Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты

Номер патента: 18129

Опубликовано: 30.05.2013

Авторы: Пупека Малгорзата, Томлинсон Айан, Эневер Кэролин, Йесперс Лорен

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4).

2. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по п.1, содержащий 22S, 49S, 83S и 94Y согласно нумерации Кабата.

3. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1) по п.1, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-202.

4. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), кодируемый последовательностью, которая идентична нуклеотидной последовательности DOM4-130-202 (представленной на фиг. 19).

5. Антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против IL-1R1 по любому из пп.1-4.

6. Антагонист по п.5, содержащий первый и второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, где каждый вариабельный домен соответствует любому из пп.1-4.

7. Антагонист по п.5 или 6, где антагонист содержит мономер указанного единичного вариабельного домена или гомодимер указанного единичного вариабельного домена, где аминокислотная последовательность единичного вариабельного домена или каждого единичного вариабельного домена идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4).

8. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий сайт связывания рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), где вариабельный домен устойчив к протеазе при инкубации с:

(1) протеазой в концентрации (с) по меньшей мере 10 мкг/мл при 37°С в течение периода времени (t) по меньшей мере один час или

(2) протеазой в концентрации (c') по меньшей мере 40 мкг/мл при 30°С в течение периода времени (t) по меньшей мере один час;

где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4).

9. Антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий вариабельный домен по п.8.

10. Антагонист IL-1R1 по п.9 для пероральной доставки.

11. Антагонист IL-1R1 по п.9 или 10 для доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента.

12. Антагонист по пп.9, 10 или 11, где вариабельный домен устойчив к трипсину, эластазе и/или панкреатину.

13. Применение антагониста IL-1R1 по п.9 для лечения и/или профилактики воспалительного состояния.

14. Антагонист по любому из пп.5-7 и 9-13, где антагонист содержит вариабельный домен, который имеет Tm по меньшей мере 50°С.

15. Вариабельный домен по любому из пп.1-4 и 8, который имеет Tm по меньшей мере 50°С.

16. Вариабельный домен по любому из пп.1-4 и 8, который ингибирует IL-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-8 клетками MRC-5 (номер доступа в АТСС CCL-171) в анализе in vitro с ND50 (средняя нейтрализующая доза) не более 1 мкМ.

17. Вариабельный домен по любому из пп.1-4 и 8, который ингибирует связывание IL-1 с IL-1R1 с IC50 (средняя ингибирующая концентрация) не более 1 мкМ.

18. Вариабельный домен по любому из пп.1-4 и 8, где вариабельный домен 1R1 ингибирует IL-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-6 в анализе цельной крови с ND50 не более 1 мкМ.

19. Лиганд с двойной специфичностью, содержащий вариабельный домен по любому из пп.1-4, 8, 15, 16, 17 и 18.

20. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-4, 8, 15, 16, 17 и 18.

21. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.20.

22. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.20 или вектор по п.21.

23. Фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью в отношении рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-4, 8, 15, 16, 17 и 18 или антагонист по любому из пп.5-7 и 9-14 и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.

24. Полипептид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4).

25. Слитый белок, содержащий полипептид по п.24.

26. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.24 или слитый белок по п.25.

27. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из пп.1-4, 8, 15, 16, 17 и 18, содержащий константный домен антитела.

28. Антагонист по любому из пп.5-7 и 9-14, содержащий константный домен антитела.

29. Полипептид по п.24, содержащий константный домен антитела.

30. Вариабельный домен по п.27, содержащий Fc антитела, где N-конец Fc связан с С-концом вариабельного домена.

31. Вариабельный домен по п.30, где N-конец Fc непосредственно связан с С-концом вариабельного домена.

32. Антагонист по п.28, содержащий Fc антитела, где N-конец Fc связан с С-концом вариабельного домена.

33. Антагонист по п.32, где N-конец Fc непосредственно связан с С-концом вариабельного домена.

34. Полипептид по п.29, содержащий Fc антитела, где N-конец Fc связан с С-концом вариабельного домена.

35. Полипептид по п.34, где N-конец Fc непосредственно связан с С-концом вариабельного домена.

Рисунок 1

Текст

Смотреть все

ПОЛИПЕПТИДЫ, ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ АНТИТЕЛА И АНТАГОНИСТЫ Изобретение относится к полипептидам и единичным вариабельным доменам (dAb) антитела против IL-1R1, которые устойчивы к деградации протеазой, а также содержащим их антагонистам. Указанные полипептиды, dAb и антагонисты полезны в качестве терапевтических и/или профилактических средств, которые, вероятно, сталкиваются с протеазами при введении пациенту,например для внутрилегочного введения, перорального введения, доставки в легкое и доставки в ЖК (желудочно-кишечный) тракт пациента, а также для лечения воспалительного заболевания,такого как артрит или COPD (хроническое обструктивное заболевание легких). Настоящее изобретение относится к протеазоустойчивым полипептидам, иммуноглобулиновым(антительным) единичным вариабельным доменам и содержащим их антагонистам против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1). Изобретение также относится к применениям, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие лиганды против IL-1R1. Предшествующий уровень техники Полипептиды и пептиды становятся все более важными агентами во многих применениях, включая промышленное применение и применение в качестве медицинских, терапевтических и диагностических агентов. Однако при некоторых физиологических состояниях, таких как воспалительные состояния (например COPD (хроническое обструктивное заболевание легких и рак, количество протеаз, присутствующих в ткани, органе или животном (например в легком, внутри или около опухоли) может увеличиваться. Такое увеличение протеаз может приводить к ускоренному расщеплению и инактивации эндогенных белков и терапевтических пептидов, полипептидов и белков, которые вводят для лечения заболевания. Соответственно, некоторые агенты, которые обладают потенциалом для применения их in vivo(например для применения в лечении, диагностике или предупреждении заболевания), имеют только ограниченную эффективность вследствие того, что они быстро расщепляются и инактивируются протеазами. Протеазоустойчивые полипептиды предоставляют некоторые преимущества. Например, протеазоустойчивые полипептиды сохраняют свою активность in vivo дольше, чем протеазочувствительные агенты, и, соответственно, сохраняют свою функциональность в течение периода времени, достаточного для получения биологических эффектов. Существует необходимость в улучшенных способах селекции полипептидов, устойчивых к расщеплению протеазой и, кроме того, имеющих желаемую биологическую активность.IL-1R1 Оказалось, что некоторые агенты, связывающие рецептор интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1) и нейтрализующие его активность, представляют собой эффективные терапевтические агенты для некоторых воспалительных состояний, таких как ревматоидный артрит от умеренно активного до тяжелой степени. Однако другие агенты, связывающие IL-1R1, такие как антитело против IL-1R1 AMG 108 (Amgen), не удовлетворяют основным конечным точкам клинических исследований. Желательно обеспечить агенты,которые связывают и оказывают антагонистическое воздействие на IL-1R1 и являются эффективными в лечении воспаления легких или респираторных заболеваний, таких как хроническое обструктивное заболевание легких (COPD). Существует потребность в улучшенных агентах, которые оказывают антагонистическое воздействие на IL-1R1, и способах введения таких агентов для лечения воспаления легких и заболевания легких. Краткое изложение сущности изобретения В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности DOM4130-201 или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-202(представленной на фиг. 4). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 97,5, 98, 98,5 или 99%. В одном из воплощений полипептид представляет собой DOM4-130-201 илиDOM4-130-202. В изобретении также предложен (по существу) чистый мономер DOM4-130-201 илиDOM4-130-202. В одном из воплощений DOM4-130-201 или DOM4-130-202 представляет собой по меньшей мере на 98, 99, 99,5% чистый или 100% чистый мономер. В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, содержащий протеазоустойчивую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202. В одном из воплощений этих аспектов процентная идентичность составляет по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений полипептид представляет собой DOM4-130-201 или DOM4-130-202. В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, кодируемый аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности DOM4130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 19). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 57% идентична нуклеотидной последовательности DOM4-130201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 19), и где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательностиDOM4-130-201 или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности DOM4130-202. В одном из воплощений процентная идентичность нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений процентная идентичность аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 94, 95,96, 97, 98 или 99% или 100%. Например, нуклеотидная последовательность может представлять собой кодон-оптимизированный вариант нуклеотидной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202(представленной на фиг. 19). Оптимизация кодонов последовательностей известна в данной области тех-1 018129 ники. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в бактериальной (например Е. coli или Pseudomonas, например Р fluorescens), млекопитающего (например СНО) или дрожжевой клетке-хозяине (например Picchia или Saccharomyces, например P. pastoris или S.cerevisiae). В одном из аспектов в изобретении предложен слитый белок, содержащий полипептид по изобретению. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 97,5,98, 98,5 или 99%. В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из 22S, 49S, 83S и 94Y, согласно нумерации Кабата ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991). В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит 22S, 49S,83S и 94Y, согласно нумерации Кабата. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), кодируемый нуклеотидной последовательностью,которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности DOM4-130-201 илиDOM4-130-202 (представленной на фиг. 19). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), кодируемый нуклеотидной последовательностью,которая по меньшей мере на 57% идентична нуклеотидной последовательности DOM4-130-201 илиDOM4-130-202 (представленной на фиг. 19), и где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательностиDOM4-130-201 или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности DOM4130-202. В одном из воплощений процентная идентичность нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений процентная идентичность аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 94, 95,96, 97, 98 или 99 или 100%. Например, нуклеотидная последовательность может представлять собой кодон-оптимизированный вариант нуклеотидной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202(представленной на фиг. 19). Оптимизация кодонов последовательностей известна в данной области техники. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в бактериальной (например Е. coli или Pseudomonas, например Р fluorescens), млекопитающего (например СНО) или дрожжевой клетке-хозяине (например Picchia или Saccharomyces, например P. pastoris или S.cerevisiae). В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), кодируемый нуклеотидной последовательностью,идентичной нуклеотидной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 19). В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против IL-1R1 по изобретению. В одном из воплощений антагонист содержит первый и второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, где каждый вариабельный домен представляет собой вариабельный домен по изобретению. Например, когда антагонист содержит мономер указанного единичного вариабельного домена или гомодимер указанного единичного вариабельного домена. В одном из воплощений аминокислотная последовательность единичного вариабельного домена или каждого единичного вариабельного домена идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202(представленной на фиг. 4) или отличается от аминокислотной последовательности DOM4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7,6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичность последо-2 018129 вательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202(представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности DOM4-130-201 илиDOM4-130-202 по не более чем 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность CDR2,которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 DOM4-130-201 или DOM4-130202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13,12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 тип 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 DOM4-130-201 или DOM4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9,8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202(представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности DOM4-130-201 илиDOM4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность CDR1,которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130202, и имеет последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR2 DOM4-130-201 или DOM4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24,23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей CDR составляют по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202(представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности DOM4-130-201 илиDOM4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность CDR1,которая по меньшей мере на 50% идентична CDR1 последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130202, и имеет последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR3 DOM4-130-201 или DOM4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24,23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей CDR составляют по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202(представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности DOM4-130-201 илиDOM4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность CDR2,которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 DOM4-130-201 или DOM4-130202, и имеет последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR3 DOM4-130-201 или DOM4-130-201, или DOM4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей CDR составляют по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130-202(представленной на фиг. 4), или отличается от аминокислотной последовательности DOM4-130-201 илиDOM4-130-202 не более чем по 25 аминокислотным положениям и имеет последовательность CDR1,которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130202, и имеет последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR2 DOM4-130-201 или DOM4-130-202, и имеет последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 DOM4-130-201 или DOM4-130-202. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,3, 2 или 1 аминокислотному(ым) положению(ям). В одном из воплощений одна или две, или каждая идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96,97, 98 или 99% соответственно. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), имеющий последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96,97, 98 или 99%. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), имеющий последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96,97, 98 или 99%. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), имеющий последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96,97, 98 или 99%. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), имеющий последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4), и последовательность CDR2,которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 DOM4-130-201 или DOM4-130202 соответственно. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR одной или обеихCDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), имеющий последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4), и последовательность CDR3,которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 DOM4-130-201 или DOM4-130202 соответственно. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR одной или обеихCDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), имеющий последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4), и последовательность CDR3,которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 DOM4-130-201 или DOM4-130202. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR одной или обеих CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), имеющий последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4), и последовательность CDR2,которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 DOM4-130-201 или DOM4-130202 соответственно, и последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 DOM4-130-201 или DOM4-130-202 соответственно. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR одной или двух, или каждой CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% соответственно. Антагонист может быть устойчив к протеазе,например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 (например CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 и 2, CDR1 и 3, CDR2 и 3 илиCDR1, 2 и 3) DOM4-130-201 или DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4). Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в опи-4 018129 санном в данной заявке наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL1R1), который конкурирует с DOM4-130-201 или DOM4-130-202 за связывание с IL-1R1. Таким образом,антагонист может связываться с тем же самым эпитопом, что и DOM4-130-201 или DOM4-130-202, или перекрывающимся эпитопом. В одном из воплощений антагонист содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201, или по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-202 (представленной на фиг. 4). В одном из воплощений процентная идентичность составляет по меньшей мере 97,5, 98, 98,5 или 99%. В одном из воплощений вариабельный домен представляет собой DOM4-130-201 или DOM4-130-202. Антагонист может быть устойчив к протеазе, например одной или более протеазам, описанным в данной заявке, например в описанном в данной заявке наборе условий. В одном из воплощений антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, такой как одновалентный антигенсвязывающий фрагмент (например scFv, Fab, Fab', dAb) обладающий специфичностью связывания в отношении IL-1R1. Другие предпочтительные антагонисты представляют собой описанные в данной заявке лиганды, связывающиеся с IL-1R1. Эти лиганды содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или доменное антитело (dAb), обладающее специфичностью связывания в отношении IL-1R1, или гипервариабельные участки такого dAb в подходящем формате. В некоторых воплощениях лиганд представляет собой мономер dAb, который состоит, по существу, или состоит из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, или dAb, обладающего специфичностью связывания в отношении IL-1R1. В других воплощениях лиганд представляет собой полипептид, который содержит dAb (или CDR dAb) в подходящем формате, таком как формат антитела. В одном из аспектов в изобретении предложен протеазоустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против IL-1R1, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130202. В одном из воплощений этих аспектов процентная идентичность составляет по меньшей мере 80, 85,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений лиганды (например полипептиды, антагонисты, вариабельные домены) по изобретению форматированы таким образом, что обладают большим гидродинамическим размером, например путем присоединения группы ПЭГ (полиэтиленгликоль), сывороточного альбумина, трансферрина, рецептора трансферрина или по меньшей мере его трансферрин-связывающего фрагмента, Fcобласти антитела, или путем конъюгации с доменом антитела. Например, мономер dAb может быть форматирован в виде более крупного антигенсвязывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например форматирован в виде Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). Гидродинамический размер лиганда и его период полувыведения из сыворотки также может быть увеличен путем конъюгации или связыванияIL-1R1-связывающего агента (лиганда; антагониста) со связывающим доменом (например, антителом или фрагментом антитела), связывающим антиген или эпитоп, что увеличивает период полувыведения invivo, как описано в данной заявке (см. Приложение 1 в WO 2006038027, включенной в данную заявку посредством ссылки). Например, связывающий агент (например полипептид) может быть конъюгирован или связан с антителом против сывороточного альбумина или антителом или фрагментом антитела против неонатального Fc-рецептора, например dAb, Fab, Fab' или scFv против SA или против неонатальногоFc-рецептора, или с аффителом против SA или аффителом против неонатального Fc-рецептора. Примеры подходящего альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина для применения в IL-1R1-связывающем лиганде по изобретению описаны в WO 2005/077042A2 и WO 2006038027,которые включены в данную заявку посредством ссылки. В других воплощениях по изобретению, раскрытых в данном описании, вместо применения "dAb" в антагонисте или лиганде по изобретению, предполагается, что специалист в данной области техники может использовать домен, который содержит CDR dAb, которое связывается с IL-1R1 (например CDR,перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например аффитело, SpA каркас, домен рецептора LDL (липопротеинов низкой плотности) класса А или домен EGF (эпителиальный фактор роста, или может представлять собой белковый домен, содержащий сайт связывания с IL-1R1, например когда домен выбран из аффитела, домена SpA, домена LDL рецептора класс А или домена EGF. Полное описание следует рассматривать таким образом, что оно раскрывает антагонисты, лиганды и способы применения таких доменов вместо dAb. Полипептиды, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и антагонисты по изобретению могут быть устойчивыми к одной или более чем одной из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеаза, карбоксипептидаза (например карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин,эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например катепсин G), протеиназа (например протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), кальпаин, фикаин,клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет со-5 018129 бой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может быть предложена в биологическом экстракте,биологическом гомогенате или биологическом препарате. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в мокроте, слизи(например желудочной слизи, носовой слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном лаваже, гомогенате легких, экстракте легких, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в глазу и/или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой небактериальную протеазу. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу животного, например млекопитающего, например человека. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу ЖК (желудочно-кишечного) тракта или протеазу легочной ткани, например протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, обнаруженные у людей. Такая приведенная в данной заявке протеаза также может быть использована в описанных в данной заявке способах, включающих воздействие протеазы на репертуар библиотеки. В одном из аспектов в изобретении предложен протеазоустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий сайт связывания рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1), где вариабельный домен устойчив к протеазе, например трипсину, при инкубации с (1) протеазой в концентрации (с) по меньшей мере 10 мкг/мл при 37 С в течение периода времени (t) по меньшей мере 1 ч; или(2) протеазой в концентрации (с') по меньшей мере 40 мкг/мл при 30 С в течение периода времени (t) по меньшей мере 1 ч, где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности DOM4-130-201 или DOM4-130202. В одном из воплощений отношение (моль/моль) протеазы, например трипсина, к вариабельному домену (протеаза:вариабельный домен) составляет 8000 к 80000, например, когда С (концентрация) равна 10 мкг/мл, отношение протеаза:вариабельный домен составляет 800 к 80000; или когда С или С равна 100 мкг/мл, отношение протеаза:вариабельный домен составляет 8000 к 80000. В одном из воплощений отношение (масса/масса, например микрограмм/микрограмм) протеазы (например трипсина) к вариабельному домену (протеаза/вариабельный домен) составляет 16000 к 160000, например, когда С равна 10 мкг/мл, отношение протеаза/вариабельный домен составляет 1600 к 160000; или когда С или С равна 100 мкгмл, отношение протеаза/вариабельный домен составляет 16000 к 160000. В одном из воплощений концентрация (с или с') протеазы составляет по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл. В данной заявке сделана ссылка на описание условий, подходящих для протеолитической активности протеазы для применения при работе с репертуарами или библиотеками пептидов или полипептидов (например параметры мас./мас.). Эти условия могут быть использованы для определения устойчивости к протеазе конкретного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена. В одном из воплощений время (t) составляет примерно 1, 3 или 24 ч, или в течение ночи (например примерно 12-16 ч). В одном из воплощений вариабельный домен устойчив в условиях (1) и концентрация протеазы (с) составляет или примерно составляет 10 или 100 мкг/мл, и время (t) составляет 1 ч. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив в условиях (2) и концентрация протеазы (с') составляет или примерно составляет 40 мкг/мл, и время (t) составляет или примерно составляет 3 ч. В одном из воплощений протеаза выбрана из трипсина, эластазы, лейкозима и панкреатина. В одном из воплощений протеаза представляет собой трипсин. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в мокроте, слизи (например желудочной слизи, носовой слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном лаваже, гомогенате легких, экстракте легких, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в глазу и/или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой небактериальную протеазу. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу животного, например протеазу млекопитающего, например человека. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, например протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, обнаруженные у людей. Такая приведенная в данной заявке протеаза также может быть использована в описанных в данной заявке способах, включающих воздействие протеазы на репертуар библиотеки. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к трипсину и/или по меньшей мере одной другой протеазе, выбранной из эластазы, лейкозима и панкреатина. Например, устойчивость представляет собой устойчивость к трипсину и эластазе; трипсину и лейкозиму; трипсину и панкреатину; трипсину,эластазе и лейкозиму; трипсину, эластазе и панкреатину; трипсину, эластазе, панкреатину и лейкозиму; или трипсину, панкреатину и лейкозиму. В одном из воплощений вариабельный домен экспонирован на бактериофаге при инкубации в условиях (1) или (2), например в фаговой библиотеке, имеющей размер от 106 до 1013, например от 108 до 1012 репликативных единиц (инфекционных вирионов). В одном из воплощений вариабельный домен специфически связывается с IL-1R1 после инкубации в условиях (1) или (2), например как оцивали с использованием BiaCore или ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), например фагового ELISA или моноклонального фагового ELISA. В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению специфически связываются с бел-6 018129 ком А или белком L. В одном из воплощений специфическое связывание с белком А или L происходит после инкубации в условиях (1) или (2). В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению могут иметь OD450 в ELISA, например фаговом ELISA или моноклональном фаговом ELISA, по меньшей мере 0,404, например после инкубации в условиях (1) или (2). В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению демонстрируют, по существу, одну полосу при электрофорезе в геле, например после инкубации в условиях (1) или (2). В некоторых воплощениях в изобретении предложен антагонист IL-1R1, который представляет собой лиганд с двойной специфичностью, содержащий первое dAb по изобретению, которое связывается сIL-1R1, и второе dAb, которое имеет такую же или отличающуюся от первого dAb специфичность связывания. Второе dAb может связываться с мишенью, выбранной из следующего: АроЕ (аполипопротеин Е),Apo-SAA (Аро-сывороточный амилоид А-1), BDNF (нейротрофический фактор головного мозга), кардиотрофин-1, СЕА (карциноэмбриональный антиген), CD40 (кластер дифференцировки 40), лигандMDC (69 а.к.), МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1) (MCAF (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор, МСР-2, МСР-3, МСР-4, MDC (67 а.к.), MDC (69 а.к.), MIG (монокин,индуцируемый IFN), MIP-1 (макрофагальный белок воспаления 1), MIP-1, MIP-3, MIP-3, MIP-4,фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (MPIF-1), NAP-2 (нейтрофил-активирующий белок-2), нейртурин, фактор роста нервов (NGF), -NGF, NT-3 (нейротрофин-3), NT-4, онкостатин М,PDGF-AA (тромбоцитарный фактор роста-АА), PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4 (тромбоцитарный фактор 4),RANTES (цитокин, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками при активации), SDF1(фактор-1 стромальных клеток), SDF1, SCF, SCGF (фактор роста стволовых клеток), фактор стволовых клеток (SCF), TARC (хемокин, регулируемый тимусом и при активации), TGF- (трансформирующий фактор роста ), TGF-, TGF-2, TGF-3, фактор некроза опухолей (TNF), TNF-, TNF-, рецептор(фактор, ингибирующий миграцию макрофагов), MIP4, MDC, МСР-1, ММР, эластазу нейтрофилов, остеопонтин, ОХ-40, PARC (легочный хемокин, регулируемый активацией), PD-1 (рецептор апоптоза 1),RANTES, SCF, SDF-1, siglec8 (связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобный лектин 8),TARC, TGFb, тромбин, Tim-1 (семейство lg и муциновых доменов, член 1), TNF, TRANCE (индуцирующий TNF-ассоциированную активацию цитокин), триптазу, VEGF, VLA-4 (очень поздний антиген-4),VCAM (молекула адгезии сосудистых клеток), 47, CCR2 (хемокиновый рецептор-2 с СС-мотивом),CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, альфаvбета 8, альфаvбета 8, сМЕТ, CD8, vWF, амилоидные белки (например альфа-амилоид), ММР 12, PDK1 и lgE. В одном из примеров лиганд с двойной специфичностью содержит первое dAb, которое связывается с первым эпитопом на IL-1R1, и второе dAb, которое связывается с эпитопом на другой мишени. В еще одном примере второе dAb связывается с эпитопом на сывороточном альбумине. В других воплощениях лиганд представляет собой полиспецифический лиганд, который содержит первый эпитоп-связывающий домен, обладающий специфичностью связывания в отношении IL-1R1, и по меньшей мере один другой эпитоп-связывающий домен, обладающий специфичностью связывания,отличающейся от первого эпитоп-связывающего домена. Например, первый эпитоп-связывающий домен может представлять собой dAb, которое связывается с IL-1R1, или может представлять собой домен, который содержит CDR dAb, которое связывается с IL-1R1 (например CDR, перенесенные на подходящий белковый каркас или скелет, например аффитело, каркас SpA, домен LDL рецептора класса А или доменEGF) или может представлять собой домен, который связывается с IL-1R1, где домен выбран из аффитела, домена SpA, домена LDL рецептора класса А или домена EGF). В одном из воплощений антагонист IL-1R1 содержит полипептидный домен, обладающий специфичностью связывания в отношении IL-1R1, который связывает IL-1R1 человека с аффинностью (KD) от примерно 300 нМ до примерно 5 пМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. В одном из воплощений вариабельный домен по изобретению обладает специфичностью связывания в отношении IL-1R1, который связывает IL-1R1 человека с аффинностью (KD) от примерно 300 нМ до примерно 5 пМ, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. Антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие IL-1R1, могут связываться с IL1R1 с любой желаемой аффинностью и могут быть легко идентифицированы с использованием любого подходящего способа скрининга. Антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие IL1R1 (например dAb), как правило, связываются с KD (KD=Koff (kd)/Kon (ka), определяемой посредством поверхностного плазмонного резонанса) примерно от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 310-7 до 510-12 М),предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ, например от 5 нМ до 200 пМ, и, например, от 1 нМ до 100 пМ, например 110-7 М или меньше, например 110-8 М или меньше, например 110-9 М или меньше, например 110-10 М или меньше, например 110-11 М или меньше; и/или константой скорости Koff от 510-1 с-1 до 110-7 c-1, например от 110-2 с-1 до 110-6 с-1, например от 510-3 с-1 до 110-5 с-1, например 510-1 с-1 или меньше, например 110-2 с-1 или меньше, например 110-3 с-1 или меньше, например 110-4 с-1 или меньше, например 110-5 с-1 или меньше, например 110-6 с-1 или меньше, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. Некоторые антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие IL-1R1, специфически связываются с IL-1R1 человека с KD от 50 нМ до 20 пМ, и константой скорости Koff от 510-1 с-1 до 110-7 с-1, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. Предпочтительно антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие IL-1R1, ингибируют связывание IL-1 и/или IL-1 с IL-1R1 со средней ингибирующей концентрацией (IC50) 10 мкМ, 1 мкМ,100 нМ,0 нМ,1 нМ, 500 пМ, 300 пМ, 100 пМ, или 10 пМ. IC50 определяют,например, с использованием анализа связывания с рецептором in vitro, такого как анализ, описанный вIL-1R1, ингибировали IL-1- и/или IL-1-индуцированные функции в подходящем анализе in vitro со средней нейтрализующей дозой (ND50), которая составляет 10 М, 1 M, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ,500 пМ, 300 пМ, 100 пМ, или 10 пМ. Например, антагонисты, полипептиды и вариабельные домены, связывающие IL-1R1, могут ингибировать IL-1- и/или IL-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-8 клетками MRC-5 (АТСС (Американская коллекция типовых культур)CCL-171) в анализе in vitro, таком как анализ, описанный в WO 2006059108. В еще одном примере полипептиды и вариабельные домены связываются с IL-1R1 и могут ингибировать IL-1- и/или IL-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-6 в анализе цельной крови, таком как анализ, описанный в WO 2006059108. Лекарственные средства, вариабельные домены, полипептиды и антагонисты по изобретению могут быть предназначены для системного или локального введения. В некоторых воплощениях лекарственное средство предназначено для интраперитонеального или подкожного введения. В других воплощениях лекарственное средство предназначено для локального введения в легочную ткань, например лекарственное средство может быть предназначено для ингаляции или интраназального введения. В некоторых воплощениях лекарственное средство или антагонист дополнительно содержит антагонист рецептора 1 фактора некроза опухолей (TNFR1, р 55), или предназначен для введения вместе с антагонистом рецептора 1 фактора некроза опухолей (TNFR1, р 55). Протеазоустойчивые полипептиды, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и антагонисты по изобретению полезны в терапии, профилактике и диагностике заболевания или состояний у млекопитающих, например людей. В частности, пептиды и полипептиды полезны в качестве основы для лекарств, которые, вероятно, сталкиваются с протеазами при введении пациенту, такому как человек. Например, при введении в ЖК тракт (например при пероральном, подъязычном, ректальном введении), в этом случае полипептиды, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и антагонисты могут подвергаться воздействию протеазы в одном или более чем одном верхнем отделе ЖК тракта, нижнем отделе ЖК тракта, во рту, в желудке, тонкой кишке и толстой кишке. Таким образом, в одном из воплощений предложен протеазоустойчивый полипептид, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или антагонист для введения перорально, подъязычно или ректально в ЖК тракт пациента для лечения и/или профилактики заболевания или состояния у пациента. Например, пероральное введение пациенту (например пациенту-человеку) для лечения и/или профилактики IL-1-опосредованного состояния или заболевания, такого как артрит (например, ревматоидный артрит), IBD (воспалительное заболевание кишечника), псориаз или болезнь Крона. В еще одном примере полипептид, вариабельный домен или антагонист, вероятно, сталкивается с протеазой при введении (например путем ингаляции или интраназально) в легочную ткань (например легкое или дыхательные пути). Таким образом, в одном из воплощений предложено введение пациенту (например человеку) протеазоустойчивого полипептида, иммуноглобулинового единичного вариабельного домена или антагониста путем ингаляции или интраназально в легочную ткань пациента для лечения и/или профилактики заболевания или состояния у пациента. Такое состояние может представлять собой астму (например аллергическую астму), COPD (хроническое обструктивное заболевание легких), грипп или любое другое легочное заболевание или состояние, раскрытое в WO 2006038027, включенной в данную заявку посредством ссылки. Антагонисты, полипептиды и иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены по изобретению могут демонстрировать улучшенные или относительно высокие температуры плавления (Tm), обеспечивающие повышенную стабильность. Высокоаффинное связывание с мишенью может также или альтернативно представлять собой свойство антагонистов, полипептидов и вариабельных доменов. Одно или более чем одно из этих свойств,объединенное с устойчивостью к протеазе, делает антагонисты, вариабельные домены и полипептиды пригодными для применения в качестве лекарственных средств у млекопитающих, таких как люди, где,вероятно, сталкиваются с протеазами, например для введения в ЖК тракт или легочную ткань. В еще одном примере полипептид, вариабельный домен или антагонист, вероятно, сталкивается с протеазой при введении (например посредством внутриглазной инъекции или в виде глазных капель) в глаз пациента. Таким образом, в одном из воплощений предложено глазное введение пациенту (например человеку) протеазоустойчивого полипептида, иммуноглобулинового единичного вариабельного домена или антагониста для лечения у пациента и/или профилактики заболевания или состояния (например заболевания или состояния глаз). Введение может представлять собой местное введение в глаз, в форме глазных капель или путем инъекции в глаз, например в стекловидное тело глаза. Таким образом, в одном из аспектов в изобретении предложен антагонист IL-1R1 для пероральной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист IL-1R1 для доставки в ЖК тракт пациента. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста IL-1R1 в изготовлении лекарственного средства для пероральной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста IL-1R1 в изготовлении лекарственного средства для доставки в ЖК тракт пациента. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к трипсину и/или по меньшей мере одной другой протеазе, выбранной из эластазы, лейкозима и панкреатина. Например, устойчивость представляет собой устойчивость к трипсину и эластазе; трипсину и лейкозиму; трипсину и панкреатину; трипсину,эластазе и лейкозиму; трипсину, эластазе и панкреатину; трипсину, эластазе, панкреатину и лейкозиму; или трипсину, панкреатину и лейкозиму. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист IL-1R1 для внутрилегочной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист IL-1R1 для доставки в легкое пациента. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста IL-1R1 в изготовлении лекарственного средства для внутрилегочной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста IL-1R1 в изготовлении лекарственного средства для доставки в легкое пациента. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к лейкозиму. В одном из аспектов в изобретении предложен способ пероральной доставки или доставки лекарственного средства в ЖК тракт пациента или в легкое, или легочную ткань пациента, включающий введение пациенту фармацевтически эффективного количества антагониста IL-1R1 по изобретению. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист IL-1R1 по изобретению для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста IL-1R1 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном из воплощений состояние выбрано из группы, состоящей из артрита,рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника и хронического обструктивного заболевания легких. Например, указанный артрит представляет собой ревматоидный артрит или ювенильный ревматоидный артрит. Например, указанное воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы,состоящей из болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Например, указанное хроническое обструктивное заболевание легких выбрано из группы, состоящей из хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы. Например, указанная пневмония представляет собой бактериальную пневмонию. Например, указанная бактериальная пневмония представляет собой стафилококковую пневмонию. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист IL-1R1 для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагонистаIL-1R1 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики респираторного забо-9 018129 левания. Например, указанное респираторное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительной пневмонии, легочного инфильтрата с эозинофилией, заболевания легких, вызванного факторами окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального заболевания легких, первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения,расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, приступов апноэ во сне, острого респираторного дистресс-синдрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, заболевания "трансплантат против хозяина", рака легких, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергилломы, аспергиллеза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического легочного фиброза, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий,плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцитоза, пневмонии, легочного актиномикоза, легочного альвеолярного протеиноза, легочной формы сибирской язвы, отека легких, легочного эмбола, воспаления легких, гистиоцитоза X легких, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, туберкулеза легких, веноокклюзионного заболевания легких, ревматоидного заболевания легких, саркоидоза и гранулематоза Вегенера. Например, заболевание представляет собой хроническое обструктивное заболевание легких(COPD). Например, заболевание представляет собой астму. Антагонист по изобретению, содержащий агент, который ингибирует IL-1R1 (например, когда агент выбран из группы, состоящей из фрагментов антитела (например Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента,Fv-фрагмента (например scFv, связанный дисульфидной связью Fv), F(ab')2-фрагмента, dAb), лигандов и мономеров и мультимеров (например гомо- или гетеродимеров) dAb, может быть введен локально в легочную ткань (например легкое) субъекта с использованием любого подходящего способа. Например,агент может быть введен локально в легочную ткань путем ингаляции или интраназального введения. Для ингаляции или интраназального введения антагонист IL-1R1 может быть введен с использованием распылителя, ингалятора, пульверизатора, аэрозоля, туманообразователя, сухого порошкового ингалятора, дозирующего ингалятора, дозирующего распылителя, дозирующего туманообразователя, дозирующего пульверизатора или другого подходящего ингалятора или устройства для интраназальной доставки. Таким образом, в одном из воплощений изобретения предложено устройство для внутрилегочной доставки, содержащее антагонист IL-1R1. В одном из воплощений устройство представляет собой ингалятор или устройство для интраназальной доставки. Изобретение также относится к устройству для доставки лекарственного средства, содержащему фармацевтическую композицию, антагонист, полипептид или вариабельный домен по изобретению. Например, устройство для доставки лекарственного средства может представлять собой устройство для парентеральной доставки, устройство для внутривенной доставки, устройство для внутримышечной доставки, устройство для интраперитонеальной доставки, устройство для трансдермальной доставки, устройство для внутрилегочной доставки, устройство для внутриартериальной доставки, устройство для внутриоболочечной доставки, устройство для внутрисуставной доставки, устройство для подкожной доставки, устройство для интраназальной доставки, устройство для внутривагинальной доставки или устройство для ректальной доставки. В конкретных воплощениях устройство для доставки лекарственного средства выбрано из группы, состоящей из шприца, устройства для трансдермальной доставки, капсулы, таблетки, распылителя, ингалятора, пульверизатора, аэрозоля, туманообразователя, сухого порошкового ингалятора, дозирующего ингалятора, дозирующего распылителя, дозирующего туманообразователя, дозирующего пульверизатора и катетера. В одном из аспектов в изобретении предложен препарат для перорального введения, содержащий антагонист IL-1R1. Препарат может представлять собой таблетку, пилюлю, капсулу, жидкость или сироп. В одном из воплощений изобретения предложена легочная композиция для доставки в легкое, содержащая антагонист, полипептид или вариабельный домен по изобретению с размером частиц в диапазоне менее 5 мкм, например, менее 4,5, 4, 3,5 или 3 мкм (например, когда находится в буфере БриттонаРобинсона, например, при рН от 6,5 до 8,0, например, при рН от 7 до 7,5, например при рН 7 или при рН 7,5). В одном из воплощений предложены композиции и препараты по изобретению при рН от 6,5 до 8,0,например от 7 до 7,5, например 7 или, например, 7,5. Вариабельные домены, соответствующие любому аспекту изобретения, могут иметь Tm по меньшей мере 50 С, или по меньшей мере 55 С, или по меньшей мере 60 С, или по меньшей мере 65 С, или по меньшей мере 70 С. Антагонист, применение, способ, композиция, устройство или препарат по изобретению могут включать такой вариабельный домен. В одном аспекте изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению являются, по существу, стабильными после инкубации (в концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл) при 37-50 С в течение 14 суток в буфере БриттонаРобинсона. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается в неагрегированном состоянии после такой инкубации при 37 С. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86,- 10018129 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остается в мономерном состоянии после такой инкубации при 37 С. В одном из воплощений по меньшей мере 5, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида,антагониста или вариабельного домена остается в неагрегированном состоянии после такой инкубации при 50 С. В одном из воплощений по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остается в мономерном состоянии после такой инкубации при 50 С. В одном из воплощений никакой агрегации полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов не наблюдается после любой из таких инкубации. В одном из воплощений pl полипептида или вариабельного домена остается неизменной или, по существу,неизменной после инкубации при 37 С в концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона. В одном аспекте изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению являются, по существу, стабильными после инкубации (в концентрации полипептида или вариабельного домена 100 мг/мл) при 4 С в течение 7 суток в буфере Бриттона-Робинсона при рН от 7 до 7,5 (например при рН 7 или рН 7,5). В одном из воплощений по меньшей мере 95, 95,5, 96,96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается в неагрегированном состоянии после такой инкубации. В одном из воплощений по меньшей мере 95, 95,5,96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остается в мономерном состоянии после такой инкубации. В одном из воплощений никакой агрегации полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов не наблюдается после любой из таких инкубаций. В одном аспекте изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению являются, по существу, стабильными после распыления (в концентрации полипептида или вариабельного домена 40 мг/мл), например при комнатной температуре, 20 или 37 С, в течение 1 ч, например в струйном небулайзере, например колпачке Pari LC+. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается в неагрегированном состоянии после такого распыления. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92,93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остается в мономерном состоянии после такого распыления. В одном из воплощений никакой агрегации полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов не наблюдается после любого такого распыления. Вариабельный домен по изобретению в одном из воплощений ингибирует IL-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-8 клетками MRC-5 (АТССCCL-171) в анализе in vitro с ND50 (средняя нейтрализующая доза), которая составляет не более 1 мкМ. В одном из воплощений вариабельный домен дополнительно или альтернативно ингибирует связывание IL-1 с IL-1R1 с IC50, которая составляет не более 1 мкМ. В одном из воплощений вариабельный домен дополнительно или альтернативно ингибирует IL-1-индуцированное высвобождение интерлейкина-6 в анализе цельной крови с ND50, которая составляет не более 1 мкМ. Антагонист, применение, способ, устройство или композиция по изобретению могут содержать такой вариабельный домен. Существуют модельные системы на животных, которые могут быть использованы для скрининга эффективности антагонистов IL-1R1 в предупреждении, подавлении или лечении воспаления легких или респираторного заболевания. Например, подходящие животные модели респираторного заболевания включают модели хронического обструктивного респираторного заболевания (см. Groneberg, DA et al.,Respiratory Research 5:18 (2004 и модели астмы (см. Coffman et al., J. Exp. Med. 201(12):1875-1879(2001). Предпочтительно антагонист IL-1R1 эффективен в мышиной модели хронического обструктивного респираторного заболевания, индуцированного табачным дымом (например раскрытой в данной заявке субхронической модели) или подходящей модели астмы или хронического обструктивного респираторного заболевания у приматов. Более предпочтительно антагонист IL-1R1 эффективен в мышиной модели хронического обструктивного респираторного заболевания, индуцированного табачным дымом(например раскрытой в данной заявке субхронической модели) (см. также Wright and Churg, Chest,122:301-306 (2002. Например, введение эффективного количества лиганда может уменьшать, замедлять или предотвращать появление симптомов COPD в модели по сравнению с соответствующим контролем. Дополнительную подробную информацию об анализах и моделях применения в оценке антагонистов и вариабельных доменов по настоящему изобретению см. WO 2006059108, описание которой включено в данную заявку посредством ссылки. Антагонисты IL-1R1 могут быть использованы в виде отдельно вводимых композиций или в сочетании с другими агентами. Эти агенты могут включать различные лекарственные средства, такие как ингибиторы фосфодиэстеразы (например ингибиторы фосфодиэстеразы 4), бронхолитические средства(например формотерол и сальметерол), антихолинергические агенты кратковременного действия (на- 11018129 пример ипратропия бромид и окситропия бромид), антихолинергические агенты длительного действия(например тиотропий), теофиллин (например препарат кратковременного действия, препарат длительного действия), ингалируемые стероиды (например беклометазон, будезонид, флунизолид, флутиказона пропионат и триамцинолон), стероиды для перорального введения (например метилпреднизолон, преднизолон, преднизолон и преднизон), комбинации бета-агонистов кратковременного действия с антихолинергическими агентами (например альбутерол/сальбутамол/ипратропий и фенотерол/ипратропий),комбинации бета-агонистов длительного действия с ингалируемыми стероидами (например сальметерол/флутиказон и формотерол/будезонид) и муколитические агенты (например эрдостеин, ацетилцистеин, бромгексин, карбоцистеин, гвайфенезин и йодированный глицерин), циклоспорин, антибиотики, противовирусные средства, метотрексат, адриамицин, цисплатин и иммунотоксины. Композиции, содержащие антагонист IL-1R1 или его коктейль, могут быть введены для профилактического и/или терапевтического лечения. В некоторых терапевтических применениях количество, достаточное для достижения, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, килинга или какого-либо другого измеряемого параметра популяции селектированных клеток определяют как"терапевтически эффективную дозу" или "фармацевтически эффективную" дозу. Например, для лечения воспаления легких и/или респираторного заболевания может быть введено количество, ингибирующее образование мокроты, количество, ингибирующее воспаление при бронхиальной биопсии, количество,ингибирующее одышку, количество, увеличивающее объем форсированного выдоха в секунду (FEV (1,количество, улучшающее состояние здоровья, определенные в соответствующем опроснике, таком как опросник госпиталя Св. Георгия (St. George's Respiratory Questionnaire) (например улучшение оценки на 4 пункта). Количества, необходимые для достижения этих эффектов, зависят от тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента, но обычно варьируют от 0,005 до 10,0 мг антагониста IL-1R1 на килограмм массы тела, причем обычно используют дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/дозу. Для профилактических применений композиции, содержащие антагонист IL-1R1 или его коктейли,также могут быть введены в похожих или несколько меньших дозах для предупреждения, ингибирования или замедления начала заболевания (например для поддержания ремиссии или состояния покоя, или для предотвращения острой фазы). Опытный врач-клиницист способен определить подходящий интервал дозирования для лечения, подавления или предупреждения заболевания. Когда антагонист IL-1R1 вводят для лечения, подавления или предупреждения воспаления легких или респираторного заболевания, он может быть введен до четырех раз в сутки, два раза в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели,один раз в месяц, или один раз в два месяца, в дозе, например, от примерно 10 до примерно 80 мг/кг, от примерно 100 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 80 мг/кг, от примерно 1 до примерно 70 мг/кг, от примерно 1 до примерно 60 мг/кг, от примерно 1 до примерно 50 мг/кг, от примерно 1 до примерно 40 мг/кг, от примерно 1 до примерно 30 мг/кг, от примерно 1 до примерно 20 мг/кг, от примерно 1 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 до примерно 10 мг/кг, от примерно 10 до примерно 5 мг/кг, от примерно 10 мкг/кг до примерно 2,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг. В конкретных воплощениях антагонист IL-1R1 вводят для лечения, подавления или предупреждения воспаления легких или респираторного заболевания каждые сутки, каждые двое суток, один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц в дозе от примерно 10 мкг/кг до примерно 10 мг/кг (например примерно 10 мкг/кг, примерно 100 мкг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 6 мг/кг, примерно 7 мг/кг, примерно 8 мг/кг, примерно 9 мг/кг или примерно 10 мг/кг). Антагонист IL-1R1 можно вводить также для лечения, подавления или предупреждения воспаления легких или респираторного заболевания в суточной дозе или стандартной дозе примерно 10 мг, примерно 9 мг, примерно 8 мг, примерно 7 мг, примерно 6 мг, примерно 5 мг, примерно 4 мг, примерно 3 мг, примерно 2 мг или примерно 1 мг. Описанные в данной заявке лечение или терапия, проводимые с использованием антагониста IL1R1, рассматривают как "эффективные", например "фармацевтически эффективные", если один или более чем один симптом уменьшается (например, по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на одну точку по шкале клинической оценки) по сравнению с такими симптомами, присутствующими до лечения, или по сравнению с такими симптомами у индивидуума (человека или животной модели), которого не лечили с помощью такой композиции, или другого подходящего контроля. Симптомы будут варьировать в зависимости от предполагаемого заболевания или расстройства, но могут быть измерены средним специалистом-клиницистом или специалистом среднего звена в данной области техники. Такие симптомы могут быть измерены, например посредством мониторинга одного или более физических показателей заболевания или расстройства (например клеточного инфильтрата в легочной ткани, продукции слизи,клеточного инфильтрата в слизи, одышки, переносимости физической нагрузки, спирометрии (например форсированной жизненной емкости легких (FVC), форсированного объема выдоха в одну секунду (FEV(1), FEV (1)/FVC), степени или тяжести обострения заболевания, или с помощью приемлемой шкалы клинической оценки, например опросника госпиталя Св. Георгия. Подходящие шкалы клинической оценки включают, например, оценку степени обструкции потока воздуха в соответствии с FEV (1) (Clini- 12018129cal Guideline 12, Chronic Obstructive Respiratory disease, Management of Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Adults in Primary and Secondary Care, National Institute for Clinical Excellence, London (2004, максимальную скорость выдоха (PEF) (British Guideline on the Management of Asthma, British Thoracic Society, Scottish Intercollegiate Guidelines Network, Revised Edition (2004, стадию COPD в соответствии со стандартом Американского торакального общества (American Thoracic Society) (ATS) (Am. J. Respir. Crit.Care Med., 152:S77-S120 (1995), класс астматического нарушения в соответствии со стандартом ATS(Am. Rev. Respir. Dis., 147:1056-1061 (1993), или другую приемлемую шкалу клинической оценки, известную в данной области техники. Длительное (например в течение одних суток или больше, предпочтительно более длительное) уменьшение симптомов заболевания или расстройства по меньшей мере на 10% или на одну или более точек на заданной клинической шкале является показателем "эффективного" лечения. Аналогично, профилактика, осуществляемая с использованием описанной в данной заявке композиции, является "эффективной", если начало или тяжесть одного или более симптомов замедляется,уменьшается или прекращается по сравнению с такими симптомами у аналогичного индивидуума (человека или модельного животного), которого не лечили с помощью данной композиции. Композиция, содержащая антагонист IL-1R1 по настоящему изобретению, может быть использована в профилактических и терапевтических схемах для того, чтобы способствовать изменению, инактивации, килингу или удалению выбранной целевой популяции клеток у млекопитающего. Например, такая композиция может быть использована для уменьшения уровней воспалительных клеток в легком и/или ингибирования клеточной инфильтрации легкого. В одном из аспектов в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из аспектов изобретения, или кодирующая полипептид, антагонист или вариабельный домен по любому из аспектов изобретения. В одном из аспектов в изобретении предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту. В одном из аспектов в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор. В одном из аспектов в изобретении предложен способ получения полипептида, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, включающий поддержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты или вектора, посредством чего получают полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен. Способ может дополнительно включать выделение полипептида, вариабельного домена или антагониста и, возможно, получение варианта, например мутантного варианта, обладающего улучшенной аффинностью и/или ND50 по сравнению с выделенным полипептидом, вариабельным доменом или антагонистом. В данной области техники известны способы улучшения аффинности связывания иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, например способы созревания аффинности. В одном из аспектов в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, полипептид или антагонист по любому из аспектов изобретения и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или антагонист по любому из аспектов изобретения содержит константный домен антитела, например Fc антитела, возможно, где N-конец Fc связан (возможно непосредственно связан) с С-концом вариабельного домена. Полипептид или вариабельный домен по изобретению может быть выделенным и/или рекомбинантным. В данной заявке описан способ селекции протеазоустойчивого пептида или полипептида. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение репертуара и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и извлечение пептида или полипептида, обладающего желаемой биологической активностью (например специфическим связыванием с IL-1R1), посредством чего селектируют протеазоустойчивый пептид или полипептид. Репертуар и протеазу, как правило, инкубируют в течение периода по меньшей мере примерно 30 мин. В данном способе может быть использована любая желаемая протеаза, такая как одна или более из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеаза, карбоксипептидаза (например карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В),трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины(например катепсин G), протеиназа (например протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин,химозин, энтеропептидаза, каспаза (например каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может быть получена из биологического экстракта, биологического гомогената или биологического препарата. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к данной комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации. В некоторых воплощениях пептид или полипептид, который имеет желаемую биологическую активность, извлекают на основании связывающей активности. Например, пептид или полипептид может быть извлечен на основании связывания с типичным лигандом, таким как белок А, белок G или белок L. Связывающая активность также может представлять собой специфическое связывание с целевым лиган- 13018129 дом. Типичные целевые лиганды включают АроЕ (аполипопротеин Е), Apo-SAA (Аро-сывороточный амилоид А-1), BDNF (нейротрофический фактор головного мозга), кардиотрофин-1, СЕА (карциноэмбриональный антиген), CD40 (кластер дифференцировки 40), лиганд CD40, CD56, CD38, CD138, EGF(интерферон-индуцибельный белок 10), фактор роста кератиноцитов-2 (KGF-2), KGF, лептин, LIF (лейкоз-ингибирующий фактор), лимфотактин, вещество, ингибирующее мюллеровы протоки, фактор, ингибирующий колониеобразование моноцитов, белок-аттрактант моноцитов, M-CSF (колониестимулирующий фактор макрофагов), MDC (макрофагальный хемокин) (67 а.к.), MDC (69 а.к.), МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1) (MCAF (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор,МСР-2, МСР-3, МСР-4, MDC (67 а.к.), MDC (69 а.к.), MIG (монокин, индуцируемый IFN), MIP-1 (макрофагальный белок воспаления 1), MIP-1, MIP-3, MIP-3, MIP-4, фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (MPIF-1), NAP-2 (нейтрофил-активирующий белок-2), нейртурин, фактор роста нервов (NGF), -NGF, NT-3 (нейротрофин-3), NT-4, онкостатин M, PDGF-AA (тромбоцитарный фактор роста-АА), PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4 (тромбоцитарный фактор 4), RANTES (цитокин, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками при активации), SDF1 (фактор-1 стромальных клеток),SDF1, SCF, SCGF (фактор роста стволовых клеток), фактор стволовых клеток (SCF), TARC (хемокин,регулируемый тимусом и при активации), TGF- (трансформирующий фактор роста ), TGF-, TGF-2,TGF-3, фактор некроза опухолей (TNF), TNF-, TNF-, рецептор I TNF, рецептор II TNF, TNIL-1, ТРО(тромбопоэтин), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия), VEGF A, VEGF В, VEGF С, VEGF D, рецептор 1 VEGF, рецептор 2 VEGF, рецептор 3 VEGF, GCP-2 (гранулоцитарный хемотаксический фактор 2), GRO/MGSA (регулирующий рост онкоген/фактор, стимулирующий рост меланомы), GRO-, GRO-,HCC1 (гемофильтратный СС-хемокин 1), 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, сывороточный альбумин,vWF (фактор (фон) Виллебранда), амилоидные белки (например альфа-амилоид), ММР 12 (матриксная металлопротеаза 12), PDK1 (PI3K(фосфатидилинозит-3-киназа)-зависимая киназа 1), IgE (иммуноглобулин Е), IL-13R1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23, IL-23R, IL-25, CD2,CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5 (активиновый рецептор-подобная киназа 5), EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), FcER1 (высокоаффинный рецептор для IgE), TGFb, CCL2 (хемокиновый лиганд-2 с СС-мотивом), CCL18, СЕА, CR8 (цитокинотвечающие (CR) гены), CTGF (фактор роста соединительной ткани), CXCL12 (хемокиновый лиганд-12 с СХС-мотивом) (SDF-1), химазу, FGF, фурин, эндотелин-1, эотаксины (например эотаксин, эотаксин-2,эотаксин-3), GM-CSF, ICAM-1 (фактор межклеточной адгезии 1), ICOS (индуцибельный Т-клеточный костимулятор), IgE, IFN, I-309, интегрины, L-селектин, MIF (фактор, ингибирующий миграцию макрофагов), MIP4, MDC, МСР-1, ММР, эластазу нейтрофилов, остеопонтин, ОХ-40, PARC (легочный хемокин, регулируемый активацией), PD-1 (рецептор апоптоза 1), RANTES, SCF, SDF-1, siglec8 (связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобный лектин 8), TARC, TGFb, тромбин, Tim-1 (семействоIg и муциновых доменов, член 1), TNF, TRANCE (индуцирующий TNF-ассоциированную активацию цитокин), триптазу, VEGF, VLA-4 (очень поздний антиген-4), VCAM (молекула адгезии сосудистых клеток), 47, CCR2 (хемокиновый рецептор-2 с СС-мотивом), CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8,альфаvбета 6, альфаvбета 8, сМЕТ, CD8, vWF, амилоидные белки (например альфа-амилоид), ММР 12,PDK1 и IgE. В конкретных воплощениях пептид или полипептид извлекают посредством пэннинга. В некоторых воплощениях репертуар включает дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомный дисплей, компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей (covalent display). Примерные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы (genetic packages). В некоторых воплощениях дисплейная система представляет собой бактериофаговый дисплей. Например, бактериофагом может быть fd, M13, лямбда, MS2 или T7. В конкретных воплощениях бактериофаг-дисплейная система является поливалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка pIII. В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты, ко- 14018129 дирующей пептид или полипептид, который имеет желаемую биологическую активность. В конкретных воплощениях нуклеиновую кислоту амплифицируют посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции. В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В более конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человека. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человека. В другом аспекте изобретение относится к способу селекции пептида или полипептида, который связывает с высокой аффинностью целевой лиганд (например IL-1R1) из репертуара пептидов или полипептидов. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение этого репертуара и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и извлечение пептида или полипептида, который связывается с целевым лигандом. Репертуар и протеазу обычно инкубируют в течение по меньшей мере примерно 30 мин. В данном способе может быть использована любая желаемая протеаза, такая как одна или более чем одна из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеаза, карбоксипептидаза (например карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В),трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины(например катепсин G), протеиназа (например протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин,химозин, энтеропептидаза, каспаза (например каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может быть получена из биологического экстракта, биологического гомогената или биологического препарата, например цельных клеток in vitro. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к данной комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации. Пептид или полипептид может быть извлечен на основании связывания с любым желаемым целевым лигандом, таким как целевые лиганды (например IL-1R1), описанные в данной заявке. В конкретных воплощениях пептид или полипептид извлекают посредством пэннинга. В некоторых воплощениях репертуар включает дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомный дисплей, компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. Примерные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида,кодируемого данной нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы. В некоторых воплощениях дисплейная система представляет собой бактериофаговый дисплей. Например, бактериофаг может представлять собой fd, M13, лямбда, MS2 или Т 7. В конкретных воплощениях бактериофаг-дисплейная система является поливалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка pIII. В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или полипептид, который имеет желаемую биологическую активность. В конкретных воплощениях нуклеиновую кислоту амплифицируют посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции. В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В более конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человека. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человека. В другом аспекте в данной заявке описан способ получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и извлечение множества пептидов или полипептидов, которые имеют желаемую биологическую активность, посредством чего получают репертуар протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. В некоторых воплощениях репертуар и протеазу инкубируют в течение по меньшей мере примерно 30 мин. Например, протеаза, используемая в данном способе, может представлять собой одно или более чем одно из следующего: сериновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксную металлопротеазу, карбоксипептидазу (например карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластазу, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин,- 15018129 катепсины (например катепсин G), протеиназу (например протеиназу 1, протеиназу 2, протеиназу 3),термолизин, химозин, энтеропептидазу, каспазу (например каспазу 1, каспазу 2, каспазу 4, каспазу 5,каспазу 9, каспазу 12, каспазу 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепаразу. В конкретных воплощениях протеазой является трипсин, эластаза или лейкозим. Протеаза также может быть получена из биологического экстракта, биологического гомогената или биологического препарата. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к данной комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации. В некоторых воплощениях множество пептидов или полипептидов, которые имеют желаемую биологическую активность, извлекают на основании связывающей активности. Например, множество пептидов или полипептидов может быть извлечено на основании связывания с типичным лигандом, таким как белок А, белок G или белок L. Связывающая активность также может относиться к специфическому связыванию с целевым лигандом, таким как целевой лиганд, описанный в данном изобретении. В конкретных воплощениях множество пептидов или полипептидов, которые имеют желаемую биологическую активность, извлекают посредством пэннинга. В некоторых воплощениях репертуар включает дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомный дисплей, компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. В конкретных воплощениях дисплейная система связывает кодирующую функцию и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы. В некоторых воплощениях дисплейная система представляет собой бактериофаговый дисплей. Например, бактериофаг может представлять собой fd, M13, лямбда, MS2 или T7. В конкретных воплощениях бактериофаг-дисплейная система является поливалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка pIII. В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновых кислот, кодирующих множество пептидов или полипептидов, которые имеют желаемую биологическую активность. В конкретных воплощениях нуклеиновые кислоты амплифицируют посредством амплификации фагов,роста клеток или полимеразной цепной реакции. В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В более конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человека. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человека. В другом аспекте изобретение относится к способу селекции протеазоустойчивого полипептида,содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (dAb), который связывается с целевым лигандом (например IL-1R1) из репертуара. В одном из воплощений способ включает получение фаг-дисплейной системы, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной фаг-дисплейной системы и протеазы, выбранной из группы, состоящей из эластазы, лейкозима и трипсина, в условиях, подходящих для протеазной активности, и извлечение фага, который экспонирует полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с целевым лигандом. В некоторых воплощениях протеазу используют в концентрации 100 мкг/мл и объединенные фагдисплейную систему и протеазу инкубируют при примерно 37 С в течение ночи. В некоторых воплощениях фаг, который экспонирует полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с целевым лигандом, извлекают посредством связывания с указанной мишенью. В других воплощениях фаг, который экспонирует полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывается с целевым лигандом, извлекают посредством пэннинга. Также описан выделенный протеазоустойчивый пептид или полипептид, селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке. В конкретном воплощении предложен выделенный, устойчивый к протеазам (например трипсину, эластазе, лейкозиму) иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (например вариабельный домен тяжелой цепи антитела человека, вариабельный домен легкой цепи антитела человека), селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке. В данной заявке также описана выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая кодирует протеазоустойчивый пептид или полипептид (например трипсин-, эластаза- или лейкозимустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке, и векторы (например экспрессирующие векторы) и клеткихозяева, которые содержат данные нуклеиновые кислоты. В данной заявке также описан способ получения протеазоустойчивого пептида или полипептида(например трипсин-, эластаза- или лейкозим-устойчивого иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного способами, описанными в данной заявке, включающий поддержание клетки-хозяина, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазоустойчивый пептид или полипептид, в условиях, подходящих для экспрессии, в результате чего продуцируется протеазоустойчивый пептид или полипептид. В данной заявке также описан протеазоустойчивый пептид или полипептид (например трипсин-,эластаза- или лейкозим-устойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), селектируемый или селектированный способами, описанными в данной заявке, для применения в медицине (например для терапии или диагностики). В данной заявке также описано применение протеазоустойчивого пептида или полипептида (например трипсин-, эластаза- или лейкозим-устойчивого иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного способами, описанными в данной заявке, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания. В данной заявке также описан способ лечения заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества протеазоустойчивого пептида или полипептида (например трипсин-, эластазаили лейкозим-устойчивого иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного способами, описанными в данной заявке. В данной заявке дополнительно описан диагностический набор для определения того, присутствует ли в образце IL-1R1 или как много IL-1R1 присутствует в образце, включающий полипептид, dAb или антагонист по изобретению и инструкции по применению (например для определения присутствия и/или количества IL-1R1 в образце). В некоторых воплощениях набор дополнительно включает один или более чем один вспомогательный реагент, такой как подходящий буфер или подходящий детектирующий реагент (например детектируемое меченое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающий полипептид или dAb по изобретению, или группировку, ассоциирующуюся или конъюгированную с ним). Изобретение также относится к устройству, содержащему твердую поверхность, на которой иммобилизован полипептид или dAb по изобретению таким образом, что иммобилизованный полипептид илиdAb связывается с IL-1R1. Могут быть использованы любые подходящие твердые поверхности, на которых могут быть иммобилизованы антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например стекло,пластик, углеводороды (например агарозные гранулы). Если желательно, то подложка может содержать или может быть модифицирована с получением желаемых функциональных групп для облегчения иммобилизации. Устройство и/или подложка могут иметь любую подходящую форму, например форму листа,стержня, ленты, пластины, предметного стекла, шарика, гранулы, диска, геля, пробирки, сферы, чипа,планшета или чашки и т.п. В некоторых воплощениях устройство представляет собой тест-полоску. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 представляет собой иллюстрацию сайта множественного клонирования pDOM13 (также известного как pDOM33), который использовали для получения фаг-дисплейного репертуара. На фиг. 2 показаны несколько гелей Novex 10-20% Tricine с образцами dAb, отобранными в разные моменты времени, которые инкубировали с трипсином в концентрации 40 мкг/мл при 30 С. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 1 х SureBlue. Гели иллюстрируют, что и DOM15-10, и DOM15-26501 оба подвергались значительному перевариванию в течение первых трех часов инкубации с трипсином. Переваривание DOM15-26, DOM4-130-54 и DOM1h-131-511 становилось заметным только через 24 ч инкубации с трипсином. Фиг. 3 представляет собой иллюстрацию аминокислотных последовательностей DOM1h-131-511 и 24 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие CDR1 (гипервариабельный участок 1), CDR2 и CDR3, обведены рамками. Фиг. 4 представляет собой иллюстрацию аминокислотных последовательностей DOM4-130-54 и 27 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, обведены рамками. Фиг. 5 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности DOM15-26-555 и 21 селектированного варианта. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, обведены рамками. Фиг. 6 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности DOM15-10 и 16 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, обведены рамками. Фиг. 7A-7D представляют кривые BIAcore, показывающие связывание родительского dAb, DOM1h131-511 (фиг. 7 А), и трех вариантов dAb, DOM1h-131-203 (фиг. 7 В), DOM1h-131-204 (фиг. 7C) и DOM1h- 17018129 131-206 (фиг. 7D), с иммобилизованным TNFR1 после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37 С. Результаты демонстрируют, что все три варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина (100 мкг/мл). Фиг. 8 А-8 С представляют кривые BIAcore, показывающие связывание dAb DOM1h-131-511 (фиг. 8 А), DOM1h-131-202 (фиг. 8 В) и DOM1h-131-206 (фиг. 8 С) с иммобилизованным TNFR1 после инкубации с эластазой и лейкозимом в течение ночи. Эти dAb продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом против эластазы и лейкозима. На фиг. 9 показаны два геля 4-12% Novex Bis-Tris с образцами dAb DOM1h-131-511, DOM1h-131203, DOM1h-131-204, DOM1h-131-206, DOM1h-131-54, DOM1h-131-201 и DOM1h-131-202 перед инкубацией с трипсином, и образцами после инкубации с 100 мкг/мл трипсина в течение 1, 3 и 24 ч. Фиг. 10 А-10 С представляют кривые BIAcore, показывающие связывание DOM4-130-54 (фиг. 10 А),DOM4-130-201 (фиг. 10 В) и DOM4-130-202 (фиг. 10 С) с иммобилизованным слитым белком IL-1R1 после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37 С. Результаты демонстрируют, что оба варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина. Фиг. 11 А-11 С представляют кривые BIAcore, показывающие связывание DOM4-130-54 (фиг. 11A),DOM4-130-201 (фиг. 11 В) и DOM4-130-202 (фиг. 11 С) с иммобилизованным слитым белком IL-1R1 после инкубации с эластазой и лейкозимом в течение ночи. Эти dAb продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом против обеих тестируемых протеаз. Фиг. 12 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности DOM15-26-555 и 6 вариантов. Аминокислоты, которые отличаются от родительской последовательности, в селектированных клонах указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Фиг. 13 А и 13 В представляют кривые BIAcore, показывающие связывание родительского dAb,DOM15-26-555 (фиг. 13 А), и наиболее протеазоустойчивого варианта, DOM15-26-593 (фиг. 13 В), с иммобилизованным VEGF. Родительское антитело и вариант сравнивали на BIAcore в отношении связывания с hVEGF (VEGF человека) при концентрации dAb 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 3 или 24 ч при 37 С. Результаты демонстрируют,что вариант более устойчив, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином. Фиг. 14 представляет собой график, показывающий влияние обработки трипсином на связывание вариантов DOM15-26-555 с hVEGF. Результаты ясно демонстрируют, что все варианты более устойчивы,чем родительское антитело (DOM15-26-555), к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином. На фиг. 15 показаны два геля Novex 10-20% Tricine, на которые наносили по 15 мкг обработанных и необработанных образцов DOM15-26-555 или DOM15-26-593. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 2, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 1 х SureBlue. Гели иллюстрируют, что профиль устойчивости к трипсину для DOM15-26-593 отличается от профиля, продемонстрированного BIAcore экспериментом. Фиг. 16 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности DOM15-10 и варианта DOM15-10-11. Аминокислоты, которые в этом варианте отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Фиг. 17 А и 17 В представляют кривые BIAcore, показывающие связывание родительского антителаDOM15-10 (фиг. 17 А) и варианта DOM15-10-11 (фиг. 17 В), с иммобилизованным VEGF. Родительское антитело и вариант сравнивали на BIAcore в отношении связывания с hVEGF при концентрации dAb 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 1, 3 и 24 ч при 37 С. Результаты демонстрируют, что вариант более устойчив, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином. На фиг. 18 показаны два геля Novex 10-20% Tricine, на которые наносили по 15 мкг образцовDOM15-10 и DOM15-10-11. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью SureBlue (1x). Результаты демонстрируют, что связывающая активность, обнаруженная в BIAcore исследовании, непосредственно отражает целостность белка. Фиг. 19A-19L иллюстрируют нуклеотидные последовательности нескольких нуклеиновых кислот,кодирующих dAb, которые представляют собой варианты DOM1h-131-511 или DOM4-130-54. Нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, представленные соответственно на фиг. 3 и 4. Фиг. 20 А-20 Е иллюстрируют нуклеотидные последовательности нескольких нуклеиновых кислот,кодирующих dAb, которые представляют собой варианты DOM15-26-555 или DOM15-10. Нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, представленные соответственно на фиг. 5 и 6. На фиг. 21 показана карта вектора pDOM 38. На фиг. 22 показан гель (Labchip) с белками DOM10-53-474 и DOM15-26-593, обработанными трипсином при соотношении dAb:трипсин 25:1 при 30 С в различные моменты времени. Стрелки указывают на полноразмерный белок. На фиг. 23 представлены кривые гель-фильтрации (SEC), демонстрирующие высокий уровень чистоты, полученный для каждого образца после очистки посредством ММС-хроматографии, затем анионного обмена. УФ контролировали при 225 нм и через колонку пропускали 1 х PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 10% этанола (об./об.). Процентное содержание мономера рассчитывали посредством интегрирования площади пика с учетом фона. На фиг. 24 представлены данные по стабильности к протеазам для DOM1h-131-511, DOM1h-131202 и DOM1h-131-206. На фиг. 25 представлены результаты SEC, которые иллюстрируют данные по стабильностиDOM1h-131-202, DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 в течение 14 суток в буфере Бриттона-Робинсона при 37 и 50 С. Концентрация белка для всех dAb составляла 1 мг/мл. SEC использовали для определения того, произошли ли какие-либо изменения в белке во время теплового стресса и в количестве мономера,остающегося в растворе, по сравнению с образцом на момент времени 0 (Т 0). На фиг. 26 А-I показаны SEC кривые, демонстрирующие влияние теплового стресса (37 и 50 С) наDOM1h-131-511 (A-C), -202 (D-F) и -206 (G-I). Также показан процент мономера, остающегося в растворе, относительно Т=0 в заданный момент времени. На фиг. 27 показан IEF (изоэлектрофокусирование) анализ DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 иDOM1h-131-511 на 24, 48 ч и 7-е и 14-е сутки теплового стресса. Образцы инкубировали либо при 37,либо при 50 С в буфере Бриттона-Робинсона. Фиг. 28 - RBA (receptor binding assay, анализ связывания с рецептором) с TNFR-1, демонстрирующий влияние 14-суточной инкубации DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 при 50 С. Концентрацию белка считали равной 1 мг/мл. Также показано отрицательное контрольное dAb (имитация (dummy) VH), которое не связывалось с антигеном. На фиг. 29 проиллюстрированы эффекты хранения A: DOM1h-131-202, В: DOM1h-131-206 и С:DOM1h-131-511 в концентрации примерно 100 мг/мл в течение 7 суток в буфере Бриттона-Робинсона при +4 С. УФ контролировали при 280 нм. На фиг. 30 показаны данные тестирования DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 с использованием небулайзеров Pari E-flow и LC+. Концентрация белка в каждом случае составляла 5 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона. На фиг. 31 проиллюстрированы относительные процентные изменения концентраций мономера в процессе распыления DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 в буфере Бриттона-Робинсона при 5 мг/мл. На фиг. 32 показаны SEC кривые для DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 в буфере БриттонаРобинсона после распыления из Pari LC+. На фиг. 33 показаны SEC кривые для DOM1h-131-206 в процессе распыления в течение 1 ч при 40 мг/мл в PBS. Белки, находящиеся как в колпачке небулайзера, так и в аэрозоле, обладают высокой устойчивостью к эффектам сдвига и теплового стресса, которым может подвергаться dAb при распылении. На фиг. 34 показаны кривые скорости седиментации для каждого из трех основных белков(DOM1h-131-206, DOM1h-131-511 и DOM1h-131-202). Бимодальный пик, наблюдаемый для образца с более низкой концентрацией, DOM1h-131-206, в этом случае представляет собой артефакт вследствие утечки образца из ячейки. На фиг. 35 показано влияние буфера и устройства на размер капли при распылении GSK1995056A(DOM1h-131-511). Фиг. 36 - стабильность GSK1995056A (DOM1h-131-511) после распыления в различных устройствах, оцениваемая по образованию димеров, как измерено с использованием SEC. На фиг. 37 показаны данные тестирования GSK1922567A (202), GSK1995057A (206) иGSK1995056A (511) с использованием небулайзеров Pari E-flow и LC+. А) тестирование в буфере Бриттона-Робинсона, В) тестирование в ПЭГ 1000/сахарозном буфере. На фиг. 38 изображена кривая зависимости от дозы TNF-, полученная в анализе связывания с рецептором TNFR1 человека. Каждый образец тестировали в четырех повторах. На фиг. 39 показано ингибирование посредством GSK1922567A (DOM1h-131-202), GSK1995057A(DOM1h-131-206) и GSK1995056A (DOM1h-131-511) в анализе связывания с рецептором TNFR1 человека. Каждый образец тестировали в четырех повторах. На фиг. 40 проиллюстрирована эффективность dAb DOM15-26 и DOM15-26-593 в RBA с VEGF. На фиг. 41 показаны фармакокинетические данные для DMS1529 (DOM 15-26-593) и DMS1545(DOM15-26-501) после однократного в/в (внутривенного) введения болюсной дозы крысам в концентрации 5 мг/мг. На фиг. 42 а показан SEC-MALLS (гель-хроматография/многоугловое лазерное светорассеяние) анализ слитой конструкции DMS1529Fc (слитой конструкции DOM 15-26-593 Fc), подтверждающий мономерные свойства. Показаны две разные партии, которые демонстрируют похожие свойства в отношении показателя преломления (т.е. концентрации; пунктирные линии) и светорассеяния (сплошные линии). Линия, отмеченная стрелкой, показывает расчет молекулярной массы. На фиг. 42b показан AUC (аналитическое ультрацентрифугирование) анализ слитой конструкцииDMS1529Fc (слитой конструкции DOM 15-26-593 Fc), подтверждающий мономерные свойства. Одну партию вещества тестировали в трех разных концентрациях, приблизительно равных 0,2, 0,5 и 1,0 мг/мл в PBS-буфере. Анализ скорости седиментации подтвердил, что молекулярная масса составляет приблизительно 80 кДа. На фиг. 43 показаны DSC (дифференциальная сканирующая калориметрия) кривые для DMS1529VEGF для DMS1529 (DOM 15-26-593) до и после 10 циклов замораживания-оттаивания для двух разных партий вещества. На фиг. 45 показан SEC-профиль устойчивости DOM 15-26-593 до и после 10 циклов замораживания-оттаивания. На фиг. 46 проиллюстрированы результаты ускоренного исследования стабильности для слитой конструкции DMS1529 (слитой конструкции DOM 15-26-593 Fc); где связывание в ELISA демонстрирует активность через 7 суток инкубации при показанной температуре. На фиг. 47 А показана стабильность DMS1529 (DOM 15-26-593) у яванского макака через 14 и 15 суток инкубации при 37 С. На фиг. 47 В показана стабильность DMS1529 (DOM 15-26-593) в сыворотке человека через 14 и 15 суток инкубации при 37 С. На фиг. 48 показана эффективность dAb DOM15-26 и DOM15-26-593 в виде Fc слияний (DMS1564 и 1529 соответственно) в RBA с VEGF. На фиг. 49 проиллюстрировано ингибирование пролиферации клеток HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) слитой конструкцией DMS1529 (слитой конструкцией DOM15-26-593Fc). Фиг. 50 - карта вектора pDom33. На фиг. 51 изображены последовательности (аминокислотная и нуклеотидная) dAb, связывающихся с сывороточным альбумином. Подробное описание изобретения Данное изобретение раскрыто в данном описании со ссылкой на воплощения, что делает возможным составление ясного и четкого описания. Предполагается и должно быть очевидным, что данные воплощения можно различным образом комбинировать или разделять без отклонения от сущности изобретения. Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники (например в клеточном культивировании, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, методах гибридизации и биохимии). Стандартные методы используются для молекулярных, генетических и биохимических способов (в общем см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring(1999) 4 Ed, John WileySons, Inc., включенные в данную заявку посредством ссылки) и химических способов. Как использовано в данной заявке, "рецептор интерлейкина-1 типа 1" (IL-1R1; CD121a) относится к встречающимся в природе или эндогенным белкам IL-1R1 млекопитающих и к белкам, имеющим аминокислотную последовательность, которая является такой же, как у встречающегося в природе или эндогенного белка, соответствующего IL-1R1 млекопитающего (например рекомбинантные белки, синтетические белки (т.е. полученные с использованием способов синтетической органической химии. Соответственно, как определено в данной заявке, данный термин включает зрелый белок, полиморфные или аллельные варианты и другие изоформы IL-1R1 (например полученные посредством альтернативного сплайсинга или других клеточных способов), и их модифицированные или немодифицированные формы(например липидированные, гликозилированные). Встречающиеся в природе или эндогенные IL-1R1 включают белки дикого типа, такие как зрелый IL-1R1, полиморфные или аллельные варианты и другие изоформы, которые встречаются в природе у млекопитающих (например людей, приматов, не являющихся людьми). Такие белки могут быть извлечены или выделены из источника, который в природе продуцирует, например, IL-1R1. Эти белки и белки IL-1R1, имеющие такую же аминокислотную последовательность, как встречающиеся в природе или эндогенные соответствующие IL-1R1, называют по названию соответствующего млекопитающего. Например, когда соответствующее млекопитающее представляет собой человека, тогда белок обозначают как IL-1R1 человека. Как использовано в данной заявке, "антагонист рецептора интерлейкина-1 типа 1 (IL-1R1)" относится к любому соединению (например полипептиду), которое может быть введено индивидууму для обеспечения благоприятного терапевтического или диагностического воздействия посредством связывания с IL-1R1 и ингибирования функции IL-1R1 у индивидуума (например ингибирует связывание IL-1 и/или IL-1 с IL-1R1, ингибирует передачу сигнала функции через IL-1R1 при связывании IL-1 и/илиIL-1P). Как использовано в данной заявке, "пептид" относится к аминокислотам в количестве от примерно двух до примерно 50, которые соединены вместе посредством пептидных связей. Как использовано в данной заявке, "полипептид" относится к по меньшей мере примерно 50 аминокислотам, которые соединены вместе пептидными связями. В большинстве случаев полипептиды имеют третичную структуру и сворачиваются в функциональные домены. Как использовано в данной заявке, пептид или полипептид (например доменное антитело (dAb,который является "устойчивым к расщеплению протеазой", по существу, не расщепляется протеазой при инкубации с данной протеазой в условиях, подходящих для протеазной активности. Полипептид (например dAb), по существу, не расщепляется, когда не более чем примерно 25%, не более чем примерно 20%,не более чем примерно 15%, не более чем примерно 14%, не более чем примерно 13%, не более чем примерно 12%, не более чем примерно 11%, не более чем примерно 10%, не более чем примерно 9%, не более чем примерно 8%, не более чем примерно 7%, не более чем примерно 6%, не более чем примерно 5%, не более чем примерно 4%, не более чем примерно 3%, не более чем примерно 2%, не более чем примерно 1% белка расщепляется протеазой, или, по существу, никакое количество белка не расщепляется протеазой при инкубации с протеазой в течение примерно одного часа при температуре, подходящей для протеазной активности. Например, при 37 или 50 С. Расщепление белка можно оценивать с использованием любого подходящего способа, например, с использованием SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) или функционального анализа (например, связывания с лигандом), как описано в данной заявке. Как использовано в данной заявке, "дисплейная система" относится к системе, в которой "коллекция" полипептидов или пептидов доступна для селекции на основании желаемой характеристики, такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например в растворе, иммобилизованном на подходящей подложке). Дисплейная система также может представлять собой биохимическую систему, которая использует клеточную экспрессирующую систему (например экспрессию библиотеки нуклеиновых кислот, например в трансформированных, инфицированных, трансфицированных или трансдуцированных клетках и экспонирование кодируемых полипептидов на поверхности этих клеток) или бесклеточную экспрессирующую систему (например компартментализацию и дисплей с использованием эмульсии). Примерные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. Когда используют такую дисплейную систему, тогда можно выбрать полипептиды или пептиды, имеющие желаемую физическую, химическую и/или функциональную характеристику, и можно легко выделить или извлечь нуклеиновую кислоту, кодирующую селектированный полипептид или пептид. В данной области техники известны различные дисплейные системы,которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, например бактериофаговый дисплей (фаговый дисплей, например фагмидный дисплей), рибосомный дисплей, компартментализация и дисплей с использованием эмульсии, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей, ковалентный дисплей и тому подобное (см., например, ЕР 0436597 (Dyax), патент США 6172197 (McCafferty et al.), патент США 6489103 (Griffiths et al Как использовано в данной заявке, "репертуар" относится к коллекции полипептидов или пептидов,которые характеризуются разнообразием аминокислотных последовательностей. Индивидуальные члены репертуара могут иметь общие признаки, такие как общие структурные признаки (например, общую коровую структуру) и/или общие функциональные признаки (например, способность связываться с общим лигандом (например типичным лигандом или целевым лигандом, IL-1R1. Как использовано в данной заявке, "функциональный" описывает полипептид или пептид, который имеет такую биологическую активность, как специфическая связывающая активность. Например, термин"функциональный полипептид" включает в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном посредством своего антигенсвязывающего сайта. Как использовано в данной заявке, "типичный лиганд" относится к лиганду, который связывается со значительной частью функциональных членов (например, по существу, всеми функциональнами членами) заданного репертуара. Типичный лиганд (например, общий типичный лиганд) может связываться со многими членами заданного репертуара даже несмотря на то, что эти члены могут не обладать специфичностью связывания, присущей общему целевому лиганду. В общем случае присутствие функционального сайта связывания с типичным лигандом на полипептиде (на что указывает способность связывания с типичным лигандом) указывает на то, что полипептид правильно свернут и функционален. Подходящие примеры типичных лигандов включают суперантигены, антитела, которые связываются с эпитопом, экспрессируемым на значительной части функциональных членов репертуара, и тому подобное."Суперантиген" представляет собой термин в данной области техники, который относится к типич- 21018129 ным лигандам, взаимодействующим с членами иммуноглобулинового суперсемейства в сайте, отличающемся от сайтов этих белков, связывающихся с целевым лигандом. Примерами суперантигенов являются стафилококковые энтеротоксины, которые взаимодействуют с Т-клеточными рецепторами. Суперантигены, которые связываются с антителами, включают белок G, который связывается с константной областью IgG (Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133: 969 (1984; белок А, который связывается с константной областью IgG и VH-доменами (Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97: 822 (1966; и белок L, который связывается с VL-доменами (Bjorck, J. Immunol., 140: 1194 (1988. Как использовано в данной заявке, "целевой лиганд" относится к лиганду, который специфически или селективно связывается полипептидом или пептидом. Например, если полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, то целевой лиганд может представлять собой любой желаемый антиген или эпитоп, а если полипептид представляет собой фермент, то целевой лиганд может представлять собой любой желаемый субстрат. Связывание с целевым антигеном зависит от функциональности данного полипептида или пептида. Как использовано в данной заявке, антитело относится к IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или фрагменту(такому как Fab, F(ab')2, Fv, связанный дисульфидной связью Fv, scFv, полиспецифическое антитело в закрытой конформации, связанный дисульфидной связью scFv, диатело), происходящему из любого вида, естественным образом продуцирующего антитело, или созданному посредством технологии рекомбинантной ДНК; или выделенному из сыворотки крови, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий. Как использовано в данной заявке, "формат антитела" относится к любой подходящей полипептидной структуре, в которую может быть встроен один или более чем один вариабельный домен антитела для того, чтобы придать данной структуре специфичность связывания с антигеном. В данной области техники известны различные подходящие форматы антител, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антигенсвязывающие фрагменты любого из перечисленного выше (например Fv-фрагмент (например одноцепочечный Fv (scFv), связанный дисульфидной связью Fv), Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент,F(ab')2-фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например adAb, VH, VHH, VL) и модифицированные варианты любого из перечисленного выше (например модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера, или гуманизированного VHH). Фраза "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), специфически связывающемуся с антигеном или эпитопом независимо от другихV-областей или доменов. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может быть представлен в формате (например гомо- или гетеромультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания антигена с единичным иммуноглобулиновым вариабельным доменом (т.е. когда иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Доменное антитело" или "dAb" представляет собой то же, что и "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен", как этот термин используется в данной заявке. "Единичный иммуноглобулиновый вариабельный домен" представляет собой то же, что и "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен", как этот термин используется в данной заявке. "Единичный антительный вариабельный домен" или "антительный вариабельный единичный домен" представляет собой то же, что и "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен", как этот термин используется в данной заявке. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен в одном из воплощений представляет собой вариабельный домен антитела человека, но также включает единичные вариабельные домены антител из других видов, таких как VHH dAb грызунов (например, как описано в WO 00/29004, содержание которой включено в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки), усатых акул и верблюжьи VHH dAb. ВерблюжьиVHH представляют собой полипептиды иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, которые происходят из видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, дромадера и гуанако, которые продуцируют антитела, состоящие из тяжелых цепей, лишенные легких цепей. VHH может быть гуманизированным."Домен" представляет собой свернутую белковую структуру, которая сохраняет свою третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции остальной части белка и/или домена. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Следовательно, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петель заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые укорочены или содержат N- или С-концевые удлинения, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, частично, связы- 22018129 вающую активность и специфичность полноразмерного домена. Термин "библиотека" относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет единичную полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. В некоторой степени "библиотека" является синонимом "репертуара". Различия в последовательностях среди членов библиотеки ответственны за разнообразие, представленное в этой библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может находиться в форме организмов или клеток, например бактерий, вирусов, клеток животных и растений и тому подобного, трансформированных библиотекой нуклеиновых кислот. В одном из воплощений каждый индивидуальный организм или клетка содержит только один член или ограниченное количество членов. В одном из воплощений нуклеиновые кислоты встроены в экспрессирующие векторы, чтобы сделать возможной экспрессию полипептидов, кодируемых данными нуклеиновыми кислотами. Следовательно, в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции организмовхозяев, где каждый микроорганизм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего единичный член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована с целью получения соответствующего ей полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет потенциал для кодирования большого репертуара различающихся полипептидов."Универсальный каркас" представляет собой последовательность каркаса единичного антитела, соответствующую областям антитела с консервативной последовательностью, как определено Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services), или соответствующую репертуару или структуре иммуноглобулинов зародышевой линии человека, как определено вChothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917. В библиотеках и репертуарах можно использовать единичный каркас или набор таких каркасов, которые, как обнаружено, допускают получение производных по сути с любой специфичностью связывания посредством варьирования только в гипервариабельных участках. Как использовано в данной заявке, термин "доза" относится к количеству лиганда, вводимому субъекту одновременно (однократная доза), или двумя или более введениями в течение определенного периода времени. Например, доза может относиться к количеству лиганда (например лиганда, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, связывающий целевой антиген), вводимому субъекту в течение суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более чем одного месяца (например посредством однократного введения, или посредством двух или более введений). Интервал между дозами может представлять собой любое желаемое количество времени. Фраза "период полувыведения" представляет собой период времени, в течение которого концентрация лиганда (например dAb, полипептида или антагониста) в сыворотке уменьшается на 50% in vivo, например вследствие расщепления лиганда и/или клиренса или секвестрации лиганда с помощью природных механизмов. Лиганды по изобретению могут быть стабилизированы in vivo, и период их полувыведения увеличивается посредством связывания с молекулами, которые устойчивы к расщеплению и/или клиренсу, или секвестрации. Типично, такие молекулы представляют собой встречающиеся в природе белки, которые сами по себе обладают длительным периодом полувыведения in vivo. Период полувыведения лиганда увеличивается в том случае, если его функциональная активность сохраняется in vivo в течение более длительного периода, чем похожего лиганда, который не специфичен в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения. Например, лиганд, специфический в отношении HAS (человеческого сывороточного альбумина), и молекулу-мишень сравнивают с тем же лигандом, у которого специфичность в отношении HSA отсутствует, то есть он не связывается с HAS, но связывается с другой молекулой. Например, он может связываться с третьей мишенью на клетке. Типично, период полувыведения увеличивается на 10, 20, 30, 40, 50% или более. Возможны увеличения периода полувыведения в диапазоне 2 х, 3 х, 4 х, 5 х, 10 х, 20 х, 30 х, 40 х, 50 х или более. Альтернативно или в дополнение к этому,возможно увеличение периода полувыведения в диапазоне 30 х, 40 х, 50 х, 60 х, 70 х, 80 х, 90 х, 100 х, 150 х. Как использовано в данной заявке, "гидродинамический размер" относится к кажущемуся размеру молекулы (например белковой молекулы, лиганда) на основе диффузии молекулы через водный раствор. Диффузию или движение белка через раствор можно преобразовать для выведения кажущегося размера белка, где размер приводят в виде "радиусе Стокса" или "гидродинамического радиуса" белковой частицы. "Гидродинамический размер" белка зависит от массы и формы (конформации), так что два белка,обладающие одинаковой молекулярной массой, могут иметь различные гидродинамические размеры на основании общей конформации белка. Как использовано в данной заявке, термин "конкурирует" означает, что связывание первой мишени со своим штатным мишень-связывающим доменом ингибируется в присутствии второго связывающего домена, который является специфическим в отношении указанной когнатной мишени. Например, связывание может быть ингибировано стерически, например посредством физического блокирования связывающего домена или изменения структуры или окружения связывающего домена таким образом, что его аффинность или авидность в отношении мишени уменьшается. См. WO2006038027 в отношении подробной информации относительно того, как осуществлять конкурентные ELISA и конкурентные BiaCore эксперименты для определения конкуренции между первым и вторым связывающими доменами. Расчеты "гомологии" или "идентичности", или "сходства" между двумя последовательностями(термины в данной заявке используются взаимозаменяемо) осуществляют следующим образом. Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены бреши в одну или обе первую и вторую аминокислотную или нуклеиновокислотную последовательности для оптимального выравнивания, а негомологичными последовательностями можно пренебречь для сравнительных целей). В воплощении длина сравниваемой последовательности, выравниваемой для сравнительных целей, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70, 80, 90, 100% от длины последовательности сравнения. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны по этому положению (как использовано в данном описании, аминокислотная "гомология" или "гомология" нуклеиновой кислоты эквивалентна аминокислотной "идентичности" или"идентичности" нуклеиновой кислоты). Процент идентичности между двумя последовательностями есть функция количества идентичных положений, общих для этих последовательностей, с учетом количества брешей и длины каждой бреши, которые следует вводить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивания аминокислотной и нуклеотидной последовательности и их гомология,сходство или идентичность, как определено в данном описании, могут быть получены и определены с использованием алгоритма для последовательностей BLAST 2 Sequences с использованием параметров по умолчанию (Tatusova, Т. A. et al., FEMS Microbiol. Lett., 174: 187-188 (1999. Способы селекции Изобретение в одном из воплощений относится к полипептидам и dAb, селектированным способом селекции протеазоустойчивых пептидов и полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью. В способе используют два селекционных давления для обеспечения эффективного процесса селекции полипептидов, которые являются высокостабильными и устойчивыми к расщеплению протеазой,и которые обладают желаемой биологической активностью. Как описано в данной заявке, протеазоустойчивые пептиды и полипептиды, как правило, сохраняют биологическую активность. В противопожность этому пептиды и полипептиды, чувствительные к протеазам, расщепляются или перевариваются протеазой в способах, описанных в данной заявке, и поэтому теряют свою биологическую активность. Соответственно, протеазоустойчивые пептиды или полипептиды обычно селектируют на основании их биологической активности, такой как связывающая активность. В одном аспекте предложен способ селекции, выделения и/или извлечения пептида или полипептида из библиотеки или репертуара пептидов и полипептидов (например дисплейной системы), который является устойчивым к расщеплению протеазой (например одной или более протеазами). В одном из воплощений данный способ представляет собой способ селекции, выделения и/или извлечения полипептида из библиотеки или репертуара пептидов и полипептидов (например дисплейной системы), который является устойчивым к расщеплению протеазой (например одной или более протеазами). В большинстве случаев способ включает получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с протеазой (например трипсином, эластазой, лейкозимом, панкреатином, слюной) в условиях, подходящих для протеазной активности, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который является устойчивым к расщеплению протеазой и имеет желаемую биологическую активность. Пептиды или полипептиды, которые расщепляются протеазой,обычно имеют сниженную биологическую активность или утрачивают свою биологическую активность вследствие активности протеазы. Соответственно, пептиды или полипептиды, устойчивые к расщеплению протеазой, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены с использованием способа на основе их биологической активности, такой как связывающая активность (например, связывание с типичным лигандом, связывание со специфическим лигандом, связывание с субстратом), каталитическая активность или другая биологическая активность. Библиотеку или репертуар пептидов или полипептидов объединяют с протеазой (например одной или более протеазами) в условиях, подходящих для протеолитической активности протеазы. Условия,которые подходят для протеолитической активности протеазы, и биологические препараты или смеси,содержащие протеолитическую активность, общеизвестны в данной области техники или могут быть легко определены средним специалистом в данной области. При желании, подходящие условия могут быть идентифицированы или оптимизированы, например, путем оценки протеазной активности в диапазоне условий рН, концентраций протеазы, температур и/или путем варьирования периода времени, в течение которого допускается взаимодействие библиотеки или репертуара и протеазы. Например, в некоторых воплощениях отношение (моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду(например вариабельному домену), составляет 800 к 8000 (например 8000 к 80000) для протеаза:пептид или полипептид, например, когда используют 10 мкг/мл протеазы, тогда отношение протеаза:пептид или полипептид составляет 800 к 80000; или когда используют 100 мкг/мл протеазы, тогда отношение про- 24018129 теаза:пептид или полипептид составляет 8000 к 80000. В одном из воплощений отношение (масса/масса,например мкг/мкг) протеазы (например трипсина) к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену), составляет 1600 к 160000 (например 16000 к 160000) для протеаза:пептид или полипептид, например, когда используют 10 мкг/мл протеазы, тогда отношение протеаза:пептид или полипептид составляет 1600 к 160000; или когда используют 100 мкг/мл протеазы, отношение протеаза:пептид или полипептид составляет 16000 к 160000. В одном из воплощений протеазу используют в концентрации по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл и отношение (моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену) составляет 8000 к 80000 для протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений протеазу используют в концентрации по меньшей мере 10 мкг/мл и отношение (моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену) составляет 800 к 80000 для протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений отношение (мас./мас., например мкг/мкг) протеазы (например трипсина) к пептиду или полипептиду (например вариабельному домену) составляет 1600 к 160000 для протеаза:пептид или полипептид, например, когда С равна 10 мкг/мл; или когда С или С' равна 100 мкг/мл, тогда отношение протеаза:пептид или полипептид составляет 16000 к 160000. В одном из воплощений концентрация протеазы (С или С) составляет по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл. Для тестирования индивидуального или выделенного пептида или полипептида (например иммуноглобулинового вариабельного домена), например, который уже выделен из репертуара или библиотеки, протеазу можно добавлять в раствор пептида или полипептида в подходящем буфере (например PBS) для получения раствора пептида или полипептида/протеазы,такого как раствор по меньшей мере примерно 0,01% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 0,01 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 0,05 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 0,1 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 0,5 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, от примерно 1 до примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,01% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,02%(мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,03% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,04% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,05% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,06% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,07%(мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,08% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,09% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,1% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,2% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,3%(мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,4% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,6% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,7% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,8%(мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 0,9% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 1% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 2% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 3% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, по меньшей мере примерно 4% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида, или примерно 5% (мас./мас.) протеазы/пептида или полипептида. Такую смесь можно инкубировать при подходящей для протеазной активности температуре (например комнатной температуре, примерно 37 С) и образцы можно отбирать через промежутки времени (например через 1, 2, 3 ч и т.д.). Образцы могут быть проанализированы в отношении расщепления белка с использованием любого подходящего способа, такого как SDS-PAGE-анализ или связывание с лигандом, и результаты можно использовать для установления динамики расщепления. В способах, описанных в данной заявке, можно использовать любую желаемую протеазу или протеазы. Например, можно использовать одну протеазу, любую желаемую комбинацию различных протеаз или любой биологический препарат, биологический экстракт или биологический гомогенат, который содержит протеолитическую активность. Нет необходимости в идентификации используемой(ых) протеазы или протеаз. Подходящие примеры протеаз, которые могут быть использованы сами по себе или в любой желаемой комбинации, включают сериновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатные протеазы, тиоловые протеазы, матриксную металлопротеазу, карбоксипептидазу (например карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластазу, лейкозим, панкреатин,тромбин, плазмин, катепсины (например катепсин G), протеиназу (например протеиназу 1, протеиназу 2,протеиназу 3), термолизин, химозин, энтеропептидазу, каспазу (например каспазу 1, каспазу 2, каспазу 4,каспазу 5, каспазу 9, каспазу 12, каспазу 13), кальпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин,сепаразу и тому подобное. Подходящие биологические экстракты, гомогенаты и препараты, которые содержат протеолитическую активность, включают мокроту, слизь (например желудочную слизь, носовую слизь, бронхиальную слизь), бронхоальвеолярный лаваж, гомогенат легких, экстракт легких, экстракт поджелудочной железы, желудочную жидкость, слюну, слезы и тому подобное. Протеазу используют в количестве, подходящем для осуществления протеолитического расщепления. Например, как описано в данной заявке, протеаза может быть использована в концентрации от примерно 0,01 до примерно 5%(мас./мас., протеаза/пептид или полипептид). Когда протеазу объединяют с дисплейной системой, содержащей репертуар пептидов или полипептидов (например фаг-дисплейной системой), например, протеаза может быть использована в концентрации от примерно 10 мкг/мл до примерно 3 мг/мл, примерно 10 мкг/мл, примерно 20 мкг/мл, примерно 30 мкг/мл, примерно 40 мкг/мл, примерно 50 мкг/мл, примерно 60 мкг/мл, примерно 70 мкг/мл, примерно 80 мкг/мл, примерно 90 мкг/мл, примерно 100 мкг/мл, примерно 200 мкг/мл, примерно 300 мкг/мл, примерно 400 мкг/мл, примерно 500 мкг/мл, примерно 600 мкг/мл, примерно 700 мкг/мл, примерно 800 мкг/мл, примерно 900 мкг/мл, примерно 1000 мкг/мл, примерно 1,5 мг/мл, примерно 2 мг/мл, примерно 2,5 мг/мл или примерно 3 мг/мл. Протеазу инкубируют с коллекцией пептидов или полипептидов (библиотекой или репертуаром) при температуре, подходящей для активности протеазы. Например, протеазу и коллекцию пептидов или полипептидов можно инкубировать при температуре от примерно 20 до примерно 40 С (например при комнатной температуре, примерно 20 С, примерно 21 С, примерно 22 С, примерно 23 С, примерно 24 С, примерно 25 С, примерно 26 С, примерно 27 С, примерно 28 С, примерно 29 С, примерно 30 С,примерно 31 С, примерно 32 С, примерно 33 С, примерно 34 С, примерно 35 С, примерно 36 С, примерно 37 С, примерно 38 С, примерно 39 С, примерно 40 С). Протеазу и коллекцию пептидов или полипептидов инкубируют вместе в течение периода времени, достаточного для осуществления протеолитического расщепления. Например, коллекцию пептидов или полипептидов можно инкубировать вместе с протеазой в течение от примерно 30 мин до примерно 24 или примерно 48 ч. В некоторых примерах коллекцию пептидов или полипептидов инкубируют вместе с протеазой в течение ночи или в течение по меньшей мере примерно 30 мин, примерно 1 ч, примерно 1,5 ч, примерно 2 ч, примерно 3 ч, примерно 4 ч, примерно 5 ч, примерно 6 ч, примерно 7 ч, примерно 8 ч, примерно 9 ч, примерно 10 ч, примерно 11 ч,примерно 12 ч, примерно 13 ч, примерно 14 ч, примерно 15 ч, примерно 16 ч, примерно 17 ч, примерно 18 ч, примерно 19 ч, примерно 20 ч, примерно 21 ч, примерно 22 ч, примерно 23 ч, примерно 24 ч, примерно 48 ч или больше. В большинстве случаев желательно, по меньшей мере, на ранних раундах селекции (например, когда используют дисплейную систему), чтобы протеаза приводила к уменьшению количества клонов,имеющих желаемую биологическую активность, которую селектируют в отношении по меньшей мере одного порядка величины, по сравнению с селекциями, которые не включают инкубацию с протеазой. В конкретных примерах количество протеазы и условия, использованные в таких способах, являются достаточными для уменьшения количества извлеченных клонов по меньшей мере примерно на один логарифм (коэффициент 10), по меньшей мере примерно на 2 логарифма (коэффициент 100), по меньшей мере примерно 3 логарифма (коэффициент 1000) или по меньшей мере примерно 4 логарифма (коэффициент 10000). Подходящие количества протеазы и условия инкубации, которые будут приводить к желаемому уменьшению количества извлеченных клонов, могут быть легко определены с использованием традиционных способов и/или руководства, предложенного в данной заявке. Протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены и инкубированы с использованием любого подходящего способа (например in vitro, in vivo или ex vivo). Например, протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены в подходящем контейнере и содержаться в стационарном состоянии, при качании, встряхивании, вихревом вращении или тому подобном, при температуре, подходящей для протеазной активности. При желании, протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены в системе in vivo или ex vivo, например, путем введения коллекции полипептидов (например фаг-дисплейной библиотеки или репертуара) подходящему животному(например мыши) и после периода времени, достаточного для проявления протеазной активности, извлечения коллекции пептидов или полипептидов. В другом примере орган или ткань подвергают перфузии коллекцией полипептидов (например фаг-дисплейной библиотекой или репертуаром) и после периода времени, достаточного для проявления протеазной активности, извлекают коллекцию полипептидов. После инкубации протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть селектирован на основании желаемой биологической активности, такой как связывающая активность. При желании, протеазный ингибитор может быть добавлен перед селекцией. Можно использовать любой подходящий ингибитор протеазы (или комбинацию двух или более ингибиторов протеаз), которые, по существу, не будут препятствовать данному способу селекции. Примеры подходящих ингибиторов протеаз включают 1 антитрипсин, 2-макроглобулин, амастатин, антипаин, антитромбин III, апротинин, 4-(2 аминоэтил)бензолсульфонил-фторида гидрохлорид (AEBSF), (4-амидинофенил)метансульфонилфторид(APMSF), бестатин, бензамидин, химостатин, 3,4-дихлоризокумарин, диизопропилфторфосфат (DIFP), Е 64, этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), эластатиналь, лейпептин, N-этилмалеимид, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), пепстатин, 1,10-фенантролин, фосфорамидон, ингибиторы сериновых протеаз, N-тозил-L-лизин-хлорметилкетон (TLCK), Na-тозил-Phe-хлорметилкетон (TPCK) и тому подобное. В дополнение к этому в продаже имеется много препаратов, которые содержат ингибиторы нескольких классов протеаз (например, Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (полный коктейль ингибиторов протеаз в таблетках от Roche) (Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN, USA), который ингибирует химотрипсин, термолизин, папаин, проназу, экстракт поджелудочной железы и трипсин). Протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть селектирован с использованием желаемого способа селекции биологической активности, который позволяет отличать и селектировать пептиды и полипептиды, имеющие желаемую биологическую активность, от или относительно пептидов и полипептидов, не имеющих желаемой биологической активности. Как правило, пептиды или полипептиды,которые были подвергнуты перевариванию или расщеплению протеазой, теряют свою биологическую активность, тогда как протеазоустойчивые пептиды или полипептиды остаются функциональными. Таким образом, для селекции протеазоустойчивых пептидов или полипептидов могут быть использованы подходящие анализы биологической активности. Например, общая связывающая функция (например,связывание с типичным лигандом, связывание со специфическим лигандом или связывание с субстратом) может быть оценена с использованием подходящего анализа связывания (например ELISA, пэннинга). Например, полипептиды, которые связываются с целевым лигандом или типичным лигандом, таким как белок А, белок L или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены посредством пэннинга или с использованием подходящей аффинной матрицы. Пэннинг может быть осуществлен путем добавления раствора лиганда (например типичного лиганда, целевого лиганда) в подходящий сосуд(например пробирку, чашку Петри) и обеспечения возможности для лиганда осаждаться на стенках или покрывать стенки сосуда. Избыток лиганда можно отмыть и полипептиды (например фаг-дисплейную библиотеку) можно добавить в сосуд и сосуд поддерживать в условиях, подходящих для связывания полипептидов с иммобилизованным лигандом. Несвязавшийся полипептид можно отмыть, а связавшиеся полипептиды можно извлечь с использованием любого подходящего способа, такого как, например, соскабливание или снижение рН. Когда используют фаг-дисплейную систему, тогда связывание может быть протестировано в фаговом ELISA-анализе. Фаговый ELISA-анализ может быть проведен в соответствии с любой подходящей методикой. В одном из примеров популяции фага, продуцируемые в каждом раунде селекции, могут быть подвергнуты скринингу в отношении связывания в ELISA с селектированным целевым лигандом или типичным лигандом с целью идентификации фага, который экспонирует протеазоустойчивые пептиды или полипептиды. При желании, растворимые пептиды и полипептиды могут быть протестированы в отношении связывания с целевым лигандом или типичным лигандом, например, посредством ELISA с использованием реагентов, например, против С- или N-концевой метки (см., например Winter et al. (1994)Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 и приведенные там ссылки). Разнообразие селектированного фага также может быть оценено посредством гель-электрофореза продуктов ПЦР (полимеразной цепной реакции)(Marks et al. 1991, выше; Nissim et al. 1994, выше), путем введения зонда (Tomlinson et al., 1992, J. Mol.Biol. 227, 776) или посредством секвенирования векторной ДНК. В дополнение к специфичности в отношении IL-1R1 антагонист или полипептид (например лиганд с двойной специфичностью), содержащий протеазоустойчивый полипептид против IL-1R1 (например,единичный вариабельный домен антитела) может обладать специфичностью связывания в отношении типичного лиганда или любого желаемого целевого лиганда, такого как человеческие или животные белки, включающие цитокины, факторы роста, цитокиновые рецепторы, рецепторы факторов роста, ферменты (например протеазы), кофакторы ферментов, ДНК-связывающие белки, липиды и углеводороды. В некоторых воплощениях протеазоустойчивый пептид или полипептид (например dAb) или антагонист связывается с IL-1R1 в легочной ткани. В одном из воплощений антагонист или полипептид также связывается с другой мишенью в легочной ткани. Когда в способах, описанных в данной заявке, используют дисплейную систему (например дисплейную систему, которая связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой), тогда часто предпочтительно амплифицировать или увеличить количество копий нуклеиновых кислот, которые кодируют селектированные пептиды или полипептиды. Это обеспечивает эффективный способ получения достаточных количеств нуклеиновых кислот и/или пептидов или полипептидов для дополнительных раундов селекции с использованием способов, описанных в данной заявке, или других подходящих способов либо для получения дополнительных репертуаров (например репертуаров созревания аффинности). Таким образом, в некоторых воплощениях способ по изобретению включает применение дисплейной системы (например, которая связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой, такой как фаговый дисплей) и также включает амплификацию или увеличение количества копий нуклеиновой кислоты,которая кодирует селектированный пептид или полипептид. Нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы с использованием любых подходящих способов, например, посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции. Способы, описанные в данной заявке, могут быть использованы как часть программы по выделению протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, например dAb, которая может включать, если желательно, другие подходящие способы селекции. В этих ситуациях способы, описанные в данной за- 27018129 явке, могут быть использованы в любом желаемом месте данной программы, например, до или после использования других способов селекции. Способы, описанные в данной заявке, могут быть использованы также для проведения двух или более раундов селекции, как описано и проиллюстрировано в данной заявке. В одном из примеров изобретение относится к способу селекции пептида или полипептида, например dAb, устойчивого к расщеплению эластазой, включающему получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с эластазой (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим эластазу) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления эластазой, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида,который устойчив к расщеплению эластазой и имеет связывающую активность в отношении IL-1R1. В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению эластазой и связывается с IL-1R1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие dAb, получают и объединяют с эластазой (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим эластазу) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления эластазой. Отбирают устойчивые к эластазе dAb, которые связываются с IL-1R1. Например, устойчивое к эластазе dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном из воплощений устойчивое к эластазе dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 12 ч. В одном из воплощений устойчивое к эластазе dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%-ном(мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч или по меньшей мере примерно 48 ч. В воплощении предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению эластазой и связывается с IL-1R1. Способ включает получение фаг-дисплейной системы, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной фаг-дисплейной системы с эластазой(примерно 100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37 С, например, в течение ночи (например примерно 12-16 ч) и затем селекцию фага, экспонирующего dAb, которое специфически связывается с IL-1R1. В одном из примеров предложен способ селекции пептида или полипептида (например dAb), который устойчив к расщеплению лейкозимом, включающий получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с лейкозимом (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим лейкозим) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления лейкозимом, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида,который устойчив к расщеплению лейкозимом и имеет специфическую связывающую активность в отношении IL-1R1. В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению лейкозимом и связывается с IL-1R1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие dAb, получают и объединяют с лейкозимом (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим лейкозим) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления лейкозимом. Отбирают устойчивые к лейкозиму dAb, которые специфически связываются с IL-1R1. Например, устойчивое к лейкозиму dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном из воплощений устойчивое к лейкозиму dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 12 ч. В одном из воплощений устойчивое к лейкозиму dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч или по меньшей мере примерно 48 ч. В воплощении предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению лейкозимом и специфически связывается с IL-1R1. Способ включает получение фаг-дисплейной системы, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной фаг-дисплейной системы с лейкозимом (примерно 100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37 С, например, в течение ночи (например примерно 12-16 ч) и затем селекцию фага, экспонирующего dAb, которое специфически связывается с IL-1R1. В другом примере предложен способ селекции пептида или полипептида (например dAb), который устойчив к расщеплению трипсином, включающий получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с трипсином в условиях, подходящих для протеолитического расщепления трипсином, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с IL-1R1. В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с IL- 28018129 1R1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие dAb, получают и объединяют с трипсином (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим трипсин) в условиях,подходящих для протеолитического расщепления трипсином. Отбирают устойчивые к трипсину dAb,которые связываются с IL-1R1. Например, устойчивое к трипсину dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном из воплощений устойчивое к трипсину dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 3 ч. В одном из воплощений устойчивое к трипсину dAb, по существу, не расщепляется при инкубации при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 4 ч, по меньшей мере примерно 5 ч, по меньшей мере примерно 6 ч, по меньшей мере примерно 7 ч, по меньшей мере примерно 8 ч, по меньшей мере примерно 9 ч, по меньшей мере примерно 10 ч, по меньшей мере примерно 11 ч или по меньшей мере примерно 12 ч. В типичном воплощении предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с IL1R1. Способ включает получение фаг-дисплейной системы, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение даннойфагдисплейной системы с трипсином (100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37 С, например, в течение ночи (например примерно 12-16 ч), и затем селекцию фага, экспонирующего dAb, которое специфически связывается с IL-1R1. В другом аспекте предложен способ получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов (например dAb). Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов; объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности; и извлечение множества пептидов или полипептидов, которые специфически связываются сIL-1R1, посредством чего получают репертуар протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. Протеазы, дисплейные системы, условия для протеазной активности и способы селекции пептидов или полипептидов, которые подходят для применения в данном способе, описаны в данном изобретении с учетом других способов по изобретению. В некоторых воплощениях используют дисплейную систему (например дисплейную систему, которая связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой), которая содержит репертуар пептидов или полипептидов, и способ также включает амплификацию или увеличение количества копий нуклеиновых кислот, кодирующих это множество селектированных пептидов или полипептидов. Нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы с использованием любого подходящего способа, например, посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции. В конкретном воплощении предложен способ получения репертуара протеазоустойчивых полипептидов, которые представляют собой dAb против IL-1R1. Способ включает получение репертуара полипептидов, которые представляют собой dAb; объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы (например трипсина, эластазы, лейкозима) в условиях, подходящих для протеазной активности; и извлечение множества полипептидов, которые представляют собой dAb, обладающие специфичностью связывания в отношении IL-1R1. Способ может быть использован для получения "наивного" репертуара или репертуара, который "смещен" в сторону желаемой специфичности связывания, такого как репертуар созревания аффинности на основе родительского dAb, обладающего специфичностью связывания в отношении IL-1R1. Полипептидные дисплейные системы В одном из воплощений репертуар или библиотека пептидов или полипептидов, предложенные для применения в способах по изобретению, содержали подходящую дисплейную систему. Дисплейная система может препятствовать расщеплению протеазой (например одной протеазой или комбинацией протеаз и любым биологическим экстрактом, гомогенатом или препаратом, который содержит протеолитическую активность (например мокротой, слизью (например желудочной слизью, носовой слизью, бронхиальной слизью), бронхоальвеолярным лаважем, гомогенатом легких, экстрактом легких, экстрактом поджелудочной железы, желудочной жидкостью, слюной, слезами и тому подобным. Дисплейная система и связь между этой дисплейной системой и экспонируемым полипептидом в одном из воплощений,по меньшей мере, настолько устойчивы к протеазе, насколько устойчивы наиболее стабильные пептиды или полипептиды репертуара. Это позволяет легко выделять и/или амплифицировать нуклеиновую кислоту, которая кодирует селектированный экспонируемый полипептид. В одном из примеров протеазоустойчивый пептид или полипептид, например dAb, может быть селектирован, выделен и/или извлечен из репертуара пептидов или полипептидов, который находится в растворе или ковалентно или нековалентно присоединен к подходящей поверхности, такой как пластик или стекло (например титрационный микропланшет, полипептидный чип, такой как микрочип). Например, можно использовать чип пептидов на поверхности способом, посредством которого каждый индивидуальный член библиотеки (например уникальная пептидная последовательность) располагается в отдельном, предварительно определенном месте в данном чипе. Идентичность каждого члена библиотеки в

МПК / Метки

МПК: C07K 16/00, C07K 16/22, C07K 16/28

Метки: антитела, антагонисты, вариабельные, домены, полипептиды

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-18129-polipeptidy-variabelnye-domeny-antitela-i-antagonisty.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Полипептиды, вариабельные домены антитела и антагонисты</a>

Похожие патенты