Последовательности днк, выведенные из хромосомной днк пропанокисляющих бактерий, содержащие ген prma или ген prmd, олигонуклеотиды, комплементарные указанным последователь­ностям, способы идентификации и количественного определения указанных бактерий, набор для определения присутствия указанных бактерий, применение последовательностей генов prma и prmd для конструирования праймеров для амплификации указанных генов и способ обнаружения присутствия природных резервуаров нефти или природного газа

Номер патента: 19241

Опубликовано: 28.02.2014

Авторы: Франки Элисабетта, Де Ферра Франческа, Родригес Франческо

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Последовательности ДНК, выведенные из хромосомной ДНК пропанокисляющих бактерий, содержащие ген prmA, кодирующий альфа субъединицу фермента пропанмонооксигеназы, характеризующиеся нуклеотидными последовательностями, указанными в табл. 4.

2. Последовательности ДНК, выведенные из хромосомной ДНК пропанокисляющих бактерий, содержащие ген prmD, кодирующий вспомогательный белок, участвующий в реакции окисления пропана, характеризующиеся нуклеотидными последовательностями, указанными в табл. 5.

3. Олигонуклеотид, комплементарный последовательностям гена prmA пропанокисляющих бактерий по п.1, выбранный из следующих последовательностей прямых и обратных праймеров для prmA:

Прямые праймеры

Обратные праймеры

4. Олигонуклеотид, комплементарный последовательностям гена prmD пропанокисляющих бактерий по п.2, выбранный из следующих последовательностей прямых и обратных праймеров для prmD:

Прямые праймеры

Обратные праймеры

5. Пара олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям гена prmA пропанокисляющих бактерий по п.1, содержащая прямой праймер и обратный праймер, выбранные из последовательностей по п.3.

6. Пара олигонуклеотидов по п.5, выбранная из следующих пар последовательностей:

7. Пара олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям гена prmD пропанокисляющих бактерий по п.2, содержащая прямой праймер и обратный праймер, выбранные из последовательностей по п.4.

8. Пара олигонуклеотидов по п.7, выбранная из следующих пар последовательностей:

9. Способ идентификации пропанокисляющих бактерий, включающий выделение ДНК из проб окружающей среды и последующую идентификацию по меньшей мере одного фрагмента гена prmA согласно последовательностям prmA по п.1 и/или гена prmD согласно последовательностям prmD по п.2, отличающийся тем, что идентификацию указанных генных фрагментов осуществляют посредством амплификации генов в присутствии пар праймеров, включающих прямые и обратные праймеры, указанные в п.3 и/или 4.

10. Способ идентификации пропанокисляющих бактерий по п.9, согласно которому проводят анализ продукта амплификации указанных генов посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени или гель-электрофореза.

11. Способ по п.9, где идентификацию гена prmA осуществляют посредством амплификации гена в присутствии следующих пар прямых и обратных праймеров:

12. Способ по п.9, где идентификацию гена prmD осуществляют посредством амплификации гена в присутствии следующих пар прямых и обратных праймеров:

13. Способ идентификации пропанокисляющих бактерий, включающий гибридизацию меченого зонда с ДНК анализируемой пробы, отличающийся тем, что этот зонд состоит по меньшей мере из одной последовательности, указанной в пп.3 и 4.

14. Способ по п.13, где ДНК представляет собой продукт амплификации гена, полученный согласно способу по п.9.

15. Способ количественного определения пропанокисляющих бактерий, включающий

осуществление амплификации генов prmA и/или prmD согласно способу по п.10 в присутствии разных количеств геномной ДНК пропанокисляющих бактерий;

количественное определение продукта амплификации гена;

построение калибровочной кривой;

количественное определение геномной ДНК в анализируемых пробах посредством интерполяции.

16. Набор для определения присутствия пропанокисляющих бактерий в пробах окружающей среды или в других типах проб на основе идентификации генов prmA и/или prmD согласно способу по п.9, содержащий пары праймеров, включающие прямые и обратные праймеры, указанные в пп.3 и/или 4, и буфер.

17. Набор по п.16, дополнительно содержащий меченые зонды для гибридизации.

18. Применение последовательностей генов prmA и prmD по пп.1 и 2 для конструирования праймеров для амплификации генов prmA и prmD.

19. Способ обнаружения присутствия природных резервуаров нефти или природного газа, включающий извлечение проб окружающей среды и определение присутствия пропанокисляющих бактерий в указанных пробах способом по п.9, где определение указанных пропанокисляющих бактерий означает присутствие природных резервуаров нефти или природного газа.

Текст

Смотреть все

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК, ВЫВЕДЕННЫЕ ИЗ ХРОМОСОМНОЙ ДНК ПРОПАНОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ, СОДЕРЖАЩИЕ ГЕН prmA ИЛИ ГЕН prmD,ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, КОМПЛЕМЕНТАРНЫЕ УКАЗАННЫМ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМ, СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УКАЗАННЫХ БАКТЕРИЙ, НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИСУТСТВИЯ УКАЗАННЫХ БАКТЕРИЙ, ПРИМЕНЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ prmA И prmD ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ УКАЗАННЫХ ГЕНОВ И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРИСУТСТВИЯ ПРИРОДНЫХ РЕЗЕРВУАРОВ НЕФТИ ИЛИ ПРИРОДНОГО ГАЗА Данное изобретение относится к способу идентификации пропанокисляющих бактерий, который основан на идентификации по меньшей мере одного фрагмента гена рrmА, кодирующего альфа субъединицу фермента пропанмонооксигеназы, и/или гена prmD, кодирующего вспомогательный белок, участвующий в реакции окисления пропана, путем генной амплификации в присутствии пар праймеров, выбранных в соответствии с гомологичными участками, выведенными из выравнивания последовательностей рrmА и prmD. 019241 Настоящее изобретение относится к способу идентификации пропанокисляющих бактерий в пробах из окружающей среды. Более конкретно настоящее изобретение относится к способу идентификации пропанокисляющих бактерий, который основан на применении специфических зондов для этой группы бактерий. Способ по изобретению можно использовать при поиске нефти, основанном на методиках анализа поверхности (поверхностная геохимическая разведка) и позволяет идентифицировать присутствие природных резервуаров нефти или природного газа в нижележащей зоне. Известно, что во многих случаях природные резервуары нефти и газа не являются водонепроницаемыми, и определенное количество более или менее летучих молекул может достигать поверхности,мигрируя через поры в скалах вплоть до поверхности земли. Это высвобождение (выход или просачивание) может быть макроскопически видимым в зонах накопления: в этом случае данное явление определяют как макровыход (макропросачивание). Макропросачивания обычно локализуются на конце сдвигов или разломов. В других случаях просачивание касается пониженного количества короткоцепочечных углеводородов в газообразном состоянии; эти следы можно выявить только специфическими анализами: в этом случае это микровыход (микропросачивание) [Schumacher D., Abrams M.A. eds., 1996, Hydrocarbon Migrationand its Near-Surface Expression, AAPG Memoir 66, 445p]. Между двумя данными крайностями могут быть промежуточные проявления, в зависимости от характеристик самого природного резервуара и геологических характеристик вышележащего пласта. Просачивания видны как на суше, так и в открытом море. При поиске нефти, основанном на методиках анализа поверхности (поверхностная геохимическая разведка), особое внимание уделяется микропросачиваниям, так как газообразные углеводороды могут мигрировать посредством плохо установленных механизмов вертикально над резервуарами, обеспечивая возможность их обнаружения [Saunders, D.F., Burson K.R., Thompson С.К., Model for Hydrocarbon Microseepage and Related Near-Surface Alterations, AAPG Bulletin, V83 Nr. 1 (Jan 1999), p. 170-185; Nunn J.,A., Meulbroek, P., Kilometer-scale upward migration of hydrocarbons in geopressured sediments by buoyancydriven propagation of methane-filled fractures, AAPG Bulletin, V86 Nr. 5 (May 2002), p. 907-918]. Разные технологии поиска, которые позволяют прямо или косвенно идентифицировать присутствие углеводородов или эффектов, обусловленных их присутствием (аномалий), классифицируют под названием "поверхностная геохимическая разведка". Продуцируемые аномалии могут быть физико-химического или биологического типа. Аномалию,обнаруженную в зонах, лежащих над резервуаром, выявляют по появлению бактериальных популяций,способных использовать углеводороды, выходящие из-под поверхности, в качестве источника углерода для их роста; среди них, например, были охарактеризованы разные виды, способные окислять метан; но поскольку метан представляет собой молекулу, которая диффундирует в разных местах в окружающей среде и продуцируется биологически, эти бактериальные системы менее важны для решения задачи настоящего изобретения. Бактерии, которые окисляют пропан и используют его для своего метаболизма, представляют больший интерес, поскольку эта молекула не продуцируется биологически: пропан обычно присутствует на уровне микропросачиваний вместе с метаном, этаном, бутаном и другими короткоцепочечными алканами (газообразными или крайне летучими). Определение присутствия пропанокисляющих бактерий можно проводить посредством микробиологических способов, которые, по существу, происходят от двух фундаментальных методик: MPOG (Microbial Prospection for Oil and Gas - микробная разведка нефти и газа) и MOST (Microbial Oil Survey Technique - методика микробной разведки нефти). Во время микробиологических разведок пробы почвы собирают с глубины 20-150 см от поверхности (как на суше, так и в открытом море); бактериальные клетки культивируют в лаборатории, используя в качестве источников углерода молекулы, обычно идентифицируемые в микропросачиваниях; при нормальных условиях микробным популяциям нужно индуцировать ферментативный пул для окисления специфического субстрата и, следовательно, присутствует определенный промежуток времени (запаздывание) между посевом и ростом; напротив, клеткам, которые уже растут в условиях, где уже присутствует молекула, не нужен какой-либо адаптационный период, и рост, следовательно, является относительно немедленным. На основании плотности популяций, продолжительности запаздывания и других биохимических параметров можно сделать предположение о присутствии источника газа под зоной сбора [Wagner М., М. Wagner J. Piske R. Smit (2002), Case Histories ofhistories: Applications of geochemistry, magnetics, and remote sensing, D. Schumacher and L.A. LeSchack eds.,AAPG Studies in Geology45 и SEG Geophysical References Series Nr. 11, p. 453-479]. Главный недостаток в применении этой методики обусловлен тем фактом, что культивирование таких бактериальных штаммов на специфических культуральных средах является медленным или очень медленным; также известно, что только минимальную часть микробных видов можно культивировать в нормальных лабораторных условиях и, кроме того, поведение исследуемых популяций может значительно варьировать, давая результаты, которые трудно стандартизировать.-1 019241 Несмотря на то, что способы культивирования непрерывно развиваются [Green B.D. and Keller, ML,Capturing the uncultivated majority, Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:1-5], биомолекулярные методики в разных обстоятельствах оказались более подходящими для характеристики бактериальных популяций в их месте обитания. Например, в пробах из окружающей среды можно идентифицировать гены со специфическими представляющими интерес активностями посредством стандартных методик, таких как ПЦР (полимеразная цепная реакция) с применением зондов, специально сконструированных на идентичных последовательностях или (на последовательностях) с разными уровнями гомологии. При помощи коррелирующих методик также можно произвести количественную оценку как самих генов, так и их транскрипционных продуктов (мРНК). Количественное определение генов можно осуществлять с помощью таких методик, как кПЦР (количественная ПЦР), посредством которой можно определить количество специфического гена в пробе почвы с помощью предварительно построенной стандартной калибровочной кривой при известной концентрации. Путем применения кПЦР к количественной оценке матричной РНК, используя методику,названную ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой), можно получить информацию об уровне активности гена, которая наиболее выраженным образом кореллирует с количеством эффективно присутствующего пропана: это представляет собой косвенное измерение количества пропана, который достигает поверхности из резервуара, которое, следовательно, позволяет идентифицировать лежащий ниже резервуар. Теперь был обнаружен способ, основанный на амплификации специфических генов, кодирующих семейство пропанмонооксигеназ, который позволяет идентифицировать бактериальные популяции, которые используют пропан. Эти ферменты отвечают за первую реакцию, которая дает возможность использовать пропан в качестве источника углерода: окисление пропана до пропанола. Объект настоящего изобретения, следовательно, относится к последовательностям ДНК, выведенным из хромосомной ДНК пропанокисляющих бактерий, содержащим ген prmA, кодирующий альфа субъединицу фермента пропанмонооксигеназы, характеризующимся нуклеотидными последовательностями, указанными в табл. 4. Другой объект настоящего изобретения относится к последовательностям ДНК, выведенным из хромосомной ДНК пропанокисляющих бактерий, содержащим ген prmD, кодирующий вспомогательный белок, участвующий в реакции окисления пропана, характеризующимся нуклеотидными последовательностями, указанными в табл. 5. Другой объект настоящего изобретения относится к способу идентификации пропанокисляющих бактерий, включающему выделение ДНК из проб окружающей среды и последующую идентификацию по меньшей мере одного фрагмента гена prmA или гена prmD, отличающемуся тем, что идентификацию фрагмента гена осуществляют посредством амплификации гена в присутствии праймеров, выбранных в соответствии с гомологичными участками, выведенными из выравнивания последовательностей prmA иprmD, указанных выше. Конкретно, идентификацию гена prmA можно эффективно проводить посредством амплификации гена в присутствии комбинаций выбранных праймеров или производных, полученных частичным вырождением, из следующих групп: Прямые праймеры для prmA Обратные праймеры для prmA Идентификацию гена prmD можно эффективно осуществлять посредством амплификации гена в присутствии комбинаций выбранных праймеров (или производных, полученных частичным вырождением) из следующих групп: Прямые праймеры для prmD Обратные праймеры для prmD Последовательности праймеров по изобретению были сначала выведены из выравнивания генов,кодирующих субъединицы ферментативных систем, гомологичных пропанмонооксигеназам, принадлежащим к семейству "растворимых монооксигеназ с двумя атомами железа", ответственным за окисление алканов, алкенов и аналогичных короткоцепочечных молекул [Leahy J.G., Batchelor P.J., Morcomb S.M.,Evolution of the soluble diiron monooxygenases, FEMS Microbiology Reviews 27 (2003) 449-479]. Данные последовательности выравнивали с использованием программы Clustal X (Thompson, J.D.,Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequenceResearch, 22:4673-4680) для того, чтобы определить сохраняющиеся области и идентифицировать в гомологичных областях специфичные нуклеотидные последовательности, подлежащие применению в качестве праймеров для амплификации гомологичных генов, присутствующих в штаммах, выделенных из проб из окружающей среды. На основе информации, полученной от секвенирования и выравнивания последовательностей указанных генов или из их генного продукта, впоследствии сконструировали праймеры по настоящему изобретению. Способ по данному изобретению показал большую чувствительность, специфичность и скорость относительно способов, описанных в предшествующем уровне техники (MPOG, MOST). Другой объект настоящего изобретения относится к олигонуклеотидам, имеющим последовательность, выбранную из последовательностей, указанных выше. Эти олигонуклеотиды, как и все олигонуклеотиды, происходящие из последовательностей prmA иprmD, идентифицированные в табл. 4 и 5, могут использоваться не только как праймеры для амплификации генов, но также и как генные зонды для идентификации гена prmA и гена prmD пропанокисляющих бактерий. В этом случае амплифицированные или клонированные, или синтезированные олигонуклеотиды по изобретению или фрагменты генов prmA или prmD, подвергают мечению, используя методики предшествующего уровня техники так, чтобы их можно было легко определить и затем подвергнуть гибридизации с анализируемой геномной ДНК [как, например, в методике FISH (fluorescence in situ hybridization),гибридизация in situ с использованием флуоресцентного мечения], что делает возможным идентификацию специфических последовательностей по флуоресценции в пробах, содержащих бактериальные клетки, как описано, например, в "In Situ Hybridization. A practical Approach" Edited by D.G. Wilkinson IPLPress, Oxford University Press, 1994. Мечение можно осуществлять разными методиками, такими как, например, флуоресцентное, радиоактивное, хемилюминисцентное или ферментативное мечение. Способ определения пропанокисляющих бактерий по изобретению включает конкретно следующие операции: выделение ДНК из проб; приведение экстрагированной ДНК в контакт с парой праймеров, выбранных из олигонуклеотидов,имеющих ранее указанные последовательности, в условиях, обеспечивающих специфическую амплифи-7 019241 кацию фрагмента гена prmA или prmD [или альтернативно с использованием других способов анализа,таких как количественная ПЦР, кПЦР (Dorak M. Т. (ed.), Real-time PCR, TaylorFrancis (2006)]; проведение анализа продукта амплификации гена посредством гель-электрофореза. Анализируемая проба может состоять из почвы или воды, происходящих из проб из окружающей среды или из бактериальных культур. Выделение геномной ДНК из анализируемых проб можно проводить согласно стандартным методикам или с применением имеющихся в продаже наборов. Эти методики, ассоциирующиеся с быстротой анализа с праймерами, являющиеся объектом данного изобретения, значительно уменьшают время определения пропанокисляющих бактерий, обеспечивая их определение и количественную оценку в течение нескольких часов; с другой стороны, обычно используемые способы, которые основаны на эффективной культивируемости бактерий, требуют значительно более продолжительного времени - по меньшей мере, недели. В качестве праймеров для амплификации используется пара олигонуклеотидов, имеющих последовательность, по существу, идентичную или содержащую ранее указанные последовательности, или происходящую из других гомологичных частей последовательностей генов prmA или prmD. Выражение "по существу, идентичная" означает, что последовательность олигонуклеотидов является, по существу, идентичной ранее идентифицированным последовательностям или, что она отличается от этих последовательностей без влияния на ее способность гибридизироваться с геном prmA или prmD. Используемый способ амплификации гена основан на реакции ДНК-полимеразы в присутствии пары праймеров и является хорошо известным экспертам в данной области (Sambrook et al., 1989, MolecularCloning, Cold Spring Harbor, NY). Выражение "условия, которые обеспечивают амплификацию генов" относится к температурным условиям, времени реакции и, возможно, к дополнительным агентам, которые необходимы для обеспечения распознавания фрагмента генов prmA или prmD праймерами по изобретению и идентичного копирования. Выражение "условия, которые обеспечивают специфическую амплификацию" относится к условиям, которые предотвращают амплификацию последовательностей, отличных от последовательностей генов prmA или prmD. Согласно способу по изобретению стадию "спаривания" во время реакции амплификации проводят при температурах, совместимых с последовательностью праймеров, предпочтительно в этом конкретном случае при 58 С. Используемыми буферами и ферментами являются растворы, совместимые с характеристиками используемых ДНК-полимераз, таких как, например, полимеразы Taq, полимеразы ampliTaq Gold и полимеразы с горячим стартом, полимеразы из гипертермофильных микроорганизмов. Полимеразы, такие как полимеразы Taq, предпочтительно используют в присутствии буферного раствора, наиболее подходящего для данного типа фермента. Последовательности, соответствующие парам праймеров, идентифицированных настоящим изобретением, дали особенно интересные результаты при количественном определении пропанокисляющих бактерий. Другим преимуществом описанного способа является легкость адаптации к протоколам, подлежащим применению in situ, таким как, например, применение портативных установок для ПЦР в реальном времени. Следующие примеры и графические материалы иллюстрируют данное изобретение без ограничения его области. Пример 1. Выделение пропанокисляющих штаммов Извлекали пробы почвы, находящейся над известными природными резервуарами нефти; 0,2-1 г каждого образца ресуспендировали в 10 мл минимальной культуральной среды без источника углерода и инкубировали в течение ночи с перемешиванием при 20-25 С. Минимальная среда (на литр):-8 019241 После декантации суспензий 0,1-1 мл аликвоты инкубировали в минимальной среде в присутствии пропана или, в качестве альтернативы, смеси нормального и 2-пропанола (конечная концентрация 0,2% для каждого); культуры в пропаноле подвергали трехсуточному периоду обогащения при 25 С перед разведением по меньшей мере 1:100 в той же самой среде, но в присутствии пропана в качестве источника углерода. Стадия в присутствии спиртов в качестве источника углерода не является необходимой, но она позволяет ускорить процесс обогащения; если данный процесс продолжается в течение слишком длительного времени, наблюдается преобладание Pseudomonas (обычно неспособных окислять пропан). Сразу после переноса в присутствии пропана клетки инкубировали до тех пор, пока культуры не показывали очевидного помутнения; аликвоты затем высевали штрихами на твердую среду, содержащую смесь спиртов в качестве источника углерода; после роста колоний, их индивидуально инокулировали в минимальную среду в присутствии пропана в качестве источника углерода. По завершении роста аликвоты культуры вновь высевали штрихами как на чашки с минимальной средой в присутствии смеси спиртов, так и на чашки с обогащенной средой (LB) для дальнейшей характеризации и для подтверждения чистоты культур перед дальнейшими экспериментами и перед хранением в форме глицеринатов. Одну колонию на морфологический тип высевали штрихами из каждой чашки (на этой стадии обычно получаются чистые культуры и, следовательно, присутствует один морфологический тип на чашку). Пример 2. Характеризация пропанокисляющих штаммов Колонии характеризовали с таксономической точки зрения путем амплификации части 16S рДНК и последующего секвенирования. Для очистки геномной ДНК штаммы инокулировали в 10 мл обогащенной среды (обычно 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl) и инкубировали при 28,5 С в течение 2-3 суток, пока не получали очевидное помутнение. Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали в 950 мкл ТЕ (10 мМ Tris/Cl, 1 мМEDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8) в присутствии лизоцима (1 мг/мл). После инкубации суспензий в течение 20 мин при 37 С добавляли 50 мкл 10% SDS (додецилсульфат натрия) и 5 мкл раствора, содержащего протеазу К (маточный раствор 20 мг/мл). Пробы инкубировали в течение 1 ч при 37 С; затем добавляли 100 мкл 3 М К-ацетата, рН 5, и смесь инкубировали во льду в течение 10 мин; после центрифугирования в течение 15 мин при 4 С при RCF(относительная центробежная сила) 20800, ДНК осаждали из супернатанта добавлением одного объема изопропанола и центрифугированием, при таких же условиях, как и ранее. Осадок промывали в 70%-ном этаноле, сушили и растворяли в 800 мкл ТЕ в присутствии 20 мкг рибонуклеазы А (из поджелудочной железы). Пробы экстрагировали одним объемом смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) и затем одним объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт. Наконец, ДНК осаждали одним объемом 2 пропанола после добавления 0,1 объема 3 М К-ацетата, рН 5; после промывки осадка 70%-ным этанолом ДНК растворяли в H2O в концентрации, равной примерно 50 нг/мкл. Геномную ДНК амплифицировали с парой праймеров Rho1F и Rho4R или Rho1F и Rho9R, как показано в табл. 1. Все праймеры, последовательность которых указана в табл. 1, использовали для секвенирования. Последовательности праймеров получены из выравнивания последовательностей 16S рДНК, депонированных в Национальном Центре биотехнологической информации (National Center for BiotechnologyInformation) (http://www-ncbi.nlm.nih.gov/). Выравнивания проводили группировкой последовательностей в классы с использованием программы clustalW [Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. (1994)alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98]: последовательности, представленные в таблице, оказавшиеся лучшей комбинацией для выделенных штаммов, получали выравниванием последовательностей, принадлежащих к классу Actinobacteria. Для ПЦР использовали примерно 5 нг геномной ДНК в конечных 20 мкл для каждой пробы; dNTP(дезоксинуклеозидтрифосфаты) смешивали в концентрации, равной 200 мкМ для каждого; праймеры использовали в концентрации 0,5-1 пмоль/мкл реакционной смеси; фермент, полимеразу Taq (New England Biolabs), добавляли до конечной концентрации 2,5 ед.для каждых 100 мкл реакционной смеси. После исходной стадии при 95 С в течение 2 мин, проводили 7 циклов с исходной денатурацией в течение 30 с при 94 С, стадией спаривания в течение 30 с при 62 С, снижая температуру на 1 С для каждого цикла до 56 С, и элонгацией в течение 1 мин 30 с при температуре 72 С; к этим циклам добавляли 35 циклов с исходной денатурацией при 94 С в течение 30 с, стадией спаривания в течение 30 с при 58 С и полимеризацией в течение 1 мин 30 с при 72 С. 4 мкл каждой пробы, полученной амплификацией, к которым добавляли 1 мкл ExoSAP-IT (USB),использовали для секвенирования; после инкубации в течение 30 мин при 37 С пробы инкубировали при денатурирующей температуре 90 С в течение 10 мин для нейтрализации активности ферментов. 3 пмоль специфического праймера добавляли к каждой пробе в присутствии 1 мкл реакционной смеси (DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit, Amersham). После стадии при 95 С в течение 1 мин проводили-9 019241 30 следующих циклов для стимуляции реакции секвенирования: 30 с при 94 С, 30 с при 56 С и 2 мин при 60 С. Полученные последовательности сравнивали с последовательностями, присутствующими в банках данных Национального Центра биотехнологической информации (http://www-ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),используя программу "blast" [Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W.Lipman D.J. (1990) "Basiclocal alignment search tool". J. Mol. Biol. 215:403-410]. Из анализа полученных выравниваний можно видеть, что выбранные штаммы принадлежат к роду Пример 3. Идентификация последовательностей, кодирующих пропанмонооксигеназы Некоторые ферменты, способные окислять газообразные алканы (такие как метан, пропан и бутан) и короткоцепочечные алкены, линейные или разветвленные, принадлежат к группе так называемых "растворимых монооксигеназ с двумя атомами железа". Они представляют собой ферменты, состоящие из разных субъединиц, которые катализируют первую реакцию, в которой алкан окисляется до первичного или вторичного спирта, альфа субъединица которых содержит каталитический сайт (Leahy J.G., BatchelorP.J., Morcomb S.M., Evolution of the soluble diiron monooxygenases, FEMS Microbiology Reviews 27 (2003) 449-479). Путем выравнивания известных последовательностей разных субъединиц оказалось возможным идентифицировать разные подгруппы, такие как, например, метанмонооксигеназы растворимого типа(sMMO), бутанмонооксигеназы, алкенмонооксигеназы и монооксигеназы, более специфичные в отношении ароматических соединений [F. Rodriguez, E. Franchi, LP. Serbolisca, F. de Ferra. Monitoring of BacterialHole, Wyoming - August 14-19, 2005]; это позволило выбрать группу монооксигеназ, более гомологичных друг другу, способных окислять молекулы, химически родственные пропану: единственная монооксигеназа, известная своей способностью окислять пропан, также принадлежит к этой группе [Kotani Т., Yamamoto Т., Yurimoto H., Sakai Y., Kato, N., Propane monooxygenase and NAD+-dependent secondary alcoholdehydrogenase in propane metabolism by Gordonia sp. strain TY-5, J. Bacteriol. 185 (24), 7120-7128 (2003)], и монооксигеназа из Frankia sp. Cc13 (Acc. Num. AAIE01000085), которая имеет крайне высокую гомологию, депонированная как метанмонооксигеназа [Copeland A., Lucas S., Lapidus A., Barry K., Detter С.,- 10019241of the draft genome and assembly of Frankia sp. Cc13]. Субъединицы этих ферментативных комплексов кодируются на уровне оперонов, в которых поддерживается порядок одиночных генов: А, В, С, D, с последующими двумя генами с не очень хорошо известной функцией, геном алкогольдегидрогеназы (adh) и геном шаперонина (GroEL). Из выравнивания аминокислотных последовательностей альфа субъединицы выбирали некоторые участки с большей гомологией, которые в Gordonia sp. TY-5 кодируются prmA, как показано в табл. 2. Следующие два вырожденных олигонуклеотида, использованных в первых экспериментах по амплификации, были получены из последовательностей в табл. 2:N обозначает любой нуклеотид, Y обозначает С или Т, и R обозначает А или G. Из выравнивания аминокислотных последовательностей субъединиц, кодируемых prmD, также выбирали участок с большей гомологией с последовательностью, показанной в табл. 3. Из этой аминокислотной последовательности получали праймер со следующей последовательностью:prmD первоначально проводили на продукте амплификации, полученном с использованием праймераprmD1R, объединенного с праймером Xmo6F, выведенным из последовательностей prmA: Аналогично, для некоторых штаммов получали частичную последовательность гена prmB с использованием праймеров, картируемых в конечной части (3') prmA; эти эксперименты по секвенированию изначально проводили на ранее упомянутых продуктах амплификации и также после обратной амплификации; а именно, для первоначального секвенирования использовали праймеры XA22F, XA26F иXA28F, перечисленные в разделе "Прямые праймеры для prmA". Участки этих генов из штаммов, выделенных из проб из окружающей среды и отобранных по их способности расти на пропане в качестве единственного источника углерода, амплифицировали и секвенировали с праймерами, указанными выше. Секвенирование проводили на продуктах как прямой амплификации, так и обратной амплификации и при "перемещении праймеров" ("primer walking") для удлинения последовательностей, известных из каждого предыдущего эксперимента. Олигонуклеотиды нового поколения называли, исходя из выравниваний частичных последовательностей; последовательности этих праймеров указаны в приведенных выше списках: "ПРЯМЫЕ ПРАЙМЕРЫ для prmA", "ОБРАТНЫЕ ПРАЙМЕРЫ для prmA", "ПРЯМЫЕ ПРАЙМЕРЫ для prmD" и "ОБРАТНЫЕ ПРАЙМЕРЫ для prmD". Эти праймеры позволили завершить последовательность генов А и D из штаммов, выделенных из ранее упомянутых проб из окружающей среды (Gordonia sp. SMV048, Rhodococcus sp. SMV049, 052, 105,106, 152, 153, 154, 155, 156, 157, Mycobacterium SMV158, Rhodococcus sp. SMV 160, 161, 162, GordoniaSMV163 и Rhodococcus SMV164, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 и 174). Последовательности, относящиеся к prmA и prmD, указаны в табл. 4 и 5. Пример 4. Амплификация генов prmA из геномной ДНК выделенных бактериальных штаммов Из известных последовательностей можно сконструировать разные "универсальные" праймеры,обеспечивающие амплификацию участков генов prmA как из очищенных штаммов, так и из проб из окружающей среды. Некоторые пары праймеров, которые можно с удобством использовать для амплификации генов Для амплификации генов очищенных штаммов использовали примерно 5 нг геномной ДНК, экстрагированной, как показано в примере 2.- 11019241 Амплификации обычно проводили в объеме 10 или 20 мкл на пробу, содержащую буфер для полимеразы Taq (Roche или New England Biolabs) с 2,5 ед. фермента на 100 мкл конечной смеси. 1 пмоль/мкл каждого праймера использовали в присутствии смеси дезокси-NTP (200 мкМ каждого). Использовали термоциклер MJ Research, проводя 30-35 циклов, состоящих из денатурации при 94 С в течение 30 с, отжига при 58 С в течение 30 с, элонгации при 72 С в течение 30 с; циклам предшествовала исходная денатурация при 95 С в течение 2 мин. В конце 2 мкл каждой пробы анализировали на 2%-ном агарозном геле в ТАЕ. Фиг. 1 показывает результат амплификации участка гена prmA, включенного в последовательности,гомологичные XA16F и XA23R; DS7 (Rhodococcus sp. SMV062) представляет собой штамм, неспособный расти на пропане в качестве единственного источника углерода (негативный контроль); Р представляет собой штамм Pseudomonas sp., выделенный из пробы из окружающей среды, способный расти на Nпропаноле в качестве единственного источника углерода, но не способный расти на пропане. Следующими штаммами являются, соответственно, штаммы от 048 до 164b:"L" показывает стандарт, содержащий фрагменты ДНК известных размеров (маркер молекулярной массы ДНК XIV - Roche). ДНК Rhodococcus DS7 (SMV062) и Pseudomonas sp. не амплифицируется при используемых экспериментальных условиях. Это согласуется с неспособностью двух данных штаммов окислять пропан. Фиг. 2 показывает результат амплификации участка гена prmA, содержащегося между последовательностями, гомологичными праймерам XA16F и Xmo5R. Проанализированные пробы и условия являются идентичными предыдущему эксперименту: также в этом случае Rhodococcus SMV062 (DS7) иPseudomonas sp. не показывают какой-либо амплификации. Пример 5. Фиг. 3 показывает результат двух экспериментов по амплификации гена prmA, проведенных одновременно на ДНК штаммов, перечисленных ниже: Двумя парами использованных праймеров были XA16F вместе с Xmo5R и XA19F вместе сXA21R. Использованные экспериментальные условия были такими же, как и условия экспериментов,описанных в примере 4, с частичной модификацией циклов: после исходной денатурации при 94 С в течение 2 мин проводили пять циклов путем инкубации при денатурирующей температуре 94 С в течение 30 с, при температуре спаривания в течение 30 с и при температуре полимеризации 72 С в течение 30 с; температуру спаривания снижали на 1 С за цикл; затем проводили 31 цикл с каждой стадией по 20 с при 94, 58 и 72 С. Обе пары праймеров демонстрируют эффективность при амплификации двух разных участковprmA: разная интенсивность полос могла быть обусловлена особенностями каждой амплифицированной последовательности и количеством тех же самых праймеров. Пример 6. Амплификация генов prmD из геномной ДНК выделенных бактериальных штаммов Из известных последовательностей были сконструированы определенные "универсальные" праймеры, которые обеспечивают амплификацию участков генов prmD из очищенных штаммов, перечисленные в разделах "ПРЯМОЙ ПРАЙМЕР для prmD" и "ОБРАТНЫЙ ПРАЙМЕР для prmD". Последовательности некоторых праймеров, которые можно с удобством использовать для амплификации генов prmD, являются следующими: Фиг. 4 демонстрирует результат амплификации участка гена prmD, содержащегося между последовательностями, гомологичными праймерам Xmo8F и XD5R. Проанализированные пробы и условия являются идентичными условиям эксперимента из примера 4: также в этом случае Rhodococcus SMV062(DS7) и Pseudomonas sp. не показывают какой-либо амплификации, тогда как для всех других штаммов результат является положительным. Фиг. 5 демонстрирует результат амплификации участка гена prmD, содержащегося между последовательностями, гомологичными праймерам Xmo8F и prmD1R. prmD1R представляет собой праймер,приведенный в перечне "ОБРАТНЫЙ ПРАЙМЕР для prmD", имеющий следующую последовательность: Проанализированные пробы и условия идентичны с предыдущим экспериментом (относящимся к фиг. 4): также в этом случае Rhodococcus SMV062 (DS7) и Pseudomonas sp. не показывают какой-либо амплификации, тогда как для всех других штаммов результат является положительным. Из описанных экспериментов можно сделать вывод, что специфические участки генов prmA и prmD амплифицируются из ДНК всех штаммов, выделенных с использованием пропана в качестве источника углерода, что подтверждается секвенированием этих продуктов амплификации. Результат является аналогичным при использовании как участка prmA, так и участка prmD. Пример 7. Амплификация генов prmA из ДНК, экстрагированной из проб из окружающей среды, с парой праймеров XA16F и Xmo5R Пробы почвы, лежащей над известным природным резервуаром нефти, и предположительно пробы,полученные в удалении, анализировали с использованием описанных ранее методик амплификации участка гена prmA. Общую ДНК экстрагировали из 0,5 г каждой пробы почвы с использованием набора Q-BIOgene"FastDNA SPIN Kit for soil" согласно рекомендованному протоколу. В конце экстракции ДНК разводили в конечном объеме 200 мкл Н 2 О. Для амплификаций использовали 2 мкл разведения 1:10 каждой пробы ДНК; конечные 20 мкл на пробу для амплификации содержали 1 буфер для полимеразы Taq от Roche с 2,5 ед. фермента (New- 13019241 Использовали установку MJ Research PTC200, предварительно осуществив денатурацию при 95 С в течение 2 мин и 4 цикла, состоящих из реакции денатурации при 94 С в течение 30 с, спаривания при 58 С в течение 30 с с уменьшением температуры на 1 С за каждый цикл и полимеризации при 72 С в течение 30 с; после этих стадий следовали 40 циклов, состоящих из денатурации при 94 С в течение 30 с,спаривания при 58 С в течение 30 с и полимеризации при 72 С в течение 30 с. По 2,5 мкл каждой пробы загружали на 2%-ный агарозный гель в ТАЕ. На фиг. 6 представлена фотография 2%-ного агарозного геля в ТАЕ, на который были загружены по 2 мкл каждой пробы: порядок соответствует нумерации, присвоенной при отборе проб; SMV155 указывает пробу, полученную из амплификации примерно 50 пг геномной ДНК Rhodococus sp. SMV155 при точно таких же условиях. Пробы 20-32, 51-54 и 63-65 собирали в зоне, в которой находится известный природный резервуар; пробы 19, 55, 61, 62 и 64 получены из зон, которые расположены приблизительно на границах известного резервуара; пробы 33-43 получены из зоны, в которой производится разведка, расположенной южнее по отношению к известному резервуару; все пробы 44-50, 57-60 расположены на юго-востоке по отношению к известному резервуару. Можно говорить, что пробы, собранные внутри известной зоны резервуара, являются очевидно положительными, дающими очевидный сигнал. Пробы, собранные в зонах, где производится разведка,также давали варьирующий сигнал, в зависимости от зоны происхождения: а именно, в зоне, расположенной южнее известного резервуара, сигналы в целом являются положительными. Пример 8. Амплификация генов prmA из ДНК, экстрагированной из проб из окружающей среды, с парой праймеров XA19F/XA21R Эксперимент, аналогичный эксперименту, описанному в примере 7, проводили на тех же самых пробах с использованием праймеров XA19F и XA21R в идентичных условиях за исключением частичной модификации циклов амплификации согласно следующей схеме: На фиг. 7 представлена фотография 2%-ного агарозного геля, на который загружали по 3 мкл каждой пробы: порядок соответствует нумерации, присвоенной во время отбора проб. В этом случае сигнал также обычно является положительным для проб, собранных на известной площади, лежащей над резервуаром. Пример 9. Амплификация генов prmD из ДНК, экстрагированной из проб из окружающей среды Аналогично экспериментам из примеров 7 и 8 участок гена prmD амплифицировали с использованием ранее описанных праймеров Xmo8F и prmD1R. Для амплификации использовали по 2 мкл разведения 1:10 каждой пробы ДНК; конечные 10 мкл на пробу для амплификации содержали 1 буфер для полимеразы Taq от Roche с 2,5 ед. фермента (NewEngland Biolabs) для каждых 100 мкл конечной смеси. Использовали 1 пмоль/мкл каждого праймера в присутствии смеси дезокси-NTP (по 200 мкл каждого). Использовали установку MJ Research PTC200, предварительно осуществив денатурацию при 95 С в течение 2 мин и 10 циклов, состоящих из реакции денатурации при 94 С в течение 30 с, спаривания при 64 С в течение 30 с с уменьшением температуры на 1 С за каждый цикл и полимеризации при 72 С в течение 30 с; после этих стадий следовали 40 циклов, состоящих из денатурации при 94 С в течение 30 с,спаривания при 58 С в течение 30 с и полимеризации при 72 С в течение 30 с. По 2,5 мкл каждой пробы загружали на 2%-ный агарозный гель в ТАЕ. На фиг. 8 представлена фотография 2,5%-ного агарозного геля, на который были загружены по 3 мкл каждой пробы: порядок соответствует нумерации, присвоенной во время отбора проб; SMV155 указывает пробу, полученную из амплификации примерно 50 пг геномной ДНК Rhodococus sp. SMV155 при точно таких же условиях. Результат может быть в достаточной степени совместим с результатом, полученным в экспериментах с парами праймеров XA16F - Xmo5R и XA-19F - XA21R; различия могут зависеть как от незначительного изменения протокола, так и от другой специфичности самих праймеров. Использование разных пар позволяет локализовать присутствие пропанокисляющих бактерий в пробах из окружающей среды с большей вероятностью успеха; в частности, последовательность гена prmA, демонстрирующая в разных штаммах определенные высокогомологичные области, является особенно подходящей для применения многих пар праймеров, полезных для амлификации разных областей данного гена, посредством ряда методик, таких как DGGE (электорофорез в денатурирующем градиентном геле) и количественная ПЦР (кПЦР).

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/68

Метки: праймеров, природного, обнаружения, природных, днк, набор, указанным, определения, последовательности, амплификации, ген, prmd, указанных, комплементарные, выведенные, пропанокисляющих, содержащие, генов, нефти, присутствия, применение, хромосомной, бактерий, олигонуклеотиды, последователь­ностям, конструирования, резервуаров, последовательностей, идентификации, способ, способы, количественного, газа

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-19241-posledovatelnosti-dnk-vyvedennye-iz-hromosomnojj-dnk-propanokislyayushhih-bakterijj-soderzhashhie-gen-prma-ili-gen-prmd-oligonukleotidy-komplementarnye-ukazannym-posledovatelnostya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Последовательности днк, выведенные из хромосомной днк пропанокисляющих бактерий, содержащие ген prma или ген prmd, олигонуклеотиды, комплементарные указанным последователь­ностям, способы идентификации и количественного определения указанных бактерий, набор для определения присутствия указанных бактерий, применение последовательностей генов prma и prmd для конструирования праймеров для амплификации указанных генов и способ обнаружения присутствия природных резервуаров нефти или природного газа</a>

Похожие патенты