Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела, содержащая буфер, наполнитель, стабилизирующий агент и поверхностно-активное вещество, отличающаяся тем, что буфер представляет собой 10 мМ гистидин и рН составляет 5,0, где наполнителем является 4% вес./об. маннитол,

где стабилизирующим агентом является 2% вес./об. сахароза и

где поверхностно-активным веществом является 0,004% вес./об. полисорбат-20; и

где терапевтическое пептидное антитело включает человеческий Fc-TMP, где ТМР содержит SEQ ID NO: 1017, где Fc человека представляет собой последовательность SEQ ID NO: 1, имеющую начальный метионин на N-конце.

2. Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела, содержащая буфер, наполнитель, стабилизирующий агент и поверхностно-активное вещество; отличающаяся тем, что буфер представляет собой 10 мМ гистидин и рН составляет 7,0,

где наполнителем является 4% вес./об. маннитол;

где стабилизирующим агентом является 2% вес./об. сахароза и

где поверхностно-активным веществом является 0,004% вес./об. полисорбат-20, и

где терапевтическое пептидное антитело содержит последовательность SEQ ID NO: 2.

Текст

Смотреть все

ЛИОФИЛИЗИРОВАННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПЕПТИДНОГО АНТИТЕЛА Настоящее изобретение включает устойчивые при длительном хранении лиофилизированного терапевтического пептидного антитела и способы лиофилизированной композиции, содержащей терапевтическое пептидное антитело. Область, к которой относится изобретение Изобретение в целом относится к препаратам лиофилизированных терапевтических пептидных антител и способам получения лиофилизированной композиции, содержащей терапевтические пептидные антитела. Предпосылки создания изобретения Рекомбинантные белки представляют собой новый класс терапевтических агентов. Такие рекомбинантные лекарства привели к успехам в области приготовления и химической модификации белков. Идентифицированы модификации, которые могут защитить терапевтические белки, главным образом, за счт блокирования их подверженности воздействию протеолитических ферментов. Модификации белков могут также повышать стабильность, время циркуляции в кровотоке и биологическую активность терапевтических белков. Обзорная статья Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Mediscript, London),в которой описываются модификация белков и слитые белки, вводится в данное описание в качестве ссылки. Одна применимая модификация представляет собой объединение (комбинацию) полипептида с "Fc" доменом антитела. Антитела содержат две функционально независимых области, вариабельный домен,известный как "Fab", который связывает антиген, и константный домен, называемый "Fc", который связывается с такими эффекторными функциями как активация комплемента и атака фагоцитарных клеток.Fc имеет продолжительный период полужизни в сыворотке, тогда как Fab является короткоживущим.Capon et al. (1989), Nature 337: 525-31. См. также, например, патент США 5428130. При конструировании вместе с терапевтическим пептидным антителом или белком Fc домен может обеспечить более продолжительный период полужизни или включить такие функции, как Fc рецепторное связывание (связывание с Fc рецептором), связывание белка А, фиксацию комплемента и, возможно, даже переход через плаценту. Id. В табл. 1 суммируются данные о применении слияний Fc с терапевтическими белками, известные в уровне техники. Таблица 1. слияние Fc с терапевтическими белками Конъюгированные или слитые с полиэтиленгликолем (ПЭГ, "PEG") белки и пептиды также изучали с целью применения в фармацевтических препаратах, искусственных имплантатах и в других случаях,когда имеет значение биосовместимость. Предлагались различные ПЭГ-производные, содержащие активный фрагмент, позволяющий ПЭГ связываться с препаратами и имплантатами и в целом с молекулами и поверхностями. Например, ПЭГ-производные предлагались для связывания ПЭГ с поверхностями с целью контроля увлажнения, повышения статических свойств и связывания молекул других типов с поверхностью, включая белки и остатки белков. В других исследованиях показано, что связывание ПЭГ ("пегилирование") желательно для того,чтобы преодолеть затруднения, встречающиеся при клиническом применении биологически активных молекул. Например, как утверждается в опубликованной патентной заявке WO 92/16221, найдено, что многие потенциальные терапевтические белки имеют короткий период полужизни в сыворотке крови. Пегилирование снижает скорость выведения из организма (кровотока) за счт повышения средней молекулярной массы. До определнного размера скорость гломерулярной фильтрации белков обратно пропорциональна размеру белка. Следовательно, способность пегилирования снижать клиренс в целом является функцией не числа групп ПЭГ, присоединнных к белку, а общей молекулярной массы конъюгированного белка. Пониженный клиренс может привести к повышенной эффективности по сравнению с непегилированным материалом. См., например, Conforti et al., Pharm. Research Commun. vol. 19, pg. 287(1987) и Katre et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol. 84, pg. 1487 (1987). Помимо этого пегилирование может снизить агрегацию белка (Suzuki et al., Biochem. Biophys. Actavol. 788, pg. 248 (1984, изменить иммуногенность белка (Abuchowski et al., J. Biol. Chem. vol. 252 pg. 3582 (1977 и повысить растворимость белка, как описано, например, в опубликованной международной заявке WO 92/16221. В целом взаимодействие белкового лиганда с его рецептором часто имеет место при относительно большой области контакта (границе раздела). Однако, как показано в случае человеческого гормона роста, лишь малое число ключевых (важнейших) остатков в области контакта действительно вносят основной вклад в энергию связывания. Clackson, Т. et al., Science 267: 383-386 (1995). Это наблюдение и тот факт, что оставшаяся основная часть белкового лиганда служит только для визуализации связывающих эпитопов в правильной топологии, позволяет обнаруживать активные лиганды значительно меньшего размера. Так, молекулы только "пептидной длины" по данному описанию могут связываться с рецепторным белком данного большого белкового лиганда (белка-лиганда). Такие пептиды могут имитировать биоактивность большого белка-лиганда("пептидные агонисты") или, за счт конкурентного связывания,ингибировать биоактивность большого белкового лиганда (белка-лиганда, "пептидные антагонисты"). Пептидные фаг-дисплейные библиотеки предоставляют мощный метод идентификации таких пептидных агонистов и антагонистов. См., например, Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990),Science 249: 404; патент США 5223409, выданный 29 июня 1993 г.; патент США 5733731, выданный 31 марта 1998 г.; патент США 5498530, выданный 12 марта 1996 г.; патент США 5432018, выданный 11 июля 1995 г.; патент США 5338665, выданный 16 августа 1994 г.; патент США 5922545,выданный 13 июля 1999 г.; международную патентную заявку WO 96/40987, опубликованную 19 декабря 1996 г.; и международную патентную заявку WO 98/15833, опубликованную 16 апреля 1998 г., каждый из этих материалов вводится в данное описание в качестве ссылки. В таких библиотеках случайные пептидные последовательности визуализируются с помощью слияния с оболочечными белками нитевидного фага. Обычно визуализируемые пептиды выделяются аффинной элюцией относительно иммобилизованного на антителе внеклеточного домена рецептора. Удержанные фаги можно обогащать в ходе последовательных циклов аффинной очистки и выращивания, и устанавливать последовательность пептидов с наилучшим связыванием для определения ключевых остатков в одном или более родственных по структуре семейств пептидов. См., например, работу Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, в которой идентифицированы два различных семейства. Можно также предвидеть пептидные последовательности, остатки в которых можно безболезненно заменить сканированием аланином или мутагенезом на уровне ДНК. Можно создавать библиотеки с помощью мутагенеза и подвергать их скринингу на дальнейшую оптимизацию последовательности наилучших связующих. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol.Struct. 26: 401-24. Другие методы являются конкурентами фагового дисплея при поиске пептидов. Пептидную библиотеку можно связывать с карбоксильным концом lac репрессора и экспрессировать в Е. coli. Другой метод на основе Е. coli позволяет визуализировать на внешней клеточной мембране за счт слияния с липопротеином, ассоциированным с пептидогликаном (PAL). Эти и родственные методы совместно называются "Е. coli дисплей (визуализация)." В другом биологическом методе скрининга растворимых пептидных смесей для экспрессии и секреции используют дрожжи. См. Smith et al. (1993), Mol.Pharmacol. 43: 741-8. Метод Smith et al. и родственные методы называются "скринингом в дрожжах." В другом методе трансляцию случайной РНК останавливают перед высвобождением рибосомы, в результате получают библиотеку полипептидов, вс ещ связанных с их ассоциированной РНК. Этот и родственные методы в целом называют "рибосомный дисплей." В других методах используют связывание пептида с РНК химической связью; см., например, RobertsSzostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94: 12297-303. Этот и родственные методы в целом называют "скрининг РНК-пептидов." Химическим синтезом получают библиотеки, в которых пептиды иммобилизованы на стабильных небиологических материалах, таких как стержни из полиэтилена и проницаемые для растворителя смолы. В другой полученной химическими методами библиотеке используют фотолитографию для сканирования пептидов,иммобилизованных на стеклянных пластинах. Эти и родственные методы в целом называют "химикопептидный скрининг." Химико-пептидный скрининг может быть предпочтительным, так как он позволяет использовать D-аминокислоты и другие неприродные аналоги, а также непептидные элементы. Обзор как биологических, так и химических методов дан в WellsLowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355-62. В случае известных биоактивных пептидов можно провести рациональный дизайн пептидных лигандов с подходящими терапевтическими свойствами. В таком методе постепенно осуществляют изменения в пептидной последовательности и определяют влияние замены на биоактивность или прогнози-2 022424 руемое биофизическое свойство пептида (например, структуру раствора). Эти методы в целом называют"рациональный дизайн". В одном таком методе получают группу пептидов, в которых за один раз единственный остаток заменяют на аланин. Этот метод обычно называют "ход (шаг) аланином" или "сканирование аланином". Когда заменяют два остатка (соседних или стоящих отдельно), это называют "двойным ходом (шагом) аланином". Результирующие аминокислотные замены можно использовать самостоятельно или в комбинации для получения новой пептидной частицы с подходящими терапевтическими свойствами. Структурный анализ взаимодействия белок-белок можно также использовать для того, чтобы предложить пептиды, которые имитируют связывающую активность больших белковых лигандов. В таком анализе кристаллическая структура может навести на мысль об идентичности и относительной ориентации важнейших остатков большого белкового лиганда, из которых можно создать пептид. См., например,Takasaki et al., (1997), Nature Biotech. 15, 1266-70. Эти и родственные методы в целом называют "структурный анализ белков". Эти аналитические методы можно также использовать для исследования взаимодействия между рецепторным белком и пептидами, выбранными с помощью фагового дисплея, который может предполагать последующую модификацию пептидов с целью повышения аффинности связывания. В принципе пептидные миметики любого белка можно идентифицировать, используя фаговый дисплей и другие указанные выше методы. Эти методы можно также использовать для эпитопного картирования, для идентификации важнейших (критических) аминокислот в белок-белковых взаимодействиях и в качестве руководства при поиске новых терапевтических агентов. Например, Cortese et al. (1996), Curr.Opin. Biotech. 7: 616- 21. В настоящее время пептидные библиотеки чаще всего используются в иммунологических исследованиях, таких как эпитопное картирование. Kreeger (1996), The Scientist 10(13): 19-20. Особый интерес представляет применение пептидных библиотек и других методов для поиска фармацевтически активных пептидов. Ряд таких пептидов, идентифицированных в уровне техники, приводится в табл. 2. Пептиды описаны в приведнных публикациях, каждая из которых вводится в данное описание в качестве ссылки. Указывается фармакологическая активность пептидов, и во многих случаях за ней в скобках следует его сокращнный термин. Некоторые из этих пептидов модифицированы (например, с образованием сшитых по С-концу димеров). Обычно пептидные библиотеки подвергают скринингу на связывание с рецептором фармакологически активного белка (например, ЕРО рецептором). По меньшей мере, в одном примере (CTLA4) проводят скрининг пептидной библиотеки на связывание с моноклональным антителом. Таблица 2. Фармакологически активные пептиды'Белок в этой колонке может быть связан с помощью ассоциированного пептида (например, ЕРО рецептора, IL-1 рецептора) или имитирован ассоциированным пептидом. В приводимых ссылках поясняется для каждого, связана ли или имитируется молекула пептидами. Пептиды, идентифицированные скринингом пептидных библиотек, рассматриваются скорее как"ведущие", "главные" ("leads") при разработке терапевтических агентов, а не используются сами в качестве терапевтических агентов. Подобно другим белкам и пептидам они быстро удаляются in vivo либо по механизмам почечной фильтрации, клеточного клиренса в ретикулоэндотелиальной системе, либо протеолитической деградацией. (Francis (1992), Focus on Growth Factors 3: 4-11.). В результате этого в уровне техники в настоящее время используют идентифицированные белки для оценки лекарственных мишеней или в качестве каркаса для создания органических соединений, которые нельзя так легко или так быстро идентифицировать скринингом химической библиотеки. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol.Struct. 26: 401-24; Kay et al. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Обычно очищенные пептиды малоустойчивы в воде и подвергаются химическому и физическому распаду, что приводит к потере биологической активности при обработке и хранении. Кроме того, пептидные соединения в водном растворе подвергаются гидролизу, такому как деамидирование и расщепление пептидной связи. Эти процессы представляют серьзную проблему для терапевтически активных пептидов, которые предполагают вводить людям в определнном диапазоне доз, исходя из биологической активности. Введение очищенных пептидов остатся весьма перспективной стратегией лечения многих заболе-7 022424 ваний, которые поражают человеческую популяцию. Однако способность терапевтического пептидного антитела оставаться в виде устойчивой фармацевтической композиции во времени в различных условиях хранения, а затем быть эффективным в отношении пациентов in vivo не рассматривалась. Поэтому в уровне техники остатся потребность в получении терапевтических пептидных антител в виде устойчивых препаратов, которые пригодны в качестве терапевтических агентов для лечения заболеваний и расстройств. Сущность изобретения Настоящее изобретение включает препараты, пригодные для лиофилизации терапевтических пептидных антител, что дат в результате высокоустойчивый продукт терапевтического пептидного антитела. Устойчивый продукт терапевтического пептидного антитела применим в качестве терапевтического агента для лечения людей, страдающих расстройствами или состояниями, на которые может благотворно подействовать введение терапевтического пептидного антитела. В одном аспекте изобретение включает лиофилизированную композицию терапевтического пептидного антитела, содержащую буфер, наполнитель, стабилизирующий агент и необязательно поверхностно-активное вещество; причм буфер состоит из рН буферизующего агента с концентрацией в примерном диапазоне 5-20 мМ, а значение рН находится в примерном диапазоне 3,0-8,0; примерная концентрация наполнителя равна 0-4,5% вес./об.; примерная концентрация стабилизирующего агента равна 0,120% вес./об.; примерная концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,004-0,4% вес./об.; и терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой I. где где Р 1, Р 2, Р 3 и Р 4, каждый независимо, обозначают последовательности фармакологически активных пептидов;L1, L2, L3, L4 и L5, каждый независимо, обозначают линкеры; а, b, с, е, f, g и h, каждый независимо, обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а и b обозначает 1;WSP обозначает водорастворимый полимер, присоединение которого осуществляется по любому реакционноспособному (реактивному) элементу F1. В другом варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой II где Fc домен присоединн по С-концу X1, а ноль, один или более WSP связано с Fc доменом необязательно через линкер L1. Ещ в одном варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой III где Fc домен присоединн по N-концу X1, а ноль, один или более WSP связано с Fc доменом необязательно через линкер L1. Ещ в одном варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой IV где Fc домен присоединн по N-концу (L1)c-P1, а ноль, один или более WSP связано с Fc доменом необязательно через линкер L1. В другом варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой V-8 022424 где Fc домен присоединн по N-концу -L1-P1-L2-P2, а ноль, один или более WSP связано с Fc доменом необязательно через линкер L1. В другом варианте изобретения терапевтическое пептидное антитело представляет собой мультимер или димер. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р 1, Р 2, Р 3 и/или Р 4 независимо выбирают из пептидов, представленных в любой из табл. 4-38. В родственном варианте изобретения Р 1, Р 2, Р 3 и/или Р 4 имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом варианте изобретения домен Fc представлен в SEQ ID NO: 1. В другом варианте изобретения WSP представляет собой ПЭГ. Ещ в одном варианте изобретения ПЭГ имеет молекулярный вес около 2-100 кДа или около 6-25 кДа. В другом варианте изобретения композиция содержит по меньшей мере на 50, 75, 85, 90 или 95% пегилированное терапевтическое антитело. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рН буферизующий агент выбирают из группы, состоящей из глицина, гистидина, глутамата, сукцината,фосфата, ацетата и аспартата. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой наполнитель выбирают из группы, состоящей из маннита, глицина, сахарозы,декстрана, поливинилпирролидона, карбоксиметилцеллюлозы, лактозы. сорбита, трегалозы или ксилита. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой стабилизирующий агент выбирают из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннозы, мальтозы, лактозы, глюкозы, раффинозы, целлобиозы, гентобиозы, изомальтозы, арабинозы, глюкозамина, фруктозы,маннита, сорбита, глицина, аргинина HCl, многоатомных спиртов, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, N-метилпирролидон, целлюлоза и гиалуроновая кислота, хлорид натрия. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из лаурилсульфата натрия, диоктилсульфосукцината натрия, диоктилсульфоната натрия, хенодезоксихолевой кислоты, натриевой соли Nлаурилсаркозина, додецилсульфата лития, натриевой соли 1-октансульфокислоты, гидрата холата натрия, дезоксихолата натрия, натриевой соли гликодезоксихолевой кислоты, бензалконийхлорида или бензетонийхлорида, моногидрата цетилпиридинийхлорида, гексадецилтриметиламмония бромида,CHAPS, CHAPSO, SB3-10, SB3-12, дигитонина, Тритона Х-100, Тритона Х-114, лауромакрогола 400,полиоксил-40-стеарата, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 10, 40, 50 и 60, моностеарата глицерина, полисорбата 20, 40, 60, 65 и 80, лецитина из сои, DOPC, DMPG, DMPC и DOPG; эфира сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела равна примерно 0,25-250 мг/мл. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рНзабуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ, а величина рН равна 5,0; наполнитель представляет собой маннит в концентрации 4% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес./об.; и поверхностно- активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,004% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р 1 содержит последовательность, представленную в табл. 6. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 0,5 мг/мл. В другом варианте изобретения терапевтическое антитело представляет собой пептидное антитело с любой последовательностью из SEQ ID NO: 993,SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999,SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ IDNO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016 или SEQ ID NO: 1017. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рНзабуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ, а величина рН равна 7,0; наполнитель представляет собой маннит в концентрации 4% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес./об.; и поверхностно- активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,004% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р 1 содержит последовательность, представленную в табл. 32. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 30 мг/мл. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рНзабуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 20 мМ, а величина рН равна 5,0; наполнитель представляет собой маннит в концентрации 3,3% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес./об.; и поверхностно- активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,01% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р 1 содержит последовательность, представленную в табл. 4. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 100 мг/мл. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой рНзабуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ, а величина рН равна 5,0; наполнитель представляет собой маннит в концентрации 2,5% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 3,5% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р 1 содержит последовательность, представленную в табл. 31. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 30 мг/мл. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, которую выбирают из группы, состоящей из: а) 10 мМ гистидина, рН 4,7, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; б) 10 мМ гистидина, рН 5, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; в) 10 мМ глутамата,рН 4,5, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; г) 10 мМ сукцината, рН 4,5, 4% маннита, 2% сахарозы, полисорбат-20 в концентрации 0,004%; д) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 9% сахарозы и полисорбат-20 в концентрации 0,004%; е) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита, 2% сахарозы, 1% гидроксиэтилкрахмала, 0,004% полисорбата-20; ж) 5 мМ глутамата,рН 4,5, 2% маннита, 1% сахарозы, 0,004% полисорбата-20 и з) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита, 2% трегалозы, 0,004% полисорбата-20. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой Р 1 содержит последовательность, представленную в табл. 21-24. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанная композиция, в которой концентрацию терапевтического пептидного антитела выбирают из группы, состоящей из 1,30, 85 и 100 мг/мл. Настоящее изобретение также относится к способам получения лиофилизированных терапевтических пептидных антител по настоящему изобретению. В одном варианте изобретение включает способ получения лиофилизированного терапевтического пептидного антитела, содержащий стадии: а) приготовление раствора буфера, наполнителя, стабилизирующего агента и необязательно поверхностноактивного вещества; причм буфер состоит из рН-забуферивающего агента с концентрацией в примерном интервале 5-20 мМ и величина рН находится в примерном интервале 3,0-8,0; наполнитель присутствует в примерной концентрации 2,5-4% вес./об.; стабилизирующий агент присутствует в примерной концентрации 0,1-5% вес./об.; поверхностно-активное вещество присутствует в примерной концентрации 0,004-0,04% вес./об.; и б) лиофилизация терапевтического антитела; отличающийся тем, что указанное терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой I. где где Р 1, Р 2, Р 3 и Р 4 каждый независимо обозначают последовательности фармакологически активных пептидов;L1, L2, L3, L4 и L5 каждый независимо обозначают линкеры; а, b, с, е, f, g и h каждый независимо обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а и b обозначает 1;d обозначает 0, 1, или число больше 1; иWSP обозначает водорастворимый полимер, связывание которого происходит по любому реакционноспособному фрагменту в F1. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой II где Fc домен присоединн по С-концу X1, и ноль, один или более фрагментов WSP связаны с Fc доменом необязательно через линкер L1. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой III где Fc домен присоединн по N-концу X и ноль, один или более фрагментов WSP связаны с Fc доменом необязательно через линкер L1. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой IV где Fc домен присоединн по N-концу -(L1)c-P1 и ноль, один или более фрагментов WSP связаны сFc доменом необязательно через линкер L1. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело имеет структуру, представленную формулой V где Fc домен присоединн по N-концу -L1-Р 1-L2-P2 и ноль, один или более фрагментов WSP связаны с Fc доменом необязательно через линкер L1. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что терапевтическое пептидное антитело представляет собой мультимер или димер. В другом варианте изобретения Р 1, Р 2, Р 3 и/или Р 4 независимо выбирают из пептидов, представленных в любой из табл. 4-38. В другом варианте изобретения Р 1, Р 2, Р 3 и/или Р 4 имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом варианте изобретения Fc домен представлен в SEQ ID NO: 1. В другом варианте изобретения WSP представляет собой ПЭГ (PEG). В другом варианте изобретения Fc домен представлен в SEQID NO: 1 и WSP представляет собой ПЭГ (PEG). В другом варианте изобретения ПЭГ имеет молекулярную массу в примерном интервале 2-100 кДа. В другом варианте изобретения ПЭГ имеет молекулярную массу в примерном интервале 6-25 кДа. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, в котором композиция содержит по меньшей мере на 50, 75, 85, 90 или 95% пегилированное терапевтическое пептидное антитело. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН-забуферивающий агент выбирают из группы, состоящей из глицина, гистидина, глутамата, сукцината, фосфата, ацетата и аспартата. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что наполнитель выбирают из группы, состоящей из маннита, глицина, сахарозы, декстрана, поливинилпирролидона, карбоксиметилцеллюлозы, лактозы, сорбита, трегалозы или ксилита. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем,что стабилизирующий агент выбирают из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, маннозы, мальтозы, лактозы, глюкозы, раффинозы, целлобиозы, гентиобиозы, изомальтозы, арабинозы, глюкозамина,фруктозы, маннита, сорбита, глицина, аргинина HCl, полигидроксильных соединений, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, целлюлоза и гиалуроновая кислота, -N-метилпирролидон и хлорид натрия. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из лаурилсульфата натрия, диоктилсульфосукцината натрия, диоктилсульфоната натрия, хенодезоксихолевой кислоты, N-лаурилсаркозина натрия, додецилсульфата лития, натриевой соли 1-октансульфоновой кислоты, гидрата холата натрия,дезоксихолата натрия, натриевой соли гликодезоксихолевой кислоты, бензалконийхлорида или бензэтонийхлорида, цетилпиридинийхлорида моногидрата, гексацетилтриметиламмония бромида, CHAPS,CHAPSO, SB3-10, SB3-12, дигитонина, Тритона Х-100, Тритона Х-114, лауромакрогола 400, полиоксил 40- стеарата, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 10, 40, 50 и 60, моностеарата глицерина, полисорбата 20, 40, 60, 65 и 80, лецитина из сои, DOPC, DMPG, DMPC и DOPG; эфира сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что концентрация терапевтического пептидного антитела равна, примерно, 0,25-250 мг/мл. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН-забуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ и величина рН равна 5,0; и тем, что наполнитель представляет собой маннит в концентрации 4% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес/об.; и поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,004% вес/об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что Р содержит последовательность, представленную в табл. 6. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем,что концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 0,5 мг/мл. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН-забуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ и величина рН равна 7,0; и тем, что наполнитель представляет собой маннит в концентрации 4% вес/об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес/об.; и поверхностно-активное вещество представля- 11022424 ет собой полисорбат-20 в концентрации 0,01% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что Р 1 содержит последовательность, представленную в табл. 32. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем,что концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 30 мг/мл. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН-забуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 20 мМ и величина рН равна 5,0; и тем, что наполнитель представляет собой маннит в концентрации 3,3% вес./об.; стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 2% вес./об.; и поверхностно- активное вещество представляет собой полисорбат-20 в концентрации 0,01% вес./об. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что Р 1 содержит последовательность, представленную в Таблице 4. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ,отличающийся тем, что концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 100 мг/мл. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что рН- забуферивающий агент представляет собой гистидин в концентрации 10 мМ и величина рН равна 5.0; и тем, что наполнитель представляет собой маннит в концентрации 2.5% вес./об.; и стабилизирующий агент представляет собой сахарозу в концентрации 3.5% вес/.объ. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что Р 1 содержит последовательность,представленную в табл. 31. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ,отличающийся тем, что концентрация терапевтического пептидного антитела составляет 30 мг/мл. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что композицию выбирают из группы, состоящей из: а) 10 мМ гистидина, рН 4,7, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; б) 10 мМ гистидина, рН 5,4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; в) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита и 2% сахарозы, в присутствии или в отсутствие полисорбата-20 в концентрации 0,004%; г) 10 мМ сукцината, рН 4.5, 4% маннита, 2% сахарозы, полисорбат-20 в концентрации 0,004%; д) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 9% сахарозы и полисорбат-20 в концентрации 0,004%; е) 10 мМ глутамата, рН 4,5, 4% маннита, 2% сахарозы, 1% гидроксиэтилкрахмала, 0,004% полисорбата-20; ж) 5 мМ глутамата, рН 4,5, 2% маннита, 1% сахарозы, 0,004% полисорбата-20 и з) 10 мМ глутамата, рН 4,5,4% маннита, 2% трегалозы, 0,004% полисорбата-20. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что композиция, в которой Р 1 содержит последовательность,представленную в табл. 21-24. Ещ в одном варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, в котором концентрацию терапевтического пептидного антитела выбирают из группы, состоящей из 1, 30, 85 и 100 мг/мл. В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, дополнительно включающий перед стадией лиофилизации стадии: б) доведение рН раствора до значения примерно 4,0-8,0; в) приготовление раствора, содержащего терапевтическое пептидное антитело; г) буферный обмен между раствором стадии (в) и раствором стадии (б); д) добавление соответствующего количества поверхностноактивного вещества и е) лиофилизация смеси со стадии (е). В другом варианте изобретения предусматривается вышеуказанный способ, отличающийся тем, что предлагается способ приготовления восстановленной (реконституированной) композиции терапевтического пептидного антитела, включающий стадии: а) лиофилизация вышеуказанной композиции терапевтического антитела; и б) восстановление (реконституция) лиофилизированной композиции терапевтического пептидного антитела. В другом варианте изобретения предусматривается набор для приготовления водной фармацевтической композиции, включающий первый контейнер, содержащий лиофилизированную композицию терапевтического пептидного антитела, и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый носитель для лиофилизованной композиции. Подробное описание изобретения Определение терминов Термин "содержащий" по отношению к пептидному соединению означает, что соединение может включать дополнительные аминокислоты на любом конце (либо на амино-, либо на карбоксиконце) или на обоих концах (и на амино-, и на карбоксиконце) данной последовательности. Само собой разумеется,что эти дополнительные аминокислоты не должны заметно влиять на активность соединения. Что касается композиции по настоящему изобретению, термин "содержащий" означает, что композиция может включать дополнительные компоненты. Эти дополнительные компоненты не должны заметно влиять на активность композиции. Термин "пептидное антитело" относится к молекуле, содержащей пептид(ы), слитые, либо непосредственно, либо опосредованно с другими молекулами, такими как Fc домен антитела, там где пептидная частица связывается с заданной мишенью. Пептид(ы) может (могут) быть либо слит(ы) с областьюFc, либо встроены в Fc-петлю, модифицированную молекулу Fc. Fc-петли описаны в опубликованной патентной заявке США 2006/0140934, введнной в данное описание в качестве ссылки во всей полноте. Изобретение включает такие молекулы, содержащие Fc домен, модифицированные таким образом,- 12022424 чтобы включать пептид в качестве внутренней последовательности (предпочтительно, на петлевом участке) Fc домена. Внутренние пептидные молекулы Fc могут включать более одной пептидной последовательности в тандемном повторе в конкретной внутренней области, и они могут включать другие пептиды в других внутренних областях. Хотя в качестве примера приводятся предполагаемые петлевые участки,любые другие неконцевые домены Fc также считаются часть данного изобретения. Термин "пептидное антитело" не включает Fc-слитые белки (например, полноразмерные белки, слитые с Fc доменом). Термин "носитель", "среда" относится к молекуле, которая предупреждает разложение (деградацию) и/или повышает период полужизни, снижает токсичность, иммуногенность или повышает биологическую активность терапевтического белка. Примеры носителей включают Fc домен, описанный в патенте США 5428130 на имя Capon et al., выданный 27 июня 1995 г. Термин "нативный Fc" относится к молекуле или последовательности, имеющей последовательность не-антигенсвязывающего фрагмента, полученного из целого антитела, либо в мономерной, либо в мультимерной форме. Обычно нативный Fc содержит СН 2 и СН 3 домен. Исходный иммуноглобулин сточник нативного Fc в одном аспекте человеческого происхождения и может являться любым иммуноглобулином. Нативный Fc является мономерным полипептидом, который может быть связан ковалентной связью (например, дисульфидными связями), нековалентной связью или их комбинацией с образованием димерной или мультимерной форм. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных Fc молекул равно от одного до четырх в зависимости от класса (например,IgG, IgA, IgE) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Примером нативного Fc является связанный дисульфидной связью димер, полученный при расщеплении IgG папаином. Ellison et al.(1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9. Термин "нативный Fc" по данному описанию является общим (родовым) для мономерных, димерных и мультимерных форм. Термин "Fc вариант" относится к молекуле или последовательности, которая получена модификацией нативного Fc, но вс ещ содержит сайт связывания рецептором- "мусорщиком", FcRn. В международных патентных заявках WO 97/34631 (опубликованной 25 сентября 1997 г.) и WO 96/32478 описаны типичные Fc варианты, а также взаимодействие с рецептором-"мусорщиком", обе заявки вводятся в данное описание в качестве ссылки. В одном аспекте термин "Fc вариант" включает молекулу или последовательность, полученную гуманизацией нативного Fc нечеловеческого происхождения. В другом аспекте нативный Fc содержит сайты, которые можно удалить, так как они сообщают структурные признаки или биологическую активность, которые не требуются для слитых молекул по настоящему изобретению. Так термин "Fc вариант" включает молекулу или последовательность, в которой отсутствует один или более сайтов или остатков нативного Fc, которые влияют на или вовлечены в (1) образование дисульфидной связи, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) гетерогенность по N-концу при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с Fc рецептором, отличным от рецептора-"мусорщика", или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Fc варианты подробнее описаны ниже. Термин "Fc домен" охватывает молекулы и последовательности нативного Fc и Fc вариантов по описанию выше. Как и в случае Fc вариантов и нативных Fc термин "Fc домен" включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, либо образующиеся при расщеплении целого антитела, либо полученные другими способами. Например, в одном варианте изобретения Fc область может представлять собой В уровне техники известны другие Fc последовательности и рассматривается их применение по данному изобретению. Например, Fc IgG1 (в GenBank РегистрационныйP01857), Fc IgG2 (в GenBank РегистрационныйP01859), Fc IgG3 (в GenBank РегистрационныйP01860), Fc IgG4 (в GenBank РегистрационныйP01861), Fc IgA1 (в GenBank РегистрационныйP01876), Fc IgA2 (в GenBank РегистрационныйP01877), Fc IgD (в GenBank РегистрационныйP01880), Fc IgM (в GenBank РегистрационныйP01871) и Fc IgE (в GenBank РегистрационныйP01854) представляют собой некоторые дополнительные Fc последовательности, применение которых рассматривается в данном описании. Необязательно к вышеуказанным последовательностям можно добавлять N-концевую аминокислотную последовательность (например, при экспрессии в бактериях). Термин "мультимер" в применении к Fc доменам или молекулам, содержащим Fc домены, относится к молекулам, имеющим две или более полипептидные цепи, связанные ковалентной связью, нековалентной связью или как за счт ковалентных, так и за счт нековалентных взаимодействий. МолекулыIgG обычно образуют димеры; IgM - пентамеры; IgD - димеры; и IgA - мономеры, димеры, триммеры или тетрамеры. Мультимеры могут образоваться при усовершенствовании последовательности и результирующей активности исходного Ig, источника нативного Fc, или при дериватизации (как описано ниже) такого нативного Fc. Термины "дериватизация", "производное", "дериватизированный" означают процессы и получающиеся в результате соединения, в которых, например, но без ограничения, (1) соединение содержит циклический фрагмент; например, сшивание цистеинильных остатков в соединении; (2) соединение сшивается (перекрстно связывается) или содержит сайт перекрстного связывания (сшивания); например, соединение содержит цистеинильный остаток и поэтому образует сшитые (перекрстно-связанные) димеры в культуре или in vivo; (3) одна или более пептид(иль)ных связей заменяются непептид(иль)ной связью;(4) N-конец заменяют на NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, сукцинимидную группу или замещнную или незамещнную группу бензилоксикарбонил-NH-, где R и R1 и заместители в цикле имеют значение по определению ниже в данном описании; (5) С-конец заменяют на -C(O)R2 или-NR3R4, где R2, R3 и R4 имеют значение по определению ниже; и (6) соединения, в которых отдельные аминокислотные фрагменты модифицированы агентом, способным реагировать с выбранными остатками боковых цепей или концевыми остатками. Термин "пептид" по данному описанию относится к молекулам, состоящим из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,100 или более аминокислот, связанных пептидными связями. Обычно пептиды имеют случайную и/или гибкую (лабильную) конформацию, такую как конформации, наблюдаемые в белках/пептидах большего размера, как правило, за счт вторичной и третичной структур. В конкретных вариантах изобретения в данном описании рассматриваются пептиды различного размера, такие как имеющие длину, примерно 390, 3-80, 3-70, 3-60, 3-50, 5-90, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 5-30; 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40,10-30, 10-20 аминокислот, и т.п В других вариантах изобретения пептиды, используемые в данном описании, имеют длину 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислот. Типичные пептиды могут быть получены любыми методами по данному описанию, например с помощью пептидной библиотеки (например, библиотеки фагового дисплея), химическим синтезом, расщеплением белков или методами рекомбинантной ДНК. Пептиды включают D и L форму, либо в очищенном виде, либо в виде смеси двух форм. Кроме того, рассматриваются физиологически приемлемые соли соединений по данному изобретению. Под "физиологически приемлемыми солями" понимают любые соли, как известно или станет известно позже, являющиеся фармацевтически приемлемыми. Некоторые конкретные примеры представляют собой ацетат, трифторацетат; гидрогалогениды, такие как гидрохлорид и гидробромид; сульфат; цитрат; тартрат; гликолят и оксалат. Термин "рандомизированный" по отношению к пептидным последовательностям обозначает полностью случайные последовательности (например, выбранные методами фагового дисплея) и последовательности, в которых один или более остатков природной молекулы заменяется на аминокислотный остаток, не встречающийся в этом положении в природной молекуле. Типичные методы идентификации пептидных последовательностей включают фаговый дисплей, рибосомный дисплей, скрининг в дрожжах, скрининг РНК-пептидов, химический скрининг, рациональный дизайн, структурный анализ белков и т.п. Термин "фармакологически активный" означает, что определяемое таким образом вещество обладает активностью, которая влияет на медицинский показатель (например, но без ограничения, кровяное давление, число гемоцитов, уровень холестерина) или болезненное состояние (например, но без ограничения, рак, аутоиммунные расстройства). Так, фармакологически активные пептиды включают агонистические, или миметические, и антагонистические пептиды по определению ниже. Термины "-миметический пептид" и "-агонистический пептид" относятся к пептиду, обладающему биологической активностью, сравнимой с белком (например, но без ограничения, ЕРО, ТРО, G-CSF и другими белками по данному описанию), который реагирует с представляющим интерес белком. Кроме того, эти термины включают пептиды, которые неявно (косвенно) имитируют активность представляющего интерес белка, например, усиливая действие (потенцируя) природного лиганда представляющего интерес белка; см., например, G-CSF- миметические пептиды, приведнные в табл. 2 и 7. Например, термин "ЕРО-миметический пептид" включает любые пептиды, которые можно идентифицировать или получить как описано в Wrighton et al. (1996), Science 273: 458-63; Naranda et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96: 7569-74, или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится ЕРО-миметический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек. Другой пример, термин "ТРО-миметический пептид" или "ТМР" относится к пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696-9, патенты США 5869451 и 5932946 или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится ТРОмиметический предмет рассмотрения (пептид), а также в международной патентной заявке WO 00/24770,опубликованной 4 мая 2000 г., которая вводится в данное описание в качестве ссылки. Рядовые специа- 14022424 листы в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек. Другой пример, термин "G-CSF-миметический пептид" относится к любым пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Paukovits et al. (1984), Hoppe-Seylers Z. Physiol.Chem. 365: 303-11, или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится G-CSF-миметический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек. Термин "CTLA4-миметический пептид" относится к любым пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Fukumoto et al. (1998), Nature Biotech. 16: 267-70. Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек. Термин "антагонистический пептид" или "ингибиторный пептид" относится к пептиду, который блокирует или каким-то образом вмешивается в биологическую активность соответствующего (ассоциированного) представляющего интерес белка, или проявляет биологическую активность, сравнимую с биологической активностью известного антагониста или ингибитора соответствующего (ассоциированного) белка, представляющего интерес. Так, термин "TNF-антагонистический пептид" включает пептиды, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15: 1266-70, или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится TNF-антагонистический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек. Термины "IL-1 антагонист" и "IL-lra-миметический пептид" относятся к пептидам, которые ингибируют или подавляют активацию IL-1 рецептора с помощью IL-1. Активация IL-1 рецептора является результатом образования комплекса между IL-1, IL-1 рецептором и IL-1 вспомогательным рецепторным белком. IL-1 антагонистические или IL-lra- миметические пептиды связываются с IL-1, IL-1 рецептором или IL-1 вспомогательным рецепторным белком и затрудняют образование комплекса между любыми двумя или тремя компонентами комплекса. Типичные IL-1 IL-1 антагонистические или IL-1raмиметический пептиды можно идентифицировать или получить, как описано в патентах США 5608035; 5786331, 5880096 или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится IL-1 антагонистический или IL-1ra-миметический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек. Термин "VEGF-антагонистический пептид" относится к пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Fairbrother (1998), Biochem. 37: 17754- 64, или в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится VEGF-антагонистический предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек. Термин "ММР ингибиторный пептид" относится к пептидам, которые можно идентифицировать или получить, как описано в Koivunen (1999), Nature Biotech. 17: 768-74 и в любых других ссылках в табл. 2, в которых приводится ММР ингибиторный предмет рассмотрения (пептид). Рядовые специалисты в данной области техники понимают, что каждый из этих ссылочных материалов позволяет выбрать различные пептиды, которые фактически раскрываются в них, следуя раскрываемым методикам с применением различных пептидных библиотек. Термин "миостатин-ингибиторный (ингибирующий) пептид" относится к пептидам, которые можно идентифицировать по их способности снижать или блокировать активность миостатина или передачу сигнала, как показано в in vitro анализах, например, таких как анализ активности миостатина в клеткахpMARE C2C12 или in vivo анализ на животных, описанный в опубликованной патентной заявке США 20040181033 А 1 и в опубликованной патентной заявке WO 2004/058988. Примеры миостатинингибиторных пептидов представлены в табл. 21-24. Термин "антагонист интегрина/адгезии" относится к пептидам, которые ингибируют или подавляют активность интегринов, селектинов, молекул клеточной адгезии, интегриновых рецепторов, селектиновых рецепторов или рецепторов молекул клеточной адгезии. Примеры антагонистов интегрина/адгезии включают ламинин, эхистатин, пептиды, описанные в табл. 25-28. Термин "ингибитор резорбции кости" относится к таким молекулам, как приводятся в примерах 4 и 11 международной патентной заявки WO 97/23614, которая вводится в данное описание ссылкой во всей полноте. Примеры ингибиторов резорбции кости включают OPG и OPG-L антитела, которые описаны соответственно в международных патентных заявках WO 97/23614 и W098/46751, которые вводятся в данное описание ссылкой во всей полноте. Термин "ингибитор фактора роста нервной ткани" или "агонист фактора роста нервной ткани " относится к пептиду, который связывается с фактором роста нервной ткани (NGF) и ингибирует активность и передачу сигнала NGF. Примеры пептидов этого типа представлены в табл. 29. Термин "TALL-1 модулирующий домен" относится к любой аминокислотной последовательности,которая связывается с TALL-1 и содержит природные последовательности или рандомизированные (случайные) последовательности. Типичные TALL-1 модулирующие домены можно идентифицировать или получать методом фагового дисплея или другими методами, указанными в данном описании. Примеры пептидов этого типа представлены в табл. 30 и 31. Термин "TALL-1 антагонист" относится к молекуле, которая связывается с TALL-1 и повышает или снижает один или более аналитических показателей по сравнению с действием на эти показатели полноразмерного нативного TALL-1. Такую активность можно определить, например, такими анализами, которые описаны в подразделе, озаглавленном "Биологическая активность AGP- 3" ("Biological activity ofAGP-3") в разделе Материалы и Методы (MaterialsMethods) патентной заявки, озаглавленной "TNFrelated proteins" ("TNF-родственные белки"), WO 00/47740, опубликованной 17 августа 2000 г. Термин "Ang 2-антагонистический пептид" относится к пептидам, которые можно идентифицировать или получать как проявляющие Ang-2-антагонистические характеристики. Примеры пептидов такого типа представлены в табл. 32-38. Термин "WSP" относится к водорастворимому полимеру, который предупреждает преципитацию пептида, белка или другого соединения с которым он связан, в водной среде, например такой, как физиологическая среда. Более подробное описание различных вариантов WSP, рассматриваемых в данном изобретении, приводится ниже. Лиофилизация и введение Терапевтические пептидные антитела применяются в фармацевтических препаратах для лечения человеческих заболеваний по данному описанию. В одном варианте изобретения композиции терапевтического пептидного антитела являются лиофилизированными. Лиофилизацию проводят общепринятыми в технике методами и их следует оптимизировать для разработанных композиций [Tang et al., Pharm Res. 21: 191-200, (2004) и Chang et al., Pharm Res. 13: 243-9 (1996)]. В одном аспекте цикл лиофилизации включает три стадии: замораживание, первичная сушка и вторичная сушка [А.Р. Mackenzie, Phil Trans R. Soc London, Ser B., Biol 278: 167 (1977)]. На стадии замораживания раствор охлаждают, инициируя льдообразование. Кроме того, на этой стадии индуцируется кристаллизация наполнителя. Лд сублимируется (возгоняется) на стадии первичной сушки, которую проводят путм понижения давления в камере ниже давления паров льда, подключая вакуум и включая нагрев с целью инициировать сублимацию (возгонку). Наконец, абсорбированную или связанную воду удаляют на стадии вторичной сушки при пониженном давлении и повышенной температуре. В результате получают материал, называемый лиофилизированным брикетом (лиофилизированной биомассой). Затем брикет (биомассу) реконституируют (восстанавливают) либо стерильной водой, либо подходящим разбавителем для инъекции. Цикл лиофилизации не только определяет конечное физическое состояние эксципиентов, но также влияет на другие показатели, такие как время реконституции (восстановления), внешний вид, стабильность и конечное содержание влаги. Структура композиции в замороженном состоянии проходит через несколько переходов (преобразований) (например, стеклование, увлажнения и кристаллизации), которые происходят при определнных температурах, и их можно использовать для того, чтобы понять и оптимизировать процесс лиофилизации. Температура стеклования (Тс (Tg) и/или Тс' (Tg' может дать информацию о физическом состоянии раствора, и е можно определить методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Тс и Тс' являются важными характеристиками, которые следует учитывать при планировании цикла лиофилизации. Например, значение Тс' важно для первичной сушки. Кроме того,температура стеклования дат информацию о температуре хранения конечного продукта в высушенном состоянии. Общие сведения об эксципиентах Эксципиенты представляют собой добавки, которые включают в состав препарата, так как они либо обеспечивают, либо улучшают стабильность, доставку и технологичность лекарственного продукта. Вне зависимости от причины их включения в состав препарата эксципиенты являются неотъемлемым компонентом лекарственного продукта и, следовательно, должны быть безопасными и должны хорошо переноситься пациентами. В случае белковых лекарств выбор эксципиентов особенно важен, так как они должны влиять как на эффективность (активность), так и на иммуногенность лекарства. Следовательно,белковые препараты необходимо разрабатывать с использованием соответствующего подбора эксципиентов, которые придают стабильность, безопасность и товарные качества. Лиофилизированный препарат обычно содержит буфер, наполнитель и стабилизатор. Пригодность поверхностно-активного вещества следует оценить и выбрать в тех случаях, в которых агрегация во время стадии лиофилизации или в процессе реконституции является проблемой. Подходящий забуферивающий агент включают с целью поддерживать рН препарата во время лиофилизации в постоянном диа- 16022424 пазоне. Сравнение компонентов эксципиента в жидких и лиофилизированных белковых препаратах датся в табл. А. Таблица А. Компоненты эксципиента в лиофилизированных белковых препаратах Основной проблемой при разработке препаратов терапевтических белков является увеличение стабильности продукта в условиях производства, перевозки и хранения. Роль эксципиентов в препарате это обеспечение устойчивости к этим стрессам. Эксципиенты можно также использовать для уменьшения вязкости препаратов с высокой концентрацией белка, чтобы содействовать их доставке и сделать их более удобными для пациентов. Вообще эксципиенты можно классифицировать в зависимости от механизмов, с помощью которых они повышают устойчивость белков к различным химическим и физическим стрессам. Некоторые эксципиенты используют для того, чтобы ослабить воздействие конкретного стресса или регулировать конкретную чувствительность (восприимчивость) конкретного белка. Другие эксципиенты оказывают более общее действие на физическую устойчивость белков и стабильность ковалентного связывания белков. Эксципиенты по данному описанию объединяют либо в зависимости от их химического типа, либо в зависимости от их функции в препаратах. Краткие описания способов стабилизации приводятся при обсуждении каждого типа эксципиентов. Учитывая рекомендации и указания в данном описании, специалисты в данной области техники поймут, в каком количестве или диапазоне количеств эксципиент можно включать в состав любого конкретного препарата для того, чтобы получить биофармацевтический препарат по изобретению, который промотирует сохранение стабильности биофармацевтического соединения. Например, количество и тип соли, которую включают в состав биофармацевтического препарата по изобретению, можно выбирать с учтом заданной осмолярности (осмотической концентрации) (а именно, изотонической, гипотонической или гипертонической) конечного раствора, а также количества и осмолярности других компонентов, ко- 17022424 торые следует включить в состав препарата. Также, например, что касается типа полиола или сахара,входящего в состав препарата, количество такого эксципиента зависит от его осмолярности. Например, введение примерно 5% сорбита может обеспечить изотоничность, тогда как для достижения изотоничности требуется около 9% сахарозы. Выбор количества или диапазона концентраций одного или более эксципиентов, которые можно включить в состав биофармацевтического препарата по изобретению, показан выше на примерах солей, полиолов (многоатомных спиртов) и сахаров. Однако специалист в данной области техники понимает, что соображения в данном описании и дополнительно поясняемые со ссылкой на конкретные эксципиенты, равно применимы ко всем типам и комбинациям эксципиентов, включая, например, соли, аминокислоты, другие агенты, регулирующие тоничность, поверхностно- активные вещества, стабилизаторы, наполнители, криопротекторы, лиопротекторы, антиоксиданты, ионы металлов, хелатирующие агенты и/или консерванты. Кроме того, если конкретный эксципиент указан в препарате, например, в виде процентного содержания (%) вес./об., специалист в данной области техники понимает, что рассматривается также эквивалентная молярная концентрация. Само собой разумеется, что рядовой специалист в данной области техники понимает, что концентрации вышеуказанных эксципиентов зависят от конкретного препарата. Например, концентрацию наполнителя можно уменьшить в тех случаях, когда концентрация белка/пептида высока или когда высока концентрация стабилизирующего агента. Кроме того, рядовой специалист в данной области техники понимает, что для поддержания изотоничности конкретного препарата, в котором отсутствует наполнитель, концентрацию стабилизирующего агента следует соответствующим образом корректировать (например, следует взять "тонизирующее" количество стабилизатора). В уровне техники известны другие эксципиенты, их можно найти в Powell et al., Compendium of Excipients for Parenteral Formulations (1998),PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52: 238-311. Буферы Обычно наблюдают, что устойчивость белкового лекарства максимальна в узком диапазоне рН. Этот рН диапазон оптимальной устойчивости (стабильности) следует определить заранее в ходе предварительных исследований. Показано, что для этого применимы некоторые подходы, такие как ускоренные исследования стабильности и калориметрический скрининг (Rommele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241-7 (1999. Когда препарат окончательно одобрен, лекарственный продукт нужно получить промышленно и поддерживать в пределах заданных характеристик в течение всего времени хранения. Поэтому для контроля рН препарата почти всегда используют забуферивающие агенты. В белковых препаратах обычно в качестве буферов используют органические кислоты, фосфаты и Трис (таблица В). Буферная мкость буферов максимальна при значении рН, равном pKa, и понижается по мере того, как рН увеличивается или уменьшается по сравнению с этим значением. Девяносто процентов буферной мкости находится в пределах одной рН единицы от величины pKa. Буферная мкость также увеличивается пропорционально увеличению концентрации буфера. При выборе буфера следует принимать во внимание несколько факторов. Первый и основной вид буфера и его концентрацию следует определять с учтом его pKa и рН заданного препарата. Также важно гарантировать, чтобы буфер был совместим с белковым лекарством, другими эксципиентами препарата и не катализировал никаких реакций расщепления. Недавно показано, что буферы, содержащие соли полианионных карбоксилатов, образуют ковалентные аддукты с остатками боковых цепей белков. Третьим важным аспектом, который следует учитывать, является чувствительность к жжению и раздражение,которые может вызвать буфер. Например, известно, что инъекция цитрата вызывает жжение и боль(Laursen Т., et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006. Вероятность жжения и раздражения выше в случае лекарств, которые вводят либо SC (подкожным), либо IM (внутримышечным)способом,когда раствор лекарства остатся в месте введения относительно более продолжительное время, чем приIB (внутривенном) введении, когда препарат после введения быстро разбавляется в крови. В случае препаратов, которые вводятся непосредственно внутривенной (IV) инфузией, следует проводить мониторинг общего количества буфера (и любого другого компонента препарата). Следует быть особенно осторожным в отношении ионов калия, вводимых в виде калийфосфатного буфера, который может оказать влияние на сердечно-сосудистую систему пациента (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006). Следует подробнее рассмотреть буферы для лиофилизированных препаратов. Некоторые буферы,подобно натрийфосфатному буферу, могут кристаллизоваться из белковой аморфной фазы в процессе замораживания, что приводит к значительным смещениям значений рН. Других обычных буферов, таких как ацетатный и имидазольный, следует избегать, так как они могут сублимироваться или испаряться в процессе лиофилизации, тем самым изменяя рН препарата во время лиофилизации или после восстановления (реконституции). Таблица В. Общеупотребительные забуферивающие агенты и величины их pKa Буферную систему для композиций выбирают таким образом, чтобы она была физиологически совместимой и поддерживала заданную величину рН в восстановленном (реконституированном) растворе,а также в растворе перед лиофилизацией. В одном варианте изобретения значение рН раствора перед лиофилизацией находится в диапазоне 2.0 - рН 12.0. Например, в одном варианте изобретения рН раствора перед лиофилизацией составляет 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7,6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5,11.7 или 12.0. В другом варианте изобретения рН восстановленного раствора находится в диапазоне 4.59.0. В одном варианте изобретения величина рН восстановленного раствора равна 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5,5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7 или 9.0. В одном варианте изобретения рН буферизующий агент, используемый в препарате, представляет собой аминокислоту или смесь аминокислот. В одном аспекте рН-забуферивающий агент представляет собой гистидин или смесь аминокислот, одной из которых является гистидин. рН-забуферивающее соединение может присутствовать в любом количестве, пригодном для поддержания рН препарата на заданном уровне. В одном варианте изобретения, в котором рНзабуферивающим агентом является аминокислота, концентрация аминокислоты находится в интервале 0,1-1000 мМ (1 М). В одном варианте изобретения концентрация рН забуферивающего агента составляет по меньшей мере 0.1, 0.5, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700 или 900 мМ. В другом варианте изобретения концентрация рН забуферивающего агента находится в интервале между 1, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 и 100 мМ. Ещ в одном варианте изобретения концентрация рН забуферивающего агента находится в интервале между 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 или 40 и 50 мМ. Ещ в одном варианте изобретения концентрация рНзабуферивающего агента составляет 10 мМ. Другие примеры рН-забуферивающих агентов, применимых для забуферивания препарата по данному описанию, включают, но без ограничения, глициновый, гистидиновый, глутаматный, сукцинатный,фосфатный, ацетатный и аспартатный буферы. Стабилизаторы и наполнители Наполнитель в лиофилизированных препаратах обычно используют для улучшения внешнего вида и предотвращения выброса. Обычно задают такие условия получения препарата, что наполнитель кристаллизуется из замороженной аморфной фазы (либо во время замораживания, либо при отжиге выше Тс'), придавая биомассе (брикету) структуру и объм. Примерами применяемых обычно наполнителей являются маннит и глицин. Стабилизаторы включают класс соединений, которые служат в качестве криопротекторов, лиопротекторов и стеклообразующих агентов. Криопротекторы стабилизируют белки в процессе замораживания или в замороженном состоянии при низких температурах (P. Cameron, ed., Good PharmaceuticalFreeze-Drying Practice, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, (1997. Лиопротекторы стабилизируют белки в тврдой лиофилизированной лекарственной форме, в процессе дегидратации во время лиофилизации сохраняя конформацию белка, аналогичную естественной. Свойства стеклообразного состояния классифицируют как "прочное" или "хрупкое" в зависимости от их пластических свойств как функции температуры. Важно, что криопротекторы, лиопротекторы и стеклообразующие агенты остаются в той же фазе, что и белок, для придания стабильности. Сахара, полимеры и полиолы (многоатомные спирты) попадают в ту же категорию и могут иногда играть все три роли. Полиолы охватывают класс эксципиентов, который включает сахара (например, маннит, сахарозу,сорбит) и другие многоатомные спирты (например, глицерин и пропиленгликоль). Полимерный полиэтиленгликоль (ПЭГ) также входит в эту группу. Полиолы обычно применяются в качестве стабилизирующих эксципиентов и/или изотонизирующих агентов как в жидких, так и в лиофилизированных белковых препаратах для парентерального введения. Что касается ряда Гофмейстера, полиолы являются космотропными и предпочтительно исключаются из белковой поверхности. Полиолы могут защитить белки как от физической деструкции, так и от химического расщепления. Предпочтительно исключнные растворители повышают эффективное поверхностное натяжение растворителя на границе с белком,при этом наиболее энергетически выгодными конформациями белка являются конформации с наименьшей площадью поверхности. Маннит широко распространн в качестве наполнителя в лиофилизированных препаратах, так как он кристаллизуется из аморфной белковой фазы в процессе лиофилизации, сообщая стабильность биомассе (брикету) (например, Лейкин, Энбрел-лио, Бетасерон). Обычно его применяют в комбинации с крио- и/или лиопротектором, таким как сахароза. Вследствие склонности маннита к кристаллизации в замороженном состоянии сорбит и сахароза являются предпочтительными регулирующими тоничность агентами/стабилизаторами в жидких препаратах для защиты продукта от стрессов замораживанияоттаивания при транспортировке или при замораживании массы перед приготовлением. Сорбит и сахароза значительно труднее кристаллизуются и, следовательно, менее вероятно их фазовое разделение с белком. Интересно отметить, что хотя маннит используется в сообщающих тоничность количествах в некоторых продажных жидких препаратах, таких как Актиммун, Фортео и Ребиф, на товарных этикетках этих лекарств имеется предостережение "Не замораживать". Следует избегать применения восстанавливающих сахаров (содержащих свободную альдегидную или кетогруппу), таких как глюкоза и лактоза, так как они могут реагировать и гликозилировать остатки лизина и аргинина на поверхности белка по реакции альдегидов с первичными аминами (реакция Мейяра) (Chevalier F. et al., Nahrung, 46(2): 58-63 (2002); Humeny A., et al., J Agric Food Chem. 50(7): 2153-60 (2002. В кислой среде сахароза может гидролизоваться, давая фруктозу и глюкозу (Kautz С. F. and Robinson A. L., JACS, 50(4) 1022-30 (1928,что затем может вызывать гликозилирование. Полимерный полиэтиленгликоль (ПЭГ) может стабилизировать белки по двум механизмам в зависимости от температуры. При более низких температурах он предпочтительно, вытесняется с поверхности белка, но, как показано, взаимодействует с нескрученной формой белка при более высокой температуре, что следует из его амфипатической природы (Lee L.L., and Lee J.C., Biochemistry, 26(24): 7813-9(1987. Таким образом, при более низких температурах он может защищать белки по механизму предпочтительного исключения (вытеснения), но при более высоких температурах, вероятно, за счт снижения числа результативных столкновений между нескрученными молекулами. ПЭГ является также криопротектором и используется в Рекомбинате, лиофилизированном препарате рекомбинантного антигемофильного фактора, в котором применяют ПЭГ(PEG) 3350 в концентрации 1,5 мг/мл. Низкомолекулярные жидкие ПЭГ (ПЭГ(PEG) 300-600) могут содержать примеси пероксидов и вызывать окисление белков. В случае их применения содержание пероксидов в сыром материале следует свести к минимуму и контролировать в период хранения. То же самое верно для полисорбатов. В отдельном варианте композиций по настоящему изобретению к лиофилизированному препарату добавляют стабилизатор (или комбинацию стабилизаторов) для предупреждения или уменьшения агрегации и химического расщепления в процессе лиофилизации или хранения. Мутный или непрозрачный раствор после реконституции является показателем выпадения белка. Термин "стабилизатор" означает эксципиент, способный предупреждать агрегацию или другого рода физическое разрушение, а также химические реакции (например, саморазложение, деамидирование, окисление и т.д.) в водной среде и в тврдом состоянии. Стабилизаторы, применяемые обычно в фармацевтических композициях, включают,но без ограничения, сахарозу, трегалозу, маннозу, мальтозу, лактозу, глюкозу, раффинозу, целлобиозу,гентобиозу изомальтозу, арабинозу, глюкозамин, фруктозу, маннит, сорбит, глицин, аргинин HCl, многоатомные спирты, включая полисахариды, такие как декстран, крахмал, гидроксиэтилкрахмал, циклодекстрины, целлюлоза и гиалуроновая кислота, N-метилпирролидон, хлорид натрия, [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74: 225, (1991)]. В одном варианте изобретения стабилизатор вводят в концентрации около 0-40% вес./об. В другом варианте изобретения стабилизатор вводят в концентрации по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 или 40% вес./об. В другом варианте изобретения стабилизатор вводят в концентрации примерно от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 до 10% вес./об. Ещ в одном варианте изобретения стабилизатор вводят в примерной концентрации 2-4% вес./об. Ещ в одном варианте изобретения стабилизатор вводят в примерной концентрации 2% вес./об. При желании лиофилизированные композиции также включают соответствующие количества агентов,регулирующих объм и осмолярность, пригодных для получения лиофилизированного "брикета" ("биомассы"). Наполнители могут быть либо кристаллическими (например, маннит, глицин), либо аморфными (например, сахароза, полимеры, такие как декстран, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза). Другие примеры наполнителей включают лактозу, сорбит, трегалозу или ксилит. В одном варианте изобретения наполнителем является маннит. В другом варианте изобретения наполнитель вводят в примерной концентрации 0-10% вес./об. В другом варианте изобретения наполнитель вводят в концентрации по меньшей мере 0.2, 0.5,0.7, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0 или 9.5% вес./об. Ещ в одном варианте изобретения наполнитель вводят в примерной концентрации 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 до 5.0% вес./об, получают механически и химически устойчивый и красивый брикет (биомассу). В другом варианте изобретения концентрация маннита составляет 4% вес./об. Поверхностно-активные вещества Белковые молекулы проявляют большую склонность к взаимодействию с поверхностями, что делает их чувствительными к адсорбции и денатурации на границах раздела воздух-жидкость, сосуджидкость и жидкость-жидкость (силиконовое масло). Согласно наблюдениям этот путь распада находится в обратной зависимости от концентрации белка и приводит либо к образованию растворимых и нерастворимых белковых агрегатов, либо к потере белка из раствора за счт адсорбции на поверхностях. Помимо адсорбции на поверхности контейнера (мкости) поверхностное разрушение интенсифицируется при физическом взбалтывании, что наблюдается при транспортировке и обработке продукта. Обычно поверхностно-активные вещества применяются в белковых препаратах для предупреждения разложения, индуцируемого на поверхности. Поверхностно-активные вещества являются амфипатическими молекулами, способными вытеснять белки с границы раздела. Гидрофобные участки молекул поверхностно-активных веществ занимают положение на границе раздела фаз (например, воздух/жидкость), тогда как гидрофильные участки молекул остаются ориентированными к массе растворителя. В достаточных концентрациях (обычно около критической мицеллярной концентрации (мицелл) детергента) поверхностный слой молекул поверхностно-активного вещества предотвращает адсорбцию белковых молекул на поверхности. Тем самым снижается до минимума деградация на поверхности. Наиболее часто применяемыми поверхностно- активными веществами являются сложные эфиры жирных кислот полиэтоксилаты сорбитана, а именно, полисорбат 20 и полисорбат 80 (например, авонекс, нейпоген, нейласта). Они различаются только длиной алифатической цепи, которая придат гидрофобный характер молекулам, С-12 и С-18 соответственно. Поэтому полисорбат-80 является более поверхностно-активным и имеет более низкую критическую мицеллярную концентрацию, чем полисорбат-20. Поверхностно-активный полоксамер 188 также применяется в некоторых продажных жидких продуктах,таких как гонал-F, нордитропин и овидрел. Детергенты могут также влиять на термодинамическую конформационную стабильность белков. В данном случае опять же влияние данного эксципиента является специфическим в отношении белка. Показано, например, что полисорбаты понижают устойчивость некоторых белков и повышают устойчивость других. Дестабилизацию белков детергентами можно обосновать, если принять во внимание гидрофобные хвосты молекул детергента, которые могут участвовать в специфическом связывании с частично или полностью раскрученными белками. Взаимодействия такого типа могут вызывать сдвиг конформационного равновесия в белках в сторону более протяжнного состояния (а именно, в сторону увеличения экспозиции гидрофобных участков белковой молекулы в дополнение к связыванию полисорбата). Или же, если белок в нативном состоянии экспонирует некоторые гидрофобные поверхности, связывание детергента с белком в нативном состоянии может стабилизировать эту конформацию. Другой особенностью полисорбатов является то, что они по своей природе чувствительны к окислительному расщеплению. Часто в сыром виде они содержат достаточные количества пероксидов для того, чтобы вызвать окисление боковых цепей белка, в особенности метионина. Возможность разрушения под действием кислорода после добавления стабилизатора подсказывает, что в препаратах следует применять самые низкие эффективные концентрации эксципиентов. Для поверхностно-активных веществ эффективная концентрация для данного белка зависит от механизма стабилизации. Утверждается,что если механизм стабилизации поверхностно- активным веществом связан с предупреждением поверхностной денатурации, эффективная концентрация равна, примерно, критической мицеллярной концентрации детергента. Напротив, если механизм стабилизации связан со специфическими взаимодействиями белок- детергент, эффективная концентрация поверхностно- активного вещества зависит от концентрации белка и стехиометрии взаимодействия (Randolph T.W. et al., Pharm Biotechnol., 13: 159- 75 (2002. Поверхностно-активные вещества можно также добавлять в соответствующих количествах для предупреждения связанного с поверхностью явления агрегации во время замораживания и сушки [Chang,В, J. Pharm. Sci. 85: 1325, (1996)]. Примеры поверхностно-активных веществ включают анионные, катионные, неионные, цвиттерионные и амфотерные поверхностно-активные вещества, в том числе поверхностно-активные вещества, образованные из природных аминокислот. Анионные поверхностноактивные вещества включают, но без ограничения, лаурилсульфат натрия, диоктилсульфосукцинат натрия и диоктилсульфонат натрия, хенодезоксихолевую кислоту, натриевую соль N-лаурилсаркозина, додецилсульфат лития, натриевую соль 1-октансульфокислоты, гидрат холата натрия, дезоксихолат натрия и натриевую соль гликодезоксихолевой кислоты. Катионные поверхностно- активные вещества включают, но без ограничения, бензалконийхлорид или бензетонийхлорид, моногидрат цетилпиридинийхлорида и гексадецилтриметиламмония бромид. Цвиттерионные поверхностно-активные вещества включают,но без ограничения, CHAPS, CHAPSO, SB3-10 и SB3-12. Неионные поверхностно-активные вещества включают, но без ограничения, дигитонин, Тритон Х-100, Тритон Х-114, TWEEN-20 и TWEEN-80. В другом варианте изобретения поверхностно-активные вещества включают лауромакрогол 400, полиоксил-40-стеарат, полиоксиэтилен гидрогенизированное касторовое масло 10, 40, 50 и 60, моностеарат глицерина, полисорбат 20, 40, 60, 65 и 80, лецитин из сои и другие фосфолипиды, такие как DOPC, DMPG,DMPC и DOPG; эфир сахарозы и жирных кислот, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу. Компо- 21022424 зиции, содержащие такие поверхностно-активныевещества, либо самостоятельно, либо в виде смеси при различных соотношениях, приводятся далее. В одном варианте изобретения поверхностно-активное вещество вводится с концентрацией около 0-5% вес./об. В другом варианте изобретения поверхностноактивное вещество вводится с концентрацией по меньшей мере 0.001, 0.002, 0.005, 0.007, 0.01, 0.05, 0.1,0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 или 4.5% вес./об. В другом варианте изобретения поверхностно-активное вещество вводится с концентрацией около 0,001-0,5% вес./об. Ещ в одном варианте изобретения поверхностно-активное вещество вводится с примерной концентрацией от 0.004,0.005, 0.007, 0.01, 0.05 или 0.1% вес./об, примерно до 0.2% вес./об. Ещ в одном варианте изобретения поверхностно-активное вещество вводится с примерной концентрацией 0,01-0,1% вес./об. Соли Часто соли добавляют для увеличения ионной силы препарата, которая может иметь значение для растворимости, физической стабильности и изотоничности белков. Соли могут воздействовать на физическую стабильность белков различными способами. Ионы могут стабилизировать нативное состояние белков, связываясь с заряженными остатками на поверхности белков. Или же они могут стабилизировать белки в денатурированном состоянии, связываясь с пептидными группами, расположенными вдоль белкового каркаса (-CONH-). Также соли могут стабилизировать нативную конформацию белка, экранируя электростатическое отталкивание остатков в белковой молекуле. Электролиты в белковых препаратах также могут экранировать электростатическое притяжение между белковыми молекулами, что в конечном счте приводит к агрегации и ухудшению растворимости белков. Влияние соли на стабильность и растворимость белков заметно меняется в зависимости от характеристик ионных соединений. Ряд Гофмейстера (Хофмейстера), предложенный в 1880-х гг., - это способ упорядочить электролиты в зависимости от их способности осаждать белки (Сасасе M.G. et al., QuarterlyReviews of Biophysics., 30(3): 241-277 (1997. В данной работе ряд Гофмейстера использован для того,чтобы проиллюстрировать степень влияния ионных и неионных сорастворителей на стабилизацию белков. В табл. С сорастворители расположены в порядке их общего воздействия на белки в растворнном состоянии, от стабилизирующих (космотропные) до дестабилизирующих (хаотропные). В целом различие эффектов между анионами значительно больше, чем между катионами, и для обоих типов эффекты являются наиболее явными при более высоких концентрациях, чем допустимо для парентеральных препаратов. Высокие концентрации космотропов (например, концентрация сульфата аммония 1 молярной) обычно используют для осаждения белков из раствора в процессе, называемом "высаливание", где космотроп предпочтительно исключается с поверхности белка, снижая растворимость белка в его нативной(скрученной) конформации. Удаление или разбавление соли способствует обратному растворению белка. Термин "всаливание" относится к использованию дестабилизирующих ионов (например, таких как гуанидин и хлорид), которые повышают растворимость белков, сольватируя пептидные связи белкового каркаса. Повышение концентрации хаотропа сдвигает равновесие в сторону конформации белка в денатурированном (раскрученном) состоянии по мере повышения растворимости пептидной цепи. Относительная эффективность ионов в процессах "всаливания" и "высаливания" определяет их положение в ряду Гофмейстера. Для поддержания изотоничности в парентеральном препарате концентрацию солей обычно ограничивают до концентрации ниже 150 мМ для комбинаций одновалентных ионов. В этом диапазоне концентраций механизм стабилизации солями определяется силами электростатического отталкивания или притяжения при взаимодействии (теория Дебая-Хюккеля). Следует отметить, как было показано, по этому механизму хаотропные соли более эффективно стабилизируют структуру белков, чем космотропы с аналогичной концентрацией. Полагают, что хаотропные анионы прочнее связываются, чем космотропные ионы. Что касается расщепления ковалентных связей в белках, предполагается, что различное влияние ионной силы на этот механизм объясняется теорией Дебая-Хюккеля. Соответственно наряду с опубликованными сообщениями о стабилизации белков хлоридом натрия имеются такие, в которых хлорид натрия ускоряет расщепление ковалентных связей. Механизмы влияния солей на стабильность белка являются специфическими в отношении белка и могут заметно меняться в зависимости от рН раствора. Примером того, как эксципиент может применяться для того, чтобы содействовать доставке белкового лекарства, являются некоторые высококонцентрированные препараты антител. Недавно было показано, что соли эффективно снижают вязкость таких препаратов (Liu J., et al., J. Pharm Sci., 94(9): 1928-40 (2005); Ошибка в: J Pharm Sci., 95(1): 234-5. (2006. Таблица С. Ряд Гофмейстера для солей Аминокислоты Аминокислоты нашли разнообразное применение в белковых препаратах в качестве буферов, наполнителей, стабилизаторов и антиоксидантов. Гистидин и глутаминовую кислоту применяют для забуферивания белковых препаратов в интервале рН 5.5-6.5 и 4.0-5.5 соответственно. Имидазольная группа гистидина имеет значение pKa = 6.0, а pKa карбоксильной группы боковой цепи глутаминовой кислоты составляет 4.3, что позволяет применять их для забуферивания в соответствующих диапазонах рН. Ацетат, наиболее общеупотребительный буфер в диапазоне кислых рН 4.0-5.5, сублимирует в процессе лиофилизации и, следовательно, не может использоваться в лиофилизированных препаратах. Глутаминовая кислота особенно полезна в таких случаях (например, Stemgen (стемген. В продаваемых белковых препаратах широко применяют гистидин (например, ксолер, герцептин, рекомбинат). Он является хорошей альтернативой цитрату, буферу, который, как известно, причиняет боль и вызывает жжение при инъекции. Интересно отметить, сообщалось, что высокие концентрации гистидина оказывают стабилизирующее действие на ABX-IL8 (антитело к IgG2) в том, что касается агрегации как в жидком, так и в лиофилизированном виде (Chen В. et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003. Наблюдали также, что гистидин (в концентрации до 60 мМ) снижает вязкость высококонцентрированного препарата этого антитела. Однако в том же исследовании авторы наблюдали в препаратах, содержащих гистидин, повышенную агрегацию и обесцвечивание во время изучения лиофилизации антитела в мкостях (контейнерах) из нержавеющей стали. Авторы отнесли этот результат за счт действия ионов железа, выделяющихся при коррозии стальных контейнеров. Другое замечание об осторожности при работе с гистидином заключается в том, что он подвергается фотоокислению в присутствии ионов металла (Tomita M. et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969. Применение метионина в препаратах в качестве антиоксиданта кажется многообещающим; наблюдали, что он эффективен против ряда окислительных стрессов (Lam ХМ. et al., J.Pharm. Sci., 86(11): 1250-5 (1997. Показано, что аминокислоты глицин, пролин, серин и аланин стабилизируют белки по механизму предпочтительного исключения. Глицин является также наполнителем, широко применяемым в лиофилизированных препаратах (например, немига, генотропин, гуматроп). Он кристаллизуется из замороженной аморфной фазы, придавая структуру и объм брикету (биомассе). Показано, что аргинин является агентом, который эффективно ингибирует агрегацию и используется как в жидких, так и в лиофилизированных препаратах (например, активаза, авонекс, энбрел жидкость). Кроме того, повышенную эффективность рефолдинга (повторного скручивания) некоторых белков в присутствии аргинина относят за счт подавления конкурентной реакции агрегации в процессе рефолдинга). Антиоксиданты Окисление белковых остатков происходит по ряду различных причин. Помимо добавления специфических антиоксидантов, предупреждение окислительного расщепления белков включает тщательный контроль за рядом факторов в процессе производства и при хранении продукта, таких как атмосферный кислород, температура, действие света и химические примеси. Наиболее широко применяемыми фармацевтическими антиоксидантами являются восстановители, "утилизаторы" кислорода/свободных радикалов или хелатирующие агенты. Антиоксиданты в препаратах терапевтических белков должны быть водорастворимыми и оставаться активными в течение всего времени хранения продукта. Восстановители и"утилизаторы" кислорода/свободных радикалов удаляют из раствора активные кислородные частицы. Хелатирующие агенты, такие как EDTA, эффективно связываются со следовыми примесями металлов,которые вызывают образование свободных радикалов. Например, EDTA используют в жидком препарате кислого фактора роста фибробластов для ингибирования катализируемого ионами металлов окисления цистеиновых остатков. EDTA используется в выпускаемых продуктах, таких как Кинерет и Онтак. Помимо оценки эффективности различных эксципиентов по предупреждению окисления белков учные, разрабатывающие препараты, должны знать, могут ли сами антиоксиданты вызывать другие изменения ковалентных связей и физические изменения в белках. Некоторые такие примеры приводятся в литературе. Восстановители (такие как глутатион) могут вызывать разрыв внутримолекулярных дисульфидных связей, что может привести к "перетасовке" (шаффлингу) дисульфидов. Показано, что в присутствии ионов переходных металлов EDTA вызывает окисление метионина в ряде белков и пептидовand Francis, UK (1999; Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res.,21(12): 2377-83 (2004. Сообщалось, что тиосульфат натрия снижает уровни окисления метионина под действием света и температуры в rhuMab HER2; однако, в этом же исследовании сообщается также об образовании аддукта тиосульфат-белок (Lam ХМ, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997. Выбор подходящего антиоксиданта делают в соответствии с конкретными воздействиями и конкретной чувствительностью белка. Ионы металлов Вообще говоря, ионы переходных металлов нежелательны в белковых препаратах, так как они могут катализировать физический и химический распад белков. Однако конкретные ионы металлов вводят в состав препаратов, если они являются кофаторами белков, и в состав суспензионных препаратов, если они образуют координационные комплексы (например, суспензия цинка с инсулином). Недавно было высказано предположение, что ионы магния (10-120 мМ) ингибируют изомеризацию аспарагиновой кислоты в изоаспарагиновую кислоту (международная патентная заявка WO 2004/039337). Человеческая дезоксирибонуклеаза (rhДHK-аза, пульмозим) и Фактор VIII представляют собой два примера, когда ионы металлов сообщают стабильность или повышенную активность в белках. В случае rhДHK-азы ионы Са+2 (до 100 мМ) повышают стабильность фермента через сайт специфического связывания (Chen В., et al., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999. Действительно, выведение ионов кальция из раствора с EGTA вызывало увеличение деамидирования и агрегации. Однако, такой эффект наблюдается только в случае ионов Са+2; наблюдали, что другие двухвалентные катионы -Mg+2, Mn+2 и Zn+2 дестабилизировали rhДHK-азу. Подобные эффекты наблюдаются в Факторе VIII. Ионы Са+2 и Sr+2 стабилизируют белок, тогда как другие ионы, такие как Mg+2, Mn+2 и Zn+2, Cu+2 и Fe+2 дестабилизируют фермент(Fatouros A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). В отдельном исследовании Фактора VIII в присутствии ионов Al+3 наблюдали значительное повышение скорости агрегации (Derrick TS, et al., J. Pharm. Sci.,93(10): 2549-57 (2004. Авторы отмечают, что в других эксципиентах, таких как буферные соли, часто бывают примеси ионов Al+3 и иллюстрируют необходимость применения в приготовляемых продуктах эксципиентов подходящей степени чистоты. Консерванты Консерванты необходимы при создании парентеральных препаратов для многократного применения, которые включают извлечение лекарства из одного и того же контейнера. Их основная функция заключается в том, чтобы ингибировать рост микробов и гарантировать стерильность продукта в течение всего периода хранения или применения лекарственного продукта. Применяемы обычно консерванты включают бензиловый спирт, фенол и м-крезол. Хотя консерванты применяются давно, разработка белковых препаратов, которые включают консерванты, может стать сложной задачей. Консерванты почти всегда оказывают дестабилизирующее действие на белки (агрегация), и это стало основной причиной ограничения их применения в белковых препаратах многократного применения(Roy S. et al., J Pharm Sci., 94(2): 382-96 (2005. В настоящее время содержащие белки лекарства готовят только для однократного прима. Однако когда возможны препараты многократного применения, их дополнительное преимущество заключается в том, что они более удобны для пациента и имеют лучшие товарные качества. Хорошим примером является случай с препаратом человеческого гормона роста (hGH), когда разработка "консервированных" препаратов привела к промышленному выпуску более удобных шприц-ручек многократного действия. По меньшей мере четыре таких устройства в виде ручек, содержащих препараты hGH с консервантом,выпускаются в настоящее время. Нордитропин (жидкость, Novo Nordisk), Нутропин AQ (жидкость,Genentech) и Генотропин (лиофилизированный - двухкамерный картридж, PharmaciaUpjohn) содержат фенол, тогда как препарат Somatrope (соматроп) (Eli Lilly) готовят с м-крезолом. При разработке лекарственных форм с консервантами следует принимать во внимание некоторые аспекты. Эффективную концентрацию консерванта в лекарственном продукте необходимо оптимизировать. Для этого требуется тестирование данного консерванта в лекарственной форме в интервале концентраций, которая сообщает противомикробную активность, не нарушая стабильности белка. Например,три консерванты были успешно проверены при создании жидкого препарата рецептора интерлейкина-1(Типа I) методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Консерванты классифицируют на основании их влияния на стабильность в концентрациях, обычно применяемых в продажных продук- 24022424 тах (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998. Как можно ожидать, разработка жидких препаратов, содержащих консерванты, является более сложной задачей, чем разработка лиофилизированных препаратов. Лиофилизированные продукты можно получать без консервантов и восстанавливать перед применением с помощью разбавителя, содержащего консервант. Это сокращает время, которое консервант находится в контакте с белком, что значительно снижает обусловленный этим контактом риск дестабилизации белка. В жидких препаратах эффективность консервантов и стабильность следует поддерживать в течение всего времени хранения продукта(18-24 месяца). Следует отметить, что эффективность консерванта должна проявляться в конечном препарате, содержащем активное лекарство и все компоненты эксципиента. Некоторые консерванты могут вызывать при инъекции побочные реакции, это является вторым фактором, который следует учитывать при выборе консерванта. В клинических испытаниях по оценке консервантов и буферов в Нордитропине, наблюдали, что восприятие боли было слабее в случае препаратов, содержащих фенол и бензиловый спирт, нежели при введении препаратов, содержащих м-крезол(Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3: 98-103 (2004. Интересно, что обычно применяемый консервант бензиловый спирт обладает анестезирующими свойствами (Minogue S.C. and Sun D.A.,AnesthAnalg., 100(3): 683-6 (2005. Принимая во внимание раскрытие и указания в данном описании, специалисты в данной области техники будут знать, в каком количестве или в каком интервале количеств можно вводить эксципиент в какой-либо конкретный препарат для того, чтобы получить биофармацевтическую рецептуру (препарат) по изобретению, инициирующую сохранение стабильности биофармацевтической составляющей. Например, количество и тип соли, которую следует включить в биофармацевтический препарат по изобретению, можно выбирать в зависимости от нужной осмолярности (а именно, изотонической, гипотонической или гипертонической) конечного раствора, а также от количеств и осмолярности других компонентов, вводимых в препарат. Аналогично, что касается типа полиола или сахара, входящего в состав препарата, количество такого эксципиента зависит от осмолярности. Например, при включении примерно 5% сорбита можно достичь изотоничности, тогда как для достижения изотоничности требуется около 9% эксципиента сахарозы. Примеры выбранного количества или интервала концентраций одного или более эксципиентов, которые можно ввести в состав биофармацевтического препарата по изобретению, а именно солей, полиолов и сахаров, приводятся выше. Однако специалисты в данной области техники понимают, что соображения (принципы) в данном описании и показанные на примерах конкретных эксципиентов, равно применимы ко всем типам и комбинациям эксципиентов, включая, например, соли, аминокислоты, другие агенты, регулирующие тоничность, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, наполнители, криопротекторы, лиопротекторы, антиоксиданты, ионы металлов, хелатирующие агенты и/или консерванты. Далее, если в препарате приводится содержание конкретного эксципиента, например, в процентах(%) вес./об., специалисты в данной области техники понимают, что также предполагается (рассматривается) эквивалентная молярная концентрация этого эксципиента. Разумеется, специалист в данной области техники понимает, что концентрация вышеуказанных эксципиентов зависит от конкретной рецептуры. Например, концентрацию наполнителя можно уменьшить в тех случаях, когда высока концентрация белка/пептида, или например, когда высока концентрация стабилизирующего агента. Кроме того, специалист в данной области техники понимает, что для сохранения изотоничности конкретного препарата, не содержащего наполнитель, концентрацию стабилизирующего агента следует соответствующим образом корректировать (например, используя "тонизирующее" количество стабилизатора). Композиции являются стабильными по меньшей мере в течение двух лет при температуре 2-8 С в лиофилизированном состоянии. Стабильность в течение такого длительного времени делает возможным продолжительное хранение фармацевтического продукта. Способы приготовления препаратов Помимо этого в настоящем изобретении рассматриваются способы приготовления препаратов терапевтических белков. В одном аспекте рассматриваются способы приготовления лиофилизированного препарата терапевтического пептидного антитела, включающие стадию лиофилизации композиции терапевтического пептидного антитела в буфере, содержащем забуферивающий агент, стабилизирующий агент и поверхностно-активное вещество. Способы по настоящему изобретению включают одну или более следующих стадий: добавление стабилизирующего агента к указанной смеси до лиофилизации, добавление по меньшей мере одного агента, выбранного из наполнителя, агента, регулирующего осмолярность, и поверхностно-активного вещества к указанной смеси перед лиофилизацией. Наполнителем может быть любой наполнитель по данному описанию. В одном аспекте наполнителем является маннит. В другом варианте изобретения стабилизирующим агентом является сахароза. Поверхностно-активное вещество может представлять собой любое поверхностно-активное вещество по данному описанию. В одном варианте изобретения поверхностно-активным веществом является полисорбат-20. Обычно на практике восстановление (реконституция) лиофилизированного материала представляет собой добавление некоторого объма чистой воды или стерильной воды для инъекций (WFI) (обычно эквивалентное объму воды, удалнному в процессе лиофилизации), хотя иногда при получении фармацевтических препаратов для парентерального введения используют разбавленные растворы антибактериальных агентов [Chen, Drag Development and Industrial Pharmacy, 18: 1311-1354 (1992)]. Соответственно предусматриваются способы приготовления восстановленных (реконституированных) терапевтических пептидных антител, включающие стадии добавления разбавителя к лиофилизированной композиции терапевтического антитела по изобретению. Лиофилизированную композицию терапевтического пептидного антитела можно восстанавливать в виде водного раствора. Различные водные носители, например стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многократного прима или вода с соответствующим количеством поверхностноактивных веществ (например, полисорбата-20), 0,4% физиологический раствор, 0,3% раствор глицина или водные суспензии могут содержать активное соединение в смеси с эксципиентами, пригодными для приготовления суспензий. В различных аспектах такие эксципиенты представляют собой суспендирующие агенты, например натрий карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу,альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант и аравийскую камедь; диспергирующие или увлажняющие агенты могут представлять собой природный фосфатид, например лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксиэтанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и безводных гекситов, например, моноолеат полиэтиленсорбитана. Водные суспензии могут содержать также один или более консервантов,например, этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат. В одном аспекте композиции для введения композиций человеку или подопытным животным содержат один или более фармацевтически приемлемый носитель. Выражения "фармацевтически" или"фармацевтически приемлемый" относятся к молекулярным частицам и композициям, которые являются устойчивыми продуктами, ингибируют деградацию белка, такую как агрегация и расщепление и, кроме того, не вызывают аллергических и других побочных реакций при введении общеизвестными в уровне техники способами, описанными ниже. "Фармацевтически приемлемые носители" включают все без исключения применяемые в клинике растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и т.п., включая такие агенты, которые раскрываются выше. Композиции терапевтических пептидных антител можно вводить перорально, топически, трансдермально, парентерально, с помощью спрея для ингаляций, ректально или с помощью интракраниальной инъекции. Термин "парентеральный" по данному описанию включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или инфузии. Также рассматривается введение с помощью внутривенной, интрадермальной, внутримышечной, интрамаммарной, интраперитонеальной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилгочной инъекции м/или хирургической имплантации в конкретное место. Обычно композиции практически не содержат пирогенов, а также других примесей,могущих принести вред реципиенту. Разовые или многократные введения композиций можно осуществлять при уровнях доз и по схеме,выбранным лечащим врачом. Доза, подходящая для предупреждения или лечения заболевания, зависит от типа заболевания, которое следует лечить, по определению выше, тяжести и течения заболевания, от того, применяется лекарство с целью предупреждения или терапии, от предыдущего лечения, анамнеза пациента и реакции на лекарство, и предписания лечащего врача. Наборы В дополнительном аспекте изобретение включает наборы, которые содержат одно (одну) или более лиофилизированных соединений или композиций в таком виде, который облегчает их введение субъекту. В одном варианте изобретения такой набор включает соединение или композицию по данному описанию(например, композицию, содержащую терапевтический белок или пептид), упакованную в контейнер,такой как герметизированный флакон или сосуд (мкость), с этикеткой, прикреплнной к контейнеру или вложенной в упаковку, на которой описано применение соединения или композиции на практике. В одном варианте изобретения набор включает первый контейнер, содержащий лиофилизированную композицию терапевтического белка или пептида, и второй контейнер, содержащий физиологически приемлемый раствор для реконституции лиофилизованной композиции. В одном аспекте соединение или композиция упакована в виде разовой (стандартной) лекарственной формы. Кроме того, набор может включать устройство, пригодное для введения композиции конкретным способом. Предпочтительно набор содержит этикетку, на которой описано применение композиции белка или пептида. Дозы Схема введения лекарства в способе лечения состояния по данному описанию определяется лечащим врачом с учтом различных факторов, которые модифицируют действие лекарств, например, возраста, состояния, массы тела, пола и диеты пациента, тяжести любой инфекции, времени введения и дру- 26022424 гих клинических факторов. В различных аспектах ежедневный прим составляет 0,1-1000 мкг препарата на килограмм массы тела (в расчт бертся только вес белка, без химической модификации) или 0,1-150 мкг/кг. В некоторых вариантах изобретения доза может превышать 1, 3 или 10 мг/кг. Препараты по изобретению можно вводить в виде первичного болюса с последующей непрерывной инфузией для поддержания терапевтических уровней лекарственного продукта в кровотоке. В другом примере соединение по изобретению можно вводить в виде одноразовой дозы. Специалисты в данной области техники легко смогут оптимизировать эффективные дозы и схемы введения, определяемые надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием отдельного пациента. Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров агентов и способа введения. Оптимальную фармацевтическую рецептуру определяет специалист в данной области техники в зависимости от способа введения и требуемой дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co.,Easton, PA 18042), стр.1435-1712, раскрытие которого вводится в данное описание в качестве ссылки. Такие рецептуры могут оказывать влияние на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo введнных агентов. В зависимости от способа введения можно рассчитать подходящую дозу в соответствии с массой тела, площадью поверхности тела или размера органа. При лечении каждым из вышеприведнных препаратов необходимое дополнительное уточнение для определения соответствующей дозы обычно проводят рядовые специалисты в данной области техники без утомительных экспериментов, в частности, на основании сведений о дозах и анализов, раскрываемых в данном описании, а также на основании фармакокинетических данных в клинических испытаниях на людях, обсуждавшихся выше. Соответствующие дозы можно выяснить с помощью известных анализов определения уровней доз в крови в сочетании с соответствующими данными о зависимости "дозаэффект". Окончательную схему лечения определяет лечащий врач, принимая во внимание различные факторы, модифицирующие действие лекарств, например, специфическую активность лекарства, тяжесть поражения и реактивность пациента, возраст, состояние, массу тела, пол и диету пациента, тяжесть какой-либо инфекции, время введения и другие клинические факторы. По мере проведения исследований выяснятся дополнительные сведения относительно подходящих уровней доз и длительности лечения в случае различных заболеваний и состояний. Структура соединений Общие сведения. В препаратах по изобретению пептид связан с носителем по N-концу пептида, Сконцу пептида, или по обоим концам, и полученную структуру можно далее модифицировать за счт связанного ковалентной связью WSP, который связывается с частицей носителя с образованием продукта носитель- пептид. Так например, молекулы терапевтического пептидного антитела по изобретению можно описать нижеприведнной формулой I где где Р 1, Р 2, Р 3 и Р 4 каждый независимо обозначают последовательности фармакологически активных пептидов;L1, L2, L3, L4 и L5 каждый независимо обозначают линкеры; а, b, с, е, f, g и h каждый независимо обозначают 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а и b обозначает 1;WSP обозначает водорастворимый полимер, присоединение которого осуществляется по любому реакционноспособному (реактивному) элементу в F1. Так например, соединение I включает соединения формул,включая его мультимеры, где F1 обозначает Fc домен и присоединн по С-концу X1, а один или бо- 27022424 лее WSP связан с Fc доменом необязательно через линкер L1; включая его мультимеры, где F1 обозначает Fc домен и присоединн по N-концу X2, а один или более WSP связан с Fc доменом, необязательно, через линкер L1; включая его мультимеры, где F1 обозначает Fc домен и присоединн по N-концу (L1)c-P1, а один или более WSP связан с Fc доменом необязательно через линкер L1; и включая его мультимеры, где F1 обозначает Fc домен и присоединн по N-концу -L1-Р 1-L2-Р 2, а один или более WSP связан с Fc доменом необязательно через линкер L1. В одном варианте изобретения F1 обозначает Fc домен и присоединн по N-концу или С-концу пептида. В другом варианте изобретения Fc связан в димерную форму по данному описанию, к которой присоединены 2 (или более) пептида. Пептиды могут быть гомодимерными (т.е. с одинаковой аминокислотной последовательностью) или гетеродимерными (т.е. с различными аминокислотными последовательностями, которые связываются с одинаковой мишенью или которые связываются с различными мишенями). В другом варианте изобретения предусматриваются Fc-петли, содержащие пептид(ы). Fc-петли, содержащие пептид(ы), получают в процессе, в ходе которого по меньшей мере один биологически активный пептид вводят в Fc домен в виде внутренней последовательности. Такую внутреннюю последовательность можно добавлять с помощью инсерции (а именно, между аминокислотами в имевшийся ранееFc домен) или заменой аминокислот в имевшемся ранее Fc домене (а именно, удаляя аминокислоты в имевшемся ранее Fc домене и добавляя аминокислоты пептида). В последнем случае число добавленных пептидных аминокислот необязательно соответствует числу аминокислот, удалнных из имевшегося ранее Fc домена. Например, в одном аспекте предусматривается молекула, в которой удалено 10 аминокислот, а добавлено 15 аминокислот. Предусматриваемые фармакологически активные соединения получают способом, включающим: а) отбор по меньшей мере одного пептида, который модулирует активность белка, представляющего интерес; и б) получение фармакологического агента, содержащего аминокислотную последовательность выбранного пептида в качестве внутренней последовательности Fc домена. Этот способ можно применять для модификации Fc домена, который уже связан с пептидом по Nили С-концу или через боковую цепь, например, как описано в патентных заявках США 20030195156,20030176352, 20030229023 и 20030236193 и в опубликованных международных патентных заявках WO 00/24770 и WO 04/026329. Способ, описанный в опубликованной патентной заявке США 20060140934, также можно применять для модификации Fc домена, который является частью антитела. Таким образом, можно получать различные молекулы, которые имеют дополнительные функциональности, такие как домен связывания с другим эпитопом или дополнительный домен связывания с эпитопом в молекуле-предшественнике. Молекулы, содержащие внутреннюю пептидную последовательность,также относятся к "Fc внутренним пептидным антителам" или "Fc внутренним пептидным молекулам".Fc внутренние пептидные молекулы могут включать более одной пептидной последовательности в тандемном повторе в конкретной внутренней области, и они могут включать другие пептиды в других внутренних областях. Хотя предпочтительными являются области предполагаемой петли, инсерции в любые другие не-концевые домены Fc также считаются частью изобретения. Варианты и производные вышеуказанных соединений (описанных ниже) также охватываются данным изобретением. Соединения по данному изобретению можно получать обычными методами синтеза, методами рекомбинантной ДНК или любыми другими методами получения пептидов и слитых белков. Рассматривается применение Fc внутренних пептидных молекул в качестве терапевтического или профилактического агента. Выбранный пептид может иметь активность, сравнимую с, или даже выше,чем активность природного лиганда, имитируемая пептидом. Кроме того, некоторые терапевтические агенты на основе природных лигандов, вероятно, могут индуцировать антитела против собственного эндогенного лиганда пациента. Напротив, уникальная последовательность пептида, связанного с носителем, позволяет обойти это затруднение, так как она в малой степени идентична или обычно не идентична последовательности природного лиганда. Кроме того, Fc внутренние пептидные антитела могут иметь преимущества при рефолдинге и очистке по сравнению с Fc молекулами, связанными по N- или С-концу. Далее Fc внутренние пептидные антитела могут быть более устойчивы как термодинамически, за счт стабилизации химерных доменов, так и химически, вследствие повышенной устойчивости к протеолитическому расщеплению под действием амино- и карбоксипептидаз. Fc внутренние пептидные антитела могут также проявлять улучшенные фармакокинетические свойства. Пептиды Можно использовать любое число пептидов в сочетании с настоящим изобретением. Особый интерес представляют пептиды, которые имитируют активность ЕРО, ТРО, гормона роста, G-CSF, GM-CSF,IL-1ra, CTLA4, TRAIL, TNF, VEGF, ММР, миостатина, интегрина, OPG, OPG-L, NGF, TALL-1, партнра(ов) по связыванию Ang-2, TGF- и TGF-. Пептидные антагонисты также представляют интерес, в(IL-1, 2, 3,) и белков, принимающих участие в активации комплемента (например, С 3b). Нацеливающие пептиды также представляют интерес, включая пептиды хоуминга клеток опухоли, пептиды для переноса через клеточную мембрану. Все эти классы пептидов можно обнаружить методами, описанными в цитированных в данном описании ссылочных материалах и в других ссылочных материалах. В частности, фаговый дисплей применим для получения пептидов с целью применения в настоящем изобретении. Было установлено, что аффинную селекцию библиотек случайных пептидов можно использовать для идентификации пептидных лигандов для любого сайта любого генного продукта. Dedman et al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 23025-30. Фаговый дисплей особенно подходит для идентификации пептидов, которые связываются с такими интересными белками, как рецепторы клеточной поверхности или любые белки, имеющие линейные эпитопы. Wilson et al. (1998), Can. J. Microbiol. 44: 313-29; Kay etal. (1998), Drug Disc. Today 3: 370-8. Такие белки подробно описаны в обзоре Herz et al. (1997), J. ReceptorSignal Transduction Res. 17(5): 671-776, который вводится в данное описание в качестве ссылки. Такие представляющие интерес белки предпочтительны для применения в данном изобретении. Например, но не в качестве ограничения, охватывается группа пептидов, которые связываются с рецепторами цитокинов. Недавно цитокины были классифицированы в соответствии с их рецепторным кодом. См. статью Inglot (1997), Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 45: 353-7, вводимую в данное описание в качестве ссылки. Среди этих рецепторов CKR (семейство I в табл. 3). Классификация рецепторов представлена в табл. 3. Таблица 3. Классификация рецепторов цитокинов в соответствии с рецепторным кодомIL- 17R принадлежит к семейству CKR, но не относится к 4 указанным подсемействам Другие подтипы IFN типа I остаются не отнеснными. Гемопоэтические цитокины, IL-10 лиганды и интерфероны не имеют функциональных имманентных протеинкиназ. Молекулы, передающие сигналы цитокинам, это JAK's, STATs и родственные нерецепторные молекулы. IL-14, IL-16 и IL-18 клонировались, но остаются не отнеснными в соответствии с рецепторным кодом. 3TNF рецепторы используют мультиплетные, отдельные внутриклеточные молекулы для сигнальной трансдукции,включая "домен клеточной гибели" FAS R и 55 кДа TNF-R, который вносит вклад в их цитотоксические эффекты. NGF/TNF R может связывать как NGF, так и родственные факторы, а также TNF лиганды. Рецепторы хемокинов представляют собой семь транмембранных (7 ТМ, серпентин) рецепторов. Они связаны с G-белком. 2

МПК / Метки

МПК: A61K 38/19, A61K 39/395, A61K 38/16, A61K 38/00

Метки: пептидного, антитела, композиция, лиофилизированная, терапевтического

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-22424-liofilizirovannaya-kompoziciya-terapevticheskogo-peptidnogo-antitela.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Лиофилизированная композиция терапевтического пептидного антитела</a>

Похожие патенты