Аптамеры к β-ngf и их применение при лечении β-ngf-опосредованных заболеваний и расстройств

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Аптамер, содержащий последовательность

BAZGRGGRSN(0-1)ZWGGGGN(0-1)ZZWADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 154) или ее фрагмент,

в которой В выбран из С, G или Z;

R независимо выбран из А или G;

S выбран из С или G;

W независимо выбран из Z или Т;

D выбран из A, G или Z;

N независимо выбран из любого встречающегося в природе или модифицированного нуклеотида;

Z независимо выбран из модифицированного пиримидина,

при этом указанная последовательность может включать неспецифические нуклеотидные вставки.

2. Аптамер по п.1, где указанный аптамер имеет следующую последовательность:

BAZGRGGRSZWGGGGZZWADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 45).

3. Аптамер, содержащий последовательность

BAZGRGGRSZZGGGGZZZADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 3) или ее фрагмент,

в которой В выбран из С, G или Z;

R независимо выбран из А или G;

S выбран из С или G;

D независимо выбран из A, G или Z;

Z независимо выбран из модифицированного пиримидина,

при этом указанная последовательность может включать неспецифические нуклеотидные вставки.

4. Аптамер по любому из пп.1-3, где указанный аптамер связывается с β-NGF.

5. Аптамер по п.4, где указанный аптамер ингибирует функцию β-NGF.

6. Аптамер по п.4, где указанный аптамер обладает способностью модулировать связывание β-NGF с одним или несколькими из его клеточных рецепторов.

7. Аптамер по п.6, где указанный клеточный рецептор выбран из р75 или TrkA.

8. Аптамер по п.5, где указанный аптамер характеризуется величиной Kd по отношению к β-NGF, составляющей 30 нМ или менее.

9. Аптамер по любому из пп.1-3, где указанный модифицированный пиримидин представляет собой С-5-модифицированный пиримидин.

10. Аптамер по п.9, где указанный С-5-модифицированный пиримидин выбран из группы, состоящей из соединений, указанных на фиг. 10.

11. Аптамер по п.10, где указанный С-5-модифицированный пиримидин выбран из группы, состоящей из

5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (BndU),

5-(N-изобутилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (iBudU),

5-(N-триптаминокарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (TrpdU) и

5-(N-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (NapdU).

12. Аптамер по п.10, где указанный С-5-модифицированный пиримидин представляет собой 5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (BndU).

13. Аптамер по п.3, где указанный модифицированный пиримидин представляет собой С-5-модифицированный пиримидин и указанный аптамер включает по меньшей мере одну нуклеотидную вставку (N) и имеет следующую последовательность:

BAZGRGGRSN(0-1)ZZGGGGN(0-1)ZZZADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 155),

в которой N независимо выбран из любого встречающегося в природе или модифицированного нуклеотида.

14. Аптамер, который связывается с β-NGF, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149.

15. Аптамер по п.14, где указанный аптамер ингибирует функцию β-NGF.

16. Аптамер по п.14, где указанный аптамер обладает способностью модулировать связывание β-NGF с одним или несколькими из его клеточных рецепторов.

17. Аптамер по п.16, где указанный клеточный рецептор выбран из р75 или TrkA.

18. Аптамер по п.17, где указанная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере приблизительно 90% идентичности, по меньшей мере приблизительно 91% идентичности, по меньшей мере приблизительно 92% идентичности, по меньшей мере приблизительно 93% идентичности, по меньшей мере приблизительно 94% идентичности и по меньшей мере приблизительно 95% идентичности.

19. Димер, включающий два компонента, представляющих собой аптамеры по п.2, соединенные между собой.

20. Димер по п.19, где указанные два компонента соединены посредством углеводородного линкера.

21. Фармацевтическая композиция, содержащая аптамер по любому из предшествующих п.1-18, его фрагмент или димер по пп.19, 20 или их соль и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

22. Композиция по п.21, дополнительно содержащая разбавитель, противомикробное средство, связующее средство, наполнитель, увлажняющее средство, суспендирующее средство, смягчающее вещество и эмульгирующее средство.

23. Композиция по п.21 или 22, где указанная композиция является местной композицией, выбранной из группы, состоящей из крема, лосьона, мази, геля, пропитанного материала, аэрозоля, медикаментозной присыпки, медикаментозного адгезива и пены.

24. Применение аптамера по любому из пп.1-18 или димера по пп.19, 20 для лечения, профилактики или улучшения состояния при заболевании, опосредованном β-NGF.

25. Применение по п.24, где указанным β-NGF-опосредованным заболеванием или состоянием является такое, при котором активность β-NGF может на определенной стадии болезненного процесса напрямую или опосредованно приводить к возникновению зуда.

26. Применение по п.24, где указанным заболеванием или состоянием является дерматит или экзема.

27. Применение по п.26, где указанным дерматитом является атопический дерматит.

28. Применение по п.24, где лечение включает местное введение указанного аптамера субъекту, в случае необходимости такого введения, в терапевтически эффективной дозе указанного аптамера.

29. Применение по п.24, где лечение включает введение указанного аптамера в дозе в диапазоне от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела в день.

30. Применение по п.24, где лечение включает введение указанного аптамера в сочетании с другим средством, используемым при лечении зуда.

Текст

Смотреть все

АПТАМЕРЫ К -NGF И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ Описание в общем связано с нуклеиновыми кислотами, более конкретно - с аптамерами,способными связываться с -NGF; с фармацевтическими композициями, содержащими такие аптамеры к -NGF; и со способами их изготовления и их применения. Родственные заявки В заявке на данное изобретение заявлен приоритет согласно предварительной заявке США с серийным номером 61/323,145, поданной 12 апреля 2010 г., которая в полном объеме включена в настоящее описание путем ссылки. Включенным в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме является список последовательностей, озаглавленный как "SequencelistingST25.txt", составленный 1 апреля 2011 г., размером 126 кбайт. Область изобретения Настоящее описание в целом связано с областью нуклеиновых кислот, более конкретно - с аптамерами, способными связываться с фактором роста нервов, более конкретно - с -субъединицей фактора роста нервов ("-NGF"), пригодными в качестве терапевтических средств для предотвращения, лечения или улучшения состояния при зуде (почесухе), патологических состояниях, сопровождающихся зудом,и/или других заболеваниях или состояниях, в развитие которых вовлечен -NGF. Кроме того, описание настоящего изобретения связано с материалами и способами введения аптамеров, способных связываться с -NGF. Предшествующий уровень техники В последующем описании представлена краткая информация, относящаяся к настоящему изобретению, и в нем не предусмотрено, чтобы какая бы то ни было представленная в нем информация или указанные здесь публикации были отнесены к предшествующему по отношению к настоящему изобретению уровню техники. Тяжелый зуд ежедневно отрицательно сказывается на качестве жизни миллионов людей. Тяжелый зуд может быть ассоциирован с разными состояниями здоровья, включая состояния кожного зуда, такие как чесотка, экзема, ксероз, псориаз и крапивница, а также с системными заболеваниями, включая хронический гепатит или почечное заболевание или лимфому. Сходным образом, боль является общим проявлением, являясь одной из основных причин визитов к врачу. Боль может быть ассоциирована с многочисленными типами повреждений или состояний, и неудача в лечении острой боли может привести к развитию хронической боли, а также к иммунным и метаболическим расстройствам. Помимо ухудшения качества жизни индивида, страдающего от зуда и/или боли, это существенно сказывается на бюджете здравоохранения, в частности, в связи с состояниями кожного зуда, а также с хроническими кожными расстройствами. В настоящее время попытки контролировать или лечить зуд и/или боль многими признаются неадекватными. Научные исследования по нейрофизиологии подтвердили отличие метаболических путей при зуде от путей метаболизма при развитии боли. Чувствительность к зуду воспринимается и передается специализированными С-нейронами, которые отличаются от болевых рецепторов, которые обусловливают чувствительность к боли (Schmelz, Neurosci. Biobehav. Rev. doi:10.1016/j.neubiorev.2008.12.004, 2009). Затем специализированные С-нейроны передают стимул зуда на специализированный класс нейронов заднего рога, проецируемых на таламус (Stander and Schmelz, Eur. J. Pain, 10: 473, 2006). Утверждается, что на окончаниях периферических нервов нет специального рецептора зуда, и специфичность С-нейронов зуда обусловлена их спинномозговыми связями с метаболическими путями при зуде. Между проявлениями зуда и боли наблюдаются различия в характере активации мозга, такие как отсутствие заметной активации таламической и соматосенсорной коры теменной доли головного мозга при ощущении зуда(Yosipovitch et al., Lancet, 361: 690, 2003). Обычно боль классифицируется либо как острая, либо как хроническая. Острая боль обычно является ответом на повреждение ткани, характеризующимся кратковременностью, и она рассасывается, как только заживает первоначальное повреждение. Хроническая боль является персистирующей, при этом может не наблюдаться видимой связи с травмирующим событием. Кроме того, боль, включая ноцицептивную и неноцицептивную, может быть классифицирована на основе механистической природы боли. Ноцицептивная боль опосредована специфическими рецепторами (ноцицептивные рецепторы), которые активируются специфическим стимулом (повреждением, воспалением, химическим стимулом и т.п.). Ноцицептивная боль может дополнительно быть классифицирована как соматическая или висцеральная. Соматическая боль возникает в таких тканях, как кожа, мышцы, суставы, кости или связки. Соматическая боль обычно является острой и локализованной. Современные способы лечения включают применение опиоидов и нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID). Висцеральная боль возникает во внутренних органах. Зачастую она является слаболокализованной болью, и обычно ее лечат с помощью опиоидов. Неноцицептивная боль может быть дополнительно подразделена на невропатическую или симпатическую. Невропатическая боль может возникать в периферической или центральной нервной системе. Невропатическая боль может быть ассоциирована с дегенеративными состояниями, воспалением или с инфекционными заболеваниями. Такой тип боли приводит к гиперчувствительности (гипералгезии) и зачастую описывается как прострел или жгучая боль. Варианты лечения включают антагонистыN-метил-D-аспартата (NMDA), противоаритмические средства, противоконвульсивные средства или ан-1 022429 тидепрессанты. Невропатическая боль часто резистентна к действию обычно применяемых анальгетиков. Симпатическая боль возникает в симпатической нервной системе, а также в периферической и центральной нервной системах, и обычно она ассоциирована с определенным типом повреждения. На месте повреждения может проявляться повышенная гиперчувствительность и аномальная температура. Лечение обычно включает схему многократного приема нескольких лекарственных средств, включая блокаторы симпатических нервов, вазодилятаторы, противоконвульсивные средства, противоаритмические средства и антидепрессанты. Общепринятое и пролонгированное лечение боли опиоидными анальгетиками не рекомендуется из опасений, что потенциально возможны привыкание, побочные эффекты, толерантность и зависимость от опиоидов. Побочные эффекты опиоидов могут включать тошноту, рвоту, запоры, угнетение дыхания и т.д. В сочетании со многими современными способами лечения возможны отсутствие эффективности,тяжелые побочные эффекты и несостоятельность способов доставки лекарственных средств в оказании помощи в адекватном устранении боли. Указанные проблемы подчеркивают необходимость в более совершенной терапии в отношении устранения боли. Несмотря на то что зуд и боль представляют собой совершенно разные ощущения, между зудом и болью имеются важные взаимосвязи. Хорошо известно, что зуд можно уменьшить провоцирующим боль ощущением, вызываемым расчесыванием. Кроме того, анальгетики, такие как опиоиды, действуя путем уменьшения болевых ощущений, на самом деле могут усиливать ощущение зуда. Таким образом, некоторые терапевтические средства в отношении боли могут обострять симптомы зуда, что дополнительно свидетельствует о необходимости в улучшении терапевтических средств, способных оказывать лечебное воздействие как в отношении зуда, так и в отношении боли. Фактор роста нервов (NGF) относится к семейству нейротрофических цитокинов, или нейротрофинов. Нейротрофины играют ключевую роль в развитии и поддержании периферической и центральной нервной системы путем регуляции выживаемости клеток, их дифференцировки и апоптоза. Помимо указанных функций нервной системы, NGF, как было показано, усиливает высвобождение гистамина, продуцирование тучных клеток, а также рост и дифференцировку В-лимфоцитов. Было показано также, чтоNGF модулирует базофильную продукцию определенных липидных медиаторов. Апоптоз нейтрофилов может также быть подавлен воздействием NGF. Все указанные факторы свидетельствуют о роли NGF в иммунной системе, а также в нервной системе. Только бета-цепь NGF (-NGF) ответственна за активностьNGF, стимулирующую рост нервов. В клетке -NGF существует в виде димера и связывается с двумя типами рецепторов клеточной поверхности в нервных и не нервных клетках. Третичная структура указанного белка основана на трех цистеиновых дисульфидах и двух антипараллельных -цепях. Аминокислотная гомология между белками человека, мыши и крысы составляет приблизительно 90%. -NGF,как и все нейротрофины, связывается с клеточным рецептором р 75 с наномолярной (нМ) аффинностью.-NGF связывается также с одним из тирозинкиназных рецепторов (Trk), в частности TrkA, с пикомолярной (пМ) аффинностью. Реакция с рецептором р 75 может вызвать гибель клетки, тогда как связывание с TrkA способствует выживанию клеток. Связывание -NGF с TrkA приводит к фосфорилированию рецептора и внутриклеточных белков. -NGF интернализируется путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Рецепторы Trk обнаруживаются во многих не нервных тканях. Фактор роста нервов (NGF), высвобождаемый из кератиноцитов в коже, является одним из основных медиаторов, которые повышают дермальную плотность нервов и действуют на морфологию, помимо прочего, стимулируя прорастание нервных волокон (Schmelz, Neurosci. Biobehav. Rev. doi: 10.1016/j.neubiorev.2008.12.004, 2009). Было обнаружено, что у пациентов с хроническим зудом повышена интрадермальная плотность нервных волокон. Кроме того, было обнаружено, что NGF повышает чувствительность периферических нейронов, помимо прочего, путем запуска рецептора NGF, тирозинкиназы TrkA (Stander and Schmelz, Eur. J. Pain, 10: 473, 2006). Важная роль NGF в опосредовании зуда, а также боли проявляется в высоких концентрациях NGF,измеряемых в атопических условиях, которые могут служить симптомами как зуда, так и боли. Пациенты с атопическим дерматитом имеют существенно повышенные уровни NGF в сыворотке, которые положительно коррелируют с тяжестью состояния. Пациенты с контактным дерматитом имеют более повышенные локальные концентрации NGF, а у пациентов с узловатой почесухой также выявляются более высокие уровни NGF и уровни активации TrkA (Schmelz, Neurosci. Biobehav. Rev. doi: 10.1016/j.neubiorev.2008.12.004, 2009). Были исследованы эффекты анти-NGF-антител, вводимых системно путем внутрибрюшинной инъекции, в отношении симптомов на мышиных моделях атопического дерматита, и результаты "дают основания предполагать, что анти-NGF-антитела блокируют эффекты NGF на периферии нервной системы и подавляют эпидермальную иннервацию, дерматит и расчесывание" (Takano et al. J. Pharmacol. Sci., 99: 277: 284, 2005). Кроме того, в указанном исследовании было обнаружено, что анти-NGF-антитела не вызывают изменения сывороточных уровней NGF, они не снижали концентрацию NGF в тестированных участках кожи и не вызывали полное устранение расчесывания. Таким образом, остается потребность в более полном ослаблении или устранении расчесывания, ассоциированного с атопическим дерматитом. Все больше данных указывает на то, что NGF функционирует в качестве медиатора определенных болевых состояний. Было показано, что анти-NGF-антитела могут вызывать длительный термический и химический анальтезирующий эффект, а также блокировать гипералгезию, которая развивается при каррагенан-индуцированном воспалении (McMahon et al., Nat. Med. 1: 774, 1995). Исследования низкомолекулярных антагонистов рецепторов NGF в отношении блокирования биологической активности NGF выявили наличие анальтезирующего эффекта при невропатических состояниях и состояниях воспаления,сопровождающихся болью (Owolabi et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 289: 1271, 1999. В исследованииOwolabi et al. показано, что анальтезирующий эффект низкомолекулярного ингибитора активности NGF может быть слабее эффекта морфина, в зависимости от пути введения. Поскольку опиоиды, такие как морфин, оказывают много нежелательных побочных эффектов, остается потребность в обеспечении обезболивания при различных болевых состояниях, опосредованных NGF, которое было бы более гибким в выборе пути введения. Краткое описание изобретения Настоящее описание связано с различными аптамерами, которые связываются с бета-субъединицей фактора роста нервов, индивидуально упоминаемыми здесь как "аптамер к -NGF", или"-NGF-аптамер", и со способами применения таких аптамеров, как -NGF, для лечения -NGFопосредованных заболеваний и расстройств, включая лечение боли и зуда, а также состояний, ассоциированных с зудом. Включены также фармацевтические композиции или составы, содержащие -NGF или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Композиции согласно настоящему описанию могут быть получены в виде любой из фармацевтически приемлемых лекарственных форм. Описанные здесь композиции и дозы подобраны с таким расчетом, чтобы максимализировать клиническую эффективность при лечении различных состояний, таких как боль и зуд, а также состояний, ассоциированных с зудом, и при этом одновременно снизить или минимизировать нежелательные побочные эффекты. Кроме того, настоящее описание связано со способами предотвращения (профилактики), лечения или улучшения состояния при заболевании или состоянии, опосредованном -NGF, где указанные способы включают введение аптамера к -NGF или фармацевтической композиции аптамера к -NGF позвоночному, в частности, млекопитающему, более конкретно, человеку. В частности, настоящее описание связано со способами лечения, предотвращения или ослабления боли и зуда, а также состояний, ассоциированных с зудом. В определенных аспектах -NGF-опосредованное заболевание или состояние является заболеванием или состоянием, при которых активность -NGF может непосредственно или опосредованно вызывать зуд на определенных стадиях заболевания. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или состоянием, которое предполагается лечить, предотвратить или облегчить, является дерматит или экзема. В других вариантах осуществления заболеванием или состоянием, которое предполагается лечить, предотвратить или облегчить, является атопический дерматит. В одном из вариантов осуществления терапевтический эффект (например, лечение, профилактика или облегчение боли и состояний, ассоциированных с зудом) может быть достигнут путем введения аптамера к -NGF, так, чтобы аптамер был экспонирован и мог бы связываться с -NGF, независимо от способа введения указанного аптамера подвергаемому лечению пациенту. В аналогичном варианте осуществления терапевтический эффект может быть достигнут путем введения аптамера к -NGF, так, чтобы он был экспонирован и связывался с -NGF, и таким образом предотвращал бы или уменьшал бы связывание -NGF с одним или несколькими из его различных клеточных рецепторов. В одном из вариантов осуществления указанным клеточным рецептором является р 75. В другом варианте осуществления указанным клеточным рецептором является рецептор Trk. Еще в одном из вариантов осуществления указанным клеточным рецептором является TrkA. В другом варианте осуществления аптамер к -NGF предотвращает или снижает уровень фосфорилирования рецептора -NGF и других внутриклеточных белков. Предлагаемые способы включают введение аптамера к -NGF в сочетании с одним или несколькими вторичными активными средствами. Такое введение может быть последовательным или в составе сочетанной композиции. В другом аспекте в настоящем описании предложен способ диагностики in vitro, включающий приведение аптамера к -NGF в контакт с образцом, в котором подразумевается наличие -NGF. В другом аспекте в настоящем описании предложен способ диагностики in vivo, включающий соответствующим образом меченный аптамер к -NGF, инъецирование указанного аптамера индивиду, у которого подразумевается наличие -NGF-опосредованного заболевания или расстройства, и детектирование меченого аптамера с целью диагностики или оценки состояния здоровья указанного индивида. Используемая метка будет выбрана в соответствии с модальностью изображения, которая будет использована. Краткое описание графического материала На фиг. 1 приведены кривые связывания аптамера 2426-66(SEQ ID NO: 1) в сравнении со случайно выбранной библиотекой (о). На фиг. 2 А и 2 В изображены аптамерные консенсусные последовательности, идентифицированные с помощью секвенирования-454 для аптамера 2426-66 (SEQ ID NO: 1). На фиг. 3 проиллюстрирована стратегия димеризации 1 для аптамера к -NGF. На фиг. 4 проиллюстрирована стратегия димеризации 2 для аптамера к -NGF. На фиг. 5 графически проиллюстрирована способность различных аптамеров ингибировать индуцированную человеческим -NGF дифференцировку клеток РС 12, тестируемую путем анализа роста нейрита, описанного в примере 4. На фиг. 6 графически проиллюстрировано ингибирование -NGF-опосредованного роста нейрита(SEQ ID NO: 1) и усеченного варианта 2426-66-50 (о) как функция от концентрации аптамера 2426-66(SEQ ID NO: 2), измеряемое так, как описано в примере 4. На фиг. 7 графически проиллюстрировано ингибирование роста нейрита, опосредованного человеческим -NGF, мышиным -NGF и крысиным -NGF, под действием аптамера 2426-66 (SEQ ID NO: 1) и усеченных вариантов 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2) и 2426-66-53 (SEQ ID NO: 43). Все три аптамера ингибировали мышиный -NGF приблизительно с такой же эффективностью, что и человеческий -NGF, а крысиный -NGF ингибировали в меньшей степени. На фиг. 8 графически проиллюстрированы результаты анализа фосфорилирования TrkA, предпринятого с помощью аптамеров 2426-66 (SEQ ID NO: 1) и усеченных вариантов 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2) и 2426-66-3 (SEQ ID NO: 5). На фиг. 9 графически проиллюстрирован анализ фосфорилирования TrkA в случае усеченного аптамера 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2) с использованием мышиного и крысиного -NGF. На фиг. 10 изображены С-5-пиримидиновые модификации, используемые для получения описанных здесь аптамеров. На фиг. 11 графически проиллюстрировано уменьшение частоты почесывания через четыре недели, в отличие от необработану больных мышей, обработанных аптамером 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2) ных мышей или мышей, обработанных гидрофильной мазью (НО, hydrophilic ointment), как описано в примере 5. Статистически достоверные различия (р 0,05) наблюдались между группой обработки аптамером и группой необработанных мышейили между группой обработки аптамером и группой обработки НОна основании t-теста. На фиг. 12 графически проиллюстрировано снижение количественных клинических показателей состояния кожи через четыре недели у больных мышей, обработанных аптамером 2426-66-50(SEQ ID NO: 2) в отличие от необработанных мышей или мышей, обработанных НО, как описано в примере 5. Статистически достоверные различия (р 0,05) наблюдались между группой обработки аптамером и группой необработанных мышейили между группой обработки аптамером и группой обработки НО ,на основании t-теста. Подробное описание изобретения Далее последует подробное описание репрезентативных вариантов осуществления настоящего изобретения. Несмотря на то что изобретение будет описано в отношении приведенных здесь вариантов осуществления, очевидно, что указанные варианты осуществления не предназначены для ограничения объема, охватываемого данным изобретением. Наоборот, подразумевается, что настоящее изобретение распространяется на все альтернативные варианты, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем, охватываемый данным изобретением, что определяется формулой изобретения. Специалистам в данной области известно много способов и веществ, сходных с описанными здесь или с их эквивалентами, которые могут быть использованы в рамках практического применения настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными здесь способами и материалами. Если специально не указано иное, используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно под ними подразумевается специалистом (специалистами) в той области, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то что любые способы, устройства и материалы, сходные или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы при реализации или тестировании настоящего изобретения, далее будут описаны предпочтительные способы, устройства и материалы. Все цитируемые в настоящем описании публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки являются путеводителем для специалистов в той области, к которой относится настоящее описание. Все цитируемые здесь публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки включены в настоящее описание в такой же степени, как и в случае, если бы каждая из этих указанных публикаций, опубликованных патентных документов или патентных заявок была бы индивидуально и специфически указана как включенная в полном объеме в настоящее описание в виде ссылки. В настоящем описании, включая и прилагаемую формулу изобретения, используемые формы единственного числа относятся, если контекстом конкретно не продиктовано иное, также и ко множественному числу, и их используют взаимозаменяемо с выражениями "по меньшей мере один" и "один или более". Таким образом, указание на "аптамер" включает смесь аптамеров и т.п. Здесь термин "приблизительно" представляет собой неопределенную модификацию или вариацию числового значения, такую, что при этом основная функция объекта, к которому относится указанное числовое значение, остается неизменной. Подразумевается, что используемый здесь в отношении множества элементов термин "каждый" относится по меньшей мере к двум из указанных элементов. Необязательно требовать, чтобы все из элементов, образующих указанное множество, удовлетворяли связанному с ними дополнительному ограничению. Здесь подразумевается, что термины "содержит", "содержащий", "включает", "включая", "включает", "включающий" и любые их варианты охватывают неэксклюзивное включение, способ, продукт, получаемый этим способом, или композицию согласно изобретению, которая включает или содержит элемент или список элементов, включает не только указанные элементы, но может включать также и другие элементы, специально не перечисленные или присущие такому способу, продукту, полученному указанным способом, или композицией согласно изобретению. Здесь термин "нуклеотид" относится к рибонуклеотиду или дезоксирибонуклеотиду, или к их модифицированной форме, а также к их аналогу. Нуклеотиды включают виды, которые содержат пурины(например, аденин, гипоксантин, гуанин, также как и их производные и их аналоги), а также пиримидины (например, цитозин, урацил, тимин, а также их производные и их аналоги). Здесь "нуклеиновая кислота", "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" используются взаимозаменяемым образом для обозначения полимера из нуклеотидов и включают ДНК, РНК, гибриды ДНК/РНК, а также модификации указанных разновидностей нуклеиновых кислот, олигонуклеотидов и полинуклеотидов, при этом сюда входит также присоединение разных элементов или фрагментов к нуклеотидному соединению в любом положении. Термины "полинуклеотид", "олигонуклеотид" и "нуклеиновая кислота" включают двух- или одноцепочечные молекулы, а также молекулы, образующие тройную спираль. Нуклеиновая кислота, олигонуклеотид и полинуклеотид являются более широкими терминами, чем термин аптамер, и, таким образом, термины "нуклеиновая кислота", "олигонуклеотид" и "полинуклеотид" включают полимеры нуклеотидов, которые являются аптамерами, однако термины "нуклеиновая кислота","олигонуклеотид" и "полинуклеотид" не ограничены аптамерами. Здесь термины "модифицировать", "модифицированный", "модификация" и любые их вариации,используемые в отношении олигонуклеотида, означают, что по меньшей мере одно из четырех составляющих нуклеотидных оснований (т.е. A, G, T/U и С) олигонуклеотида является аналогом или сложным эфиром встречающегося в природе нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид придает олигонуклеотиду резистентность к нуклеазе. Пиримидин с замещением в С-5 положении является примером модифицированного нуклеотида. Модификации могут включать модификации остова, метилирование, необычные комбинации спаривания оснований, такие как изомерные основания изоцитидина и изогуанидина и т.д. Модификации могут также включать 3'- и 5'-модификации,такие как кэппинг. Другие модификации могут включать замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидными модификациями, такими, например, как модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, сложные фосфотриэфиры, фосфоамидаты,карбаматы и т.д.) и модификации с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации с интеркаляторами (например, акридин, псорален и т.д.), модификации, содержащие хелатообразующие соединения (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модификации, содержащие алкилирующие вещества, и модификации с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих на сахаре нуклеотида, может быть заменена на фосфонатную группу или фосфатную группу; защищена стандартными защитными группами или активирована с целью получения дополнительных связей с добавочными нуклеотидами или с твердой подложкой. 5'- и 3'-Концевые ОН-группы могут быть фосфорилированы или замещены аминами, фрагментами органических кэппинг-групп, содержащими от приблизительно 1 до приблизительно 20 атомов углерода, полимерами полиэтиленгликоля (ПЭГ) согласно одному из вариантов осуществления, составляющими от приблизительно 10 до приблизительно 80 кДа, полимерами ПЭГ согласно другому варианту осуществления,составляющими от приблизительно 20 до приблизительно 60 кДа, или другие гидрофильные или гидрофобные полимеры. В одном из вариантов осуществления модификациями являются модификации в С-5 положении пиримидинов. Указанные модификации могут быть получены путем непосредственного связывания амида в С-5-положении или посредством других типов связей. Полинуклеотиды могут содержать также аналогичные формы сахаров рибозы или дезоксирибозы,которые в общем известны в данной области, включая 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фторо- или 2'-азидорибозу, аналоги карбоциклических сахаров, -аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Как было указано выше, одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Указанные альтернативные связывающие группы включают варианты осуществления, при которых фосфат заменен на P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), (O)NR2 ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', СО или СН 2("формацеталь"), в которых каждый R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Необязательно, чтобы все связи в полинуклеотиде были идентичными. Замена аналогичных форм сахаров, пуринов и пиримидинов может оказаться благотворной в создании конечного продукта, поскольку могут образоваться альтернативные структуры остова, например, наподобие полиамидного остова. Здесь термин "С-5-модифицированный пиримидин" относится к пиримидину с модификацией в С-5-положении, включая, но не ограничиваясь, те фрагменты, которые проиллюстрированы на фиг. 10. Примеры С-5-модифицированного пиримидина включают таковые, описанные в патентах США 5719273 и 5945527, а также в предварительной заявке США с серийным 61/264,545, поданной 25 ноября 2009 г., под названием "Nuclease Resistant Oligonucleotides." Примеры С-5-модификации включают замену дезоксиуридина в положении С-5 заместителем, независимо выбранным из бензилкарбоксиамида (альтернативно, бензиламинокарбонила) (Bn), нафтилметилкарбоксиамида (альтернативно, нафтилметиламинокарбонила) (Nap), триптаминокарбоксиамида (альтернативно, триптаминокарбонила)(Trp) и изобутилкарбоксиамида (альтернативно, изобутиламинокарбонила) (iBu), как проиллюстрировано непосредственно ниже. Химические модификации С-5-модифицированного пиримидина могут также быть совмещены с сахаром, модифицированным в одном положении, или в любой комбинации с сахаром, модифицированным в 2'-положении, с модификациями в экзоциклических аминах и заменами 4-тиоуридина и т.п. Репрезентативные С-5-модифицированные пиримидины включают 5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (BndU),5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридин,5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-фторуридин,5-(N-изобутилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (iBudU),5-(N-изобутилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридин,5-(N-изобутилкарбоксиамид)-2'-фторуридин,5-(N-триптаминокарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (TrpdU),5-(N-триптаминокарбоксиамид)-2'-О-метилуридин,5-(N-триптаминокарбоксиамид)-2'-фторуридин,5-(N-[1-(3-триметиламмоний)пропил]карбоксиамид)-2'-дезоксиуридинхлорид,5-(N-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридин (NapdU),5-(N-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридин,5-(N-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-фторуридин или 5-(N-[1-(2,3-дигидроксипропил)]карбоксиамид)-2'-дезоксиуридин. Модификация нуклеотидной структуры, если таковая имеет место, может быть осуществлена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть прерван ненуклеотидными компонентами. Кроме того, полинуклеотид может быть модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгации с меченым компонентом. Здесь термин "по меньшей мере один пиримидин", когда он относится к модификациям нуклеиновой кислоты, относится к одному, нескольким или же всем пиримидинам в нуклеиновой кислоте, что указывает на то, что любой или все из числа С, Т или U в нуклеиновой кислоте могут быть модифицированы или не модифицированы. Здесь "нуклеиново-кислотный лиганд", "аптамер" и "клон" используются взаимозаменяемым образом для обозначения не встречающейся в природе нуклеиновой кислоты, которая оказывает требуемое воздействие на молекулу-мишень. Требуемое воздействие включает, но не ограничено связыванием с мишенью, каталитическим изменением мишени, реагированием с мишенью таким образом, чтобы модифицировалась или изменялась мишень или функциональная активность мишени, ковалентным прикреплением к мишени (как в случае суицидного ингибитора) и облегчением реакции между мишенью и другой молекулой. В одном из вариантов осуществления указанное воздействие представляет собой специфическую аффинность связывания с молекулой-мишенью, при этом такая молекула-мишень представляет собой трехмерную химическую структуру, отличную от полинуклеотида, который связывается с нуклеиново-кислотным лигандом посредством механизма, который не зависит от спаривания оснований по Уотсону/Крику или образования тройной спирали, где указанный аптамер не является нуклеиновой кислотой, имеющей известную физиологическую функцию при связывании с молекулой-мишенью. Аптамеры к данной мишени включают нуклеиновые кислоты, которые идентифицируют из смеси нуклеиновых кислот-кандидатов, где аптамер является лигандом мишени, посредством способа, включающего:(а) приведение смеси молекул-кандидатов в контакт с мишенью, при этом нуклеиновые кислоты,имеющие повышенную аффинность в отношении мишени, по сравнению с другими нуклеиновыми кислотами в смеси молекул-кандидатов, могут быть отделены от остальных молекул-кандидатов в смеси;(b) отделение нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью от остальной смеси молекулкандидатов и(с) амплификацию нуклеиновых кислот с повышенной аффинностью с получением лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот, посредством чего идентифицируют аптамеры молекулымишени. Считается, что аффинность взаимодействий является понятием, характеризующимся степенью выраженности; однако в данном контексте "специфическая аффинность связывания аптамера с его мишенью" означает, что указанный аптамер связывается со своей мишенью обычно со значительно более высокой степенью аффинности, чем он связывается с другими компонентами, не являющимися мишенями,в смеси или в образце. "Аптамер" или "нуклеиново-кислотный лиганд" представляет собой набор копий одного типа или вида молекулы нуклеиновой кислоты, которая имеет конкретную нуклеотидную последовательность. Аптамер может включать любое подходящее число нуклеотидов. "Аптамеры" относятся к более чем одному такому набору молекул. Различные аптамеры могут иметь либо одинаковое либо разное количество нуклеотидов. Аптамеры могут представлять собой ДНК или РНК и могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или содержать двухцепочечные участки или участки тройной спирали. Здесь "протеин", или "белок", используется синонимично с "пептидом", "полипептидом" или "пептидным фрагментом". "Очищенный" полипептид, протеин, белок, пептид или пептидный фрагмент, по существу, свободен от клеточного материала или других контаминирующих белков из клетки, ткани или бесклеточного источника, из которого получена аминокислотная последовательность, или, по существу,свободен от химических предшественников или других химикалий, в случае химического синтеза. Здесь "модулировать" означает изменять либо в сторону увеличения, либо уменьшения уровня пептида или полипептида или означает изменять либо в сторону увеличения, либо уменьшения стабильности или активности пептида или полипептида. Термин "ингибировать" означает понизить уровень пептида или полипептида или уменьшить стабильность или активность пептида или полипептида. Здесь подразумевается, что белок, модуляцию или ингибирование которого осуществляют, представляет собой -NGF. Здесь термин "биологическая активность" указывает на эффект в отношении одного или нескольких клеточных или внеклеточных процессов (например, путем связывания, передачи сигнала и т.д.), который может оказывать влияние на физиологические или патофизиологические процессы. Здесь термины "фактор роста нервов", "NGF" и "[бета]-NGF" относятся к бета-субъединице фактора роста нервов и его вариантов, которые хотя бы частично сохраняют активность NGF. Здесь NGF включает нативные последовательности NGF всех видов млекопитающих, включая человеческие, собачьи, кошачьи, мышиные, последовательности приматов, лошадиные и бычьи последовательности. Здесь "рецептор NGF" относится к полипептиду, который связывается или активируется посредством NGF. Рецепторы NGF включают рецептор TrkA и рецептор р 75 любого вида млекопитающего,включая человека, собаку, кошку, мышей или крыс, лошадей, приматов и жвачных животных, но не ограничиваясь ими."Аптамер -NGF" представляет собой аптамер, который способен связываться с -NGF и модифицировать его активность. Здесь "аптамер -NGF" относится к аптамеру, который способен связываться с-NGF и/или ингибировать биологическую активность и/или низлежащий путь(пути) -NGF, опосредованный передачей сигнала NGF. Здесь "заболевание или болезненное состояние, опосредованное -NGF", относится к заболеванию или болезненным состояниям, при которых активность -NGF может напрямую или опосредованно приводить к возникновению боли или зуда (почесухи) на определенной стадии болезненного процесса,включая любое из заболеваний или болезненных состояний, перечисленных в табл. 7. Таким образом,лечение -NGF-аптамером ингибирует боль или зуд, которые возникают в результате активности -NGF при указанных заболеваниях или болезненных состояниях. Аптамер к -NGF может, кроме того, блоки-7 022429 ровать связывание -NGF с одним или несколькими из его рецепторов. Здесь "боль" относится к острой боли, хронической боли, ноцицептивной боли, висцеральной боли,соматической боли, неноцицептивной боли, невропатической боли, симпатической боли или к боли, связанной с процессами воспаления, опосредованными -NGF. Термин "зуд" относится к почесухе, которая может варьировать от слабых ощущений до интенсивного ощущения болезненного кожного зуда. Кожный зуд может сопровождать первичное кожное заболевание или может быть симптомом системного заболевания - иногда единственным симптомом. Кожные заболевания, при которых кожный зуд может быть наиболее тяжелым, включают, помимо прочего, чесотку, педикулез, укус насекомого, ксероз, крапивницу, атопический дерматит, контактный дерматит,красный плоский лишай, потницу и герпетиформный дерматит. Системные причины зуда включают хронический гепатит или почечное заболевание и лимфому. Термины "кожное расстройство" и "кожное заболевание" относятся к любому заболеванию или состоянию, которое поражает кожу или в которое вовлечена кожа, включая кожные состояния, такие как атопический дерматит, ихтиоз, ксеродермия, себорейный дерматит, аллергический контактный дерматит,алопеция, пузырчатка, герпетиформный дерматит, псориаз, кандидамикоз, акне, дерматофитоз, опрелость, себорейный дерматит у новорожденного, экзема, анкилостомоз и повреждение кожи, например, от ран, ожогов, а также от непроизвольного стула и недержания мочи. Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный органами государственного регулирования федеральной власти или правительством штата или же входящий в список Фармакопеи США или других общепризнанных фармакопей для применения в отношении животных, а конкретнее, в отношении человека. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или эксципиенту, в сочетании с которым вводят лекарственное средство, и он включает, но не ограничен, такие стерильные жидкости, как вода и масла."Фармацевтически приемлемая соль", или "соль" аптамера к -NGF, является продуктом обнаруженного соединения, который содержит ионную связь и обычно продуцируется в результате реакции обнаруженного соединения либо с кислотой, либо с основанием, подходящим для введения индивиду. Фармацевтически приемлемая соль может включать, не ограничиваясь перечисленным, соли присоединения кислот, включая гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты, кислые сернокислые соли,алкилсульфонаты, арилсульфонаты, арилалкилсульфонаты, ацетаты, бензоаты, цитраты, малеаты, фумараты, сукцинаты, лактаты и тартраты; катионы щелочных металлов, таких как Li, Na, K, соли щелочноземельных металлов, таких как Mg или Са, или соли органических аминов."Фармацевтическая композиция" является композицией, включающей аптамер к -NGF в форме,подходящей для введения индивиду. Фармацевтическую композицию обычно составляют таким образом, чтобы она соответствовала предполагаемому пути введения. Примеры путей введения включают, но не ограничены, пероральный и парентеральный пути введения, например внутривенный, интрадермальный, подкожный пути введения, введение путем ингаляции, местный, трансдермальный, чресслизистый и ректальный пути введения. Здесь термин "терапевтически эффективное количество" обычно означает количество, необходимое для облегчения по меньшей мере одного симптома расстройства или состояния, которое предполагается предотвратить, ослабить или подвергнуть лечению, согласно приведенному здесь описанию. Фраза "терапевтически эффективное количество" в отношении аптамеров к -NGF согласно настоящему описанию означает дозу аптамера, которая обеспечивает специфический фармакологический ответ, для получения которого указанный аптамер вводят большому количеству индивидов, нуждающихся в таком лечении. Следует подчеркнуть, что терапевтически эффективное количество аптамера, которое вводят конкретному индивиду в конкретном случае, не всегда будет эффективным при лечении описываемых здесь состояний/заболеваний, даже несмотря на то, что такая доза будет казаться терапевтически эффективной специалистам в данной области. Способ SELEX. Термины "SELEX" и "способ SELEX" используются здесь взаимозаменяемым образом обычно для обозначения (1) отбора нуклеиновых кислот, которые взаимодействуют с молекулой-мишенью требуемым образом, например с высокой степенью аффинности связываются с белком; (2) амплификации указанных отобранных нуклеиновых кислот. Способ SELEX может быть использован для идентификации аптамеров с высокой аффинностью в отношении специфической молекулы-мишени или специфического биомаркера. Обычно способ SELEX включает получение смеси нуклеиновых кислот-кандидатов, связывание смеси нуклеиновых кислот-кандидатов с требуемой молекулой-мишенью с образованием аффинного комплекса, отделение аффинного комплекса от не связанных нуклеиновых кислот-кандидатов, отделение и выделение указанной нуклеиновой кислоты из аффинного комплекса, очистку нуклеиновой кислоты и идентификацию специфической последовательности аптамера. Указанный способ может включать множественные циклы для дальнейшего усовершенствования аффинности выбранного аптамера. Указанный способ может включать стадии амплификации на одной или нескольких стадиях данного процесса. См.,например, патент США 5475096 под названием "Nucleic Acid Ligands". Способ SELEX может быть использован для получения аптамера, который ковалентно связывается со своей мишенью, так же как и аптамера, который нековалентно связывается со своей мишенью. См., например, патент США 5705337 под названием "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi-SELEX." Способ SELEX может быть использован для идентификации высокоаффинных аптамеров, содержащих модифицированные нуклеотиды, которые придают улучшенные характеристики аптамеру, такие,например, как улучшенная стабильность in vivo или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают химические замены в положениях рибозы и/или фосфата и/или оснований. Аптамеры, идентифицируемые способом SELEX и содержащие модифицированные нуклеотиды,описаны в патенте США 5660985 под названием "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", в котором описаны олигонуклеотиды, содержащие нуклеотидные производные, химически модифицированные в 5'- и 2'-положениях пиримидинов. В патенте США 5580737, см. выше,описаны высокоспецифичные аптамеры, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных в положениях 2'-амино (2'-NH2), 2'-фторо (2'-F) и/или 2'-O-метил (2'-OMe). См. также публикацию патентной заявки США 20090098549 под названием "SELEX and PHOTOSELEX", в которой описаны библиотеки нуклеиновых кислот, имеющих расширенный диапазон физических и химических свойств, и их применение в способах SELEX и photoSELEX. В предварительной заявке США с серийным 61/264,545, поданной 25 ноября 200 г., под названием "Nuclease Resistant Oligonucleotides", описаны способы получения олигонуклеотидов с улучшенной резистентностью к нуклеазе. Резистентные к нуклеазе олигонуклеотиды включают по меньшей мере один пиримидин, модифицированный в С-5-положении группой, выбранной из таковых, представленных на фиг. 10. В различных вариантах осуществления указанные модификации включают замену дезоксиуридина в С-5-положении заместителем, независимо выбранным из бензилкарбоксиамида (Bn), нафтилметилкарбоксиамида (Nap), триптаминокарбоксиамида (Trp) и изобутилкарбоксиамида, как было проиллюстрировано выше. Способ SELEX может быть использован также для идентификации аптамеров, которые имеют требуемые характеристики скорости диссоциации. См. публикацию патентной заявки США 20090004667 под названием "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", в которой описаны усовершенствованные способы SELEX для получения аптамеров, которые могут связываться с молекуламимишенями. Описаны способы получения аптамеров и фотоаптамеров, имеющих более низкие скорости диссоциации от соответствующих им молекул-мишеней. Указанные способы включают приведение смеси-кандидата в контакт с молекулой-мишенью, что дает возможность образования комплексов нуклеиновая кислота-мишень, и осуществление обогащения процесса более низкими скоростями диссоциации, где комплексы нуклеиновая кислота-мишень с высокими скоростями диссоциации диссоциируют и не восстанавливаются, тогда как комплексы с низкими скоростями диссоциации остаются интактными. Кроме того, указанные способы включают применение модифицированных нуклеотидов при продуцировании смесей-кандидатов нуклеиновых кислот для получения аптамеров с улучшенными показателями скоростей диссоциации (см. публикацию патентной заявки США 20090098549 под названием "SELEX and"Мишень" или "молекула-мишень", или "мишень", относится здесь к любому соединению, посредством которого нуклеиновая кислота может действовать желаемым образом. Молекула-мишень может представлять собой белок, пептид, нуклеиновую кислоту, углевод, липид, полисахарид, гликопротеин,гормон, рецептор, антиген, антитело, вирус, патоген, токсическое вещество, субстрат, метаболит, аналог переходного состояния соединения, кофактор, ингибитор, лекарственное средство, краситель, питательное вещество, фактор роста, клетку, ткань, любую часть или фрагмент указанного выше и т.д., без ограничения. В действительности любой химический или биологический эффекторный фактор может быть подходящей мишенью. Молекулы любого размера могут служить в качестве мишеней. Мишень также может быть модифицирована определенными путями с целью повышения вероятности или силы взаимодействия между указанной мишенью и указанной нуклеиновой кислотой. Мишень может также включать любую минорную вариацию конкретного соединения или молекулы, например, в случае белка, например минорные вариации в аминокислотной последовательности, в образовании дисульфидных связей, в гликозилировании, липидизации, ацетилировании, фосфорилировании или в любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгация с меченым компонентом, которая, по существу, не изменяет идентичности молекулы. "Молекула-мишень", или "мишень", представляет собой набор копий одного типа или вида молекул или мультимолекулярную структуру, которая способна связываться с аптамером. "Молекулы-мишени", или "мишени", относятся более чем к одному такому набору молекул. Варианты осуществления способа SELEX, при котором мишенью является пептид, описаны в патенте США 6376190 под названием "Modified SELEX Processes Without Purified Protein". В данном случае такой мишенью является -NGF. Аптамеры. Аптамеры согласно настоящему изобретению были идентифицированы с помощью усовершенствованного способа SELEX с целью идентификации аптамеров, имеющих низкие скорости диссоциации, как описано в примере 1, в котором описан репрезентативный способ селекции продуцирования ДНК аптамера к -NGF. Форма -NGF, которая была использована в способе селекции, соответствовала рекомбинантному человеческому белку и была выделена в виде мономерной формы белка с молекулярной массой порядка 13,2 кДа. В растворе такой мономер образует димер. С помощью такого способа идентифицировали ДНК-аптамер к -NGF, обозначенный как аптамер 2426-66 (SEQ ID NO: 1). Используя аптамер 2426-66 (SEQ ID NO: 1), проводили исследования по идентификации минимальной длины последовательности, необходимой для поддержания строгой аффинности в отношении-NGF, как описано в примере. Минимизация длины последовательности позволяет производить более воспроизводимый синтез аптамера в химическом процессе и потенциально способствует адсорбции через кожу, а также включению фармацевтической композиции. Сокращенные исследования ведут к идентификации аптамеров, имеющих число укороченных последовательностей, которые также были авидными связующими веществами в отношении -NGF, со значениями Kd, приблизительно составляющими вплоть до 30 нМ. Указанные последовательности включают SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149 (табл. 3 и 4). В конкретном аптамере 2426-66-50 (SEQ ID NO: 2; табл. 4) был идентифицирован 28-мер, имеющий Kd порядка 1,4 нМ в отношении -NGF. Исследования дополнительного секвенирования проводили на группе последовательностей, из которых была выбрана последовательность 2426-66 (SEQ ID NO: 1). Используемым способом секвенирования был способ секвенирования-454. Это широкомасштабный, высокопроизводительный способ, в котором используется параллельное пиросеквенирование. Указанный способ обеспечивает объективное получение образца и очень безошибочный анализ последовательностей. В указанном способе биотинилированные фрагменты ДНК захватывают на поверхности стрептавидиновых бусинок, а затем амплифицируют путем ПЦР. Небиотинилированная нить высвобождается с бусинки и используется в качестве библиотеки одноцепочечных ДНК-матриц. Затем указанную ДНК амплифицируют путем ПЦР. После чего каждая бусинка содержит амплифицированные клональные копии ДНК-фрагментов. Указанная библиотека бусинок используется затем в процессе ферментативного секвенирования. Полученные при секвенировании данные были использованы для идентификации консенсусной последовательности для-NGF-аптамера. Кроме того, исследования нуклеотидных замен, описанные в примере 3, привели к открытию, что семь из девяти положений BndU в консенсусной последовательности являются желательными с точки зрения связывания -NGF, а два положения BndU могут быть заменены на dT без потери активности связывания. Указанная консенсусная последовательность представлена на фиг. 2 А вместе с графическим представлением частоты нуклеотида в каждом положении по отношению к аптамеру 242666 (SEQ ID NO: 1). Как проиллюстрировано на фиг. 2 А, консенсусная последовательность представляет собой следующую последовательность:BAZGRGGRSZWGGGGZZWADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 45),в которой В выбран из любого нуклеотида, отличного от А;R независимо выбран из А или G;W независимо выбран из Z или Т;D выбран из любого нуклеотида, отличного от С; иZ независимо выбран из модифицированного нуклеотида, в частности из модифицированного пиримидина. В одном из аспектов В выбран из С, G или Z; D выбран из A, G или Z и R, S, W и Z являются такими, как определено выше. В другом аспекте консенсусная последовательность представляет собой следующую последовательность:BAZGRGGRSZZGGGGZZZADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 3),в которой В, R, S, D и Z являются такими, как определено выше. В некоторых вариантах осуществления Z является модифицированным уридином. В других вариантах осуществления Z является С-5-модифицированным пиримидином, как определено выше. В других воплощениях Z является С-5-модифицированным пиримидином, независимо выбранным из группы, состоящей из 5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (BndU),5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридина,5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-фторуридина,5-(N-изобутилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (iBudU),5-(N-изобутилкарбоксиамид)-2'-O-метилуридина,5-(N-изобутилкарбоксиамид)-2'-фторуридина,5-(N-триптаминокарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (TrpdU),- 10022429 5-(N-триптаминокарбоксиамид)-2'-О-метилуридина,5-(N-триптаминокарбоксиамид)-2'-фторуридина,5-(N-[1-(3-триметиламмоний)пропил]карбоксиамид)-2'-дезоксиуридинхлорида,5-(N-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридина (NapdU),5-(N-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-О-метилуридина,5-(N-нафтилметилкарбоксиамид)-2'-фторуридина и 5-(N-[1-(2,3-дигидроксипропил)]карбоксиамид)-2'-дезоксиуридина). В других вариантах осуществления Z является 5-(N-бензилкарбоксиамид)-2'-дезоксиуридином(BndU). Подразумевается, что любые из указанных нуклеотидных модификаций будут одинаково эффективны в промоции высокоаффинного связывания с -NGF и будут обеспечивать низкие скорости диссоциации. Здесь термин "консенсусная последовательность", используемый в отношении серии родственных нуклеиновых кислот, относится к нуклеотидной последовательности, которая отражает наиболее типовую подборку основания в каждом положении в последовательности, при этом указанные серии родственных нуклеиновых кислот подвергают интенсивному математическому анализу и/или анализу последовательностей. В настоящем описании представлены аптамеры к -NGF, идентифицированные с помощью способаSELEX и перечисленные в табл. 3 и 4 (SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149). Аптамеры к -NGF, которые являются, по существу, гомологичными любому из перечисленных аптамеров и которые обладают способностью связываться с -NGF, по существу, сходной с таковой аптамера, выбранного из группы аптамеров,представленных в табл. 3 и 4 (SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149), также считаются входящими в объем, охватываемый настоящим изобретением. Кроме того, аптамеры к -NGF, которые имеют, по существу, такую же структурную форму, что и идентифицированные здесь аптамеры, и которые обладают способностью связываться с -NGF, по существу, сходной с таковой аптамера, выбранного из группы аптамеров, представленных в табл. 3 и 4 (SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149), также считаются входящими в объем, охватываемый настоящим изобретением. В одном из аспектов в настоящем описании представлен аптамер, который специфически связывается с -NGF и включает первичную последовательность нуклеиновой кислоты. В одном из вариантов осуществления указанная первичная последовательность нуклеиновой кислоты выбрана изSEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. В других вариантах осуществления первичная последовательность нуклеиновой кислоты выбрана таким образом, чтобы она была по меньшей мере приблизительно на 75% идентична, по меньшей мере приблизительно на 80% идентична, по меньшей мере приблизительно на 85% идентична, по меньшей мере на приблизительно 90% идентична или по меньшей мере приблизительно на 95% идентична первичной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 1, 2,9-44 и 149. Термины "идентичность последовательности", "процент (или степень) идентичности последовательности", "% идентичности", "%-ная идентичность", а также их вариации, при применении в контексте двух или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот, используются взаимозаменяемым образом для обозначения двух или нескольких последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют точно определенный процент нуклеотидов, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании на предмет максимального соответствия, которое определяется с помощью алгоритма сравнения последовательностей или путем визуальной проверки. Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает в качестве ссылочной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. Когда используют алгоритм сравнения последовательностей, тестируемые и ссылочные последовательности вводят в компьютер, если это необходимо, задают координаты подпоследовательности и задают параметры программы алгоритма последовательностей. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей на основе заданных параметров программы вычисляют процент идентичности тестируемой последовательности (последовательностей) по отношению к ссылочной последовательности. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981, с помощью алгоритма гомологичного выравнивания Нидельмана и Вунша, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970, путем поиска методом подобия Пирсона и Липмана, Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988,путем компьютеризованных комплементаций указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA с помощью набора программного обеспечения по генетике, Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), или путем визуальной проверки (в целом см. Ausubel,F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience(1987. Одним из примеров алгоритма, который является подходящим для определения процента идентичности последовательностей, является алгоритм, используемый в стандартном инструментальном средстве поиска (здесь далее "BLAST"), см., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990 иAltschul et al., Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402, 1997. Программное обеспечение для осуществления анализа BLAST является общественно доступным через Национальный Центр Информации по Биотехнологии (здесь далее "NCBI", National Center for Biotechnology Information). Подразумеваемые значения параметров по умолчанию, используемые при определении идентичности последовательностей с помощью программного обеспечения, доступного в NCBI, например, BLASTN (для нуклеотидных последовательностей), описаны McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 32: W20-W25, 2004. Здесь при описании процента идентичности нуклеиновой кислоты, такой как -NGF-аптамер, последовательность которого составляет по меньшей мере, например, приблизительно 95% идентичности ссылочной нуклеотидной последовательности, подразумевается, что указанная последовательность нуклеиновой кислоты идентична ссылочной последовательности, за исключением того, что последовательность нуклеиновой кислоты может включать вплоть до пяти точковых мутаций на каждые 100 нуклеотидов ссылочной последовательности нуклеиновой кислоты. Иными словами, чтобы получить требуемую последовательность нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере приблизительно на 95% идентична ссылочной последовательности нуклеиновой кислоты, вплоть до 5% нуклеотидов в ссылочной последовательности может быть подвергнуто делеции или замене другим нуклеотидом, или же некоторое количество нуклеотидов вплоть до 5% общего количества нуклеотидов ссылочной последовательности может быть встроено в ссылочную последовательность (здесь они упоминаются как вставки или инсерции). Указанные мутации ссылочной последовательности для получения требуемой последовательности происходят в 5'- или 3'-концевых положениях ссылочной нуклеотидной последовательности или же где-либо между указанными концевыми положениями, вставленные либо индивидуально между нуклеотидами в ссылочной последовательности, либо в одну или несколько смежных групп внутри ссылочной последовательности. Ссылочная (запрашиваемая) последовательность может быть какой-нибудь любой из последовательностей полного нуклеотида, представленного в последовательностях SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149, или любым фрагментом любой из указанных последовательностей. В одном из аспектов каждая из консенсусных последовательностей SEQ ID NO: 45 илиSEQ ID NO: 3 может быть модифицирована таким образом, чтобы включать по меньшей мере одну вставку. В одном из вариантов осуществления консенсусные последовательности либо SEQ ID NO: 45,либо SEQ ID NO: 3 модифицированы таким образом, чтобы один нуклеотид (N) был встроен в консенсусную последовательность между основаниями 9 и 10. В другом варианте осуществления консенсусная последовательность либо SEQ ID NO: 45, либо SEQ ID NO: 3 модифицирована таким образом, чтобы один нуклеотид (N) был встроен в консенсусную последовательность между основаниями 15 и 16. В другом варианте осуществления консенсусные последовательности либо SEQ ID NO: 45, либоSEQ ID NO: 3 модифицированы таким образом, чтобы один нуклеотид (N) был встроен в консенсусную последовательность между основаниями 9 и 10 и дополнительный нуклеотид (N) был встроен в консенсусную последовательность между основаниями 15 и 16. Указанные варианты осуществления можно проиллюстрировать следующим образом:BAZGRGGRSN(0-1)ZWGGGGN(0-1)ZZWADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 154),BAZGRGGRSN(0-1)ZZGGGGN(0-1)ZZZADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 155),где В, R, S, D и Z являются такими, как определено выше, и N независимо выбрано из встречающегося в природе или модифицированного нуклеотида (А, С, G или Т). В другом аспекте настоящее описание связано с аптамером к -NGF, который при связывании с-NGF модулирует функцию -NGF. В различных вариантах осуществления указанный аптамер модулирует функцию -NGF in vivo. В различных вариантах осуществления указанный аптамер к -NGF включает последовательность смежных нуклеотидов, которая идентична последовательности смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. В различных вариантах осуществления указанная последовательность смежных нуклеотидов в аптамере к -NGF может включать любое число нуклеотидов, которые идентичны такому же числу нуклеотидов в последовательности смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. В различных вариантах осуществления указанная последовательность смежных нуклеотидов в аптамере к -NGF включает последовательность от приблизительно 4 до приблизительно 30 смежных нуклеотидов, которые идентичны последовательности от приблизительно 4 до приблизительно 30 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. В иллюстративном варианте осуществления аптамер к -NGF включает последовательность 30 смежных нуклеотидов, которые идентичны последовательности 30 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. В другом иллюстративном варианте осуществления аптамер к -NGF включает последовательность из 20 смежных нуклеотидов, которые идентичны последовательности 20 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. Еще в одном иллюстративном варианте осуществления аптамер к -NGF включает последовательность 8 смежных нуклеотидов, которые идентичны последовательности 8 смежных нуклеотидов, включенных в любую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. Еще в одном иллюстративном варианте осуществления аптамер к -NGF включает последовательность 4 смежных нуклеотидов, которые идентичныSEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. В одном из вариантов осуществления указанный аптамер к -NGF-аптамер представляет собой последовательность SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления указанный -NGF-аптамер представляет собой последовательность SEQ ID NO: 2. Еще в одном варианте осуществления указанный -NGFаптамер получен из консенсусной последовательности SEQ ID NO: 3. В других вариантах осуществления-NGF-аптамер представляет собой любую из последовательностей SEQ ID NO: 9-44 и 149. В одном из вариантов осуществления указанный -NGF-аптамер по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичен, по меньшей мере приблизительно на 85% идентичен, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичен или по меньшей мере приблизительно на 75% идентичен любой из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. В другом варианте осуществления указанный -NGF-аптамер включает последовательность из любой из последовательностейSEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149 и фрагменты любой из них. Указанный -NGF-аптамер может содержать любое число нуклеотидов вдобавок к области, связывающейся с -NGF. В различных вариантах осуществления аптамер к -NGF может включать приблизительно вплоть до 100 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 95 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 90 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 85 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 80 нуклеотидов,приблизительно вплоть до 75 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 70 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 65 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 60 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 55 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 50 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 45 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 40 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 35 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 30 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 25 нуклеотидов, приблизительно вплоть до 20 нуклеотидов. В другом варианте осуществления указанный аптамер к -NGF выбран из аптамеров, которые имеют сходные характеристики связывания и обладают способностью лечить -NGF-ассоциированную боль или состояния зуда, в качестве аптамера, выбранного из группы, состоящей из последовательностейSEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. Указанный -NGF-аптамер может быть выбран таким образом, чтобы он имел любую подходящую константу диссоциации (Kd) по отношению к -NGF. В иллюстративном варианте осуществления указанный -NGF-аптамер имеет константу диссоциации (Kd) по отношению к -NGF, составляющую приблизительно 10 нМ или менее. В другом иллюстративном варианте осуществления указанный -NGF-аптамер имеет константу диссоциации (Kd) по отношению к -NGF, составляющую приблизительно 15 нМ или менее. Еще в одном иллюстративном варианте осуществления указанный -NGF-аптамер имеет константу диссоциации (Kd) по отношению к -NGF, составляющую приблизительно 20 нМ или менее. Еще в одном иллюстративном варианте осуществления указанный -NGF-аптамер имеет константу диссоциации (Kd) по отношению к -NGF, составляющую приблизительно 25 нМ или менее. Подходящая константа диссоциации может быть определена анализом связывания с использованием многоступенчатого титрования и в соответствии с уравнением у=(max-min)(Protein)/(Kd+белок)+min,как описано в примере 1 ниже. Следует иметь в виду, что определение констант диссоциации в большой степени зависит от условий, при которых они измеряются, и, таким образом, их значения могут значительно варьировать в зависимости от факторов, таких как время установления равновесия и т.д. В других вариантах осуществления указанный -NGF-аптамер является аптамером со значением Kd, которое меньше или равно Kd аптамера, выбранного из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 9-44 и 149. Аптамер 2426-66 (SEQ ID NO: 1) связывается с -NGF-мономером со стехиометрией 1:1. Поскольку-NGF образует жесткий гомодимер, который необходим для реакции с его рецепторами-мишенями, более эффективное ингибирование активности -NGF могло бы быть достигнуто при использовании димерной или другой мультимерной формы 2426-66-аптамера. Таким образом, в другом варианте осуществления -NGF-аптамер является продуктом мультимеризации любой комбинации указанных выше последовательностей. На фиг. 3 и 4 проиллюстрированы потенциальные подходы к димеризации 2426-66-аптамера. Такие же стратегии могут быть использованы в отношении любой последовательности аптамера с соответствующими характеристиками связывания с -NGF. Сходные подходы могут быть использованы также для создания мультимерных аптамеров с таким количеством копий последовательности аптамера, какое потребуется. В таком случае используется последовательность 2426-66-50(SEQ ID NO: 2) усеченного аптамера, но может быть использована также и полная длина последовательности 2426-66. На фиг. 3 проиллюстрирована конструкция голова-к-хвосту двух последовательностей 2426-66 либо с одним, либо с несколькими гексаэтиленгликолями (HEG), либо с абазическими сахарфосфатами в качестве линкеров между указанными двумя частями новой последовательности аптамера. На фиг. 4 изображена димеризация последовательности 2426-66 путем использования разветвленного фосфорамидита, необязательно включающая либо гексаэтиленгликоль (HEG), либо абазические сахар- 13022429 фосфаты в качестве линкеров. Фармацевтические композиции, включающие аптамер к -NGF Настоящее описание включает фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере один аптамер к -NGF и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие носители описаны в справочникеWilliamsWilkins, который включен в настоящее описание в виде ссылки. Фармацевтические композиции, которые включают по меньшей мере один аптамер к -NGF и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, могут также включать один или несколько активных компонентов, которые не являются ингибиторами -NGF. Описанные здесь аптамеры могут быть использованы в любой фармацевтически приемлемой форме, включая, но не ограничиваясь, инъецируемые лекарственные формы, жидкие дисперсии, гели, аэрозоли, мази, крема, лиофилизированные композиции, сухие порошки, таблетки, капсулы, композиции с контролируемым высвобождением, быстрорастворимые композиции, композиции с отложенным высвобождением, композиции с замедленным высвобождением, композиции с пульсирующим высвобождением, композиции со смешанным моментальным высвобождением и контролируемым высвобождением и т.д. Описанные здесь аптамеры могут, в частности, быть составлены в композицию (а) для введения, выбранного из любого из таких введений, как пероральное, пульмональное, внутривенное, внутриартериальное, интратекальное, внутрисуставное, ректальное, офтальмическое, ободочное, парентеральное, интрацистернальное, внутривлагалищное, внутрибрюшинное, локальное, защечное, назальное и местное введение; (b) в лекарственной форме, выбранной из любой из таких форм, как жидкие дисперсии, гели,аэрозоли, мази, крема, таблетки, саше и капсулы; (с) в лекарственной форме, выбранной из любой из таких форм, как лиофилизированные композиции, сухие порошки, быстрорастворимые композиции, композиции с контролируемым высвобождением, композиции с отложенным высвобождением, композиции с замедленным высвобождением, композиции с пульсирующим высвобождением, композиции со смешанным моментальным высвобождением и контролируемым высвобождением; или (d) любую их комбинацию. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать один или несколько из следующих компонентов: (1) стерильный разбавитель,такой как вода для инъекций, физиологический раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин,пропиленгликоль или другие синтетические растворители; (2) антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; (3) антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; (4) хелатообразующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; (5) буферы,такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и (6) средства для доведения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Значение рН может быть доведено с помощью кислот или оснований, таких как соляная кислота или гидроокись натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы,шприцы одноразового использования или пузырьки для многократного приема, изготовленные из стекла или пластика. Фармацевтические композиции, подходящие для применения в виде инъекций, могут включать стерильные водные растворы (в случае водорастворимых средств) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильного инъецируемого раствора или дисперсии для немедленного введения. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) или раствор фосфатного буфера (PBS). Во всех случаях такая композиция должна быть стерильной и должна быть в такой степени текучей, чтобы легко набиралась в шприц. Такая фармацевтическая композиция должна быть стабильна в условиях производства и хранения и должна быть защищена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Здесь термин "стабильный" означает пребывание в состоянии или в условиях, которые являются подходящими для введения пациенту. Указанный носитель может быть растворителем или диспергирующей средой, включая, например,воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), а также соответствующие их смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем нанесения эмульсионного слоя, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включение в такую композицию изотонических средств, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит или сорбит, и неорганических солей, таких как хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута путем включения в композицию средства, которое задерживает абсорбцию, например моностеарат алюминия и желатин. Стерильные инъецируемые растворы могут быть получены путем включения активного реагента гредиентом или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, при необходимости, с последующей стерилизацией путем фильтрования. Обычно дисперсии получают путем включения по меньшей мере одного аптамера к -NGF в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и любой другой требуемый ингредиент. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов иллюстративные способы получения включают вакуумную сушку и лиофильную сушку, обе из которых дают на выходе порошок -NGF-аптамера плюс любого дополнительного ингредиента из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора. Пероральные композиции обычно включают инертный разбавитель или пищевой наполнитель. Они могут быть заключены, например, в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для целей перорального терапевтического введения аптамер к -NGF может быть введен в составе с эксципиентами и использован в виде таблеток, пастилок или капсул. Оральные композиции могут быть получены также с использованием жидкого наполнителя для применения в качестве жидкости для полоскания рта, где указанное соединение в жидком наполнителе наносится орально и ополаскивает и выплевывается или проглатывается. Фармацевтически приемлемые связующие средства и/или адъювантные материалы могут быть включены как часть композиции. Для введения путем ингаляции соединения доставляются в виде аэрозольного спрея из спрессованного контейнера или диспенсера, который содержит соответствующий пропеллент, например, газ, такой как двуокись углерода, распыленную жидкость или сухой порошок, из соответствующего устройства. Для чресслизистого или трансдермального введения в композиции используются пенетранты, подходящие для преодоления конкретного барьера. Такие пенетранты в общем известны в данной области и включают, например, в случае предназначения для чресслизистого введения, детергенты, желчные кислоты и производные фусидовой кислоты. Чресслизистое введение может быть осуществлено посредством назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные реагенты составляют в виде растирок, целебных мазей, гелей или кремов, как правило, широко известных в данной области. Указанные реагенты могут быть составлены также в виде суппозиториев (например, с соответствующими основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм для ректальной доставки. В одном из вариантов осуществления аптамер к -NGF составлен в композицию для местного введения. Здесь термин "местное введение" относится к доставке -NGF-аптамера путем приведения в контакт, напрямую или иным способом, композиции, содержащей -NGF-аптамер, со всей кожей (эпидермисом) животного или части кожи. Указанный термин охватывает несколько путей введения, включая,но не ограничиваясь местным и трансдермальным введениями. Общим требованием для таких способов введения является эффективность доставки к ткани- или к слою-мишени. В одном из аспектов местное введение используется в качестве средства для проникновения через эпидермис и дерму, и в конечном итоге достигается системное введение -NGF-аптамера. В другом аспекте местное введение используется в качестве средства для селективного проникновения -NGF-аптамера к эпидермису или дерме животного или же к его специфическому слою-мишени. Для местного введения -NGF-аптамер может быть составлен в виде фармацевтически приемлемых целебных мазей, кремов, лосьонов, глазных мазей, глазных капель, пропитанных перевязочных материалов и аэрозолей, медикаментозных присыпок, медикаментозных адгезивов, пен и может содержать соответствующие обычно применяемые добавки или эксципиенты, включая, например, консервирующие добавки или растворители, способствующие проникновению лекарственного средства, и мягчительные средства в составе мазей, гелей и кремов. Такие местные композиции могут также содержать совместимые обычно применяемые носители, например, этанол или олеиловый спирт в случае лосьонов. Такие носители могут составлять от приблизительно 1 до приблизительно 98% от массы композиции; чаще такие носители будут составлять приблизительно 80% от массы композиции. Специфические композиции для местного введения аптамеров описаны в патенте США 6841539 и в публикации патентной заявки США 20050096287. Дозировка, доставляемая при нанесении местной композиции, предназначена для обеспечения режима непрерывной доставки. В одном из вариантов осуществления -NGF-аптамер вводят в композицию в составе с носителем,который обеспечит защиту против быстрого его выведения из организма. Например, может быть использована композиция с контролируемым высвобождением, включая имплантирующие примеси и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимер молочной кислоты. Способы получения таких композиций должны быть знакомы специалистам в данной области. Необходимые материалы являются также коммерчески доступными от компаний Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Липосомные суспензии (включая липосомы, нацеленные на инфицированные клетки моноклональными антителами против вирусных антигенов) также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными спе- 15022429 циалистам в данной области, например, как описано в патенте США 4522811. Кроме того, суспензии -NGF-аптамера могут быть получены в виде приемлемых масляных инъекционных суспензий. Подходящие для этого липофильные растворители или наполнители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Нелипидные поликатионные аминополимеры также могут быть использованы для доставки. Необязательно, но такая суспензия может включать также и соответствующие стабилизаторы или средства для повышения растворимости соединений, которые дают возможность получать высококонцентрированные растворы. В некоторых случаях может быть особенно предпочтительным составление оральных или парентеральных композиций в лекарственной форме для облегчения введения и стандартизации дозировки. Используемая здесь дозированная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных дозировок для субъекта, подвергаемого лечению; каждая однократная дозировка содержит предварительно определяемое количество аптамера к -NGF, рассчитанное для продуцирования требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Подробная характеристика дозированных лекарственных форм описанных здесь -NGFаптамеров диктуется и напрямую зависит от особых характеристик конкретного -NGF-аптамера и конкретного терапевтического эффекта, которого желательно достичь, и характерных в данной области ограничений, возникающих при составлении композиций, содержащих такое активное лекарственное средство, для лечения индивидов. Фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один -NGF-аптамер, могут включать один или несколько фармацевтических эксципиентов. Примеры таких эксципиентов включают, но не ограничены, связующие средства, наполнители, смазывающие вещества, суспендирующие средства,подсластители, ароматизирующие вещества, консерванты, буферы, увлажняющие средства, дезинтеграторы, шипучие агенты и другие эксципиенты. Такие эксципиенты известны в данной области. Иллюстративные эксципиенты включают следующее: (1) связующие средства, которые включают различные целлюлозы и поперечно сшитый поливинилпирролидон, микрокристаллическую целлюлозу, такую какAvicel PH101 и Avicel PH102, силицифицированную микрокристаллическую целлюлозу (ProSolvSMCC), трагакантовую камедь и желатин; (2) наполнители, такие как различные крахмалы, лактоза,моногидрат лактозы и безводная лактоза; (3) дезинтегрирующие спредства, такие как альгиновая кислота, примогель, кукурузный крахмал, слабо поперечно сшитый поливинилпирролидон, картофельный крахмал, маисовый крахмал и модифицированные крахмалы, кроскармеллозу натрия, кросповидон, гликоляткрахмал натрия и их смеси; (4) скользящие вещества, включая средства, которые действуют на текучесть порошка, предназначенного для компрессии, включают стеарат магния, коллоидный диоксид кремния, такой как Aerosil 200, тальк, стеариновую кислоту, стеарат кальция и силикагель; (5) вещества, способствующие скольжению, такие как коллоидный диоксид кремния; (6) консерванты, такие как сорбат калия, метилпарабен, пропилпарабен, бензойная кислота и ее соли, другие эфиры парагидроксибензойной кислоты, такие как бутилпарабен, спирты, такие как этиловый или бензиловый спирт, фенольные соединения, такие как фенол, или четвертичные соединения, такие как бензалконий хлорид;(7) разбавители, такие как фармацевтически приемлемые инертные наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, двухосновный фосфат кальция, сахариды, и/или смеси любых из перечисленных выше веществ; примеры разбавителей включают микрокристаллическую целлюлозу, такую как Avicel PH101 и Avicel PH102; лактозу, такую как моногидрат лактозы, безводная лактоза; иPharmatose DCL21; двухосновный фосфат кальция, такой как Emcompress; маннит; крахмал; сорбит; сахароза и глюкоза; (8) подсластители, включая любой природный или искусственный подсластитель,такой как сахароза, сахарин сахарозы, ксилит, сахарин натрия, цикламат, аспартам и ацесульфам;(9) вкусовые добавки, такие как мята перечная, метилсалицилат, апельсиновый ароматизатор,Magnasweet (торговая марка MAFCO), ароматизатор надувной жевательной резинки, фруктовые ароматизаторы, и т.п.; а также (10) шипучие вещества, включая шипучие соединения, такие как органическая кислота и карбонат или бикарбонат. Подходящие органические кислоты включают, например, лимонную, виннокаменную, яблочную, фумаровую, адипиновую, янтарную и альгиновую кислоты и ангидриды и кислые соли. Подходящие карбонаты и бикарбонаты включают, например, карбонат натрия, бикарбонат натрия, карбонат калия, бикарбонат калия, карбонат магния, глицин-карбонат натрия, карбонатL-лизина и карбонат аргинина. Альтернативно, может присутствовать только компонент бикарбоната натрия шипучего вещества. В различных вариантах осуществления описанные здесь композиции являются, по существу, чистыми. Здесь термин "по существу чистые" означает, что активный ингредиент (-NGF аптамер) является количественно преобладающим (т.е. на молярной основе, его количество превосходит количество всех других компонентов в композиции). В одном из вариантов осуществления, по существу, очищенная фракция представляет собой композицию, в которой активный ингредиент составляет по меньшей мере приблизительно 50% (на молярной основе) всех присутствующих видов макромолекул. Обычно, по существу, чистая композиция будет включать более чем приблизительно 80% всех видов макромолекул,- 16022429 присутствующих в такой композиции. В различных вариантах осуществления, по существу, чистая композиция будет включать по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%,по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% всех видов макромолекул, присутствующих в такой композиции. В различных вариантах осуществления активный ингредиент очищают, по существу, до гомогенного состояния (при обычных способах детектирования в такой композиции не удается обнаружить тех или иных видов примесей), при этом указанная композиция состоит, по существу, из макромолекул одного вида. Наборы, содержащие композиции аптамера к -NGF. В настоящем описании представлены наборы, содержащие любой из описанных здесь-NGF-аптамеров. Такие наборы могут включать, например, (1) по меньшей мере один аптамер -NGF и(2) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, такой как растворитель или раствор. Дополнительные компоненты набора, необязательно, могут включать, например, (1) любой из идентифицированных здесь фармацевтически приемлемых эксципиентов, таких как стабилизаторы, буферы и т.д.,(2) по меньшей мере один контейнер, флакон или подобное устройство для временного хранения и/или смешивания компонентов указанного набора и (3) аппарат для доставки. Способы доставки. В настоящем описании представлены способы предотвращения или лечения (например, улучшения одного или нескольких симптомов) болезненных состояний путем применения -NGF-аптамера. Указанные способы включают введение пациенту, в случае необходимости, терапевтически эффективного количества -NGF-аптамера. Описанные аптамеры могут быть использованы также и для профилактической терапии. В некоторых вариантах осуществления используется местное введение указанного-NGF-аптамер, полученный описанными здесь способами, или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство. Индивидом или пациентом может быть любое животное (домашнее животное, домашний скот или дикое животное), включая, но не ограничиваясь, кошек, собак, лошадей, свиней и крупный рогатый скот,и предпочтительно человек. Здесь термины "пациент", "индивид" и "субъект" могут быть использованы взаимозаменяемым образом. Здесь термином "лечение" описывается оказание помощи и уход за пациентом с целью лечения заболевания, состояния или расстройства, и оно включает введение -NGF-аптамера для предотвращения запуска симптомов или осложнений заболевания, состояния или расстройства, для облегчения симптомов или осложнений заболевания, состояния или расстройства; или для устранения наличия заболевания,состояния или расстройства у пациента. Более конкретно, "лечение" включает обратное развитие, ослабление, облегчение, минимизацию, супрессию или устранение по меньшей мере одного из болезнетворных симптомов или проявления болезненного состояния (расстройства), прогрессии заболевания, этиологического фактора заболевания (например, бактерии или вирусов) или другого аномального состояния. Лечение обычно продолжается до тех пор, пока не ослабнут симптомы и/или само патологическое состояние. В различных вариантах осуществления описанные композиции (включая местные композиции) и способы используются для лечения дерматита, который часто характеризуется поверхностным воспалением или сыпью на коже, характеризующейся покраснением, отеком, выделениями, образованием струпьев, процессом шелушения кожи и иногда образованием везикул. Прурит (зуд, чесотка) является общим симптомом при дерматите. Экзема является термином, часто взаимозаменяемым образом используемым с дерматитом. Примеры дерматита или экземы включают, например, атопический дерматит (также называемый инфантильной или флексурной экземой), контактный дерматит (включая аллергический и раздражающий), ксеротическую экзему (называемую также астеатозной экземой, потрескавшейся или сухой, Холодовым зудом, или зимней чесоткой), эксфолиативный дерматит, ладонно-подошвенный дерматит, нейродерматит (например, простой хронический лишай), себоррейный дерматит (себорейный дерматит у новорожденных, перхоть), дискоидную экзему (называемую также монетовидной простой экземой, экссудативной экземой, микробной экземой), дисгидроз, венозную экзему (гравитационная экзема,застойный дерматит, застойный дерматит при варикозной экземе, герпетиформный дерматит (болезнь Дюринга), аутоэкзематизацию (называемую также ауточувствительным дерматитом, аутосенсибилизацией), синдром пловцов (например, зуд пловцов или утиный зуд (проявление шистосомоза, урушиолиндуцированный контактный дерматит, который называется также токсикодендроновым дерматитом и луговым дерматитом (например, сыпь от соприкосновения с сумахом ядоносным, сумахом укореняющимся, с ядовитым плющом), солнечный дерматит и экзема домашних хозяек. В одном из вариантов осуществления описанные здесь соединения или же их фармацевтически приемлемые соли или пролекарства могут быть введены в сочетании с другими терапевтическими средствами, которые облегчают или устраняют кожный зуд. Композиции, содержащие описанные здесь-NGF-аптамеры, могут включать, например, более чем один аптамер, например аптамер к IgE, к IL-6 и/или к PAR2, а также аптамер к -NGF. В некоторых примерах композицию -NGF-аптамера, содержащую один или несколько аптамеров, вводят в сочетании с другой эффективной противозудной композицией, такой, например, как антигистаминовое, анальгезирующее, антихолинергическое, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство, стероид, антиоксидантное вещество, витамин, модификатор лейкотриена, антагонист интерлейкина, ингибитор тучных клеток, анти-IgE-антитело, селективный ингибитор обратного захвата серотонина, антагонист рецептора 5-гидрокситриптамина, антибиотик, замедлитель реакции кальцийнейрина, ингибитор деацетилаз гистонов, габапентин или налоксон, в которой активные ингредиенты представлены в свободной форме или в виде фармацевтически приемлемой соли и, необязательно, по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем для системного или местного применения или одновременного, раздельного или последовательного введения и т.п. В большинстве случаев общеприменимые доступные лекарственные формы известных терапевтических лекарственных средств для применения в таких комбинациях являются подходящими."Комбинированная терапия" (или "совместная терапия") включает введение композиции -NGFаптамера и по меньшей мере еще одного второго средства как части специфической схемы лечения,предназначенной для обеспечения благотворного эффекта от совместного воздействия указанных терапевтических лекарственных средств. Благотворный эффект такой комбинации включает, не ограничиваясь, совместное фармакокинетическое или фармадинамическое действие, обусловленное сочетанием терапевтических средств. Введение таких терапевтических средств в сочетании обычно осуществляют в течение определенного периода (обычно минут, часов, дней или недель, в зависимости от выбранной комбинации). Под "комбинированной терапией" может подразумеваться, но обычно не подразумевается, возможность введения двух или нескольких из указанных терапевтических средств как части отдельных схем монотерапии, которые случайно и произвольным образом приводят к комбинациям согласно настоящему изобретению. Под "комбинированной терапией" подразумевается, что она включает введение указанных терапевтических средств в последовательном режиме, т.е. в таком режиме, при котором каждое терапевтическое средство вводят в разное время, так же как и введение указанных терапевтических средств или по меньшей мере двух из указанных терапевтических средств, по существу, одновременно. По существу,одновременное введение может быть осуществлено, например, путем введения субъекту однократной дозы, имеющей фиксированное соотношение каждого из терапевтических средств, или многократного введения однократных доз каждого из терапевтических средств. Схему приема лекарственного средства, в которой используются -NGF-аптамеры, выбирают в соответствии с разными факторами, включая, например, тип, вид, возраст, вес, пол и состояние здоровья пациента; степень тяжести подвергаемого лечению состояния; путь введения; функцию почек и печени пациента и конкретно используемый -NGF-аптамер или его соль. Рядовой практикующий врач или ветеринар может с легкостью определить и предписать эффективное количество указанной композиции,необходимой для профилактики, оказания противодействия или остановки процесса прогрессирования конкретного состояния. Обычно дозировка, т.е. терапевтически эффективное количество, варьирует от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела субъекта, подвергаемого лечению, в день. Эффективность. В примере 4 проиллюстрирована способность различных -NGF-аптамеров и их укороченных (усеченных) вариантов ингибировать -NGF-опосредованный рост нейрита у человека (фиг. 5-7) и ингибировать фосфорилирование TrkA под действием -NGF (фиг. 8 и 9). В примере 5 проиллюстрирована эффективность -NGF-аптамеров в уменьшении частоты расчесывания и улучшении клинического состояния кожи в результате введения аптамера 2426-66-50(SEQ ID NO: 2) больным мышам. Со ссылкой на фиг. 11 можно видеть, что частота расчесывания постоянно уменьшается между 14 и 28 днями у мышей, обработанных аптамером 2426-66-50, в отличие от отсутствия изменении, наблюдаемых у необработанных мышей или мышей, обработанных гидрофильной мазью (НО). Сходным образом, со ссылкой на фиг. 12 можно видеть, что клиническое состояние кожи улучшалось через 4 недели у больных мышей, обработанных аптамером 2426-66-50, и что отсутствие улучшения в отношении частоты расчесывания имело место у необработанных мышей или мышей, обработанных НО. Примеры Следующие примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема притязаний настоящего изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения. Все описанные здесь примеры были осуществлены с использованием стандартных технологий,которые хорошо известны и являются рутинными для специалистов в данной области. Общеизвестные технологии молекулярной биологии, описанные в следующих примерах, могут быть осуществлены так,как описано в стандартных лабораторных справочниках, таких как Sambrook et al., Molecular Cloning: A Пример 1. Селекция и последовательности аптамеров. А. Получение смесей-кандидатов. Кандидатную смесь частично рандомизированных олигонуклеотидов одноцепочечной ДНК(оцДНК) получали путем полимеразного удлинения ДНК-праймера, отожженного на биотинилированной матрице оцДНК, как показано в табл. 1. Кандидатная смесь содержала рандомизированную кассету из 40 нуклеотидов, содержащую dATP, dGTP, dCTP и BndUTP 5-(N-бензилкарбоксиамид-2'дезоксиуридинтрифосфат). 4,8 нмоль праймера 1 (SEQ ID NO: 165), содержащего единственный хромофор, нитрозоазидоанилин (ANA, обозначенный в последовательности как X), на 5'-конце, и 4 нмоль матрицы 1(SEQ ID NO: 46), содержащей два биотиновых остатка (обозначенных в последовательности как В') и 40 рандомизированных положений (А, С, G или Т) (обозначенных в последовательности как N), объединяли в 100 мкл 1 ДНК-полимеразного буфера KOD (Novagen), нагревали до 95C в течение 8 мин и охлаждали на льду. 100 мкл смеси праймер:матрица добавляли к 400 мкл реакции достройки, содержащей 1 ДНК-полимеразный буфер KOD, 0,125 Ед/мкл ДНК-полимеразы KOD XL и 0,5 мМ каждого из dATP,dCTP, dGTP и BndUTP, и инкубировали при 70 С в течение 30 мин. Двухцепочечный продукт собирали посредством биотинов матричной цепи с добавлением 1 мл покрытых стрептавидином магнитных бусинок (MagnaBind Streptavidin, Pierce, 5 мг/мл в 3 М NaCl, содержащем 0,05% TWEEN-20) и инкубировали при 25C в течение 10 мин при помешивании. Бусинки трижды промывали 0,75 мл буфера SB17T (40 мМHEPES, рН 7,5, 125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,05% TWEEN-20). Аптамерную цепь элюировали с бусинок с помощью 1,2 мл 20 мМ NaOH, нейтрализовывали 0,3 мл 80 мМ HCl и забуферивали, используя 15 мкл 1 М HEPES, рН 7,5. Кандидатные смеси концентрировали с помощью Centricon-30 приблизительно до 0,2 мл и подвергали количественному спектроскопическому анализу УФ-поглощения. Таблица 1 Последовательности матрицы и праймеров SELEX 1B. Получение белка-мишени. Немеченный человеческий -NGF (RD Systems) биотинилировали путем ковалентного связывания NHS-PEO4-биотина (Pierce) с лизиновыми остатками. Белок (300 пмоль в 50 мкл) обменивали вSB17T с использованием микроспиновой колонки Sephadex G-25. NHS-PEO4-биотин добавляли до 1,5 мМ и реакционную смесь инкубировали при 4 С в течение 16 ч. Непрореагировавший NHS-PEO4 биотин удаляли на микроспиновой колонке Sephadex G-25.C. Иммобилизация белка-мишени. Белок-мишень иммобилизировали на парамагнитных бусинках MyOne-SA (MyOne SA, Invitrogen,или, как они будут называться далее, на SA-бусинках), в цикле 1 способа SELEX. -NGF разбавляли до 0,2 мг/мл в 0,5 мл SB17T и добавляли к 0,5 мл SA-бусинок (предварительно дважды промытых в 20 мМNaOH и однократно - в SB17T). Полученную смесь перемешивали в течение 30 мин при 25 С и до использования хранили при 4 С.D. Отбор целевых аптамеров способом обогащения с низкой скоростью диссоциации и путем фотохимической сшивки. Были предприняты способы отбора из кандидатной смеси, сравнение связывания между образцами и белком-мишенью (сигнал S) и образцами без белка-мишени (фон В). Первые три цикла были предприняты с отбором в отношении аффинности (без фотохимической сшивки); второй и третий циклы включали процесс обогащения с низкой скоростью диссоциации. Циклы с четвертого по девятый включали как процесс обогащения комплексами с низкой скоростью диссоциации, так и фотохимической сшивкой. Для каждого образца 90 мкл смеси ДНК получали в SB17T с 10-20 пмоль кандидатной смеси(56 пмоль в первом цикле) и 56 пмоль обратного праймера. Образцы нагревали до 95 С в течение 3 мин и охлаждали до 37 С со скоростью 0,1 С/с. Образцы объединяли с 10 мкл конкурентной белковой смеси(0,1% HSA, 10 мкМ казеина и 10 мкМ протромбина в SB17T), добавляли к 0,5 мг SA-бусинок и инкубировали при 37 С в течение 5 мин при перемешивании. Бусинки удаляли путем магнитного разделения. Реакции связывания предпринимали путем добавления 10 мкл белка-мишени (0,5 мкМ в SB17T) или SB17T к 40 мкл смесей ДНК и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. Процесс обогащения с низкой скоростью диссоциации использовали тремя различными путями. В циклах два и три образцы 20-кратно разбавляли путем добавления 950 мкл SB17T (предварительно нагретого до 37 С) и инкубировали при 37 С в течение 15 мин перед началом захвата комплексов. В циклах четыре и пять образцы 20-кратно разбавляли путем добавления 950 мкл SB17T (предварительно нагретого до 37 С) и инкубировали при 37 С в течение 30 мин перед фотосшивкой. В циклах шесть и семь образцы 20-кратно разбавляли путем добавления 950 мкл SB17T (предварительно нагретого до 37 С). 50 мкл каждого разбавленного образца вновь разбавляли путем переноса в 950 мкл SB17T, содержащего 10 мМ декстрансульфата(5 кДа) (предварительно нагретого до 37 С), что дает общее 400-кратное разведение, и инкубировали при 37 С в течение 60 мин перед фотосшивкой. В циклах восемь и девять образцы 20-кратно разбавляли путем добавления 950 мкл SB17T (предварительно нагретого до 37 С) и 50 мкл каждого образца вновь разбавляли путем переноса в 950 мкл SB17T, давая 400-кратное разведение. Наконец, 50 мкл каждого 400 кратно разведенного образца вновь разбавляли путем переноса в 950 мкл SB17T, содержащего 10 мМ декстрансульфата (5 кДа) (предварительно нагретого до 37 С), давая в общей сложности 8000-кратное разведение, и инкубировали при 37 С в течение 60 мин перед фотосшивкой. При осуществлении фотосшивки 1 мл реакции связывания после процесса обогащения с низкой скоростью диссоциации облучали сверху с помощью совокупности LED 470 нм в течение 60 с до захватывания комплекса. Комплексы захватывали SA-бусинками посредством биотинов белка с добавлением 0,25 мгMyOne-SA-бусинок (Invitrogen) и инкубировали при 25 С в течение 15 мин при перемешивании. Свободную ДНК удаляли путем 5-кратного промывания бусинок буфером SB17T. Если специально не указано иное, все промывки осуществляли путем ресуспендирования бусинок в 100 мкл промывочного раствора, перемешивали в течение 30 с при 25 С, отделяли бусинки магнитом и удаляли промывочный раствор. Цепь аптамера элюировали с бусинок путем добавления 85 мкл 20 мМ NaOH и инкубировали при 37 С в течение 1 мин при перемешивании. 80 мкл элюата аптамера переносили в новую пробирку после магнитного разделения, нейтрализовывали 20 мкл 80 мМ HCl и забуферивали, используя 1 мкл 0,5 МTris-HCl, pH 7,5. При осуществлении фотоселекции комплексы захватывались, как было указано выше, и несшитую ДНК удаляли путем однократного промывания бусинок 4 М гуанидином-HCl, содержащим 0,05%TWEEN-20 при 50 С в течение 10 мин, однократного промывания 20 NaOH при 25 С в течение 2 мин,двукратного промывания буфером SB17T и однократного промывания 16 мМ NaCl. Поперечно сшитую ДНК не удаляли с поверхности бусинок с целью проведения стадий амплификации. Е. Амплификация и очистка аптамера. Отобранный аптамер ДНК амплифицировали и количественно определяли с использованием QPCR. 48 мкл ДНК добавляли к 12 мкл смеси QPCR (5 ДНК-полимеразный буфер KOD, 25 мМ MgCl2, 10 мкМ прямого ПЦР-праймера (праймер 2, SEQ ID NO: 47), 10 мкМ биотинилированного обратного ПЦРпраймера (праймер 3, SEQ ID NO: 48), 5 SYBR Green I, 0,125 Ед/мкл ДНК-полимеразного буфера KODXL и 1 мМ каждого из dATP, dCTP, dGTP и dTTP) и подвергали циклической термообработке в аппаратеBio-Rad MyIQ QPCR со следующим протоколом: 1 цикл при 99,9 С, 15 с, 55 С, 10 с, 68 С, 30 мин,30 циклов при 99, 9 С, 15 с, 72 С, 1 мин. Количественное определение осуществляли с использованием программного обеспечения и отобранное число копий ДНК, без белка-мишени или с белком-мишенью,сравнивали для определения соотношений сигнал/фон. При осуществлении фотоселекции копию кДНК отобранной ДНК получали путем достройки праймера на поверхности бусинок. Промытые бусинки ресуспендировали в 20 мкл смеси достроенной кДНК(буфер для достройки праймера, содержащий 5 мкМ небиотинилированного обратного ПЦР-праймера(праймер 4, SEQ ID NO: 169), 0,5 мМ каждого из dATP, dCTP, dGTP и dTTP, а также 0,125 Ед/мкл ДНК-полимеразного буфера KOD XL) и инкубировали при 68 С в течение 30 мин при перемешивании. Бусинки 3 раза промывали буфером SB17T и цепь кДНК элюировали с бусинок путем добавления 85 мкл 20 мМ NaOH и инкубировали при 37 С в течение 1 мин при перемешивании. 80 мкл элюата аптамера переносили в новую пробирку после магнитного разделения, нейтрализовывали 20 мкл 80 мМ HCl и забуферивали, используя 1 мкл 0,5 М Tris-HCl, рН 7,5. кДНК амплифицировали и количественно определяли с использованием QPCR, как было описано выше, с проведением 30 циклов при 99,9 С, 15 с, 72 С,1 мин. После амплификации продукт ПЦР улавливали на поверхности Sa-бусинок посредством биотинилированной антисмысловой цепи. 1,25 мл Sa-бусинок (10 мг/мл) дважды промывали 0,5 мл 20 мМ NaOH,однократно промывали 0,5 мл буфера SB17T, ресуспендировали в 1,25 мл 3 М NaCl + 0,05% Tween и хранили при 4 С. 25 мкл Sa-бусинок (10 мг/мл в 3 М NaCIT) добавляли к 50 мкл двухцепочечных продуктов QPCR и инкубировали при 25 С в течение 5 мин при перемешивании. Бусинки однократно промывали буфером SB17T и "смысловую" цепь элюировали с бусинок путем добавления 200 мкл 20 мМNaOH и инкубировали при 37 С в течение 1 мин при перемешивании. Элюированную цепь отбрасывали и бусинки 3 раза промывали буфером SB17T и однократно промывали 16 мМ NaCl. Смысловую цепь аптамера получали, используя хромофор ANA, путем достройки праймера из им- 20022429 мобилизированной антисмысловой цепи. Бусинки ресуспендировали в 20 мкл реакционной смеси достроенного праймера (1 буфер для достройки праймера, 1,5 мМ MgCl2, 5 мкМ прямого праймера с 5'-хромофором ANA (праймер 1, SEQ ID NO: 165), 0,5 мМ каждого из dATP, dCTP, dGTP и dTTP, a также 0,125 Ед/мкл ДНК-полимеразного буфера KOD XL) и инкубировали при 68 С в течение 30 мин при перемешивании. Бусинки 3 раза промывали буфером SB17T и цепь аптамера элюировали с бусинок путем добавления 85 мкл 20 мМ NaOH и инкубировали при 37 С в течение 1 мин при перемешивании. 80 мкл элюата аптамера переносили в новую пробирку после магнитного разделения, нейтрализовывали 20 мкл 80 мМ HCl и забуферивали, используя 5 мкл 0,1 М HEPES, рН 7,5.F. Выбор обратной связи и условий строгости. Концентрация соответствующего белка-мишени на стадии селекции при каждом цикле снижалась в соответствии с соотношением S/B следующим образом, где сигнал S и фон В определены выше в разделе D: где [Р]=концентрация белка, i=номер текущего цикла. После каждого цикла селекции определяли конвергентный статус обогащенной смеси ДНК. 10 мкл двухцепочечного продукта QPCR разбавляли до 200 мкл 4 мМ MgCl2, содержащим 1 SYBR Green I. Образцы покрывали 75 мкл силиконового масла и проводили анализ на предмет сходимости с помощьюC0t-анализа, в котором измеряется время гибридизации комплексных смесей двухцепочечных олигонуклеотидов. Образцы подвергали циклической термообработке в соответствии со следующим протоколом: 3 цикла при 98 С, 1 мин, 85 С, 1 мин, 1 цикл при 93 С, 1 мин, 85 С, 15 мин. В течение 15 мин при 85 С измеряли флуоресцентные изображения с 5-секундными интервалами. Интенсивность флуоресценции наносили в виде логарифмической функции log (от времени) и с каждым циклом SELEX наблюдали повышенную скорость гибридизации, что указывает на конвергенцию последовательностей.G. Способ скрининга клонов и идентификация аптамеров. Конвергированный пул, полученный после девяти циклов SELEX, клонировали и секвенировали. Отобранную ДНК подвергали ПЦР-амплификации с небиотинилированными SELEX-праймерами для создания AGCT ДНК, очищали с помощью набора QIAquick 96 PCR Purification Kit (Cat28181) и очищенные вставки клонировали, используя набор Stratagene PCR-Script Cloning Kit (Cat211189), в соответствии с инструкциями изготовителя. Лигированные пулы SELEX отсылали в компанию по секвенированию (Cogenics, Houston, Texas) для трансформации, расположения в 96-луночных планшетах, подготовки и секвенирования ДНК. Были получены последовательности 42 клонов, их подвергали анализу на предмет сходимости, используя общеупотребимое для этого программное обеспечение, с помощью которого определяют значение порядкового номера последовательности/число копий и идентифицируют общий характер сходимости с помощью алгоритма локального выравнивания. Последовательности с наиболее высокой воспроизводимостью/числом копий в пуле и последовательности, которые сводились к общим мотивам связывания, отбирались для дальнейшего скрининга. Для дальнейшего анализа было отобрано шесть последовательностей и их получали ферментативным путем с использованием плазмидной ДНК, полученной от компании Cogenics, в качестве матрицы для ПЦР-амплификации. Н. Измерение константы равновесного связывания (Kd). Константы равновесного связывания 6 отобранных последовательностей измеряли путем анализа на определение аффинности. Радиоактивно меченую ДНК нагревали в течение 3 мин при 95 С в буфереSB17T-0,002 (SB17T с TWEEN-20 доведенный до 0,002%) и медленно остужали до 37 С. Комплексы образовывались в результате смешивания низкой концентрации радиоактивно меченой ДНК (110-11 M) с белком-мишенью с разбросом концентраций (от 110-7 до 110-12 M) в SB17T-0,002 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. Часть каждой из реакционных смесей переносили на нейлоновую мембрану и высушивали для определения общего счета в каждой реакции. Комплексы перехватывали на смолеZORBAX (Agilent), пропущенной под вакуумом через планшет Multiscreen HV Plate (Millipore), и промывали 200 мкл буфера SB17T-0,002 для отделения белок-связанных комплексов из несвязанной ДНК. Нейлоновую мембрану и планшет Multiscreen HV фосфорометрически визуализировали и количественно определяли уровень радиоактивности в каждом образце с помощью FUJI FLA-3000. Относительное количество (фракцию) захваченной ДНК наносили как функцию концентрации белка (Pt) и определяли константы равновесного связывания (Kd) посредством уравнения у=(max-min)(Pt)/(Kd+Pt)+min. Клон 2426-66 (SEQ ID NO: 1, перечисляемый в табл. 3), 76-мер, с Kd=510-9 М, был отобран как лидирующий клон для определения дальнейших его характеристик, см. фиг. 1.I. Полное секвенирование пула SELEX. Для более полной оценки последовательностей внутри пула семейства аптамеров 2426-66 данный обогащенный пул секвенировали с использованием технологии пиросеквенирования-454. Пул ДНК амплифицировали с помощью праймеров согласно технологии 454, как описано выше, и продукт ПЦР очищали и нормировали, используя Sequal normalization plate (Invitrogen, CatA 10510-01). Элюат нано- 21022429 сили и пропускали через гель для подтверждения размера и чистоты каждого ампликона. Очищенный продукт ПЦР секвенировали с помощью облегченной технологии пиросеквенирования-464 в Центре Здоровья в университете штата Колорадо, University of Colorado Health Science Center in Aurora CO. Указанные 454 последовательности выравнивали в соответствии с 2426-66 с использованиемCLUSTAL-анализа. Всего из 1165 мультикопийных последовательностей 165 последовательностей имели характеристики, сходные с таковыми 2426-66. На основе общности 5'-последовательностей в указанных последовательностях их выравнивали по трем группам. Средняя область последовательности была консервативна во всех трех группах. Для всех последовательностей для каждого положения вычисляли степень идентичности с 2426-66, как указано на фиг. 2 В. В табл. 2 перечислены номера последовательностей-представителей последовательностей семейства аптамеров 2426-66, где Z' представляет собой Показана только область 40N. На основе этого, как указано выше, была определена следующая консенсусная последовательность связывания с -NGF:BAZGRGGRSZZGGGGZZZADCCGZZRZG (SEQ ID NO: 3),в которой В, Z, R и S являются такими, как определено выше. Хотя консенсусная последовательность содержит 28 нуклеотидов в длину, ряд последовательностей, перечисленных в табл. 2, имеет в указанной консенсусной последовательности вставки из одного основания. На фиг. 2 В показано, что приблизительно 91% последовательностей имеет делецию в положении 12, но приблизительно 7% последовательностей имеет в этом положении G или Z и приблизительно 95% последовательностей имеет делецию в положении 19, но приблизительно 3% последовательностей имеет в этом положении G. Данное наблюдение свидетельствует о том, что вставки консенсусной последовательности -NGF (SEQ ID NO: 3) в некоторых положениях являются допустимыми и что такие вставки не вызывают инактивации -NGF-аптамера. Пример 2. Исследования укорочения последовательностей.-NGF-аптамер 2426-66 (SEQ ID NO: 1) насчитывает в длину 76 нуклеотидов с Kd=510-9 M. Для большей части эффективных химических синтезов важно идентифицировать минимальную высокоаффинную последовательность аптамера и укорачивать такой аптамер до наименьшего возможного размера. К другим положительным качествам относятся повышение проницаемости тканей и стабильность в отношении активности нуклеазы in vivo. Чтобы идентифицировать минимальную область аптамера 2426-66 (SEQ ID NO: 1), которая сохраняет связывающую активность, синтезировали целую серию укороченных вариантов, представляющих собой все возможные последовательности длиной в 50 смежных нуклеотидов, представленных в 2426-66. Последовательности указанных вариантов перечислены в табл. 3, в которой Z' представляет собой BndU,и Т представляет собой dT. Указанные варианты тестировали на предмет их аффинности путем анализа аффинности связывания с -NGF, как описано выше. Таблица 3 Последовательности аптамеров 2426-66 и их укороченных вариантов Все варианты сохраняли активность связывания с -NGF, за исключением вариантов 2426-66-2(SEQ ID NO: 4), 2426-66-3 (SEQ ID NO: 5), 2426-66-4 (SEQ ID NO: 6), 2426-66-5 (SEQ ID NO: 7) и 2426-66-6 SEQ ID NO: 8), что свидетельствует о том, что 5'-концевых 26 нуклеотидов (положения 1-26) и 3'-концевых 21 нуклеотидов (положения 56-76) в 2426-66 не являются необходимыми для связывания-NGF, и что полностью всех или части остальных 29 нуклеотидных элементов (положения 27-55) может быть достаточно. Такая гипотеза была проверена путем синтеза и измерения аффинностей связывания второй серии вариантов 2426-66 (SEQ ID NO: 1). Последовательности указанных вариантов перечислены в табл. 4, в которой Z' представляет собой BndU и Т представляет собой dT. Все варианты сохраняли активность связывания с -NGF, за исключением вариантов 2426-66-56 (SEQ ID NO: 150), 2426-66-57(SEQ ID NO: 149), 25-мер, оказался самой короткой последовательностью с -NGF-связывающей аффинностью, равной таковой полноразмерного аптамера 2426-66 (SEQ ID NO: 1). Вариант 2426-66-54(SEQ ID NO: 44), 26-мер, обладал аффинностью в отношении -NGF, слегка лучшей, чем таковая полноразмерного аптамера 2426-66 (SEQ ID NO: 1), и он был выбран для дальнейшей оптимизации. Таблица 4 Последовательности укороченных вариантов аптамеров 2426-66 Пример 3. Определение подходящих положений BndU. Одиночные замены BndU на dT в 26-мерном аптамере. Девять из 26 нуклеотидов аптамера 2426-66-54 (SEQ ID NO: 44) представляют собой BndU. Для определения того, в каких именно положениях BndU вовлечен в связывание, было синтезировано девять вариантов 2426-66-54, каждый из которых содержал единственную замену dT в одном из девяти положений BndU, и были измерены аффинности в отношении -NGF. Последовательности всех вариантов перечислены в табл. 5, в которой Z' представляет собой BndU и Т представляет собой dT. Таблица 5 Последовательности вариантов аптамеров 2426-66-54(2426-66-73, SEQ ID NO: 163) и в положении 25 (2426-66-74, SEQ ID NO: 164) привела к полной потере аффинитета. Полученные результаты свидетельствуют о том, что модифицированные остатки уридина в положениях 1, 8, 14, 15, 22, 23 и 25 являются желательными для проявления максимальной аффинности связывания -NGF. Укороченные варианты 2426-66 (SEQ ID NO: 1) с остатками BndU в положениях 9 и 16, замененными на dT, синтезировали и тестировали на предмет аффинности в отношении -NGF. Последовательности приведены в табл. 6, в которой Z' представляет собой BndU и Т представляет собой dT. ЗаменаBndU на dT в двух положениях любого из трех указанных вариантов не вызывала потери аффиннности по сравнению с незамещенными контрольными образцами. Таблица 6 Укороченный и замещенный варианты аптамера 2426-66 На основе полученных результатов, которые суммированы на фиг. 2 А, консенсусную последовательность (SEQ ID NO: 3) для связывания с -NGF модифицировали следующим образом, чтобы отразить возможность замены BndU на dT в двух положениях:-NGF-аптамер 2426-66 (SEQ ID NO: 1) и укороченные варианты 2426-66 подвергали скринингу на предмет ингибирования активности -NGF в двух клеточных анализах in vitro. Клетки РС 12 (CRL-1721 из АТСС), линия злокачественных клеток феохромоцитомы крысы и модель нейрональной дифференцировки отвечали на -NGF индукцией нейронального фенотипа. Двумя проявлениями указанного ответа являются фосфорилирование мембрано-связанной TrkA и удлинение нейритов. Аптамеры тестировали на предмет их способности ингибировать -NGF-стимулированное фосфорилирование TrkA и рост нейритов на клетках РС 12. Анализ роста нейритов. Клетки PC12 редко помещали в 60-мм чашки и предоставляли им возможность прикрепиться к чашке в течение ночи. После прикрепления нормальную среду для роста клеток заменяли средой с низким содержанием сыворотки (LSM), поскольку клетки РС 12 не дифференцируются в нормальной ростовой среде с высоким содержанием сыворотки. -NGF (100 нг/мл) и аптамер (100 нМ) предварительно

МПК / Метки

МПК: C12P 19/34, C07H 21/04

Метки: заболеваний, beta;-ngf-опосредованных, аптамеры, применение, лечении, расстройств, beta;-ngf

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-22429-aptamery-k-beta-ngf-i-ih-primenenie-pri-lechenii-beta-ngf-oposredovannyh-zabolevanijj-i-rasstrojjstv.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Аптамеры к β-ngf и их применение при лечении β-ngf-опосредованных заболеваний и расстройств</a>

Похожие патенты