстановление стволовых раковых клеток посредством пути,включающем Fak и Akt, a блокада такого пути индуцирует гибель стволовых раковых клеток и окружающих клеток опухоли. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения изобретения последнее описывает композиции и способы нарушения пути ИЛ 8-CXCR1 (например, с использованием антител кCXCR1, антител к FAK или других агентов) для лечения рака. Поскольку ИЛ-8 является хемокином, вовлеченным в воспалительный процесс в ткани, ранее проявлялся интерес к разработке ингибиторов передачи сигнала ИЛ-8. Будучи ингибитором с небольшим размером молекулы, репертаксин был разработан в качестве противовоспалительного препарата для потенциального снижения осложнений инфаркта миокарда и инсульта. Репертаксин был введен в клинические исследования I и II фазы, и была выявлена его незначительная токсичность. Как это показано в примерах ниже, репертаксин (подобно антителам к CXCR1) способен поражать стволовые раковые клетки и индуцировать опосредованный Fas-лигандом апоптоз с помощью "эффекта свидетеля" в окружающих клетках. Важно, что в опухолевых ксенотрансплантатах репертаксин усиливает эффект химиотерапии. Более того, в отличие от химиотерапии, которая преимущественно уничтожает дифференцированные клетки в опухолях, удерживая стволовые клетки опухоли, репертаксин способен поражать стволовые клетки опухоли. Как это показано в примерах, данный факт был доказан путем снижения популяцииALDEFLUOR в опухолях, подвергнутых лечению репертаксином, а также путем снижения способности таких подвергнутых лечению клеток опухолей образовывать вторичные опухоли у мышей. Также был подвергнут испытаниям эффект репертаксина на способность блокирования метастазов. Опухолевые клетки были помечены люциферазой, после чего они были интракардиально введены в экспериментальную модель метастазов. По прошествии одного дня клетки опухоли были введены животным, причем одна группа животных получала лечение репертаксином, а лечение во второй группе отсутствовало. Репертаксин значительно снизил развитие метастазов. Данное изобретение определило, что ИЛ-8 рецептор CXCR1 является мишенью при лечении стволовых раковых клеток. Небольшая молекула ингибитора репертаксина ингибирует как CXCR1, так иCXCR2. Примеры показывают, что CXCR1 является наиболее важным рецептором в стволовых раковых клетках. Более того, примеры показывают, что неудача цитотоксической терапии относительно эффективного лечения установленного вида рака может быть вызвана не только неспособностью данной терапии поражать стволовые раковые клетки, но также и в результате добавления доказанного повышения секреции ИЛ-8 к цитотоксическому химиотерапевтическому лечению опухоли. Представленные приме- 12023466 ры указывают, что использование ингибиторов CXCR1 имеет полезный эффект относительно избирательного поражения стволовых раковых клеток и блокирования стимуляции ИЛ-8 таких клеток, индуцированного цитотоксической терапией. Направленность на путь ИЛ 8-CXCR1 не ограничивается только раком молочной железы, наоборот,она может использоваться при раке любого типа. Для лечения предпочтителен тип рака, при котором имеются доказательства повышенной выработки ИЛ-8 (например, в сочетании с химиотерапией). Было показано, что препараты химиотерапии напрямую регулируют транскрипцию ИЛ-8 в раковых клетках. Паклитаксел повышает транскрипцию ИЛ-8 и его секрецию в клеточных линиях рака яичников, молочной железы и легких (Uslu et al., 2005, Int. J. Gynecol. Cancer, 15:240-245; and Collins et al., 2000, Can.Imm. Immuno., 49:78-84, оба источника включены в текст в виде ссылок). Кроме того, введение адриамицина и 5-фтор-2'-дезоксиуридина в клетки рака молочной железы (DeLarco et al., 2001, Can. Res. 61:28572861, включено в виде ссылки), добавление 5-ФУ в клетки рака ротовой полости (Tamatani et al., 2004,Int., J. Can., 108:912:921, включено в виде ссылки), добавление доксорубицина в небольшие клетки рака легкого (Shibakura et al., 2003, Int. J. Can., 103:380-386, включено в виде ссылки) и введение дакарбазина в клетки меланомы (Lev et al., 2003, Mol., Can. Ther., 2:753-763, включено в виде ссылки) приводило к усилению экспрессии CXCL8. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения изобретения последнее описывает препараты для поражения IL-CXCR1 при их комбинированном использовании со средствами химиотерапии (например, средствами, представленными в приведенных выше ссылках) для лечения пациента с разными типами рака, которые включают, но не ограничиваются, следующие: рак предстательной железы, рак яичника, рак молочной железы, меланома, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и аденокарцинома пищевода. Данное изобретение не ограничивается типом рака, подвергнутого лечению, и включает (но не ограничивается представленным) фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, рак толстой кишки,рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточный рак, базально-клеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточный рак, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки,рак яичек, карциному легкого, мелкоклеточную карциному легкого, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, невроному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому и ретинобластому.II. Определение маркеров стволовых раковых клеток солидных опухолей. В некоторых вариантах исполнения изобретения содержатся способы определения экспрессии маркеров стволовых раковых клеток (например, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, ТВР и других белков, представленных в табл. 1). В некоторых вариантах исполнения изобретения описывается их непосредственное определение (например, на уровне РНК или белка). В некоторых вариантах исполнения изобретения экспрессия определяется в образцах тканей (например, при биопсии тканей). В некоторых вариантах исполнения изобретения экспрессия определяется в жидкостях организма (например,включая (но не ограничиваясь) плазму, сыворотку, цельную кровь, слизь и мочу). Данное изобретение в дальнейшем описывает панели и наборы для определения маркеров. В некоторых вариантах исполнения изобретения присутствие маркера стволовых раковых клеток используется для прогноза результата лечения для пациента. Представленная информация также используется для направления курса лечения. Например, если у пациента обнаружен маркер, свойственный стволовой клетке солидной опухоли (например, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, ТВР и другие белки из табл. 1), может быть начато дополнительное лечение на ранней стадии, когда такое лечение может быть эффективным (т.е. до появления метастазов). Кроме того, если у пациента обнаружена опухоль без ответа на определенную терапию, можно избежать лишних затрат и неудобств данной терапии. В некоторых вариантах исполнения изобретение описывает панель для анализа множества маркеров (например, комбинации CXCR1 или FBXO21 и как минимум одного CD44, CD24 и ESA). Панель позволяет осуществлять одновременный анализ множества маркеров, коррелирующих с карциногенезом и/или метастазами. В зависимости от пациента панели могут быть проанализированы по одной или в сочетании для обеспечения наилучшего возможного диагноза и прогноза. Маркеры для включения на панель отбираются путем скрининга на предмет их прогностической значимости с использованием любого подходящего способа, включая, но не ограничиваясь, способами, описанными в иллюстративных примерах ниже. 1. Определение РНК. В некоторых вариантах исполнения изобретения определение маркеров стволовых клеток солидной опухоли осуществляется путем измерения экспрессии соответствующей мРНК в образце ткани. Экспрессия мРНК может быть измерена с помощью любого подходящего способа, включая, но не ограничива- 13023466 ясь, способы, представленные ниже. Номер доступа для человеческой нуклеиновой кислоты CXCR1 составляет NM000634 (включено в виде ссылки) и номер доступа для человеческого FBXO21 составляетNM033624 (включено в виде ссылки). Такие последовательности могут использоваться для разработки праймеров и зондов (а также последовательностей миРНК). В некоторых вариантах исполнения изобретения РНК определяется с помощью Нозерн-блоттинга. Нозерн-блоттинг подразумевает сепарацию РНК и гибридизацию комплементарно-маркированного зонда. В дальнейших вариантах исполнения изобретения РНК (или соответствующая кДНК) определяется путем гибридизации в олигонуклеотидный зонд. Имеется целый ряд анализов гибридизации, использующих множество технологий гибридизации и последующего определения. Например, в некоторых вариантах исполнения изобретения используется анализ TaqMan РЕ Biosystems, Foster City, CA; см. примеры, патенты США 5962233 и 5538848, каждый из который включен в данный текст в виде ссылки). Анализ выполняется в течение ПЦР. TaqMan-анализ использует активность 5'-3' экзонуклеазы ДНК-полимеразы AMPLITAQ GOLD. В ПЦР включен зонд, состоящий из олигонуклеотида с 5'красителем-репортером (например, флуоресцирующим красителем) и 3'-красителем-блокатором. Если в ходе ПЦР зонд связывается со своей мишенью, 5'-3' нуклеолитическая активность полимеразы AMPLITAQ GOLD расщепляет зонд между красителем-репортером и блокатором. Сепарация красителярепортера от красителя-блокатора приводит к повышению флуоресценции. Сигнал накапливается с каждым циклом ПЦР и может отслеживаться с помощью флуориметра. В других вариантах исполнения изобретения для определения экспрессии РНК используется ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). В ходе ОТ-ПЦР РНК ферментативно конвертируется в комплементарную ДНК или "кДНК" с использованием фермента обратной транскриптазы. Затем кДНК используется в качестве шаблона для ПЦР. Продукты ПЦР могут быть определены с использованием любого подходящего метода, включая, но не ограничиваясь, электрофорез в геле и окрашивание с помощью ДНКспецифичного красителя, или гибридизации в меченый зонд. В некоторых вариантах исполнения изобретения используется количественная ПЦР с обратной транскриптазой и стандартизованными смесями соответствующих шаблонов (метод описан в патентах США 5639606, 5643765 и 5876978, каждый их которых включен в текст в виде ссылки ). 2. Определение белка. В других вариантах исполнения изобретения экспрессия генов маркеров стволовых раковых клеток определяется путем измерения экспрессии соответствующего белка или полипептида (например,CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, ТВР и других белков из табл. 1). Экспрессия белка может быть определена любым подходящим способом. В некоторых вариантах исполнения изобретения белки определяются иммуногистохимическим анализом. В некоторых вариантах исполнения изобретения белки определяются по их связыванию с антителом против белка. Номер доступа для человеческого белкаCXCR1 составляет NM000625 (включено в виде ссылки) и номер доступа для человеческого FBXO21 составляет NM296373 (включено в виде ссылки). Получение антител описано ниже. Связывание антител определяется с использованием методов, известных науке (например, радиоиммуноанализ, ИФА (иммуноферментный анализ), например сэндвич-анализ, иммунорадиометрический анализ, реакция преципитации с гель-диффузией, анализ иммунодиффузии, in situ иммуноанализы (например, использование коллоидного золота, фермента или радиоизотопных меток), вестерн-блоттинг,реакции преципитации, реакции агглютинации (например, тест гель-агглютинации, тесты гемагглютинации), тесты фиксации комплемента, анализы иммунофлуоресценции, тесты белка А, анализ иммуноэлектрофореза и т.д.). В другом варианте исполнения изобретения связывание антител определяется путем выявления метки на первичном антителе. В другом варианте исполнения изобретения первичное антитело определяется путем выявления связывания вторичного антитела или реагента с первичным антителом. В дальнейшем изобретение описывает метку вторичного антитела. Науке известно много способов для определения связывания в ходе иммуноанализа, и такие способы включены в сферу применения данного изобретения. В некоторых вариантах исполнения изобретения используется автоматическое определение. Методы автоматических иммуноанализов включают способы, описанные патентами США 5885530,4981785, 6159750 и 5358691, каждый из которых включен в данный текст в виде ссылок. В некоторых вариантах исполнения изобретения анализ и представление результатов также автоматические. Например, в некоторых вариантах исполнения используется программное обеспечение, генерирующее прогноз,основанный на присутствии или отсутствии серий белков, соответствующих маркерам рака. В других вариантах исполнения используется иммуноанализ, описанный в патентах США 5599677 и 5672480, каждый из которых включен в данный текст в виде ссылки. 3. Технология микроматрицы кДНК. Микроматрицы кДНК состоят из множества (обычно тысяч) разных кДНК, размещенных (с использованием роботизированного устройства для нанесения пятен) в известные положения на плотной основе, например на предметном стекле микроскопа. кДНК обычно получают с помощью ПЦР амплифика- 14023466 ции плазмидной библиотеки с использованием праймеров, комплементарных векторной основе плазмиды или самого гена для генов с известной последовательностью. Продукты ПЦР подходят для получения микроматриц и обычно составляют в длину 0,5 и 2,5 кВ. Может быть выбрана полная длина кДНК, экспрессируемых маркерных последовательностей (ЭМП) или случайным образом выбранных кДНК из любой интересующей библиотеки. ЭМП частично секвентируются кДНК, как это описано, например,Hillier, et al., 1996, 6:807-828. Несмотря на то что некоторые ЭМП соответствуют известным генам, зачастую доступно очень малое количество информации или информация о соответствующем ЭМП отсутствует вообще, за исключением небольшого количества 3' и/или 5' последовательности и, возможно, ткани происхождения мРНК, из которой была получена ЭМП. Как это будет оценено одним из специалистов в данной области, в целом кДНК содержит достаточно информации о секвенции для уникальной идентификации гена в геноме человека. Более того, в целом кДНК имеют достаточную длину для гибридизации избирательным, специфичным или уникальным образом в кДНК, полученную из мРНК отдельного гена в условиях экспериментальной гибридизации. В ходе стандартного эксперимента с использованием микроматрицы последняя гибридизируется с помощью дифференциально меченых популяций РНК, ДНК или кДНК, полученных из двух разных образцов. Большинство обычно используемых РНК (вся РНК или поли А+РНК) изолируется из интересующих клеток или тканей и подвергается обратному транскрибированию для получения кДНК. Мечение обычно выполняется в течение обратной транскрипции путем введения меченого нуклеотида в реакционную смесь. Несмотря на то что могут использоваться разные метки, наиболее часто нуклеотиды конъюгируются с флуоресцирущими красителями Су 3 или Су 5. Например, могут использоваться Cy5dUTP и Су 3-dUTP. кДНК, полученная из одного образца (представляя, например, особый тип клетки, тип ткани или состояние роста) подлежит мечению одним флуорофором, в то время как кДНК, полученная из другого образца (представляя, например, другой тип клетки, тип ткани или состояние роста), подлежит мечению вторым флуорофором. Подобные количества меченого материала из двух образцов подлежат ко-гибридизации в микроматрице. В случае эксперимента с микроматрицей, в ходе которого образцы подвергаются мечению с использованием Су 5 (флуоресценция красным) и Су 3 (флуоресценция зеленым), основные данные (полученные путем сканирования микроматрицы с использованием детектора,способного качественно определить интенсивность флуоресценции) представлены соотношением интенсивности флуоресценции (красный/зеленый, К/З). Такие соотношения представляют собой относительные концентрации молекул кДНК, которые были гибридизированы в кДНК, представленные на микроматрице и отражающие, таким образом, уровни относительной экспрессии мРНК, соответствующей каждой кДНК/гену, представленным на микроматрице. Каждый эксперимент с микроматрицей может предоставить тысячи опорных точек, каждая из которых представляет собой относительную экспрессию отдельного гена в двух образцах. Соответствующая организация и анализ данных имеют особую важность, и были разработаны множественные компьютерные программы, использующие стандартные статистические инструменты, для облегчения анализа данных. Одна основа для организации данных об экспрессии генов состоит в группировке генов с подобными моделями экспрессии вместе в один кластер. Способ для выполнения иерархического анализа кластеров и отображения данных, полученных в ходе экспериментов с микроматрицей, описан Eisen et al.,1998, PNAS 95:14863-14868. Как это описано здесь, кластеринг может быть объединен с графическим представлением первичных данных, в которых каждая точка данных приводится цветом, который качественно и количественно описывает отдельную точку данных. Путем конвертации данных из большой таблицы с цифрами в визуальный формат, такой процесс облегчает их интуитивный анализ. Дополнительная информация и детали относительно математических инструментов и/или метода кластеринга может быть получена, например, из SokalSneath, Principles of numerical taxonomy, xvi, 359, W.H. Freeman, San Francisco, 1963; Hartigan, Clustering algorithms, xiii, 351, Wiley, New York, 1975; Paull et al., 1989,J. Natl. Cancer Inst. 81:1088-92; Weinstein et al. 1992, Science 258:447-51; van Osdol et al., 1994, J. Natl. Cancer Inst. 86:1853-9 and Weinstein et al., 1997, Science, 275:343-9. Дополнительная информация об используемых в данном изобретении методах эксперимента представлена в примерах ниже. Дополнительная информация, описывающая методы получения и использования микроматрицы, представлена в патенте США 5807522, включенном в данный текст в виде ссылки. Инструкции по конструированию аппаратного обеспечения для микроматриц (например, матричных анализаторов и сканеров) включают представленные на рынке детали. Дополнительные обсуждения технологии микроматриц и протоколов для приготовления образцов и выполнения микроматричного эксперимента представлены, например, в DNA arrays for analysis of gene expression, Methods Enzymol, 303:179-205, 1999; Fluorescence-based expression monitoring using microarrays, Methods Enzymol, 306: 3-18, 1999 and M. Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford,UK, 1999. 4. Анализ данных. В некоторых вариантах исполнения изобретения используется компьютерная программа для перевода необработанных данных, полученных при анализе матрицы (например, наличие, отсутствие или количества заданного маркера или маркеров), в данные, имеющие для доктора прогностическое значе- 15023466 ние. Доктор может оценить прогностические данные с использованием любых подходящих способов. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения изобретения последнее предоставляет докторам, не обладающим глубокими знаниями молекулярной биологии и генетики, дополнительную пользу относительно отсутствия необходимости в понимании необработанных данных и знаний в области генетики или молекулярной биологии. Данные представляются непосредственно доктору в наиболее понятной форме. Затем доктор может немедленно использовать информацию для оптимизации ухода за пациентом. Данное изобретение рассматривает любой способ получения, обработки и передачи информации из/в лаборатории, проводящие анализы, получения информации, с включением медицинского персонала и пациентов. Например, в некоторых вариантах исполнения данного изобретения образец (например,биопсия или сыворотка или образец мочи) отбирается у пациента и предоставляется соответствующей службе (например, клинической лаборатории в медицинском учреждении, учреждению генетической направленности и т.д.), расположенной в любой части мира (например, в другой стране, которая отличается от страны проживания пациента или страны конечного использования информации) для получения необработанных данных. В случае если образец представлен тканью или другим биологическим образцом, пациент может посетить медицинский центр для взятия образца и его отсылки в профильный центр или пациенты могут собрать образцы сами и непосредственно передать их в профильный центр. Если образец содержит предварительно определенную биологическую информацию, последняя может быть напрямую отослана профильной службе пациентом (например, информационная карта может быть просканирована с помощью компьютера, а данные переданы в компьютер профильного центра с использованием электронных систем передачи данных). При получении профильным центром образец обрабатывается и составляется его профиль (например, данные экспрессии), специфичный для диагностики или получения прогностической информации для пациента. Затем данные профиля готовятся в формате, подходящем для интерпретации лечащим врачом. Например, вместо предоставления необработанных данных об экспрессии (например, обследование ряда маркеров) подготовленный формат может представлять собой диагноз или оценку риска для пациента вместе с рекомендациями для отдельных методов лечения. Данные могут отображаться доктору любым подходящим образом. Например, в некоторых вариантах исполнения эксперимента профильная служба генерирует отчет, который может быть распечатан для доктора (например, в месте оказания ухода) или отображен на мониторе компьютера. В некоторых вариантах исполнения изобретения информация сначала анализируется в месте оказания ухода или региональном учреждении. Затем необработанные данные отсылаются центральному обрабатывающему учреждению для дальнейшего анализа и/или конвертации необработанных данных в информацию, полезную для доктора или пациента. Центральное учреждение по обработке данных гарантирует конфиденциальность (все данные хранятся в центральном учреждении в виде одинаковых протоколов службы безопасности), скорость и однообразие анализа данных. Центральное учреждение по обработке данных может контролировать судьбу данных после лечения пациента. Например, путем использования системы электронной передачи данных центральное учреждение может предоставить данные доктору, пациенту или исследователям. В некоторых вариантах исполнения изобретения пациент имеет непосредственный доступ к данным с помощью электронной системы передачи данных. Пациент может выбрать дальнейшее вмешательство или отказать в нем на основе результатов. В некоторых вариантах исполнения изобретения данные используются в целях исследования. Например, данные могут использоваться для дальнейшей оптимизации включения или элиминации маркеров как полезных индикаторов отдельного состояния или стадии заболевания. 5. Наборы. В других вариантах исполнения изобретения последнее описывает наборы для определения и характеристики рака (например, для определения одного или нескольких маркеров или для модуляции активности пептида, экспрессируемого одним или несколькими маркерами). В некоторых вариантах исполнения наборы содержат антитела, специфичные относительно маркера рака в добавление к реагентам и буферам для выявления. В других вариантах исполнения изобретения наборы содержат реагенты, специфичные для определения мРНК или кДНК (например, олигонуклеотидные зонды или праймеры). В некоторых вариантах исполнения изобретения наборы содержат все компоненты, необходимые и/или достаточные для выполнения анализа-определения, включая все контроли, направления для выполнения анализов, и все необходимое программное обеспечение для анализа и представления результатов. Другой вариант исполнения данного изобретения включает набор для тестирования присутствия полинуклеотидов или белков. Набор может включать, например, антитело для определения полипептида или зонда для определения полинуклеотида. Кроме того, набор может включать эталонный или контрольный образец, инструкции по обработке образцов, выполнению теста и интерпретации результатов,а также буферы и другие реагенты, необходимые для проведения теста. В других вариантах исполнения изобретения набор включает пары праймеров для определения экспрессии одного или нескольких генов сигнатуры стволовых клеток солидной опухоли. В других вариантах исполнения изобретения набор включает кДНК или олигонуклеотидные матрицы для определения экспрессии одного или нескольких генов сигнатуры стволовых клеток солидной опухоли. 6. In vivo визуализация. В некоторых вариантах исполнения способы in vivo визуализации используются для визуализации экспрессии маркеров рака у животного (например, человека или не принадлежащего к человеческому роду млекопитающего). Например, в некоторых вариантах исполнения изобретения маркер рака мРНК(например, CXCR1 или FBXO21 мРНК) подлежит мечению с использованием меченого антитела, специфичного относительно маркера рака. Специфически связанное и меченое антитело может быть выявлено у индивидуума с использованием метода in vivo визуализации, включая, но не ограничиваясь, радионуклидную визуализацию, позитрон-эмиссионную томографию, компьютерную осевую томографию, рентгенографию или магнитно-резонансную томографию, флуоресценцию или определение методом хемилюминесценции. Способы для получения антител к маркерам рака, используемые в данном изобретении,представлены ниже. Способы in vivo визуализации согласно данному изобретению можно применять для диагностики рака при наличии раковых маркеров стволовых клеток солидных опухолей. In vivo визуализация используется для визуализации наличия маркера, специфичного для вида рака. Такие методы позволяют ставить диагноз без применения неприятной биопсии. Способы in vivo визуализации для данного изобретения также полезны для предоставления прогноза пациентам с раком. Например, может быть выявлено наличие маркера, специфичного для стволовых клеток рака. Способы in vivo визуализации для данного изобретения могут в дальнейшем использоваться для определения раковых метастазов в других частях организма. В некоторых вариантах исполнения изобретения (например, антитела) реагенты, специфичные относительно CXCR1 или FBXO21, подлежат флуоресцирующему мечению. Меченые антитела вводятся индивидууму (например, перорально или парентерально). Флуоресцентно меченые антитела определяются с использованием любого подходящего способа (например, при использовании аппарата, описанного в патенте США 6198107, включен в данный текст в виде ссылки). В других вариантах исполнения изобретения антитела подлежат радиоактивному мечению. Использование антител для in vivo диагностики широко известно науке. Sumerdon et al. ( Nucl. Med. Biol 17:247254 [1990]) описали оптимизированное антитело-хелатор для радиоиммуносцинтиграфической визуализации опухолей с помощью индия-111 в качестве метки. Griffin et al. (J Clin One 9:631-640 [1991]) описали использование данного агента в определении опухолей у пациентов с подозрением на рак поджелудочной железы. Использование подобных агентов с парамагнитными ионами в качестве меток для магнитно-резонансной визуализации известно науке (Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342[1991]). Используемая метка будет зависеть от выбранного способа визуализации. Радиоактивные метки,такие как индий-111, технеций-99 м или йод-131, могут использоваться для плоскостного сканирования или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОЭКТ). Позитрон-излучающие метки, такие как флуорин-19, также могут использоваться для позитрон-эмиссионной томографии (ПЭТ). Для МРТ могут использоваться парамагнитные ионы, такие как гадолиний (III) или магний (II). Радиоактивные металлы с периодом полураспада от 1 ч до 3,5 дней могут использоваться для конъюгации с антителами; они включают скандий-47 (3,5 дня), галлий-67 (2,8 дня), галлий-68 (68 мин),технеций-99 м (6 ч) и индий-111 (3,2 дня), из них галлий-67, технеций-99 м и индий-111 предпочтительнее для визуализации в камере с гамма-лучами, а галлий-68 предпочтителен для позитрон-эмиссионной томографии. Полезный способ мечения антител таким радиометаллами представлен бифункциональным хелатообразующим агентом, например диэтилентриаминпентауксусной кислотой (ДТПА), как это описано, например, (Science 209:295 [1980]) для In-111 и Тс-99m, и by Scheinberg et al. (Science 215:1511 [1982]). Также могут использоваться и другие хелатообразующие агенты,однако 1-(ркарбоксиметоксибензил)ЭДТА и карбоксикарбоновый ангидрид ДТПА являются предпочтительными,т.к. их использование позволяет происходить конъюгации без существенного нарушения иммуннореакционной способности антитела. Другой метод для связывания ДТПА с белками состоит в использовании циклического ангидрида ДТПА, как это описано Hnatowich et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33:327 [1982]) для мечения альбумина ln111, но этот способ может быть адаптирован для мечения антител. Подходящий метод для мечения антител Тс-99m не предполагает использование хелатообразования с ДТПА и описан Crockford et al. (U.S. Pat.4323546, включен в данный текст в виде ссылки). Метод мечения иммуноглобулинов Тс-99m описан Wong et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29:251[1981]) для мечения антител. В случае радиометаллов, конъюгированных со специфическим антителом, их желательно вводить в большей пропорции относительно радиометки, что не приведет к нарушению иммуноспецифичности молекулы антитела. Дальнейшее улучшение может быть достигнуто путем проведения мечения радиоактивными метками в присутствии специфического маркера стволовых раковых клеток данного изобрете- 17023466 ния для обеспечения защиты антигенсвязывающего участка антитела. В дальнейшем изобретение описывает in vivo биофотонную визуализацию (Xenogen, Almeda, CA) для in vivo визуализации. Такой метод in vivo визуализации в режиме реального времени использует люциферазу. Ген люциферазы содержится в клетках, микроорганизмах и животных (например, в качестве химерного белка с маркером рака данного изобретения). В активном состоянии он приводит к реакции с излучением света. Для захвата изображения и его анализа используется ПЗС-камера и программное обеспечение.III. Антитела и фрагменты антител. Данное изобретение описывает изолированные антитела и фрагменты антитела к CXCR1, FBXO21,NFYA, NOTCH2, RAD51L1, ТВР и другим белкам, представленным в табл. 1. Антитело или фрагмент антитела может быть представлен любым моноклональным или поликлональным антителом, который специфически распознает такие белки. В некоторых вариантах исполнения изобретения последнее описывает моноклональные антитела или их фрагменты, которые специфически связываются с CXCR1,FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, ТВР и другими белками, представленными в табл. 1. В некоторых вариантах исполнения изобретения моноклональные антитела или их фрагменты являются химерными или гуманизированными антителами, которые специфически связываются с такими белками. В других вариантах исполнения изобретения моноклональные антитела или их фрагменты являются человеческими антителами, которые специфически связываются с такими протеинами. Антитела к CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, ТВР и другим белкам из табл. 1 используются в описанных здесь экспериментальных, диагностических и терапевтических методах. В некоторых вариантах исполнения изобретения антитела используются для определения экспрессии белкамаркера стволовых раковых клеток в биологических образцах, например в биопсии ткани пациента,плевральном выпоте или образце крови. Биопсии ткани могут быть разделены на секции, а определение белка может проводиться с использованием, например, иммунофлуоресценции или иммуногистохимического анализа. С другой стороны, отдельные клетки из образца изолируются, и экспрессия белка определяется на фиксированных или живых клетках с использованием ФАСК анализа. Кроме того, антитела могут использоваться в белковых моделях для определения экспрессии маркера стволовых раковых клеток, например на клетках опухоли, в клеточных лизатах или в других белковых образцах. В некоторых вариантах исполнения изобретения антитела используются для ингибирования роста опухолевых клеток путем контакта антител с опухолевыми клетками в ходе in vitro анализов клетки или с использованием invivo животных моделей. В других вариантах исполнения изобретения антитела используются для лечения рака у пациента путем введения терапевтически эффективного количества антитела к маркеру стволовых раковых клеток (например, из табл. 1). Поликлональные антитела могут быть приготовлены любым известным способом. Поликлональные антитела могут быть получены путем иммунизации животного (например, кролика, крысы, обезьяны,осла и т.д.) множественными подкожными или интраперитонеальными инъекциями соответствующего антигена (очищенного фрагмента пептида, рекомбинантного протеина с полной длиной, химерного белка и т.д.), опционно конъюгированного с гемоцианином фиссуреллы (KLH), сывороточным альбумином и т.д., разведенном в стерильном физиологическом растворе и комбинированном с адъювантом (например,полным или неполным адъювантом Фрейнда) для образования стабильной эмульсии. Затем поликлональное антитело восстанавливается из крови, асцита и т.п. иммунизированного животного. Собранная кровь подлежит сворачиванию, сыворотка осаждается, кровь очищается путем центрифугирования, и анализируется титр антитела. Поликлональные антитела могут быть выделены из сыворотки или асцита в соответствии со стандартными методами, используемыми в науке, включая аффинную хроматографию,ионообменную хроматографию, электрофорез в геле, диализ и т.д. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием методов гибридомы, например, описанных Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495. При применении такого метода мышь, хомяк или другое соответствующее животное-хозяин иммунизируется согласно описанному выше способу для достижения выработки лимфоцитами антител, которые специфически связывают иммунизирующий антиген. С другой стороны, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. После иммунизации лимфоциты изолируются и соединяются с подходящей клеточной линией миеломы с использованием, например, полиэтиленгликоля, для образования клеток гибридомы, которые затем могут быть изолированы из лимфоцитов и клеток миеломы. Гибридомы, вырабатывающие моноклональные антитела, направленные специфически относительно выбранного антигена, что определено путем иммунопреципитации, иммуноблоттинга или теста связывания in vitro (радиоиммуноанализ (РИА) или иммуноферментный анализ(ИФА, могут затем быть размножены в in vitro культуре с использованием стандартных методов (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) или в условиях in vivo в качестве асцитной опухоли у животного. Затем моноклональные антитела могут быть выделены из культуры среды или асцитной жидкости, как это описано для поликлональных антител выше. С другой стороны, моноклональные антитела также могут быть получены с использованием методов рекомбинантной ДНК, описанных в патенте США 4816567. Полинуклеопептиды, кодирующие моноклональное антитело, изолируются, например, из зрелой В-клетки или клетки гибридомы, напри- 18023466 мер, с использованием ОТ-ПЦР с праймерами олигонуклеотидов, где специфически амплифицируют гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи антитела, а их последовательность определяется с использованием стандартных процедур. Изолированные полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи,затем клонируются в подходящих векторах экспрессии, которые затем переносятся в клетки хозяина,например, клетки Е. coli, клетки обезьян COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые не вырабатывают иммуноглобулин; данные клетки вырабатывают необходимые моноклональные антитела. Кроме того, рекомбинантные моноклональные антитела или их фрагменты из используемых видов могут быть изолированы с использованием библиотек фаговых изображений, как это описано (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628 andMarks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597). Полинуклеотид(-ы), кодирущий моноклональное антитело, может быть в дальнейшем модифицирован с использованием целого ряда методов и технологии рекомбинантной ДНК для получения альтернативных антител. В одном варианте исполнения изобретения постоянные домены легких и тяжелых цепей, например, мышиного моноклонального антитела, могут быть замещены: 1) в участках, например,человеческого антитела, для получения химерного антитела или 2) в полипептиде, не являющемся иммуноглобулином, для получения антитела слияния. В других вариантах исполнения изобретения неизменные участки укорачиваются или удаляются для получения необходимого фрагмента моноклонального антитела. Более того, направленный или высокоплотный мутагенез варьируемого участка может использоваться для оптимизации специфичности, аффинности и т.д. моноклонального антитела. В некоторых вариантах исполнения данного изобретения моноклональное антитело к маркерам стволовых раковых клеток представлено гуманизированным антителом. Гуманизированные антитела являются антителами, содержащими минимальные последовательности из нечеловеческих (например,мышиных) антител в варьируемых участках. Такие антитела используются в лечебных целях для снижения антигенности и ответов на НАМА (человеческое антимышиное антитело) при введении человеку. На практике гуманизированные антитела обычно представлены человеческими антителами с минимальным или полным отсутствием нечеловеческих последовательностей. Человеческое антитело является антителом, вырабатываемым в организме человека, или антителом, содержащим аминокислотную последовательность, соответствующую антителу, вырабатываемому у человека. Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием разных известных науке способов. Антитело может быть гуманизированно путем замены КОО человеческого антитела таковой областью нечеловеческого антитела (например, мыши, крысы, кролика, хомяка и т.д.), обладающей необходимой специфичностью, аффинностью и свойствами (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann etal., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). Гуманизированное антитело может в дальнейшем быть модифицировано путем замены дополнительного остатка в каркасном участкеFv и/или в замененных нечеловеческих остатках для обновления и оптимизации специфичности, аффинности антитела и/или его свойств. Человеческие антитела могут быть непосредственно приготовлены с использованием известных науке способов. Могут быть получены иммортализированные человеческие В-лимфоциты, иммунизированные in vitro или изолированные из иммунизированного индивидуума, у которого вырабатываются антитела к конкретному антигену (см., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; и патент США 5750373). Кроме того, человеческое антитело может быть выбрано из фаговой библиотеки с наличием экспрессии человеческих антител (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS,95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.,222:581). Гуманизированные антитела также могут быть получены у трансгенных мышей, имеющих локусы человеческого иммуноглобулина; такие мыши после иммунизации способны воспроизводить полный список человеческих антител при отсутствии эндогенной выработки иммуноглобулинов. Такой способ описан в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016. Данное изобретение также включает биспецифические антитела, которые специфически распознают маркеры стволовых раковых клеток. Биспецифические антитела являются антителами, способными специфически распознавать и связываться с как минимум двумя разными эпитопами. Биспецифические антитела могут быть интактными антителами или фрагментами антител. Способы получения биспецифических антител известны науке (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan etal., 1985, Science 229:81; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:15471553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368 и патент США 5731168). В некоторых вариантах исполнения изобретения предпочтительнее использовать фрагмент антитела, чем интактное антитело, что позволит повысить пенетрацию опухоли. Для производства фрагментов антител имеется целый ряд способов. Традиционно такие фрагменты получают путем протеолитического расщепления интактных антител (например, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117 и Brennan et al., 1985, Science, 229:81). Однако, такие фрагменты сейчас обычно получают непосредственно с использованием рекомбинантных клеток-хозяев, как это описано выше. Таким образом такие Fab, Fv и scFv фрагменты антител могут экспрессироваться в и секретироваться из Е. coli или другой клетки-хозяина, что позволяет получать большое количество таких фрагментов. С другой стороны, такие фрагменты антител могут быть изолированы из фаговых библиотек антител, описанных выше. Фрагмент антитела также может быть представлен линейными антителами, как это описано в патенте США 5641870, и может быть моно- или биспецифичным. Квалифицированный доктор выберет и другие методы получения фрагментов антител. В дальнейшем может стать необходимым, особенно в случае фрагментов антител, модифицировать антитело для повышения его времени полужизни в сыворотке. Это может быть достигнуто, например,путем введения реутилизационной рецепторсвязывающей антигенной детерминанты в фрагмент антитела с помощью мутации соответствующего участка в фрагменте антитела или путем включения такой детерминанты в пептидную метку, которая затем соединяется с фрагментом антитела в его средней или концевой части (например, посредством ДНК или белкового синтеза). Данное изобретение в дальнейшем предоставляет варианты и эквиваленты, которые являются достаточным образом гомологичными для химерных, гуманизированных и человеческих антител или фрагментов антител. Они могут включать, например, консервативные мутации замещения, т.е. замещения одной или нескольких аминокислот подобными аминокислотами. Например, консервативное замещение относится к замещению аминокислоты другой аминокислотой одного и того же общего класса, например, замещение одной кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой, или замещение одной основной аминокислоты другой основной аминокислотой, или замещение одной нейтральной аминокислоты другой нейтральной аминокислотой. Что подразумевается под консервативным замещением аминокислоты, хорошо известно науке. Изобретение также описывает иммуноконъюгаты, состоящие из антитела, конъюгированного с цитотоксическим агентом. Цитотоксические агенты включают агенты химиотерапии, агенты ингибитора роста, токсины (например, ферментно-активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты), радиоактивные изотопы (т.е. радиоконъюгаты) и т.д. Агенты химиотерапии используются для получения таких иммуноконъюгатов, как, например, метотрексата, адриамицина, доксорубицина, мелфалана, митомицина С, хлорамбуцила, даунорубицина или других вставочных агентов. Ферментативно-активные токсины и их фрагменты могут включать А цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А цепь экзотоксина, А цепь рицина, А цепь абрина, А цепь модеццина, альфа-сарцин, протеины Aleurites fordii, протеины диантина, протеины Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецины. Для получения радиоконъюгированных антител, включая 212Bi, 131I, 131In, 90Y и 186Re, используется целый ряд радионуклидов. Конъюгаты антитела и цитотоксического агента получают с использованием целого ряда бифункциональных протеинсвязывающих агентов, таких как Nсукцинимидил-3-(2-пиридитиол) пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (таких как диметиладипимидат HCL), активных эфиров (таких как диссукцинимидил суберат), альдегиды (таких как глутаральдегид), бис-азидо соединения (таких как бис(разидобензойл)гексанедиамин),бис-диазония производные(таких как бис-(рдиазониумбензойл)этилендиамин), диизоцианаты (таких как толуен 2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (таких как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Могут также использоваться конъюгаты антитела и одной или нескольких небольших молекул токсинов, таких как калихимицин, майтансиноиды, трихотецин и СС 1065, а также производные таких токсинов, обладающих токсическими свойствами. В некоторых вариантах исполнения изобретения антитело состоит из участков человеческого Fc,модифицированного для усиления эффекторной функции, например антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и/или комплементнозависимой цитотоксичности (CDC). Это может быть достигнуто путем введения одной или нескольких замещенных аминокислот в участок Fc антитела. Например, в участок Fc может быть введен остаток (-тки) цистеина, что позволит образоваться дисульфидным мостикам между цепями в данном участке и улучшит комплементопосредованную гибель клеток и антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) (Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; Shopes, 1992, Immunol. 148:2918-2922). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью могут быть также получены с использованием гетеробифункциональных кросслинкеров, как это описано Wolff et al., 1993, Cancer Research 53:2560-2565. С другой стороны, может быть получено антитело с двумя участками Fc (Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).IV. Скрининг препарата. В некоторых вариантах исполнения изобретения последнее описывает анализы скрининга препаратов (например, скрининга для противораковых препаратов). Способы скрининга данного изобретения используют маркеры стволовых раковых клеток (например, CXCR1, FBXO21, NFYA, NOTCH2,RAD51L1, ТВР и других белков из табл. 1), выявленных с помощью способов согласно данному изобретению. Например, в некоторых вариантах исполнения изобретения последнее содержит способы скрининга для соединений, которые изменяют (например, снижают или повышают) экспрессию или активность CXCR1 или FBXO21. В некоторых вариантах исполнения изобретения кандидатные соединения представлены антисмысловыми агентами (например, олигонуклеотидами), действие которых направлено против маркеров рака. В других вариантах исполнения изобретения кандидатные соединения представлены антителами, которые специфически связываются с маркером стволовой раковой клетки, используемом в данном изобретении. В определенных вариантах исполнения изобретения скринингу подвергаются библиотеки соединений с использованием описанных здесь способов. В проведении одного способа скрининга кандидатное соединение оценивается по его способности изменять экспрессию маркера стволовых раковых клеток путем контакта соединения с клеткой, экспрессирующей маркер стволовой раковой клетки, с последующим анализом эффекта кандидатного соединения на экспрессию. В некоторых вариантах исполнения изобретения эффект кандидатного соединения на экспрессию гена маркера рака оценивается путем определения уровня мРНК маркера рака, экспрессируемых клеткой. Экспрессия мРНК может быть определена любым подходящим способом. В других вариантах исполнения изобретения эффект кандидатного соединения на экспрессию генов маркера рака оценивается путем измерения уровня полипептида, кодируемого онкомаркерами. Уровень экспрессируемого полипептида может быть измерен с помощью любого подходящего способа, включая, но не ограничиваясь, способы, представленные в тексте. В некоторых вариантах исполнения изобретения определяются другие изменения в биологии клеток (например, апоптоз). В частности, данное изобретение описывает способы скрининга для идентификации модуляторов,т.е. кандидатных или исследуемых соединений или агентов (например, белки, пептиды, пептидомиметики, пептоиды, небольшие молекулы или другие препараты), которые связывают или изменяют передачу сигнала или функцию, связанную с маркерами рака данного изобретения, обладают эффектом ингибирования (или стимуляции), например, на экспрессию маркера стволовых раковых клеток или активность онкомаркеров, или обладают стимулирующим или ингибирующим воздействием, к примеру, на экспрессию или активность субстрата маркера рака. Идентифицированные подобным образом соединения могут использоваться для модуляции активности целевых генных продуктов (например, генов маркеров стволовых раковых клеток, таких как CXCR1 или FBXO21) прямо или косвенно в протоколе лечения, усовершенствования биологической функции определенного генного продукта или для выявления соединений, нарушающих нормальные взаимодействия определенных генов. Соединения, ингибирующие активность или экспрессию маркеров рака, полезны в лечении пролиферативных нарушений, например рака, в частности метастатического рака, или элиминации или контроле опухолевых стволовых клеток для предотвращения или снижения риска рака. В одном варианте исполнения изобретение описывает анализы для скрининга кандидатных или исследуемых соединений, являющихся субстратами белка маркера рака или полипептида, или биологически активного участка. В другом варианте исполнения изобретение описывает анализы для скрининга кандидатных или исследуемых соединений, которые связываются или модулируют активность белка маркера рака или полипептида, или биологически активного участка. Исследуемые соединения данного изобретения могут быть получены с помощью любого из многочисленных методов, известных науке, включая биологические библиотеки, пептоидные библиотеки(библиотеки молекул, имеющих функции пептидов, но включающих новый, непептидный остов, устойчивый к ферментному расщеплению и остающийся биологически активным (см. например, Zuckennann etal., J. Med. Chem. 37: 2678-85 [1994]), библиотеки пространственно-параллельных твердых фаз или библиотеки твердых фаз, библиотеки методов синтеза, требующих деконволюции, метод "одна гранула одно соединение", а также библиотеки методов синтеза с использованием селекции с помощью аффинной хроматографии. Включение биологических библиотек и пептоидных библиотек предпочтительнее при использовании пептидных библиотек, в то время как другие четыре метода применимы к пептидам,непептидному олигомеру или библиотекам небольших молекул соединений (Lam (1997) Anticancer DrugDes. 12:145). Примеры методов синтеза библиотек молекул известны науке и представлены, к примеру, в следующих источниках: DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 [1993]; Erb et al., Proc. Nad. Acad.[1993]; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]; and Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 [1994]. Библиотеки соединений могут включать соединения, представленные в виде раствора (e.g., Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]), на гранулах (Lam, Nature 354:82-84 [1991]), стружках (Fodor, Nature 364:555-556 [1993]), бактериях или спорах (патент США 5223409; включен в текст в виде ссылки),плазмидах (Cull et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:1865-1869 [1992]) или на фаге (Scott and Smith, Science 249:386-390 [1990]; Devlin Science 249:404-406 [1990]; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382[1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222:301 [1991]). В одном варианте исполнения указывается, что анализ основывается на клеточном анализе, в ходе которого клетка, экспрессирующая белок маркера стволовой раковой клетки или его биологически активный фрагмент, контактирует с исследуемым соединением, вслед за чем определяется способность исследуемого соединения модулировать активность маркера рака. Определение способности исследуемого соединения модулировать активность маркера стволовой раковой клетки может сопровождаться мониторингом, например, изменений ферментной активности. К примеру, клетка может иметь происхождение от млекопитающих. Также может быть оценена способность тестового соединения модулировать связывание маркера рака с соединением, например с субстратом маркера стволовой раковой клетки. Это может сопровождаться, например, связыванием соединения, например субстрата, с радиоизотопной или ферментной меткой, таким образом, связывание маркера рака с соединением, т.е. субстратом, может определяться путем выявления меченого соединения в комплексе, т.е. субстрате. С другой стороны, маркер стволовой раковой клетки комбинируется с радиоизотопной или ферментной меткой для отслеживания способности исследуемого соединения модулировать связывание маркера рака со своим субстратом в комплексе. Например, соединения (т.е. субстраты) могут быть мечены 125I, 35S, 14 С или 3 Н прямым или косвенным образом, и радиоизотоп определяется путем непосредственно подсчета радиоэмиссии или сцинтилляции. С другой стороны, соединения могут быть мечены ферментом, например пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или люциферазой, и ферментная метка определяется путем выявления конверсии соответствующего субстрата в продукт. Может быть оценена способность соединения (например, субстрата маркера стволовой раковой клетки) взаимодействовать с маркером стволовой раковой клетки с/без метки любого взаимодействующего агента. Например, для определения взаимодействия соединения с маркером рака без метки любого из соединения или маркера рака может быть оценено с помощью микрофизиометра (McConnell et al.Science 257:1906-1912 [1992]). Как использовано в данном описании, "микрофизиометр" (например,Cytosensor) является аналитическим инструментом, измеряющим показатель, при котором клетка окисляет собственную среду с помощью светового потенциометрического датчика (LAPS). Изменения в таком показателе окисляемости могут использоваться в качестве индикатора взаимодействия между соединением и маркерами рака. В еще одном варианте исполнения изобретения описывается анализ без использования клеток, в ходе которого белок маркера рака или его биологически активный участок контактирует с исследуемым соединением, вслед за чем оценивается способность исследуемого соединения связываться с белком маркера стволовых раковых клеток или его биологически активным участком. Биологически активные участки белков маркеров рака, которые используются в таких анализах данного изобретения, включают фрагменты, которые участвуют во взаимодействиях с субстратом или другими белками, например фрагментами с высокими показателями площади поверхности. Анализы без использования клеток включают получение реакционной смеси соответствующего белка гена и исследуемого соединения в условиях и в течение времени, достаточного для предоставления двум компонентам взаимодействия и связывания, образуя, таким образом, комплекс, который может быть извлечен и/или удален. Также может быть выявлено взаимодействие между двумя молекулами, например, с использованием переноса энергии флуоресценции (FRET) (см., например, Lakowicz et al., патент США 5631169;Stavrianopoulos et al., патент США 4968103; каждый из который включен в данное описание в виде ссылки). Метка флуорофором выбирается таким образом, что первая молекула донора с излучением энергии флуоресценции будет абсорбироваться флуоресцирующей меткой на второй молекуле"акцепторе", которая, в свою очередь, способна флуоресцировать благодаря поглощенной энергии. С другой стороны, "донорская" молекула белка может просто использовать естественную энергию флуоресценции остатков триптофана. Метки выбираются таким образом, чтобы они испускали разные длины волн света, чтобы метка молекулы-"акцептора" могла отличаться от "донора". Поскольку эффективность переноса энергии между метками относится к расстоянию, разделяющему молекулы, может быть оценена пространственная взаимосвязь между молекулами. В ситуации, когда между молекулами возникает связывание, эмиссия света метки молекулы-"акцептора" в 15 анализе должна быть максимальной. Явление связывания FRET может быть удобно измерено с помощью средств стандартной флуорометрии, хорошо известных науке (например, с использованием флуориметра). В другом варианте исполнения изобретения определение способности белка маркеров стволовых раковых клеток связываться с молекулой-мишенью может сопровождаться с использованием биомолекулярного анализа взаимодействия (BIA) в режиме реального времени (см., например, Sjolander and Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338-2345 [1991] и Szabo et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 [1995]). "Поверхностный плазмонный резонанс", или "BIA", определяет биоспецифические взаимодействия в режиме реального времени без мечения любых взаимодействий (например, BIAcore). Изменения в массе на поверхности связывания (индикатор явления связывания) приводят к изменениям коэффициента рефракции света возле поверхности (оптический феномен поверхностного плазмонного резонанса (ППР, позволяя получить определяемый сигнал, который может использоваться в качестве индикатора реакций между биологическими молекулами в режиме реального времени. В одном варианте исполнения изобретения целевой продукт гена или исследуемое вещество зафиксировано в твердой фазе. Комплексы соответствующий продукт гена/исследуемое соединение зафиксированы в твердой фазе, что может быть определено в конце реакции. Соответствующий продукт гена может быть зафиксирован на твердой поверхности, а исследуемое соединение (которое не зафиксирова- 22023466 но) может быть помечено прямым или косвенным образом с обсуждаемыми в тексте определяемыми метками. Может оказаться необходимым иммобилизация маркеров стволовых раковых клеток, антитела к маркеру рака или его молекуле-мишени для облегчения разделения комплекса на некомплексные формы одного или нескольких белков, а также для улучшения автоматизации анализа. Связывание исследуемого соединения с белком маркера стволовой раковой клетки или взаимодействие белка маркера рака с молекулой-мишенью в присутствии и отсутствии кандидатного соединения может сопровождаться использованием любого сосуда, подходящего для реагентов. Примеры таких сосудов включают панели микротитратора, тестовые пробирки и пробирки для микроцентрифугирования. В одном варианте исполнения изобретения может использоваться белок для связывания, который имеет дополнительный домен для связывания в матрице. Например, белки слияния для маркера рака глутатион-S-трансферазы или белки слияния глутатион-S-трансферазы/мишени могут быть абсорбированы на гранулах сефарозы-глутатиона(Sigma Chemical, St. Louis, MO) или панелях микротитратора с производными глутатиона, которые затем комбинируются с исследуемым соединением или исследуемым соединением и неабсорбируемым белком-мишенью или белком маркера рака, и смесью, инкубированной в условиях, подходящих для образования комплекса (например, при физиологических условиях для соли и рН). После инкубации гранулы или ячейки панели микротитрации промываются для удаления любых несвязанных компонентов, матрица иммобилизируется в случае гранул, и комплекс определяется прямым или косвенным образом, например, описанным выше. С другой стороны, комплексы могут диссоциировать из матрицы, а степень связывания маркеров рака или их активность могут быть определены с использованием стандартных методов. Другие способы для иммобилизации белка маркера рака или молекулы-мишени на матрицах включают использование конъюгации биотина и стрептавидина. Биотинилированный белок маркера рака или молекула-мишень могут быть получены из биотина-NHS (N-гидроксисукцинимид) с использованием известных науке способов (например, раствор для биотинилирования, Pierce Chemicals, Rockford, IL), и иммобилизируются в 96 ячейках планшетов, покрытых стрептавидином (Pierce Chemical). Для проведения анализа на поверхность, покрытую фиксированным компонентом, наносится неиммобилизированный компонент. После завершения реакции непрореагировавшие компоненты удаляются (например, путем промывания) при условии, что на твердой поверхности останутся любые образовавшиеся комплексы. Определение комплексов, зафиксированных на твердой поверхности, может проводиться несколькими методами. В случае предварительного мечения неиммобилизированного компонента, определение метки, иммобилизированной на поверхности, указывает на формирование комплексов. В случае отсутствия предварительного мечения неиммобилизированного компонента, для выявления комплексов, зафиксированных на поверхности, может использоваться косвенная метка, например с помощью меченого антитела, специфичного относительно иммобилизированного компонента (антитело,в свою очередь, может быть мечено прямо или косвенно с использованием, например, меченого антитела к IgG). Такой анализ выполняется с использованием антител, реагирующих с белком маркера стволовой раковой клетки или молекулами-мишенями, которые не мешают связыванию белка маркеров стволовой раковой клетки с молекулой-мишенью. Такие антитела могут быть нанесены на ячейки планшета, и несвязанная мишень или белок маркеров рака могут быть захвачены в ячейках путем конъюгации антитела. Методы определения подобных комплексов в добавление к описанным выше для GSTиммобилизированных комплексов включают иммуноопределение комплексов с использованием антител,реагирующих с белком маркера рака или молекулой-мишенью, а также тесты связывания фермента, которые основываются на определении ферментативной активности, обусловленной белком маркера рака или молекулой-мишенью. С другой стороны, в жидкой фазе может проводиться анализ без наличия клеток. В таком анализе продукты реакции разделяются от непрореагировавших компонентов с использованием любого из стандартных методов, включая, но не ограничиваясь, следующие: дифференциальное центрифугированиеCurrent Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York.); и иммунопреципитацию (см., например,Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York). Подобные смолы и методы хроматографии известны науке (см., например, Heegaard J. Mol. Recognit 11:141-8 [1998];Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sci. App1 699:499-525 [1997]). Далее может использоваться перенос энергии флуоресценции, как это было описано ранее, для определения связывания без дальнейшей очистки комплекса из раствора. Анализ может включать контакт белка маркеров стволовой раковой клетки или его биологически активного участка с известным соединением, связывающимся с маркером рака для образования смеси для анализа, контакт смеси для анализа с исследуемым соединением и определение способности исследуемого соединения взаимодействовать с белком маркера рака, при этом определение способности исследуемого соединения взаимодействовать с белком маркера рака включает определение способности исследуемого соединения специфически связываться с маркерами рака или его биологически активными участками или модулировать активность молекулы-мишени в сравнении с известным соединением. Принимая во внимание, что маркеры стволовых раковых клеток могут in vivo взаимодействовать с одной или несколькими клеточными или внеклеточными макромолекулами, такие как белки, ингибиторы такого взаимодействия очень полезны. Для выявления ингибиторов может использоваться гомогенный анализ. Например, предварительно образованный комплекс продукта соответствующего гена и интерактивный клеточный или внеклеточный продукт-партнер для связывания готовится таким образом, что продукты соответствующего гена или их связывающиеся партнеры подлежат мечению, но сигнал, генерируемый меткой, подавляется по причине образования комплекса (см., например, патент США 4109496, включенный в текст в виде ссылки и использующий такой подход для иммуноанализов). Добавление исследуемого вещества, которое соперничает и замещает один из видов предварительно образовавшегося комплекса, приведет к образованию сигнала за пределы основания. В таком случае могут быть идентифицированы исследуемые вещества, разрушающие взаимодействие связывающего партнера с продуктом соответствующего гена. С другой стороны, белок маркеров рака может использоваться в качестве "наживки" в ходе двух- или трехгибридного анализа (см., например, патент США 5283317;Zervos et al., Cell 72:223-232 [1993]; Madura et al., J. Biol. Chem. 268.12046-12054 [1993]; Bartel et al.,Biotechniques 14:920-924 [1993]; Iwabuchi et al., Oncogene 8:1693-1696 [1993] и Brent WO 94/10300; каждый из которых включен в данное описание в виде ссылки) для выявления других белков, которые связываются или взаимодействуют с маркерами рака ("белки связывания с маркером рака" или "cancermarker-bp") и задействованы в активности маркера рака. Такие белки связывания с маркером рака могут служить активаторами или ингибиторами сигналов белков маркеров рака или мишеней, как, например,нижележащие элементы сигнального пути, опосредованного маркерами рака. Модуляторы экспрессии маркеров рака также могут быть выявлены. Например, клетка или не содержащая клеток смесь контактирует с кандидатным соединением, и экспрессия мРНК маркера рака или белка оценивается относительно степени экспрессии мРНК маркера стволовой раковой клетки или белка в отсутствие или присутствие кандидатного соединения. Если в присутствии кандидатного соединения экспрессия мРНК маркера рака или белка больше, чем в его отсутствие, кандидатное соединение определяется в качестве стимулятора мРНК маркера рака или экспрессии белка. С другой стороны, если в присутствии кандидатного соединения экспрессия мРНК маркера рака или белка меньше (т.е. имеет меньшую статистическую значимость), чем в его отсутствие, кандидатное соединение определяется в качестве ингибитора мРНК маркера рака или экспрессии белка. Уровень экспрессии мРНК маркеров рака или белка может быть определен с помощью методов, описанных в данном тексте для определения мРНК маркеров рака или белка. Данное изобретение в дальнейшем описывает новейшие агенты, выявленные с использованием описанных выше анализов скрининга (см. описание методов лечения рака ниже). Согласно этому данный факт включен в настоящее изобретение для дальнейшего использования препарата, выявленного с использованием представленных способов (например, агент, модулирующий маркер рака, молекула нуклеиновой кислоты антисмыслового маркера рака, молекула миРНК, антитело, специфичное к маркеру рака, или партнер, связывающий маркер рака) и подходящей животной модели (например, таких как описаны в тексте) для определения эффективности, токсичности, побочных эффектов или механизмов действия лечения данным препаратом. Более того, для описанных в тексте способов лечения (например, для лечения пациентов, страдающих раком) могут использоваться новейшие препараты, выявленные с помощью описанных выше процедур скрининга. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения описываются неклейкие маммосферы для разных процедур скрининга, включая методы скрининга антагонистов пути передачи сигнала CXCR1 или FBXO21. Неклейкие маммосферы представлены системой культуры in vitro, обеспечивающей распространение первичных человеческих эпителиальных стволовых клеток и клеток-предшественников молочной железы в недифференцированном состоянии, основываясь на их способности пролиферировать в суспензии в виде сферических структур. Неклейкие маммосферы были описаны ранее Dontu et al.Genes Dev. 2003 May 15; 17(10): 1253-70 и Dontu et al., Breast Cancer Res. 2004;6(6):R605-15 (включены в текст в виде ссылки). Такие источники включены в виде ссылки и используются для пояснения построения и использования неклейких маммосфер. Как это было описано Dontu et al., маммосферы состоят из стволовых клеток и клеток-предшественников, имеющих способность самовосстанавливаться и обладающих многолинейной дифференциацией. Dontu et al. также указывают, что маммосферы содержат клетки, способные клонически генерировать сложные функциональные протоковоальвеолярные структуры в восстановленных 3-D системах культуры в матригеле. В определенных вариантах исполнения изобретения используются следующие примеры методов скрининга. Для исследований in vitro клетки могут подвергаться действию контроля с экспрессией аденовируса или миРНК кандидата CXCR1 или FBXO21 (множественность заражения 10-100) в течение 3 дней или небольшой молекулы кандидата (например, производное РНА 665752) в течение 3 дней с последующим сравнением способности CXCR1+ или FBXO21+ клеток образовывать опухоли в сравнении с не подвергнутыми воздействию клетками. Для исследований in vivo клетки рака молочной железы инфицируются люциферазой, экспрессирующей лентивирус, для мониторинга роста опухоли. Раковые клетки,экспрессирующие люциферазу, могут быть введены в ткань грудной железы и опухоль размером примерно 0,5-0,7 см минимум 5 животным из каждой группы. Животные с выявленными опухолями затем могут быть подвергнуты лечению кандидатом ингибитора CXCR1 или FBXO21 (ежедневно внутривенно 30 мг/кг/сутки в течение 7 дней) или носителя. Могут проводиться параллельные исследования с использованием инфекции контролем с экспрессией аденовируса или кандидата миРНК CXCR1 или FBXO21(множественность заражения 100 или 500 в течение 7 дней). Животные могут быть подвергнуты визуализации на 7, 14, 21 и 28 дни для оценки размера опухоли, а затем выведены из эксперимента. В дальнейшем размер опухоли может быть оценен посредством вскрытия и окрашивания образца опухоли для оценки ее гистологии. Оставшаяся опухоль может быть собрана и отсортирована для оценки процентного показателя CXCR1- или FBXO21-положительных и CXCR1- или FBXO21-отрицательных клеток. Для верификации того, что введение кандидата ингибитора CXCR1 или FBXO21 и кандидата миРНК CXCR1 или FBXO21 приводит к ингибированию инфекцией аденовируса сигнальной функции CXCR1 илиFBXO21, фосфорилирование нисходящих медиаторов может быть оценено с помощью Gab-1 и ERK (см.V. Способы лечения рака. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения описываются способы лечения рака. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения лечение нацелено на маркеры рака (например,включая, но не ограничиваясь, CXCR1 или FBXO21 и белки в пути передачи сигнала CXCR1 илиFBXO21). В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения могут использоваться любые известные или разработанные позднее способы, относящиеся к стволовым раковым клеткам. Например,препараты, действующие на стволовые раковые клетки, описаны в патентах США 6984522 и 7115360 и приложениях WO 03/050502, WO 05/074633 и WO 05/005601 (включены в данное описание в виде ссылки). Терапия с использованием антител. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения описываются антитела, которые поражают опухоли, экспрессирующие маркер стволовых раковых клеток, представленный в данном изобретении. В описанных здесь способах лечения может использоваться любое соответствующее антитело(например, моноклональное, поликлональное или синтетическое). В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения используемые для лечения рака антитела представлены гуманизированными антителами. Способы с использованием гуманизированных антител широко известны науке (см., например, патенты США 6180370, 5585089, 6054297 и 5565332, каждый из которых включен в текст в виде ссылки). В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения используемые в лечении антитела представлены антителом, полученным относительно маркера стволовых раковых клеток данного изобретения, при этом антитело конъюгировано с цитотоксическим агентом. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения получают терапевтические агенты, специфические относительно опухоли,которые не поражают здоровые клетки, снижая, таким образом, большинство разрушительных побочных эффектов традиционной химиотерапии. Для определенных применений предусматривается, что терапевтические агенты будут представлены фармакологическими препаратами, которые будут служить в качестве полезных агентов для прикрепления к антителам, в частности, они будут представлены цитотоксическими или другими противоклеточными агентами, обладающими свойством убивать или подавлять рост клеток эндотелиального происхождения. Данное изобретение описывает использование любого фармакологического препарата, который может быть конъюгирован с антителом и поставляться в активной форме. Типовые противоклеточные агенты включают агенты химиотерапии, радиоизотопы и цитотоксины. Используемые в лечении и описываемые в данном изобретении антитела могут включать целый ряд цитотоксических молекул, включая, но не ограничиваясь, радиоактивные изотопы (например,йод-131, йод-123, технеций-99m, индий-111, рений-188, рений-186, галлий-67, медь-67, иттрий-90, йод 125 или астат-211), гормоны, такие как стероиды, антиметаболиты, такие как цитозины (например, арабинозид, фторурацил, метотрексат или амиоптерин; антрациклин; митомицин С), алкалоиды барвинка(например, демеколцин, этопозид, митрамицин) и противоопухолевые алкилирующие агенты, такие как хлорамбуцил или мелфалан. Другие варианты исполнения настоящего изобретения могут включать агенты, такие как коагулянты, цитокины, факторы роста, бактериальные эндотоксины или молекулы липида А бактериального эндотоксина. Например, в некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения терапевтические агенты будут включать токсины, полученные из растений, грибов или бактерий, такие как А цепь токсина, белок, инактивирующий рибосому, -сарцин, аспергиллин, рестриктоцин, рибонуклеаза, дифтерийный токсин или эндотоксин pseudomonas (приведено в качестве примеров). В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения используется А цепь дегликозилированного рицина. В любом случае предлагается, что подобный агент может, при желании, быть успешно конъюгирован с антителом таким образом, что это позволит его наведению, интернализации, выпуску или представления относительно компонентов крови на участке опухолевых клеток-мишеней, как это требует известная технология конъюгации (см., например, Ghose et al., Methods Enzymol., 93:280 [1983]). Например, в некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения описываются иммунотоксины, нацеленные на маркер стволовых раковых клеток, указанный в данном изобретении. Иммунотоксины представлены конъюгатами специфически нацеленного агента, обычно это нацеленное на опухоль антитело или его фрагмент, вместе с цитотоксическим агентом, например, молекулой токсина. Такой агент направляет токсин и избирательно вызывает гибель клеток, несущих антиген-мишень. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения используемые в лечении антитела обуславливают использование кросс-линкеров, обеспечивающих высокую in vivo стабильность (Thorpe et al., Cancer Res.,48:6396 [1988]). В других вариантах исполнения настоящего изобретения, особенно тех, которые описывают лечение солидных опухолей, антитела разработаны для наличия цитотоксичного или другого противоклеточного эффекта относительно сосудистой системы опухоли путем подавления роста или деления сосудистых эндотелиальных клеток. Такая атака предназначена для обеспечения коллапса сосудов опухоли,депривации опухолевых клеток, в частности дистальных клеток васкулатуры опухоли, относительно кислорода и питания, приводя, в конце концов, к гибели клеток и некрозу опухоли. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения методы лечения, основанные на использовании антител, представлены в качестве фармацевтических композиций, как это описано ниже. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения введение препарата антитела в рамках данного изобретения приводит к измеримому снижению рака (например, уменьшению или элиминации опухоли).VI. Терапевтические композиции и пути введения. Фармацевтическая композиция, включающая регулятор образования опухоли в соответствии с данным изобретением, может быть введена любым эффективным способом. Например, антагонист пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1 или другой терапевтический агент, действующий в качестве антагониста белков в передаче сигнала/пути передачи ответа ИЛ 8-CXCR1, может вводиться любым эффективным способом. В некоторых вариантах исполнения данного изобретения терапевтический агент состоит из репертаксина или его производного. В определенных вариантах исполнения данного изобретения физиологически подходящий раствор,содержащий эффективную концентрацию антагониста пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1, может быть введен местно, интраокулярно, парентерально, перорально, интраназально, внутривенно, внутримышечно, подкожно или любым другим эффективным способом. В частности, антагонист пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1 может быть непосредственно введен в намеченную опухоль и рак (например, в ткань молочной железы) с помощью иглы в количествах, эффективных для лечения опухолевых клеток тканимишени. С другой стороны, рак или опухоль, присутствующие в полости организма, например, в глазу,желудочно-кишечном тракте, мочеполовом тракте (например, мочевом пузыре), легких и бронхиальной системе и т.п., могут получать физиологически соответствующую композицию (например, раствор,представляющий собой физиологический раствор или фосфатный буфер, суспензию или эмульсию, являющихся стерильными), содержащую эффективную концентрацию антагониста пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1 посредством непосредственного введения иглой, или катетером, или другой подающей трубкой, помещенной в рак или полостной орган, имеющий опухоль. Для локализации ткани-мишени и направления иглы или трубки катетера может использоваться любое эффективное устройство визуализации, например система рентгенограммы, ультразвука или оптоволоконная система визуализации. С другой стороны, физиологически соответствующий раствор, содержащий эффективную концентрацию антагониста пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1, может быть введен системно в кровоток для лечения рака или опухоли, которую невозможно достичь напрямую или которая анатомически изолирована. Подобные манипуляции имеют общую цель, т.е. доставку антагониста пути передачи сигнала ИЛ 8CXCR1 в достаточном количестве в опухоль-мишень для обеспечения контакта антагониста, преобразования или трансфекции опухолевых клеток (в зависимости от природы агента). В одном варианте исполнения настоящего изобретения солидные опухоли, находящиеся в эпителиальной выстилке полых органов, могут быть подвергнуты лечению путем введения суспензии в заполненный жидкостью полый орган или путем обрызгивания или орошения заполненного воздухом полого органа. Таким образом, опухолевые клетки (например, стволовые клетки солидной опухоли), которые могут присутствовать в эпителиальной ткани, выстилающей бронхиальное дерево легких, желудочно-кишечный тракт, женские половые пути, мочеполовой тракт, мочевой пузырь, желчный пузырь и любой другой ткани органов, могут контактировать с антагонистом пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1. В другом варианте исполнения настоящего изобретения солидная опухоль может располагаться в/на выстилающих клетках центральной нервной системы, например спинного мозга, корешков спинного мозга или головного мозга, таким образом, антагонист пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1, введенный в спинно-мозговую жидкость, контактирует и преобразовывает клетки солидной опухоли в данной области. Специалист в области онкологии может оценить тот факт, что антагонист может быть введен в солидную опухоль путем непосредственного введения в опухоль, таким образом, антагонист контактирует и поражает опухолевые клетки внутри опухоли. Опухолеобразующие клетки, идентифицированные данным изобретением, также могут использоваться для повышения выработки антител к раковым клеткам. В одном варианте исполнения настоящего изобретения метод описывает получение обогащенной популяции опухолеобразующих клеток или изолированных опухолеобразующих клеток, обработку популяции для предотвращения репликации клеток(например, путем иррадиации) и введение обработанной клетки человеку или животному в количестве,эффективном для индуцирования иммунного ответа на стволовые клетки солидной опухоли. Руководство по эффективной дозировке клеток, которую следует ввести или принять перорально, представлено в патентах США 6218166 , 6207147 и 6156305 (включены в текст в виде ссылки). В другом варианте исполнения настоящего изобретения способ описывает получение обогащенной популяции стволовых клеток солидной опухоли или изолированных стволовых клеток солидной опухоли, смешивание стволовых опухолевых клеток в in vitro культуре с иммунными клетками-эффекторами (в соответствии с известными науке иммунологическими методами) человека или животного-хозяина, в которых планируется повышение уровня антител, удаление иммунных клеток-эффекторов из культуры и трансплантация иммунных клеток-эффекторов животному-хозяину в дозе, эффективной для стимуляции иммунного ответа у животного. В некоторых вариантах исполнения данного изобретения противоопухолевые терапевтические агенты (например, антагонисты пути передачи сигнала ИЛ 8-CXCR1) данного изобретения вводятся совместно с другими способами лечения рака. Данное изобретение предполагает использование целого ряда терапевтических агентов. Любой терапевтический агент, который может быть совместно введен с агентами данного изобретения или связан с агентами данного изобретения, подходит для использования в способах согласно данному изобретению. В определенных вариантах исполнения данного изобретения предполагается использование разных классов противоопухолевых (например, противораковых) агентов. Противораковые агенты, подходящие для использования в данном изобретении, включают, но не ограничиваются, агенты, индуцирующие апоптоз, агенты, ингибирующие функцию аденозиндезаминазы, ингибирующие биосинтез пиримидина,ингибирующие биосинтез пуринового кольца, ингибирующие преобразования нуклеотидов, ингибирующие рибонуклеотидредуктазу, ингибирующие синтез тимидинмонофосфатазы (ТМФ), ингибирующие снижение количества дегидрофолата, ингибирующие синтез ДНК, формирующие комплексы с ДНК,повреждающие ДНК, ингибирующие восстановление ДНК, взаимодействующие с ДНК, дезаминирующие аспарагины, ингибирующие синтез РНК, ингибирующие синтез белка или его стабильность, ингибирующие синтез микротрубочек или их функцию и т.п. В некоторых вариантах исполнения настоящего изобретения типовые противораковые агенты, подходящие для использования в композициях и способах согласно данному изобретению, включают, но не ограничиваются: 1) алкалоиды, включая ингибиторы микротрубочек (например, викристин, винбластин и виндезин и т.д.), стабилизаторы микротрубочек (например, паклитаксел (TAXOL) и доцетаксел и т.д.),и ингибиторы функции хроматина, включая ингибиторы топоизомеразы, такой как эпиподофиллотоксин(например, этопозид (VP-16) и тенипозиды (VM-26) и т.д.), а также агенты, действующие на топоизомеразу I (например, камптотецин и изиринотекан (СРТ-11) и т.д.); 2) ковалентные ДНК-связывающие агенты (алкилирующие агенты), включая азотистый иприт (например, мехлоретамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид и бусульфан (MYLERAN) и т.д.), нитрозомочевину (например, кармустин, ломустин и семустин и т.д.) и другие алкилирующие агенты (например, дакарбазин, гидроксиметилмаламин,тиотепа и митомицин и т.д.); 3) нековалентные ДНК-связывающие агенты (противоопухолевые антибиотики), включая ингибиторы нуклеиновой кислоты (например, дактиномицин (актиномицин D) и т.д.),антрациклины (например, даунорубицин (дауномицин и церубидин), доксорубицин (адриамицин) и идарубицин (идамицин) и т.д.), антрацендионы (например, аналоги антрациклина, такие как митоксантрон и т.д.), блеомицины (Бленоксан) и т.д. и пликамицин (митрамицин) и т.д.; 4) антиметаболиты, включая антифолаты (например, метотрексат, Фолекс и Мексат и т.д.), пуриновые антиметаболиты (например, 6 меркаптопурин (6-МР, Пуринетол), 6-тиогуанин (6-TG), азатиоприн, ацикловир, ганцикловир, хлордезоксиаденозин, 2-хлордезоксиаденозин (CdA) и 2'-дезоксикоформицин (пентостатин) и т.д.), пиримидиновые антагонисты (например, фторпиримидины (например, 5-фторурацил (Адруцил), 5 фтордезоксиуридин (FdUrd) (флоксуридин и т.д.) и цитозиновые арабинозиды (например, Цитозар (араС) и флударабин и т.д.); 5) ферменты, включая L-аспарагиназу и гидроксимочевину и т.д.; 6) гормоны,включая глюкокортикоиды, антиэстрогены (например, тамоксифен и т.д.), нестероидные антиандрогены(например, флутамид и т.д.) и ингибиторы ароматазы (например, анастрозол (Аримидекс) и т.д.); 7) соединения платины (например, цисплатин и карбоплатин и т.д.); 8) моноклональные антитела, конъюгированные с противораковыми препаратами, токсинами и/или радионуклидами и т.д.; 9) модификаторы биологического ответа (например, интерфероны (например, ИФН- и т.д.) и интерлейкины (например,ИЛ-2, и т.д.) и т.д.); 10) адаптивная иммунотерапия; 11) гематопоэтические факторы роста; 12) агенты,индуцирующие дифференциацию опухолевых клеток (например, политрансретиноевая кислота и т.д.); 13) методы генной терапии; 14) методы антисмысловой терапии; 15) опухолевые вакцины; 16) лечение,направленное против опухолевых метастазов (например, батимастат и т.д.); 17) ингибиторы ангиогенеза; 18) ингибиторы протеосомы (например, Велкад); 19) ингибиторы ацетилирования и/или метилирования(например, ингибиторы HDAC); 20) модуляторы NF каппа В; 21) ингибиторы регуляции клеточного цикла (например, ингибиторы CDK); 22) модуляторы функции белка р 53 и 23) облучение. В композиции и способы согласно данному изобретению включены любые онколитические агенты,которые обычно используются в лечении рака. Например, Управление США по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных препаратов предоставляет льготы по разработке онколитических агентов, утвержденных для использования в США. Международные соответствующие агентства, работающие в той же области, что и Управление США по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных препаратов, также предоставляют подобные льготы. В табл. 3 представлен список типовых противоопухолевых агентов, утвержденных для использования в США. Специалист в данной области оценит, что "листок-вкладыш с информацией о продукте", требуемый для всех утвержденных в США препаратов химиотерапии, включает описание утвержденных показаний, сведения о дозе, токсичности и т.п. Таблица 3

МПК / Метки

МПК: G01N 33/574

Метки: молочной, железы, клеток, рака, способ, cxcr1, определения, применение, лечения, антагонистов, стволовых

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-23466-sposob-opredeleniya-stvolovyh-kletok-raka-molochnojj-zhelezy-i-primenenie-antagonistov-cxcr1-dlya-lecheniya-raka.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ определения стволовых клеток рака молочной железы и применение антагонистов cxcr1 для лечения рака</a>

Похожие патенты