Вирус гриппа с нарушенной репликацией для экспрессии гетерологичных последовательностей

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Вирус гриппа с нарушенной репликацией, включающий:

а) модифицированный NS сегмент, кодирующий NS1 белок, включающий по меньшей мере 10 N-концевых аминокислот, где участок связывания РНК расположен между аминокислотами 1 и 73, а эффекторный участок расположен между аминокислотой 74 и С-концевым аминокислотным остатком, где указанные участки утратили свои функции из-за аминокислотных делеций, и

б) гетерологичную последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, вставленную в NS сегмент гена.

2. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по п.1, включающий до 14, предпочтительно до 30 аминокислотных остатков с N-конца NS1 белка.

3. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1 или 2, в котором удалены аминокислотные остатки 134-161 или аминокислотные остатки 117-161.

4. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-3, включающий сигнальный пептид или его часть, присоединенную к С-концу NS1 белка.

5. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-4, в котором гетерологичная последовательность экспрессируется с открытой рамкой считывания NS1 с другой открытой рамки считывания.

6. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-5, в котором гетерологичную последовательность выбирают из группы, состоящей из биологически активных белков, их антигенов или производных или фрагментов.

7. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-6, в котором гетерологичная последовательность представляет собой антиген, хемокин, цитокин или их производное или фрагмент, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из Mycobacterium tuberculosis, IL-2, GM-CSF, EL-15, MIP1a и MIP3a, ESAT-6 или их фрагмента или производного.

8. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.4-7, в котором гетерологичная последовательность включает сигнальный пептид, полученный из легкой цепи антитела, предпочтительно из k-цепи иммуноглобулина (IgK), более предпочтительно из IgK цепи мыши.

9. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по п.8, в котором сигнальный пептид IgK включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков, предпочтительно включает последовательность METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID No. 11), или METDTLLLWVLLLWVPRSHG (SEQ ID No. 82), или ее часть.

10. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-9, в котором трансляция указанного NS1 белка заканчивается с помощью по меньшей мере одного стоп-кодона и экспрессия указанной гетерологичной последовательности инициируется старт-кодоном.

11. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-10, в котором открытая рамка считывания гетерологичной последовательности, по меньшей мере, частично перекрывается с открытой рамкой считывания NS1.

12. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-11, в котором трансляция с открытой рамки считывания гетерологичной последовательности инициируется последовательностью перекрывающихся стоп-старт-кодонов, которая предпочтительно представляет собой TAATG (SEQ ID No. 81) или UAAUG (SEQ ID No. 53).

13. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-12, содержащий измененную последовательность, расположенную после донорного участка сплайсинга и/или перед акцепторным участком сплайсинга в NS сегменте.

14. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-13, включающий последовательность SEQ ID No. 1-10, 67, 68 или по меньшей мере на 98% гомологичную им.

15. Вакцина, включающая вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14.

16. Применение вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для терапевтического лечения больных.

17. Вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14.

18. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14, включающий стадии

трансформации клеток, предпочтительно Vero клеток, вектором по п.17 предпочтительно вместе с очищенным препаратом RNP комплекса вируса гриппа,

необязательно инфицирования трансфецированных клеток вспомогательным (хелперным) вирусом гриппа,

инкубации инфицированных клеток для развития потомства вируса и

отбора трансформированных клеток, которые экспрессируют модифицированный NS ген и гетерологичную последовательность.

19. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14, включающий стадии

трансфецирования клеточной линии, предпочтительно линии Vero клеток, ДНК вектором, включающим модифицированный NS ген, лишенный функционального домена связывания РНК, и гетерологичную последовательность, помещенную между функциональным донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга NS гена;

отбора трансфецированных клеток, которые продуцируют вирус, экспрессирующий модифицированный NS ген и гетерологичную последовательность,

инфицирования отобранных клеток требуемым вирусом гриппа,

инкубации инфицированных клеток для развития потомства вируса, содержащего гетерологичный белок,

отбора и сбора указанного потомства вируса, содержащего гетерологичный белок.

20. Модифицированный NS сегмент гена, кодирующий NS1 белок, включающий по меньшей мере 10 N-концевых аминокислот, где участок связывания РНК расположен между аминокислотами 1 и 73, а эффекторный участок расположен между аминокислотой 74 и С-концевым аминокислотным остатком, где указанные участки утратили свои функции из-за аминокислотных делеций, а гетерологичная последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, вставленная в NS сегмент гена, дополнительно содержит сигнальный пептид, присоединенный к С-концу указанного NS1 белка, где указанный сигнальный пептид предпочтительно состоит из 8-50 аминокислотных остатков.

21. Модифицированный NS сегмент по п.20, в котором сигнальный пептид получен из легкой цепи антитела, предпочтительно из k-цепи иммуноглобулина, более предпочтительно из IgK цепи мыши или ее производного, где предпочтительно указанный сигнальный пептид IgK включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков и предпочтительно включает последовательность METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID No. 11), или METDTLLLWVLLLWVPRSHG (SEQ ID No. 82), или ее часть.

Рисунок 1

Текст

Смотреть все

ВИРУС ГРИППА С НАРУШЕННОЙ РЕПЛИКАЦИЕЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Настоящее изобретение охватывает новый вирус гриппа с нарушенной репликацией, включающий модифицированныйNS1 сегмент, кодирующий NS1 белок, утративший функциональный домен связывания РНК и функциональный эффекторный домен, и гетерологичную последовательность, вставленную между донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга NS сегмента гена. Дополнительно изобретение охватывает применение вируса в качестве вектора для экспрессии различных белков, таких как хемокины, цитокины или антигенные структуры, способы получения вирусных частиц с применением указанного вирусного вектора, а также его применение для производства вакцин. Изобретение также охватывает составной белок, включающий часть N-конца NS1 белка и сигнальную последовательность, присоединенную к С-концу указанного NS1 белка.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: АВИР ГРИН ХИЛЗ БАЙОТЕКНОЛОДЖИ РИСЕРЧ ДИВЕЛОПМЕНТ ТРЕЙД АГ (AT) Настоящее изобретение относится к вирусу гриппа с нарушенной репликацией, включающему модифицированный NS1 сегмент, кодирующий NS1 белок, утративший функциональный домен связывания РНК и функциональный эффекторный домен, и гетерологичную последовательность, помещенную между донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга NS сегмента. Указанная гетерологичная последовательность может экспрессироваться с открытой рамкой считывания NS1 или с другой открытой рамкой считывания, отличной от открытой рамки считывания NS1. Дополнительно изобретение относится к терапевтическим средствам, содержащим указанный вирус гриппа с нарушенной репликацией, и его применению, а также к способу получения указанного вируса. Вирионы гриппа состоят из внутренней рибонуклеопротеиновой сердцевины (спиральный нуклеокапсид), содержащей одноцепочечную геномную РНК, и внешней липопротеиновой оболочки, выстланной изнутри матричным белком (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А и В состоит из восьми(из семи - в случае вируса гриппа С) линейных отрицательно заряженных одноцепочечных РНК, кодирующих одиннадцать (у некоторых штаммов вируса гриппа десять) полипептидов, включающих белки РНК-зависимой РНК-полимеразы (РВ 2, РВ 1 и РА) и нуклеопротеин (NP), образующий нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (M1, M2 или ВМ 2 для вируса В соответственно); два поверхностных гликопротеина, выступающие из оболочки, содержащей липид: гемагглютинин (НА) и нейраминидаза(NA); неструктурный белок (NS1) и белок ядерного экспорта (NEP). Вирус гриппа типа В кодирует такжеNB, мембранный белок, который может обладать активностью ионного канала, а большинство штаммов вирусов типа А кодируют также одиннадцатый белок (PB1-F2), обладающий, как считается, проапоптическими свойствами. Транскрипция и репликация генома происходит в ядре, и сборка происходит путем почкования на плазматической мембране. Вирусы могут обмениваться генами при смешанных инфекциях. Вирус гриппа присоединяется через НА к сиалилолигосахаридам гликопротеинов и гликолипидов клеточной мембраны. Вслед за эндоцитозом вирусной частицы происходит конформационное изменение молекулы НА внутри клеточной эндосомы, которое облегчает слияние мембран, запуская таким образом снятие вирусной оболочки. Нуклеокапсид перемещается в ядро, где происходит транскрипция вирусной мРНК. Вирусная мРНК транскрибируется и процессируется с помощью уникального механизма, при котором вирусная эндонуклеаза отщепляет модифицированный 5'-конец от клеточных гетерологичных мРНК, которые далее служат в качестве праймеров при транскрипции вирусных РНК матриц с помощью вирусной транскриптазы. Продукты транскрипции заканчиваются на уровне 15-22 оснований от концов соответствующих матриц, где последовательности олиго(U) действуют как сигналы для добавления участков поли(А). Из восьми молекул вирусной РНК вируса гриппа А, полученных таким образом, шесть являются моноцистронными, которые транслируются непосредственно с получением белков, представляющих собой НА, NA, NP и белки вирусных полимераз, РВ 2, РВ 1 и РА. Два другие продукта транскрипции подвергаются сплайсингу, в результате чего каждый дает две молекулы мРНК, которые транслируются с применением различных рамок считывания с получением белков M1, M2, NS1 и NEP. У большинства вирусов гриппа А сегмент 2 кодирует также второй белок (PB1-F2), который экспрессируется с применением перекрывающейся рамки считывания. Таким образом, восемь сегментов вирусных РНК кодируют одиннадцать белков: девять структурных и два неструктурных белка (NS1 и недавно идентифицированный PB1-F2). Применение вирусных векторов для доставки чужеродных белков и биологически активных молекул является заманчивым подходом в генной терапии для лечения рака и предотвращения инфекционных заболеваний. Вирусы гриппа особенно подходят в качестве потенциальных векторов для вакцин. В отличие от других векторов, таких как аденовирусы или ретровирусы, вирус гриппа не содержит ДНК интермедиата и не способен таким образом к интеграции в геном (хромосомы) хозяина. Имеется несколько вариантов изменения генома вируса гриппа в зависимости от поставленных задач и возможностей получения рекомбинантных вирусов. Эти стратегии включают вставку чужеродных белков в гликопротеины поверхности NA и НА (Muster T. et al., 1994, J. Virol., 68, 4031-4034; Percy N. et al., 1994, J. Virol., 68,4486-4492), создание дополнительных геномных фрагментов (Flick R. and Hobom G., 1999, Virology, 262,93-103; Watanabe T., et al., 2003, J. Virol., 77, 10575-10583) и изменение неструктурного NS1 белка (Ferko В. et al., 2001, J. Virol., 8899-8908; Takasuka N. et al., 2002, Vaccine, 20, 1579-1585). Вирусный белок NS1 обладает рядом преимуществ в качестве точки приложения генной инженерии, поскольку он, повидимому, не влияет на структуру вирионов, однако синтезируется в больших количествах в инфицированных клетках и выдерживает длинные вставки, вплоть до нескольких сотен нуклеотидов. Поскольку NS1 экспрессируется только внутриклеточно и менее открыт для взаимодействия с гуморальной частью иммунной системы, развитие иммунного ответа на NS1 белок или на белки, присоединенные к NS1, ограничено, в основном, индукцией CD8+ Т-клеток. Очевидно, что для индукции ответа В-клеток или экспрессии биологически активных молекул необходима эффективная доставка рекомбинантного белка к клеточной поверхности. Вакцинация в настоящее время рассматривается как наилучший способ защиты человека от гриппа. Ежегодные эпидемии гриппа среди людей (вызванные вирусами гриппа типа А или В) проявляются как высокоинфекционные острые респираторные заболевания с высокой заболеваемостью и значительной смертностью. Вакцинацию проводят с помощью имеющихся в продаже инактивированных химическим способом (убитых) или живых ослабленных вакцин против вируса гриппа. Концепция современных живых ослабленных вакцин основана на получении чувствительного к температуре ослабленного "исходного штамма" (master strain), адаптированного к росту при 25 С (адаптация к холоду). Живые адаптированные к холоду (СА) и инактивированные вирусные вакцины стимулируют иммунную систему различным образом, хотя в обоих случаях дефицит необходимой иммуногенности, особенно у престарелых больных,является одним из наиболее важных недостатков вакцинации от гриппа. Хотя живые СА вакцины от гриппа считаются достаточно безопасными, точный генетический и молекулярный механизмы их ослабления не вполне понятны. Считается, что природа безопасности СА вакцин от гриппа заключается в большом числе точечных мутаций, распределенных во внутренних сегментах гена. Однако только небольшое число картированных мутаций, находящихся в генах полимеразы,отвечает за ослабление вирусных СА штаммов, которые не способны к репликации при нормальной температуре тела (Herlocher M.L., Clavo А.С. and Maassab H.F., 1996, Virus, Res. 42:11-25; Herlocher M.L.H.F.et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6032-6036). Фактически, генетическая стабильность штаммов живой вакцины часто находится под вопросом, поскольку вирусы, повторно изолированные из вакцинированных хозяев, проявляют дополнительные точечные мутации, которые в конечном счете могут функционировать как "супрессоры" мутаций, приводя к усиленной репликации и возможной утрате чувствительного к температуре фенотипа у ревертантного вируса (Herlocher M.L.H.F. et al., 1993, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 90:6032-6036, Treanor J.M. et al., 1994, J. Virol. 68:7684-7688). В связи с потенциальным риском адаптированных к холоду живых ослабленных вакцин против вируса гриппа и ввиду низкой стабильности, часто сочетающейся с низкой скоростью экспрессии чужеродных белков в векторах вируса гриппа, по-прежнему имеется большая потребность в создании вектора на основе полностью ослабленного вируса гриппа, включающего клеточную и/или гуморальную иммуногенность и стабильно экспрессирующего большие количества чужеродных белков. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что вектор на основе вируса гриппа, разработанный согласно изобретению, удовлетворяет этим требованиям, т.е. представляет собой вектор вируса гриппа,обладающий высокой безопасностью благодаря полному ослаблению и демонстрирующий стабильную экспрессию чужеродных генов, включенных в вирусный вектор. Предпочтительно чужеродные гены проявляют высокую скорость экспрессии при размещении в вирусном векторе согласно изобретению. Хотя предпринимались различные попытки преодоления низкой генетической стабильности и низкой скорости экспрессии белков или пептидов в ослабленных вирусных векторах, ни одна из таких конструкций пока что не была достаточно эффективной.Kittel et al. (Virology, 2004, 324, 67-73) описывают вирус гриппа типа А, состоящий из NS1 размеров в 125 аминокислотных остатков (примерно половина размера NS1 белка дикого типа) и экспрессирующий зеленый флуоресцирующий белок (GFP) в той же рамке считывания, что и NS1, который реплицируется у нокаутных мышей PKR. В интерферонкомпетентных клетках вирус не проявляет стабильной экспрессии GFP, напротив, он утрачивает способность к генерации флуоресценции из-за появления различных делеций в последовательности GFP. Стратегия бицистронной экспрессии, основанная на вставке кассеты с перекрывающимися стоп- и старт-кодонами в NS ген для экспрессии GFP, раскрыта в Kittel et al. (2005, J. Virol., 79, 10672-10677). При наличии генетической стабильности уровень экспрессии GFP при такой рамке считывания был значительно ниже, чем полученный в случае вектора на базе вируса гриппа, экспрессирующего GFP с открытой рамкой считывания NS1 (Kittel et al. см выше).Ferko et al. описывают не вирус с нарушенной репликацией, а адаптированный к холоду вирус гриппа, экспрессирующий человеческий интерлейкин-2 (J. Virol., 2006, 11621-11627). Так, генетическую стабильность и безопасность адаптированного к холоду вируса следует поставить под вопрос из-за генетической структуры, приводящей к чувствительности к температуре (Herlocher M.L.H.F. et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1993, 90:6032-6036). Дополнительно уровни экспрессии IL-2 оказываются низкими. Настоящее изобретение относится к разработке вируса гриппа с нарушенной репликацией, включающего модифицированный сегмент NS, кодирующий белок NS1, утративший функциональный домен связывания РНК и функциональный эффекторный домен, и гетерологичную последовательность, помещенную между донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга NS1 сегмента гена. Согласно изобретению гетерологичная последовательность может экспрессироваться с рамкой считывания NS1 или с другой открытой рамкой считывания. Хотя патент WO 07/016715 описывает вирус гриппа, где NS ген (иногда называемый также NS1 геном) включает делеции и где вирус может применяться для экспрессии иммуностимуляторного цитокина, в патенте отсутствует раскрытие конкретного вектора вируса гриппа, который мог бы успешно экспрессировать чужеродные белки. В противоположность этому авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что гетерологичные последовательности, которые могут быть даже больше природного интрона, могут стабильно экспрессироваться на высоком уровне в NS сегмента, если они расположены между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, предоставленная эффективность сплайсинга регулируется согласно размеру вставки. Это не было ни показано, ни отмечено в WO 06/088481 и WO 01/64680. Согласно предпочтительному осуществлению изобретения функциональный донорный участок сплайсинга и акцепторный участок сплайсинга сегмента NS гена представляют собой природный участок сплайсинга. Согласно изобретению гетерологичные последовательности можно выбирать из последовательности любого биологически активного белка или пептида или антигенных структур. Антигенные пептиды или белки характеризуются наличием эпитопов, которые могут приводить к иммуномодуляторным активностям, таким как связывание антител или антителоподобных структур, или индукции клеточных иммунных ответов. Предпочтительно белки или пептиды выбирают из группы, состоящей из антигенов, предпочтительно бактериальных антигенов, таких как ESAT6, ростовых факторов, цитокинов, таких как интерлейкины, лимфокинов и хемокинов и их фрагментов или производных, более предпочтительно из Mycobacterium tuberculosis, GM-CSF, CCL-3, CCL-20, интерлейкина-2, интерлейкина-15 или их фрагментов или производных. Настоящее изобретение дополнительно относится к терапевтическим средствам, предпочтительно вакцинным средствам, содержащим указанные вирусы гриппа с нарушенной репликацией. Для примера,такие средства можно применять для предотвращения и лечения инфекционных заболеваний или рака. Дополнительно раскрыты способы получения вируса гриппа согласно изобретению путем трансфекции клеточных линий (например, Vero клеток, MDCK клеток и т.д.) и экспрессии вирусных частиц. Краткое описание фигур Фиг. 1(a-j) - нуклеотидные последовательности различных конструкций вектора:a) последовательность delNS1-IL-2-10 сегмента (SEQ ID No. 1),b) последовательность delNS1-IL-2-11 сегмента (SEQ ID No. 2),с) последовательность delNS1-IL-2-14 сегмента (SEQ ID No. 3),d) последовательность delNS1-IL-2-13 сегмента (SEQ ID No. 4),e) последовательность delNS1-IL-2-21 сегмента (SEQ ID No. 5),f) последовательность delNS1-IL-2-17 сегмента (SEQ ID No. 6),g) последовательность delNS1-IL-15-21 сегмента (SEQ ID No. 7),h) последовательность delNS1-GM-CSF-21 сегмента (SEQ ID No. 8),i) последовательность delNS1-CCL-3-21 сегмента (SEQ ID No. 9),j) последовательность delNS1-CCL-20-21 сегмента (SEQ ID No. 10),k) последовательность delNS1-ESAT-6s-21 сегмента (SEQ ID No. 67),l) последовательность delNS1-ESAT-6i-21 сегмента (SEQ ID No. 68),m) последовательность delNS1-IL-2-23 сегмента (SEQ ID No. 78),n) последовательность delNS1-IL-2-24 сегмента (SEQ ID No. 79); фиг. 2 - схематическое представление NS сегмента дикого типа вируса гриппа А и трех химерныхIL-2-NS сегментов delNS1-IL-2-10, delNS1-IL-2-11 и delNS1-IL-2-14; фиг. 3 - уровни человеческого IL-2 в супернатантах Vero клеток, инфицированных GHB-IL-2-10,GHB-IL-2-11 и GHB01; фиг. 4 - анализ с помощью ПЦР в реальном времени (RT-PCR) NS сегмента после пяти пассажей наVero клетках; фиг. 5 - уровни человеческого IL-2 в супернатантах Vero клеток, инфицированных GHB-IL-2-11,GHB-IL-2-13, GHB-IL-2-14 и GHB-IL-2-21; фиг. 6 - сплайсинг мРНК delNS1-IL-2 можно изменять путем модификации последовательности, окружающей донорный участок сплайсинга, или последовательности от 5' к акцепторному участку сплайсинга; фиг. 8 - схематическое представление конструкций для экспрессии IL-2. ORF (открытая рамка считывания) укороченного NS1 включает нуклеотиды 45-158; ORF человеческого IL-2 включает нуклеотиды 161-619; 5'-граница интрона находится между нуклеотидами 77 и 78; 3'-граница интрона находится между нуклеотидами 657 и 658; фиг. 9 - нуклеотидная последовательность delNS1-38IL-2 (SEQ ID No. 77). Изобретение представляет вирусы гриппа с нарушенной репликацией, включающие модифицированный NS сегмент, кодирующий NS1 белок, включающий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию между положениями 1-73, приводящую к полной утрате его функционального участка связывания РНК, и модификацию по меньшей мере одной аминокислоты между положением 74 и Сконцевым аминокислотным остатком, конкретно до положения 167, приводящую к полной утрате эффекторной функции, и гетерологичную последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, помещенным в NS сегменте гена. Предпочтительно вирус гриппа получен из вируса гриппа типа А, вируса гриппа типа В или вируса гриппа типа С. Векторы, основанные на или полученные из вирусов гриппа типа А или вирусов гриппа типа В, являются предпочтительными. Вирусы гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению можно применять в качестве вирусного вектора для иммунизации против любых патогенов или антигенных структур для индукции иммунного ответа против гетерологичных структур, экспрессируемых указанным вирусным вектором. Иммунный ответ может включать клеточный иммунный ответ и/или гуморальный иммунный ответ. Применяя гетерологичные последовательности, экспрессирующие иммуномодулирующие белки или пептиды,можно дополнительно укрепить иммунный ответ против вируса гриппа, что приводит к улучшенному составу для вакцины против гриппа. Это особенно относится к вакцинации престарелых лиц или лиц с подавленным иммунитетом. Вирус, выбранный для применения согласно изобретению, включает модифицированный NS ген,что приводит к ослабленному вирусу гриппа, т.е. вирусу, который является инфекционным и может реплицироваться in vivo в интерферондефицитных клетках или клеточных системах, но не может реплицироваться в интерферонкомпетентных клетках. Согласно изобретению термин "нарушенная репликация" определяется как скорость репликации в интерферонкомпетентных клетках хозяина, составляющая по меньшей мере менее 5%, предпочтительно менее 1%, предпочтительно менее 0,1% таковой у дикого типа вируса гриппа, как определено с помощью метода гемагглютинации, TCID50 метода или анализа бляшкообразования, хорошо известных в данной области техники. Сегмент NS гена согласно изобретению должен содержать функциональный донорный участок сплайсинга и функциональный акцепторный участок сплайсинга. Согласно конкретному осуществлению изобретения сегменты генов вируса гриппа можно получать из различных штаммов вируса гриппа, пандемических или интерпандемических (циркулирующих между пандемиями). Это может приводить к появлению вирусов гриппа, претерпевших генный обмен (реассортацию), которые сочетают гены поверхностных гликопротеинов гемагглютинина (НА) и/или нейраминидазы (NA) существующих интерпандемических вирусов с пятью, шестью или семью сегментами РНК,кодирующими другие белки из ослабленного исходного штамма (сочетание 6/2) или реассортанты (продукты реассортации) 7/1, или реассортанты 5/3, содержащие НА, NA и М сегменты циркулирующего штамма соответственно. Авторы изобретения применяют обратную генетическую систему на Vero клетках для получения реассортантов и/или экспрессии модифицированных штаммов вируса гриппа. Этот подход уже хорошо известен в данной области техники (Pleschka S. et al., 1996, J. Virol., 70(6), 4188-4192, Neumann andKawaoka, 1999, Adv. Virus Res., 53, 265-300, Hoffmann et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:6108-13). Альтернативно для получения реассортантов можно применять подход, основанный на RNPs, как описано Enami and Enami (J. Virol., 2000, 74, 12, 5556-5561). Белок NS1 вируса гриппа типа А является многофункциональным белком, состоящим приблизительно из 230 аминокислотных остатков, и синтезируется на ранней стадии инфекции и в большом количестве. Он противодействует клеточным антивирусным активностям и является фактором вирулентности. Активность С-концевого района NS1 белка проявляется в ингибировании механизма процессинга мРНК хозяина. Во-вторых, NS1 белок облегчает предпочтительную трансляцию вирусной мРНК путем прямого взаимодействия с клеточным фактором инициации трансляции. В-третьих, путем связывания сdsPHK и взаимодействия с предполагаемой клеточной киназой(ами) NS1 белок способен предотвращать активацию индуцируемой интерфероном (INF) dsPHK-активируемой киназы (PKR), 2'5'олигоаденилатсинтазной системы и факторов транскрипции цитокина. В-четвертых, N-концевая частьNS1 связывается с RIG-1 и ингибирует последующую активацию IRF-3, предотвращая транскрипционную индукцию INF-. Поэтому NS1 белок ингибирует экспрессию генов INF- или INF-, задерживает развитие апоптоза в инфицированных клетках и предотвращает развитие антивирусного состояния в соседних клетках. Вирусы гриппа, содержащие модификации в NS1 белке, известны в данной области техники. Например, WO 99/64571 описывает полный нокаут сегмента NS гена. WO 99/64068 описывает частичные делеции различных сегментов NS гена, но ни одна из описанных модификаций не раскрывает вектор вируса гриппа согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению модификация NS1 белка может быть делецией, вставкой или заменой по меньшей мере одной аминокислоты, приводящей к вирусу гриппа с нарушенной репликацией. Предпочтительно модифицированный NS1 белок включает делецию по меньшей мере 50% аминокислотных остатков NS1, предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 90%. Альтернативно функциональность NS1 белка может быть полностью подавлена.NS1 белок вектора вируса гриппа согласно настоящему изобретению лишен функционального домена связывания РНК. Первичная функция этого домена, связанная с N-концом NS1 белка (аминокислотные остатки 1-73, аминокислотная последовательность дикого типа прилагается как SEQ ID No. 80),представляет собой связывание dsPHK и ингибирование 2'3'олиго(А)-синтазы/РНКазы L пути (Min J. etal., Proc. Natl. Acad. Sci., 2006, 103, 7100-7105, Chien et al., Biochemistry. 2004 Feb. 24; 43(7):1950-62), а также активацию цитоплазматической РНК-хеликазы, RIG-1, индуцируемого ретиноевой кислотой белкаI (Yoneyama M. et al., Nat. Immunol., 2004, 5, 730-737). Утрата функционального домена связывания РНК определяется согласно настоящему изобретению как полное отсутствие способности связывать dsPHK, в результате чего вирус гриппа не может реплицироваться в интерферон-компетентных клетках. Согласно изобретению эффекторный домен NS1 белка вектора вируса гриппа является нефункциональным. Эффекторный домен взаимодействует с клеточными белками для ингибирования выхода мРНК из ядра. Эффекторный домен расположен в С-концевой части NS1 белка. Согласно Schultz et al., эффекторный домен конкретно расположен между аминокислотными остатками 117 и 161, другие источники располагают эффекторный домен между остатками 134 и 161. Эффекторный домен NS1 может быть изъят полностью или частично, а также аминокислотные остатки могут быть заменены или вставлены и функциональность полученного эффекторного домена можно тестировать, как описано в данной области техники (Schultz-Cherry et al., J. Virol., 2001, 7875-7881). Согласно изобретению С-концевые аминокислотные остатки, имеющие отношение к активности связывания эффектора, модифицируют с целью ингибирования эффекторной функции. Конкретно модифицируют аминокислотные остатки в положениях 74-230, более конкретно в положениях 116-161, более конкретно в положениях 134-161. Согласно предпочтительному осуществлению модификация представляет собой делецию указанных аминокислотных остатков. Гетерологичная последовательность согласно настоящему изобретению может быть любой последовательностью любого биологически активного белка, или пептида, или антигенной структуры. Например, антигенные структуры могут быть белками или углеводными структурами, которые могут узнаваться иммунной системой, т.е. антитела или подобные антителам структуры могут связываться с такими структурами. Эти структуры эпитопа могут содержать сигнальные пептиды или могут быть непосредственно связаны с модифицированным NS1 белком. Например, чужеродный эпитоп можно получить из других патогенов, из связанных с опухолями антигенов или ретровирусных эпитопов, экспрессируемых на поверхности опухолевых клеток. Углеводные антигены часто обладают весьма слабой иммуногенностью. Их иммуногенность можно улучшить путем конъюгации углевода с белковым носителем. Белки или пептиды также можно присоединять к последовательностям трансмембранного домена,предпочтительно содержащим участки (цепочки) гидрофобных аминокислот или другим лидерным последовательностям, как известно, необходимым для переноса белка/пептида через барьер клеточной мембраны. Трансмембранный домен обычно означает одиночную трансмембранную -спираль трансмембранного белка. В мембране -спираль может быть собрана независимо от остального белка сходно с доменами водорастворимых белков. Трансмембранный домен может быть любой трехмерной белковой структурой, которая термодинамически стабильна в мембране. Это может быть одиночная -спираль,стабильный комплекс из нескольких трансмембранных -спиралей, трансмембранная -структура (бочонок), -спираль грамицидина А или любая другая структура. Трансмембранные спирали обычно характеризуются длиной примерно в 20 аминокислотных остатков, хотя они могут быть гораздо длиннее или короче. Например, это могут быть НА трансмембранные последовательности или любые другие известные вирусные трансмембранные домены. Биологически активный белок согласно настоящему изобретению может включать сигнальный пептид. Сигнальный пептид может быть любой сигнальной последовательностью, встречающейся в природе или синтетической. Например, он может быть природной сигнальной последовательностью гетерологичной последовательности. Альтернативно он также может быть получен из антитела, предпочтительно из-цепи иммуноглобулина (IgK), более предпочтительно из сигнального пептида -цепи иммуноглобулина. Предпочтительно -цепь иммуноглобулина получают из мышиной -цепи иммуноглобулина. Согласно предпочтительному осуществлению изобретения гетерологичная последовательность экспрессирует цитокины или хемокины или их фрагменты или производные. Цитокины представляют собой малые секретируемые белки, опосредующие и регулирующие иммунитет, воспаление и гематопоэз. Самую обширную группу цитокинов представляют те, которые способствуют пролиферации и дифференциации иммунных клеток. В состав этой группы входят интерлейкины, которые являются цитокинами, производимыми лейкоцитами, и интерфероны, которые могут продуцироваться различными типами клеток. Интерфероны (INF) представляют собой семейство природных гликопротеинов, продуцируемых клетками иммунной системы позвоночных, включая млекопитающих, птиц, рептилий и рыб, в ответ на введение таких агентов, как бактерии, вирусы, паразиты и опухолевые клетки. У людей наличествуют три основных класса интерферонов. Тип I интерферонов включает 14 подтипов INF- и одиночные изоформы интерферонов INF-, -, - и -. Интерфероны типа II состоят из INF-, а недавно открытый третий класс интерферонов состоит из INF-, в трех разных изоформах.Th1 клетки синтезируют в основном IL-2, INF- и TNF-, тогда как Th2 клетки, относящиеся к гуморальным иммунным ответам, секретируют цитокины, такие как IL-4, IL-5 и IL-10. Цитокины Th2 типа опосредуют гиперчувствительные ответы замедленного типа на внутриклеточные патогены и ингибируют Th1 ответы. Хемокины, исходно полученные из цитокинов хемоаттрактантов, реально включают более 50 чле-5 018174 нов и представляют семейство небольших индуцибельных и секретируемых белков с низким молекулярным весом (6-12 кДа в мономерной форме), которые играют решающую роль в процессах иммунного надзора и воспаления. В зависимости от их функции в иммунитете и воспалении их можно разделить на два класса. Воспалительные хемокины продуцируются клетками большого числа разных тканей, а также иммигрирующими лейкоцитами в ответ на бактериальные токсины и воспалительные цитокины типа IL1, TNF и интерфероны. Их основной функцией является вовлечение лейкоцитов в защитный ответ хозяина и в процесс воспаления. Направляющие (homing) хемокины, с другой стороны, экспрессируются конститутивно в определенных областях лимфоидной ткани. Они направляют движение и перемещение к месту назначения лимфоцитов и дендритных клеток в иммунной системе. Эти хемокины, как проиллюстрировано с помощью ВСА-1, SDF-1 или SLC, контролируют перемещение и рециркуляцию лимфоцитов при созревании, дифференциации, активации и обеспечивают их правильное размещение во вторичных лимфоидных органах. Согласно настоящему изобретению показано, что биологически активные цитокины, или хемокины,или их фрагменты или производные могут стабильно и эффективно экспрессироваться с применением открытой рамки считывания, отличной от ORF, применяемой при экспрессии NS1 белка. Альтернативно к цитокинам или хемокинам можно присоединять дополнительные лидерные последовательности, отличные от природных сигнальных пептидов, которые могут дополнительно поддерживать эффективную секрецию белка и демонстрировать высокоэффективную индукцию иммунного ответа in vivo. Оказалось, что хемокины и цитокины могут также эффективно экспрессироваться, когда аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому цитокину/хемокину, присоединена к части NS1 белка через аминокислотную последовательность, выступающую в роли сигнального пептида. Например,это может быть часть сигнального пептида мышиного IgK. Согласно настоящему изобретению гетерологичная последовательность предпочтительно кодирует интерлейкин-2 (IL-2), или его фрагмент, или производное. IL-2 включает последовательность секреторного сигнала и представляет собой иммуномодуляторную молекулу, продуцируемую Т-клетками, необходимую для экспансии клона активированных антигеном Т-клеток. Секреция IL-2 CD4+ T-лимфоцитами оказывает множественные биологические воздействия, такие как индукция пролиферации Т-хелперных клеток и Т-киллерных клеток и стимуляция Т-клеток для продукции других цитокинов. ДополнительноIL-2 может также активировать В-клетки, NK-клетки и макрофаги. Когда IL-2 экспрессируется при участии рекомбинантных вирусов, инфицировавших нелимфоидные клетки, его секреция может значительно понижать патогенность вирусной инфекции и модифицировать иммунный ответ. Известно также, чтоIL-2 действует в качестве иммунного вспомогательного вещества. Согласно настоящему изобретению включен любой фрагмент или производное цитокинов и хемокинов, которые еще сохраняют биологическую активность, т.е. проявляют иммуномодуляторные активности. Альтернативно цитокины/хемокины можно также выбирать из группы, состоящей из IL-15, GMCSF, CCL3 или CCL20 или их фрагментов или производных. Альтернативно он может быть любым эпитопом или иммуномодуляторным районом, полученным из Mycobacterium tuberculosum, например ESAT-6. Альтернативно гетерологичные последовательности могут также включать химерные белки, являющиеся цитокинами или хемокинами или их фрагментами или производными, присоединенными к антигенным белкам или антигенным пептидам. Присоединение может быть непосредственным или через последовательности пептидных линкеров длиной по меньшей мере из 4 аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере из 5 аминокислотных остатков. Например, последовательности линкеров согласно изобретению представляют собой GGGS или GGGGS. Примеры химерных белков с IL-2 известны в данной области техники. Например, это может бытьIL-2-PE40 (где РЕ является экзотоксином А из Pseudomonas), DAB389-IL-2 (где DAB является дифтерийным токсином) или IL-2 Вах (где Вах является проапоптическим белком человеческого происхождения)(Aqeilan R. et al., Biochem. J., 2003, 129-140). Согласно настоящему изобретению нуклеотидные последовательности гетерологичных последовательностей, внесенные в вирус гриппа с нарушенной репликацией, демонстрируют по меньшей мере 80% идентичности со своими природными последовательностями, предпочтительно по меньшей мере 85% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичности. Любая оптимизация нуклеотидной последовательности с точки зрения употребления кодонов при этом включена. Альтернативно гетерологичная последовательность может включать эпитопы Т-клеток или Вклеток, например эпитоп В-клеток из гемагглютинина гриппа (НАТВ), например эпитоп А-петли гемагглютинина вируса гриппа (НА) или их части или пептиды, представляющие один из иммунодоминантных эпитопов НА, соответствующих аминокислотной последовательности 150-159 (Caton et al., 1982, Cell.,417-427). Эпитоп может быть также получен из связанного с меланомой эндогенного ретровируса(MERV), как описано в WO 06/119527. Это может быть эпитоп, полученный из gag, pol или env белка вируса, предпочтительно из env белка. Предпочтительно это может быть один из следующих пептидов: Согласно альтернативному осуществлению изобретения гетерологичная последовательность экспрессируется с открытой рамкой считывания (ORF), отличной от ORF NS1. Другой способ получения второй ORF состоит во включении элемента внутреннего участка посадки рибосомы (Garsia-Sastre A. etal., 1999, J. Virol., 75, 9029-9036) или удвоения последовательностей промоторов вируса гриппа (MachadoA. et al., 2003, Virology, 313, 235-249). Согласно настоящему изобретению впервые показано, что даже если первые приблизительно 12 аминокислотных остатков NS1 белка все еще присутствуют, секреция гетерологичной последовательности не запрещена. Поэтому согласно настоящему изобретению вирусный вектор может содержать по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, предпочтительно до 30 аминокислотных остатков, предпочтительно до 20 аминокислотных остатков, предпочтительно до 14 аминокислотных остатков на N-конце NS1 белка и сигнальный пептид или его часть, присоединенный к С-концу NS1 белка. С-концевая сигнальная последовательность предпочтительно присутствует в том случае, когда NS1 белок содержит не более 30 аминокислотных остатков на N-конце. Применяя эту конкретную конструкцию, т.е. составной белок, включающий сигнальный пептид или его часть и указанные аминокислотные остатки N-конца NS1 белка, можно функционально модифицировать получаемый таким образом NS1 белок, чтобы он действовал в качестве сигнального пептида. Экспрессия гетерологичных последовательностей с помощью указанных составных пептидов может увеличить секреторные характеристики указанных гетерологичных последовательностей. Согласно предпочтительному осуществлению настоящего изобретения трансляция NS1 белка завершается с помощью по меньшей мере одного стоп-кодона и экспрессия указанной гетерологичной последовательности инициируется с помощью старт-кодона. Например, стоп- и старт-кассету с последовательностью UAAUG (SEQ ID No. 53) можно вставить в кодирующую последовательность NS гена вируса гриппа с последующей вставкой гетерологичной последовательности. Из-за краткости последовательности стоп- и старт-кодонов и ограниченной способности вируса экспрессировать вставки с длинными последовательностями при непосредственном присоединении к NS или посттрансляционном отщеплении от NS1, стоп- и старт-системы обладают большими преимуществами по сравнению со вставкой длинных последовательностей, например элемента внутреннего участка посадки рибосомы. Стоп- и старт-кодоны можно вставлять по любому положению внутри NS гена между донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга без модификации нуклеотидных последовательностей функциональных участков сплайсинга. В альтернативном осуществлении стоп- и старт-кодоны вставляют в такое положение, при котором экспрессируются по меньшей мере 4 нуклеотида, более предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов (более предпочтительно по меньшей мере 8 нуклеотидов, расположенных ниже) 5'-донорного участ-7 018174 ка сплайсинга NS гена. 5' и 3' границы NS интрона определены как точка разрыва между первым экзоном и интроном и точка разрыва между интроном и вторым экзоном. В случае вируса гриппа типа А вставка старт- и/или стоп-кодона может находиться в любом положении внутри NS1 гена так, чтобы экспрессировались по меньшей мере 10 N-концевых аминокислотных остатков NS1 белка, альтернативно, чтобы экспрессировались по меньшей мере 12 N-концевых аминокислотных остатков NS1 белка. Альтернативно открытая рамка считывания гетерологичной последовательности может также, по меньшей мере, частично перекрываться с открытой рамкой считывания NS1. В осуществлении изобретения трансляция с рамкой считывания гетерологичной последовательности инициируется с помощью оптимизированной последовательности инициации трансляции, предпочтительно последовательность инициации трансляции является консенсусной последовательностью Козак(Kozak M., Nucleic Acid Research, 1984, 12, 857-872). Эта консенсусная последовательность может включать по меньшей мере часть последовательности CCRGCCAUGG, где R может быть А или G (SEQ IDNo. 54). Положения -3 (т.е. на 3 нуклеотида выше ATG кодона) и +4 оказывают сильнейшее влияние на трансляцию (Kozak M., Nucleic Acid Research, 1987, 15, 8125-8148). Так, консенсусной последовательностью может также быть RXXAUGG, XXAUGG или RXXAUG. Дополнительно согласно настоящему изобретению NS сегмент гена содержит функциональный донорный и/или акцепторный участок сплайсинга. Согласно изобретению донорный участок сплайсинга и акцепторный участок сплайсинга NS гена состоят из двух нуклеотидов 3'-5' границы интрона и двух нуклеотидов 5'-3' границы интрона. Гомологию U1 snPHK или пиримидиновой цепочке также можно протестировать и изменить для улучшения функциональных участков сплайсинга. Согласно конкретному осуществлению NS сегмент гена содержит функциональные природные донорный и акцепторный участки сплайсинга, т.е. донорный и акцепторный участки сплайсинга сохранены в виде природных участков, т.е. нуклеотиды не модифицированы с помощью искусственных подходов. Любые модификации нуклеотидов на участках сплайсинга, происходящие в естественных условиях благодаря модификациям вируса гриппа, основанным на приспособлении к окружающей среде или развитии природных штаммов, являются естественными модификациями и не входят в определение синтетических или искусственных модификаций. Альтернативно последовательности, окружающие донорный участок сплайсинга и/или выше акцепторного участка, можно изменять. Предпочтительно изменение или модификацию можно проводить в пределах 3 нуклеотидов от 5' и/или 8 нуклеотидов от 3' до 5' границы NS интрона, а также 100 нуклеотидов от 5' и/или 2 нуклеотидов от 3' до 5' границы NS интрона. Это осуществляется предпочтительно путем введения синтетических последовательностей для модификации активности сплайсинга. Если при этом гетерологичная последовательность увеличивает размер NS интрона, может быть предпочтительным модифицировать последовательности, окружающие донорный и/или акцепторный участки сплайсинга для увеличения эффективности сплайсинга и таким образом генетической стабильности рекомбинантного NS сегмента. Например, модификация может быть такой, что изменяется последовательность, окружающая донорный участок сплайсинга для увеличения гомологии с 5'-концом U1 snPHK человека и/или последовательностью выше акцепторного участка сплайсинга, содержащая точку разветвления (Plotch et al., 1986,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5444-8; Nemeroff et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:962-70) и пиримидиновая цепочка заменяется последовательностью, усиливающей сплайсинг NS сегмента. Например, последовательность, окружающую 5'-участок сплайсинга, можно изменить сCAG/GTAGATTG (как обнаружено в PR8 NS сегмента, SEQ ID No. 55) на CAG/GTAAGTAT (нуклеотиды, комплементарные 5'-концу U1 snPHK человека, показаны жирным курсивом, донорный участок сплайсинга отмечен косой чертой /, SEQ ID No. 56). Для оптимизации сплайсинга предпочтительная вставленная последовательность,у 5'-акцепторного участка сплайсинга включает петлеобразную (lariat) консенсусную последовательность и пиримидиновую цепочку. Например, последовательность выше синтетического акцепторного участка сплайсинга может быть следующей:TACTAACCTTCTTCTCTTTCTTCTCCTGACAG/ (SEQ ID No. 57). Петлеобразная консенсусная последовательность подчеркнута, пиримидиновая цепочка показана жирным шрифтом, 3' граница интрона отмечена косой чертой /. Для стабильности вирусного вектора и скорости экспрессии гетерологичной последовательности может быть важным ввести синтетическую/модифицированную последовательность, содержащую петлеобразную консенсусную последовательность и пиримидиновую цепочку в конкретное положение внутри NS гена, например непосредственно выше акцепторного участка сплайсинга. Дополнительно может быть необходимым варьировать расстояние между петлеобразной консенсусной последовательностью и пиримидиновой цепочкой для модификации скорости сплайсинга NS сегмента (Plotch S. and Krug R., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5444-8; Nemeroff M. et al., 1992, Mol.Cell. Biol., 962-970). В предпочтительном осуществлении вирус гриппа с нарушенной репликацией согласно изобрете-8 018174 нию включает нуклеотидную последовательность, как показано на фиг. 1(a-j), или по меньшей мере на 96% гомологичную последовательность, альтернативно по меньшей мере на 98% гомологичную. В дополнительном осуществлении заявляется также комбинация по меньшей мере двух вирусов гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению, включающих по меньшей мере одну биологически активную молекулу или ее производное или фрагмент и по меньшей мере одну антигенную структуру. Такая комбинация, включающая разные гетерологичные последовательности, может давать преимущества в плане дополнительного повышения гуморальной, а также клеточной иммуногенности. Например, один из векторов может содержать цитокин, или его фрагмент, или производное, как IL-2, и второй вирусный вектор может содержать антигенный пептид или полипептид. Альтернативно гетерологичные последовательности могут также включать составные белки, в которых цитокины, или хемокины, или их фрагменты или производные присоединены к антигенным белкам или антигенным пептидам или связаны непосредственно или через последовательность линкера с производным NS1 белка. Настоящее изобретение охватывает сигнальный пептид, включающий часть N-концевых аминокислотных остатков NS1 белка, например 10-12 аминокислотных остатков с N-конца NS1 белка, и сигнальный пептид или его часть, присоединенные к С-концу указанного NS1 белка. Указанный сигнальный пептид может состоять из 8-30, предпочтительно до 50 аминокислотных остатков. Сигнальную последовательность можно получать из легкой цепи антитела, предпочтительно из IgK цепочки, более предпочтительно из мышиной IgK цепочки. Согласно альтернативному осуществлениюIgK цепь может включать по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков, например включать последовательностьMETDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID. No. 11) или METDTLLLWVLLLWVPRSHG (SEQ ID No. 82) или их части. Состав вакцины, включающей вектор вируса гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению, также охвачен изобретением. Согласно изобретению вирус гриппа с нарушенной репликацией можно применять для получения лекарственного средства для терапевтического применения у больных, например, для лечения инфекционных заболеваний или рака. Способы введения включают, не ограничиваются этим, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, интраназальный, эпидуральный или оральный пути. Введение через нос предпочтительнее. В предпочтительном осуществлении может быть желательно вводить лекарственное средство в легкие любым подходящим способом. Пульмонарное введение можно также осуществлять с помощью,например, ингалятора или небулайзера или смешивать лекарственное средство с аэрозольным агентом. Фармацевтическую смесь можно также доставлять с помощью системы с контролируемым высвобождением, например, насоса. Лекарственное средство согласно настоящему изобретению может включать терапевтически эффективное количество вируса с нарушенной репликацией и фармацевтически приемлемый носитель."Фармацевтически приемлемый" означает одобренный уполномоченными инстанциями, такими как FDA или ЕМЕА. Термин "носитель" относится к растворителю, вспомогательному средству, наполнителю или средству доставки, вместе с которыми вводят лекарственное средство. Можно применять физиологические растворы, растворы декстрозы и глицерина в качестве жидких носителей или вспомогательные вещества, такие как глюкоза, лактоза, сахароза или любые другие вспомогательные вещества, известные в данной области техники как применимые в фармацевтических смесях. Дополнительно можно включать стабилизирующие агенты для увеличения срока годности лекарственного средства. Предпочтительно предоставляется готовый к употреблению раствор для инфузий. Альтернативно лекарственное средство можно готовить в виде порошка, который растворяют в подходящем водном растворе непосредственно перед введением. Количество фармацевтической композиции согласно изобретению, эффективное для лечения конкретного нарушения или состояния, будет зависеть от природы нарушения или состояния и может определяться с помощью стандартных клинических подходов. Дополнительно при необходимости можно применять анализы in vitro для помощи при определении границ оптимальной дозы. Точная доза, включенная в состав, также будет зависеть от пути введения и серьезности заболевания или нарушения и должна быть установлена в соответствии с решением практикующего врача и состоянием каждого пациента. Однако подходящие интервалы дозировок для введения обычно составляют примерно 104-5107 pfu(единиц бляшкообразования) и могут вводиться однократно или несколько раз с интервалами по необходимости. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, включающие 104-5107 pfu мутантного вируса с нарушенной репликацией можно вводить интраназально, внутримышечно или подкожно. Эффективные дозы можно определять экстраполяцией по кривым зависимости ответа от дозы,полученным in vitro или в моделях тестирования на животных. Дополнительно изобретение охватывает вектор, включающий нуклеотидную последовательность,-9 018174 кодирующую вирус гриппа с нарушенной репликацией, согласно настоящему изобретению. Если применяется ДНК вектор, указанный вектор является системой транскрипции для антисмысловой вирусной РНК. Например, это может быть вектор, примененный Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 97:6108-13. Альтернативно можно применять РНК, включающую последовательность,кодирующую вирус с нарушенной репликацией согласно изобретению. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению, включающий следующие этапы: трансфекция клеток,предпочтительно Vero клеток, по меньшей мере одним вектором, включающим последовательность вируса согласно изобретению, инкубацию трансфицированных клеток для обеспечения развития потомства вируса, содержащего гетерологичный белок, также, естественно, охвачен областью притязаний изобретения. Альтернативно предоставляется также способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией,включающий следующие этапы: трансформация клеток, предпочтительно Vero клеток, вектором, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую вирус гриппа с нарушенной репликацией согласно изобретению предпочтительно вместе с очищенным препаратом RNP комплекса вируса гриппа,инфицирование выбранных клеток вспомогательным вирусом гриппа, инкубация инфицированных клеток для обеспечения развития потомства вируса и отбор трансформированных клеток, экспрессирующих модифицированный NS ген и гетерологичную последовательность. Вышеприведенное описание понятно в большей полноте с помощью нижеследующих примеров. Такие примеры, однако, являются только представительными для практического проведения одного или более осуществлений и их не следует рассматривать как ограничивающие область притязаний изобретения. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Пример 1. Экспрессия человеческого интерлейкина-2 с помощью отдельной открытой рамки считывания. Последовательность сДНК, кодирующую человеческий IL-2, вставляют в модифицированный NS сегмент вируса гриппа типа А штамма Puerto Rico/8/34, который не кодирует функциональный NS1 белок. NS1 белок оканчивается после аминокислотного остатка 21 с помощью искусственно вставленного стоп-кодона и не содержит ни домена связывания РНК, ни эффекторного домена. Для обеспечения трансляции IL-2 искусственно вставленный стоп-кодон для NS белка перекрывается со старт-кодоном для IL-2 с образованием последовательности TAATG (SEQ ID No. 81). Получены две конструкции (см. фиг. 2). В обеих конструкциях (delNS1-IL-2-10 и delNS1-IL-2-11) сДНК IL-2, включающая перекрывающийся стоп- и/или старт-кодон, заменяет нуклеотиды 90-345 дикого типа NS сегмента, соответствующие аминокислотным остаткам 22-106 NS1 белка. Конструкция delNS1-IL-2-10 таким образом включает природный акцепторный участок сплайсинга,природную точку разветвления на 20 нуклеотидов выше акцепторного участка сплайсинга (Plotch et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5444-8; Nemeroff et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12:962-70), а также природную пиримидиновую цепочку из 11 нуклеотидов дикого типа NS сегмента. Петлеобразная консенсусная последовательность (CTRAY или YNYYRAY), обнаруживаемая на 72 нуклеотида выше 3' участка сплайсинга в NS сегменте дикого типа, также присутствует в сегменте delNS1-IL-2-10. Дополнительно в сегменте delNS1-IL-2-11 синтетическая последовательность из 29 нуклеотидов,включающая петлеобразную консенсусную последовательность и следующую за ней пиримидиновую цепочку, заменяет нуклеотиды 361-525 NS сегмента дикого типа, соответствующие аминокислотным остаткам 112-166 NS1 белка. Таким образом, природная точка разветвления, пиримидиновая цепочка, а также петлеобразная консенсусная последовательность, находящиеся на 72 основания выше 3' участка сплайсинга в сегменте NS заменены. Дополнительно в обоих химерных IL-2 NS сегментах последовательность ниже 5' границы интрона изменена для достижения 100% комплементарности с 5'-концом человеческой snPHK U1 (т.е./GTAGATTG, находящаяся в NS сегменте дикого типа, заменена на GTAAGTAT). Дополнительно метионин, присутствующий в случае альтернативной рамки считывания в положении 76 NS сегмента дикого типа, заменен на валин. Таким образом, аминокислотная последовательность укороченного NS1 белка следующая:MDPNTVSSFQVSIFLWRVRKR (буквы, показанные жирным шрифтом с подчеркиванием, отмечают изменения по сравнению с последовательностью дикого типа (SEQ ID No. 59). Описание delNS1-IL-2-10 сегмента, как приведено на фиг. 1a: ORF состоит из укороченного NS1,т.е. нуклеотидов 27-92, ORF человеческого IL-2 состоит из нуклеотидов 92-553; 5' граница интрона находится между нуклеотидами 56 и 57; 3' граница интрона находится между нуклеотидами 739 и 740 (SEQID No. 1). Описание delNS1-IL-2-11 сегмента, как приведено на фиг. 1b: ORF укороченного NS1 состоит из нуклеотидов 27-92, ORF человеческого IL-2 состоит из нуклеотидов 92-553; донорный участок сплайсинга находится между нуклеотидами 56 и 57; акцепторный участок сплайсинга находится между нуклеотидами 603 и 604 (SEQ ID No. 2). Конструкция плазмид В качестве основы для создания химерной конструкции из человеческого IL-2 и NS сегмента применяют плазмиду pKW2000. pKW2000 получают путем делеции CMV промотора в pHW2000 (Hoffman etal., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6108-13). Так, при трансфекции происходит транскрипция толькоvPHK с производных pKW2000. Сегменты delNS1-IL-2-10 и delNS1-IL-2-11 получают с помощью стандартных способов ПЦР и клонируют в pKW2000 с получением плазмид pKW-delNS1-IL-2-10 и pKW-delNS1-IL-2-11 соответственно. Аналогичным образом создают производные pKW2000, содержащие PR8 delNS сегмент (Garsia-Sastre etPA, PB1, PB2, HA, NA, M и NP сегменты, полученные из адаптированного к Vero клеткам штамма вируса гриппа A H1N1 (GHB01), клонируют в pHW2000. Все плазмиды секвенируют для подтверждения отсутствия нежелательных мутаций. Получение вирусовVero клетки поддерживают на среде DMEM/F12, содержащей 10% сыворотки плода коровы и 1%Glutamax-1 при 37 С. Для получения вируса применяют семь производных pKW2000, содержащих сегменты PA, PB1,РВ 2, НА, NA, М и NP, полученные из GHB01, а также две плазмиды для экспрессии белка, кодирующиеPR8 NS1 белок вируса гриппа A (pCAGGS-NS1(SAM); (Salvatore et al., 2002, J. Virol., 76:1206-12) и NEP(pcDNA-NEP), применяют вместе с pKW-delNS-IL-2-10, pKW-delNS-IL-2-1 или pKW-delNS1 для совместной трансфекции Vero клеток. Вслед за трансфекцией для поддержания репликации вируса Vero клетки культивируют в среде без сыворотки (Opti-Pro; Invitrogen) в присутствии 5 мкг/мл трипсина. Через три дня после трансфекции наблюдается 50-100% СРЕ и высвобожденные вирусы замораживают или дополнительно амплифицируют в Vero клетках. Дополнительно вирусы, экспрессирующие химерный IL-2,однократно очищают по способу бляшкообразования. После амплификации в Vero клетках несколько бляшек замораживают для дальнейшего анализа. Полученные вирусы обозначают GHB-IL-2-10, GHB-IL-2-11 и GHB01. Анализ экспрессии интерлейкина-2Vero клетки инфицируют при множественности инфекции 0,1 GHB-delNS1, GHB-IL-2-10 или GHBIL-2-11 и инкубируют в течение 16 ч при 37 С на среде без сыворотки в присутствии 1 мкг/мл трипсина. Затем добавляют сыворотку плода коровы (конечная концентрация 10%) и ингибитор трипсина из соевых бобов (конечная концентрация 100 мкг/мл) и продолжают инкубацию при 37 С в течение еще 24 ч. Супернатанты анализируют на наличие секреции IL-2 с помощью ELISA. Показано, что экспрессия IL-2 примерно в 5 раз выше в случае вируса GHB-IL-2-10 по сравнению с вирусом GHB-IL-2-11 (см. фиг. 3). Как и ожидалось, IL-2 не детектируется в супернатантах культур, инфицированных вирусом GHB01, лишенным сДНК IL-2. Уровень экспрессии человеческого IL-2 в Vero клетках составляет приблизительно 2600 пг/мл в случае GHB-IL-2-10 и примерно 500 пг/мл в случае GHB-IL-2-11. В отличие от этого уровень экспрессии, известный в данной области техники, составляет 250-350 пг/мл (Kittel et al., 2005, см.выше). Анализ стабильности вирусов Вирусы с химерными IL-2, полученные непосредственно после трансфекции или после одного цикла очистки по способу бляшкообразования, последовательно пассируют пять раз на Vero клетках. РНК экстрагируют с применением набора ViralAmp (Qiagen) и подвергают обратной транскрипции. Целые NS сегменты амиплифицируют с помощью ПЦР и подвергают электрофорезу в агарозном геле для оценки присутствия делеций. Как показано на фиг. 4, полоски результатов делеций обнаружены для всех образцов вирусов GHB-IL2-10 независимо от очистки по способу бляшкообразования. В отличие от этого, продукты ПЦР, полученные с образцами вируса GHB-IL-2-11, мигрируют в соответствии с ожидаемым размером (см. фиг. 4). Пример 2. Экспрессия человеческого интерлейкина-2 с открытой рамкой считывания NS1. Последовательность сДНК, кодирующую человеческий IL-2, вставляют в модифицированный NS сегмент вируса гриппа типа А штамма Puerto Rico/8/34, который не кодирует функциональный NS1 белок. В отличие от примера 1 IL-2 непосредственно присоединяют к укороченному (12 аминокислотных остатков) NS1 белку. Так, IL-2 экспрессируется с открытой рамкой считывания NS1 (см. фиг. 1c, delNS1IL-2-14). Для обеспечения секреции IL-2 зрелый IL-2, присоединяют к первым 12 аминокислотным остаткамNS1 белка через модифицированный сигнальный пептид IgK, получая следующую аминокислотную последовательность: Первые 12 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укоро- 11018174 ченному NS1 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного IgK, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому IL-2. Описание сегмента delNS1-IL-2-14: ORF составной последовательности NS1-IgK-IL-2: нуклеотиды 27-509. Донорный участок сплайсинга находится между нуклеотидами 56 и 57; акцепторный участок сплайсинга между нуклеотидами 559 и 560 (фиг. 1 с). Получение вируса и анализ экспрессии IL-2 проводят, как описано в примере 1. Полученные вирусы названы GHB-IL-2-14. Обнаружено, что экспрессия IL-2 примерно в 17 раз выше, чем в случае delNS1-IL-2-11 (см. фиг. 5). Таким образом, высокий уровень экспрессии с открытой рамкой считывания жирным шрифтом является реальностью. Пример 3. Влияние последовательности, окружающей донорный участок сплайсинга, на экспрессию IL-2. Для анализа влияния последовательности, окружающей донорный участок сплайсинга, на экспрессию IL-2 последовательности delNS1-IL-2-11 и delNS1-IL-2-14 дополнительно модифицируют.delNS1-IL-2-13 получают из delNS1-IL-2-11 путем замены 8 нуклеотидов, расположенных ниже 5' границы интрона с /GTAAGTAT на /GTAGATTG, как найдено в PR8 NS сегменте дикого типа (нуклеотиды, комплементарные 5' концу snPHK человеческого U1, показаны жирным курсивом, 5' граница интрона помечена знаком /). Последовательность delNS1-IL-2-13 показана на фиг. 1d. Сходным способом получают delNS1-IL-2-21 из delNS1-IL-2-14 путем замены последовательности/GTAAGTCT на /GTATTTGC (нуклеотиды, комплементарные 5' концу snPHK человеческого U1, показаны жирным курсивом, 5' граница интрона помечена знаком /). Последовательность delNS1-IL-2-21 показана на фиг. 1 е. Таким образом, в обеих конструкциях гомология 5'-концу snPHK U1 уменьшена по сравнению с конструкциями-предшественниками. Для delNS1-IL-2-13 аминокислотная последовательность укороченного NS1 белка следующая:MDPNTVSSFQVDCFLWRVRKR (SEQ ID No. 61) Для delNS1-IL-2-21 аминокислотная последовательность составного белка NS1-сигнального пептида IgK-IL-2 следующая: Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному NS1 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного IgK, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому IL-2. Получение вирусов и анализ экспрессии IL-2 проводят, как описано в примере 1. Полученные вирусы названы GHB-IL-2-13 и GHB-IL-2-21. Генетическую стабильность delNS1-IL-2-13 и delNS1-IL-2-21 сегментов анализируют после 5 последовательных пассажей на Vero клетках, как описано в примере 1. Обнаружено, что уровни экспрессии IL-2 выше у соответствующих конструкций, имеющих более низкую гомологию с snPHK U1 в районе донорного участка сплайсинга (см. фиг. 5). Обнаружено, что уровни экспрессии в случае GHB-IL-2-13 примерно в 13 раз выше, чем в случае соответствующего вируса, проявляющего высокую гомологию с snPHK U1 (GHB-IL-2-13; 9,4 нг/мл по сравнению с 0,7 нг/мл; фиг. 5). Сходным образом обнаружено, что уровни IL-2 в случае GHB-IL-2-21 примерно в 2,6 раза выше,чем в случае GHB-IL-2-14 (31,1 нг/мл по сравнению с 12,1 нг/мл; фиг. 5). Таким образом, модифицируя последовательность в районе донорного участка сплайсинга NS,можно влиять на уровни экспрессии IL-2. В случае обоих вирусов delNS1-IL-2-13 и delNS I-IL-2-21 полоски с результатами делеций не обнаружены после пяти последовательных пассажей, что указывает на генетическую стабильность. Пример 4. Экспрессия IL-2 с отдельной открытой рамкой считывания: инициация трансляции с помощью консенсусной последовательности Козак. Последовательность стоп- и старт-кодонов в delNS1-IL-2-11 заменяют на консенсусную последовательность Козак (т.е. TAATG замещен на TAAGCCGCCACCATG, стоп- и старт-кодоны помечены жирным шрифтом с подчеркиванием, SEQ ID No. 63) с получением сегмента delNS1-IL-2-17. Нуклеотидная последовательность сегмента delNS1-IL-2-17 показана на фиг. 1f. Получение вирусов и анализ экспрессии IL-2 для GHB-IL-2-17 проведены, как описано в примере 1. Обнаружено, что уровни экспрессии IL-2 примерно в два раза выше, чем для GHB-IL-2-11 (данные не приведены). Пример 5. Экспрессия человеческого IL-15 с открытой рамкой считывания NS1. Последовательность сДНК, кодирующую человеческий IL-15, вставляют в модифицированный NS сегмент вируса гриппа типа А штамма Puerto Rico/8/34, который не кодирует функциональный NS1 белок. Для обеспечения секреции сДНК, кодирующую зрелый IL-15, присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) NS1 белку, не меняя рамки считывания через модифицированный сигнальный пептид мышиного IgK, получая следующую аминокислотную последовательность: Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному NS1 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного IgK, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому IL-15. Полученный химерный сегмент IL-15 NS назван delNS1-IL-15-21. Последовательность нуклеотидов delNS1-IL-15-21 показана на фиг. 1g. Получение вируса проводят, как описано в примере 1. Уровни экспрессии IL-15 в супернатантах инфицированных Vero клеток анализируют с помощьюELISA и показывают, что они находятся в интервале 1-2 нг/мл. Пример 6. Экспрессия человеческого GM-CSF с открытой рамкой считывания NS1. Последовательность сДНК, кодирующую человеческий GM-CSF, вставляют в модифицированныйNS сегмент вируса гриппа типа А штамма Puerto Rico/8/34, который не кодирует функциональный NS1 белок. Для обеспечения секреции зрелый GM-CSF присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) NS1 белку через модифицированный сигнальный пептид мышиного IgK, получая следующую аминокислотную последовательность: Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному NS1 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного IgK, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому GM-CSF. Полученный химерный сегмент GM-CSF и NS назван delNS1-GM-CSF-21. Последовательность нуклеотидов delNS1-GM-CSF-21 показана на фиг. 1h. Получение вируса проводят, как описано в примере 1. Пример 7. Экспрессия человеческого CCL-3 с открытой рамкой считывания NS1. Последовательность сДНК, кодирующую человеческий CCL-3 (MIP-1), вставляют в модифицированный NS сегмент вируса гриппа типа А штамма Puerto Rico/8/34, который не кодирует функциональный NS1 белок. Для обеспечения секреции зрелый CCL-3 присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) NS1 белку через модифицированный сигнальный пептид мышиного IgK, получая следующую аминокислотную последовательность: Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному NS1 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного IgK, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому CCL-3. Полученный химерный сегмент CCL-3 NS назван delNS1-CCL-3-21. Последовательность нуклеотидов delNS1-CCL-3-21 показана на фиг. 1i. Получение вируса проводят, как описано в примере 1. Пример 8. Экспрессия человеческого CCL-20 с открытой рамкой считывания NS1. Последовательность сДНК, кодирующую человеческий CCL-20 (MIP-3), вставляют в модифицированный NS сегмент вируса гриппа типа А штамма Puerto Rico/8/34, который не кодирует функциональный NS1 белок. Для обеспечения секреции зрелый CCL-20 присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков) NS1 белку через модифицированный сигнальный пептид мышиного IgK, получая следующую аминокислотную последовательность: Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному NS1 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного IgK, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует зрелому человеческому CCL-20. Полученный химерный сегмент CCL-20 NS назван delNS1-CCL-20-21. Последовательность нуклеотидов delNS1-CCL-20-21 показана на фиг. 1j. Получение вируса проводят, как описано в примере 1. Уровни экспрессии CCL-20 в супернатантах инфицированных Vero клеток анализируют с помощьюELISA и показывают, что они составляют примерно 25 нг/мл. Пример 9. Экспрессия секретируемого ESAT-6 из Mycobacterium tuberculosis с открытой рамкой считывания NS1. Последовательность сДНК, кодирующую ESAT-6 из Mycobacterium tuberculosis, вставляют в модифицированный NS сегмент вируса гриппа типа А штамма Puerto Rico/8/34, который не кодирует функциональный NS1 белок. Для обеспечения секреции ESAT-6 присоединяют к укороченному (11 аминокислотных остатков)NS1 белку через модифицированный сигнальный пептид мышиного IgK, получая следующую аминокислотную последовательность: Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному NS1 белку, аминокислотные остатки, соответствующие сигнальному пептиду модифицированного мышиного IgK, показаны жирным курсивом, оставшаяся аминокислотная последовательность соответствует ESAT-6. Полученный химерный сегмент ESAT-6 NS назван delNS1-ESAT-6s-21. Последовательность нуклеотидов delNS1-ESAT-6s-21 показана на фиг. 1k. Получение вируса проводят, как описано в примере 1. Пример 10. Внутриклеточная экспрессия ESAT-6 из Mycobacterium tuberculosis с открытой рамкой считывания NS1. Последовательность сДНК, кодирующую ESAT-6 из Mycobacterium tuberculosis, вставляют в модифицированный NS сегмент вируса гриппа типа А штамма Puerto Rico/8/34, который не кодирует функциональный NS1 белок. В отличие от примера 9 ESAT-6 прямо присоединяют (т.е. без аминокислотной последовательности, выступающей в роли сигнального пептида) к укороченному (11 аминокислотных остатков) NS1 белку с получением следующей аминокислотной последовательности: Первые 11 аминокислотных остатков вышеприведенной последовательности соответствуют укороченному NS1 белку, аминокислотная последовательность, показанная жирным курсивом, соответствуетESAT-6. Полученный химерный сегмент ESAT-6 NS назван delNS1-ESAT-6i-21. Последовательность нуклеотидов delNS1-ESAT-6i-21 показана на фиг. 11. Получение вируса проводят, как описано в примере 1. Пример 11. Экспрессия IL-2 с открытой рамкой считывания NS1 с применением альтернативных последовательностей сигнальных петидов. Сегмент delNS1-IL-2-21 (пример 3) модифицируют путем замены части последовательности мышиного сигнального пептида IgK другими последовательностями. Для получения delNS1-IL-2-23 аминокислотную последовательность LLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID No. 58) в delNS1-IL-2-21 заменяют последовательностью WVLFILLLFLFLPRSHG (SEQ ID No. 72) с получением аминокислотной последовательностиNo. 58) в delNS1-IL-2-21 заменяют последовательностью AGAALLALLAALLPASRA (SEQ ID No. 74),полученной из сигнального пептида человеческого эпидермального ростового фактора (hEGF)ELISA. Таким образом, часть сигнального пептида мышиного IgK может быть заменена другими последовательностями, действующими в качестве сигнального пептида. Пример 12. Модификация последовательностей, окружающих донорный и акцепторный участки сплайсинга, влияет на эффективность сплайсинга NS. Для анализа влияния последовательностей, окружающих границы интрона, на эффективность сплайсинга, последовательность delNS1-IL-2-10 (см. пример 1) дополнительно модифицируют. delNS1IL-2-12 получают из delNS1-IL-2-10 путем замены 8 нуклеотидов, расположенных ниже 5' границы интрона с IGTAAGTAT на /GXAGA7TG, как обнаружено в PR8 NS сегменте дикого типа (нуклеотиды,комплементарные 5'-концу snPHK человеческого U1, показаны жирным курсивом, 5' граница интрона помечена знаком /). В остальном нуклеотидная последовательность delNS1-IL-2-12 идентична последовательности delNS1-IL-2-10. Вирус получают, как описано в примере 1. Генетическую стабильность сегмента delNS1-IL-2-12 анализируют после пяти последовательных пассажей, как описано в примере 1. Обнаружены ясные полоски результатов делеций (данные не приведены). Для анализа эффективности сплайсинга Vero клетки инфицируют совместно четырьмя плазмидами,экспрессирующими белки РВ 1, РВ 2, РА и NP, вместе с плазмидой, экспрессирующей vPHK delNS1-IL-210, delNS1-IL-2-11 (см. пример 1), delNS I-IL-2-12 или delNS1-IL-2-13 (см пример 3). Через 24 ч мРНК экстрагируют из трансфицированных клеток и анализируют на наличие мРНКdelNS1-IL-2 с прошедшим сплайсингом и без сплайсинга с помощью ПЦР в реальном времени. В следующей таблице суммированы модификации последовательностей, проведенные от 3' до донорного участка сплайсинга или от 5' до акцепторного участка сплайсинга, а также генетическая стабильность и уровни экспрессии IL-2 (уровни экспрессии IL-2 в случае delNS1-IL-2-10 и delNS1-IL-2-12 не приведены, поскольку оба сегмента оказались генетически нестабильными). Как показано на фиг. 7, сплайсинг мРНК delNS1-IL-2 можно изменять путем модификации последовательности, окружающей донорный участок сплайсинга или последовательности от 5' до акцепторного участка сплайсинга. Оказалось также, что увеличение эффективности сплайсинга выше определенного порогового уровня, необходимое для достижения генетической стабильности, снижает экспрессию IL-2 (см delNS1IL-2-13 по сравнению delNS1-IL-2-11). Пример 13. Экспрессия человеческого интерлейкина-2 с отдельной рамкой считывания вируса гриппа типа В. Последовательность сДНК, кодирующую человеческий IL-2, помещают в модифицированный NS сегмент вируса гриппа типа В штамма B/Vienna/33/06. Белок NS1 заканчивается после аминокислотного остатка 38 путем введения искусственного стоп-кодона и таким образом не содержит ни домена связывания РНК, ни С-концевого домена NS1. Для осуществления трансляции IL-2 искусственно вставленный стоп-кодон для NS1 перекрывается со стартовым кодоном для IL-2 с получением последовательности TAATG. Схема экспрессии представлена на фиг. 8. В этой конструкции (ANS1-38IL-2) сДНК IL-2, включая перекрывающийся стоп- и/или старт-кодон, замещает нуклеотиды 159-728 сегмента NS дикого типа, соответствующие аминокислотным остаткам 38-228 белка NS1. В такой конструкции синтетическая последовательность из 29 нуклеотидов, включающая петлеобразную консенсусную последовательность с последующей пиримидиновой цепочкой из 20 нуклеотидов,замещает природный акцепторный участок сплайсинга плюс природную пиримидиновую цепочку по аналогии с конструкцией на основе вируса гриппа типа A delNS1-IL-2-11. Описание сегмента ANS1-38IL-2, как показано на фиг. 8: ORF укороченного NS1 состоит из нуклеотидов 45-158; ORF человеческого IL-2 состоит из нуклеотидов 161-619; 5' граница интрона находится между нуклеотидами 77 и 78, 3' граница интрона находится между нуклеотидами 657 и 658. Получение плазмид и вирусов Плазмиды для вируса гриппа типа В получают аналогично плазмидам гриппа типа А с применением стандартных техник клонирования. НА и NA, полученные из адаптированного к Vero клеткам вируса гриппа штамма B/Thuringen/2/06 и сегменты РА, РВ 1, РВ 2 и NP, полученные из адаптированного к Vero клеткам вируса гриппа штамма B/Vienna/33/06, клонируют в pHW2006. Все плазмиды секвенируют для подтверждения отсутствия нежелательных мутаций. Вирус гриппа, экспрессирующий IL-2, получают, как описано для вируса гриппа типа А, и называют ANS1-38IL2. Анализ стабильности вируса Химерные IL-2 вирусы гриппа, полученные прямо после трансфекции, последовательно пассируют четыре раза на Vero клетках. РНК экстрагируют с помощью набора Viral Amp (Qiagen) и проводят обратную транскрипцию. Целые NS сегменты амплифицируют с помощью ПЦР и подвергают электрофорезу в агарозном геле для оценки присутствия делеций. Продукты ПЦР, полученные с образцами вирусаANS1-38IL2 после 1 и 4 пассажей, мигрируют соответственно ожидаемым размерам, что указывает на стабильность IL-2 экспрессирующего вектора. Иммуногенность у мышей Для исследования иммуногенного потенциала мышей иммунизируют дозой 1105 TCID50/мышь вирусом гриппа В дикого типа, ANS1-38IL2, NS1-38 (контрольный вирус, полученный по сходномуCANS1-38IL2 способу, но без вставки IL-2) или PBS в качестве контроля. Через четыре недели после иммунизации мышам вводят инфицирующую дозу 1105 TCID50/мышь гомологичного вируса гриппа В дикого типа. Через три дня после инфицирования мышей забивают и исследуют репликацию вируса в легких и носовых раковинах. У мышей, которых иммунизировали вирусом гриппа дикого типа, легкие и носы защищены от инфекции, тогда как у контрольной группы мышей, получивших PBS, титры вируса примерно 3 logs обнаружены как в носовых, так и легочных тканях. При дозе 1105 TCID50/мышь ни одна из мышей, иммунизированных ANS1-38, не была защищена от вируса гриппа дикого типа, демонстрируя носовые и легочные ткани, сравнимые с таковыми у неиммунизированных животных. В отличие от этого вирус нельзя было изолировать ни из одной мыши, иммунизированной ANS1-38IL2 в такой же дозе, что указывает на развитие у мышей защиты от вируса. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Вирус гриппа с нарушенной репликацией, включающий: а) модифицированный NS сегмент, кодирующий NS1 белок, включающий по меньшей мере 10 Nконцевых аминокислот, где участок связывания РНК расположен между аминокислотами 1 и 73, а эффекторный участок расположен между аминокислотой 74 и С-концевым аминокислотным остатком, где указанные участки утратили свои функции из-за аминокислотных делеций, и б) гетерологичную последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, вставленную в NS сегмент гена. 2. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по п.1, включающий до 14, предпочтительно до 30 аминокислотных остатков с N-конца NS1 белка. 3. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1 или 2, в котором удалены аминокислотные остатки 134-161 или аминокислотные остатки 117-161. 4. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-3, включающий сигнальный пептид или его часть, присоединенную к С-концу NS1 белка. 5. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-4, в котором гетерологичная последовательность экспрессируется с открытой рамкой считывания NS1 с другой открытой рамки считывания. 6. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-5, в котором гетерологичную последовательность выбирают из группы, состоящей из биологически активных белков, их антигенов или производных или фрагментов. 7. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-6, в котором гетерологичная после- 16018174 довательность представляет собой антиген, хемокин, цитокин или их производное или фрагмент, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из Mycobacterium tuberculosis, IL-2, GM-CSF, EL-15,MIP1a и MIP3a, ESAT-6 или их фрагмента или производного. 8. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.4-7, в котором гетерологичная последовательность включает сигнальный пептид, полученный из легкой цепи антитела, предпочтительно из-цепи иммуноглобулина (IgK), более предпочтительно из IgK цепи мыши. 9. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по п.8, в котором сигнальный пептид IgK включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков, предпочтительно включает последовательность METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ IDNo. 11), или METDTLLLWVLLLWVPRSHG (SEQ ID No. 82), или ее часть. 10. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-9, в котором трансляция указанного NS1 белка заканчивается с помощью по меньшей мере одного стоп-кодона и экспрессия указанной гетерологичной последовательности инициируется старт-кодоном. 11. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-10, в котором открытая рамка считывания гетерологичной последовательности, по меньшей мере, частично перекрывается с открытой рамкой считывания NS1. 12. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-11, в котором трансляция с открытой рамки считывания гетерологичной последовательности инициируется последовательностью перекрывающихся стоп-старт-кодонов, которая предпочтительно представляет собой TAATG (SEQ ID No. 81) или UAAUG (SEQ ID No. 53). 13. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-12, содержащий измененную последовательность, расположенную после донорного участка сплайсинга и/или перед акцепторным участком сплайсинга в NS сегменте. 14. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-13, включающий последовательность SEQ ID No. 1-10, 67, 68 или по меньшей мере на 98% гомологичную им. 15. Вакцина, включающая вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14. 16. Применение вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для терапевтического лечения больных. 17. Вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14. 18. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14, включающий стадии трансформации клеток, предпочтительно Vero клеток, вектором по п.17 предпочтительно вместе с очищенным препаратом RNP комплекса вируса гриппа,необязательно инфицирования трансфецированных клеток вспомогательным (хелперным) вирусом гриппа,инкубации инфицированных клеток для развития потомства вируса и отбора трансформированных клеток, которые экспрессируют модифицированный NS ген и гетерологичную последовательность. 19. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14, включающий стадии трансфецирования клеточной линии, предпочтительно линии Vero клеток, ДНК вектором, включающим модифицированный NS ген, лишенный функционального домена связывания РНК, и гетерологичную последовательность, помещенную между функциональным донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга NS гена; отбора трансфецированных клеток, которые продуцируют вирус, экспрессирующий модифицированный NS ген и гетерологичную последовательность,инфицирования отобранных клеток требуемым вирусом гриппа,инкубации инфицированных клеток для развития потомства вируса, содержащего гетерологичный белок,отбора и сбора указанного потомства вируса, содержащего гетерологичный белок. 20. Модифицированный NS сегмент гена, кодирующий NS1 белок, включающий по меньшей мере 10 N-концевых аминокислот, где участок связывания РНК расположен между аминокислотами 1 и 73, а эффекторный участок расположен между аминокислотой 74 и С-концевым аминокислотным остатком,где указанные участки утратили свои функции из-за аминокислотных делеций, а гетерологичная последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, вставленная в NS сегмент гена, дополнительно содержит сигнальный пептид, присоединенный к С-концу указанного NS1 белка, где указанный сигнальный пептид предпочтительно состоит из 8-50 аминокислотных остатков. 21. Модифицированный NS сегмент по п.20, в котором сигнальный пептид получен из легкой цепи антитела, предпочтительно из -цепи иммуноглобулина, более предпочтительно из IgK цепи мыши или ее производного, где предпочтительно указанный сигнальный пептид IgK включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков и предпочтительно включает последовательность METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID No. 11), или

МПК / Метки

МПК: C12N 15/62, A61K 39/00, C12N 15/86, C07K 14/11, A61K 39/145

Метки: репликацией, вирус, гриппа, последовательностей, экспрессии, нарушенной, гетерологичных

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-18174-virus-grippa-s-narushennojj-replikaciejj-dlya-ekspressii-geterologichnyh-posledovatelnostejj.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Вирус гриппа с нарушенной репликацией для экспрессии гетерологичных последовательностей</a>

Похожие патенты