Человеческие моноклональные антитела к фукозил-gm1 и способы применения антифукозил-gm1 антител

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Выделенное человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая включает последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, которая включает последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:

(a) последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 25, и последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 43, и их консервативных модификаций;

(b) последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 26, и последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 44, и их консервативных модификаций;

(c) последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 27, и последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 45, и их консервативных модификаций;

(d) последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 28, и последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 46, и их консервативных модификаций;

(e) последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 29, и последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 47, и их консервативных модификаций;

(f) последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 30, и последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 48, и их консервативных модификаций;

где антитело специфически связывается с фукозил-GM1.

2. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, которое представляет собой полноразмерное антитело изотипа IgG1 или IgG4.

3. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, где антигенсвязывающий участок представляет собой фрагмент Fab или Fab'2 антитела или одноцепочечное антитело.

4. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или происходит от гена VH 3-48 человека.

5. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом или происходит от гена VKL15.

6. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.5, дополнительно содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или происходит от гена VH 3-48 человека.

7. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, которые содержат:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 13;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 19;

(c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 25;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 31;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 37; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 43.

8. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, которые содержат:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 14;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 20;

(c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 26;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 32;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 38; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 44.

9. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, которые содержат:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 15;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 21;

(c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 27;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 33;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 39; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 45.

10. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, которые содержат:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 16;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 22;

(c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 28;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 34;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 40; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 46.

11. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, которые содержат:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 17;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 23;

(c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 29;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 35;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 41; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 47.

12. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, которые содержат:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 18;

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 24;

(c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 30;

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 36;

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 42; и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 48.

13. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

14. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

15. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

16. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

17. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

18. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

19. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, содержащие:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; или

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8; или

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; или

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; или

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11; или

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12.

20. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, где последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:

(a) последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 19, и последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 37, и их консервативных модификаций;

(b) последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 20, и последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 38, и их консервативных модификаций;

(c) последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 21, и последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 39, и их консервативных модификаций;

(d) последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 22, и последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 40, и их консервативных модификаций;

(e) последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 23, и последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 41, и их консервативных модификаций;

(f) последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 24, и последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 42, и их консервативных модификаций.

21. Антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, где последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:

(a) последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 13, и последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 31, и их консервативных модификаций;

(b) последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 14, и последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 32, и их консервативных модификаций;

(c) последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 15, и последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 33, и их консервативных модификаций;

(d) последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 16, и последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 34, и их консервативных модификаций;

(e) последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 17, и последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 35, и их консервативных модификаций;

(f) последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 18, и последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащей SEQ ID NO: 36, и их консервативных модификаций.

22. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-21, где указанное антитело не содержит фукозных остатков.

23. Антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-21, которые являются фукозилированными.

24. Композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-21, и фармацевтически приемлемый носитель.

25. Иммуноконъюгат, содержащий антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-21, связанные с терапевтическим средством.

26. Композиция, содержащая иммуноконъюгат по п.25 и фармацевтически приемлемый носитель.

27. Иммуноконъюгат по п.25, где терапевтическое средство представляет собой цитотоксин.

28. Композиция, содержащая иммуноконъюгат по п.27 и фармацевтически приемлемый носитель.

29. Иммуноконъюгат по п.25, где терапевтическое средство представляет собой радиоактивный изотоп.

30. Композиция, содержащая иммуноконъюгат по п.29 и фармацевтически приемлемый носитель.

31. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-21.

32. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.31.

33. Клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по п.32.

34. Способ получения антитела к фукозил-GM1, который включает экспрессирование антитела в клетке-хозяине по п.33 и выделение антитела из клетки-хозяина.

35. Способ лечения или предотвращения болезни, характеризующейся ростом опухолевых клеток, экспрессирующих фукозил-GM1, включающий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-21 в количестве, эффективном для лечения или предотвращения болезни.

36. Способ по п.35, где болезнь представляет собой рак.

37. Способ по п.36, где рак представляет собой рак легкого.

38. Способ по п.37, где рак легкого представляет собой мелкоклеточный рак легкого.

39. Способ по п.37, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого.

40. Способ по п.35, где способ дополнительно включает введение субъекту второго терапевтического средства.

41. Способ по п.40, где второе терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое средство или радиотоксическое средство.

42. Способ по п.40, где второе терапевтическое средство вводят до введения антитела или его антигенсвязывающего участка.

43. Способ по п.40, где второе терапевтическое средство вводят одновременно с введением антитела или его антигенсвязывающего участка.

44. Способ по п.40, где второе терапевтическое средство вводят после введения антитела или его антигенсвязывающего участка.

45. Биспецифическая молекула, включающая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-21, связанные со вторым функциональным фрагментом, обладающим иной специфичностью связывания, чем указанные антитело или его антигенсвязывающий участок.

46. Композиция, содержащая биспецифическую молекулу по п.45 и фармацевтически приемлемый носитель.

Текст

Смотреть все

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ФУКОЗИЛ-GM1 И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИФУКОЗИЛ-GM1 АНТИТЕЛ Изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в частности человеческим моноклональным антителам, которые специфически связывают фукозил-GM1 с высокой аффинностью. Также предлагают молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела по данному изобретению, экспрессирующие векторы, клетки-хозяева и способы экспрессирования антител по данному изобретению. Также предлагают иммуноконъюгаты, биспецифические молекулы и фармацевтические композиции, содержащие антитела по данному изобретению. Данное изобретение также относится к способам выявления фукозил-GM1, а также к способам лечения различных заболеваний, включая рак, с применением анти-фукозил-GM1 антител. 017491 Перекрестная ссылка на родственные заявки Данной заявкой испрашивается приоритет по отношению к предварительной заявке на патент США серийный 60/748915, зарегистрированной 8 декабря 2005 г., включенной сюда в качестве ссылки. Уровень техники Фукозил-GM1 представляет собой сфинголипид моносиалоганглиозид, состоящий из церамидного липидного компонента, который фиксирует молекулу в клеточной мембране, и углеводного компонента,который экспонирован на поверхности клетки. Углеводные антигены являются наиболее обильно экспрессируемыми антигенами на поверхности раковых клеток (Feizi Т. (1985) Nature 314:53-7). При некоторых видах опухолей, таких как мелкоклеточный рак легкого (SCLC), первоначальные ответы на химиотерапию являются впечатляющими, однако вскоре следуют неподдающиеся химиотерапии рецидивы. Воздействием новыми иммунотерапевтическими средствами можно преодолеть устойчивый к лекарственным средствам рецидив (Johnson D.H. (1995) Lung Cancer 12 Suppl. 3:S71-5). Показали, что несколько углеводных антигенов, таких как ганглиозиды GD3 и GD2, являются эффективными мишенями для пассивной иммунотерапии с помощью мАТ (Irie R.F. и Morton D.L. (1986) PNAS 83:8694-8698; HoughtonA.N. et al. (1985) PNAS 82:1242-1246). При клинических испытаниях также показали, что ганглиозидные антигены являются эффективными мишенями для активной иммунотерапии с помощью вакцин (KrugL.M. et al. (2004) Clinical Cancer Research 10:6094-6100; Dickler M.N. et al. (1999) Clinical Cancer Research 5:2773-2779; Livingston P.O. et al. (1994) J. Clin. Oncol. 12: 1036-44). Действительно, сыворотка, полученная от пациентов с SCLC, у которых появились титры антител к фукозил-GM1 после вакцинации антигеном, конъюгированным с KLH, специфически связывалась с опухолевыми клетками и проявляла опухолеспецифическую комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Токсические проявления, связанные с титрами антифукозил-СМ 1, были легкими и преходящими, и у трех пациентов с SCLC на ранних стадиях отсутствовали рецидивы после 18, 24 и 30 месяцев (Krug et al., выше; Dickler et al., выше). Экспрессию фукозил-GM1 показали в большой доле случаев SCLC, и, в отличие от других ганглиозидных антигенов, фукозил-GM1 экспрессируется незначительно или совсем не экспрессируется в нормальных тканях (Nilsson et al. (1984) Glycoconjugate J. 1:43-9; Krug et al., supra; Brezicka et al. (1989) Cancer Res 49:1300-5; Zhangyi et al. (1997) Int J. Cancer. 73:42-49; Brezicka et al. (2000) Lung Cancer 28:29-36;al. (1986) Cancer Res 46:1403-7). Присутствие фукозил-GM1 показали в культуральной среде от клеточных линий SCLC, в опухолевых экстрактах и сыворотке ксенотрансплантатов "голых" мышей, а также в сыворотке пациентов с SCLC на запущенной стадии болезни (Vangsted et al. (1991) Cancer Res 51:287984; Vangsted et al. (1994) Cancer Detect Prev 18:221-9). Данные публикации достоверно свидетельствуют о том, что фукозил-GM1 является высокоспецифичным опухолевым антигеном, который может быть мишенью для иммунотерапевтических средств. Соответственно существует потребность в средствах, которые распознают фукозил-GM1, а также способах применения таких средств. Сущность изобретения Изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в частности к человеческим моноклональным антителам, которые связываются с фукозил-GM1 и которые обладают множеством желаемых свойств. Данные свойства включают высокоаффинное связывание с фукозил-GM1 и связывание с клеточной линией DMS-79 мелкоклеточного рака легкого человека (Human SCLC ATCCCRL-2049). Также предлагают способы лечения множества опосредованных фукозил-GM1 болезней с использованием антител и композиций по данному изобретению. В одном аспекте данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, где антитело: (а) специфически связывается с фукозил-GM1 и (b) связывается с клеточной линией DMS-79 мелкоклеточного рака легкого человека (Human SCLC АТССCRL-2049). Предпочтительно антитело представляет собой человеческое антитело, хотя в альтернативных вариантах осуществления антитело может представлять собой мышиное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, где антитело перекрестно конкурирует за связывание фукозил-GM1 с антителом сравнения, где антитело сравнения: (а) специфически связывается с фукозилGM1 и (b) связывается с клеточной линией DMS-79 мелкоклеточного рака легкого человека (HumanSCLC ATCCCRL-2049). В определенных вариантах осуществления антитело сравнения содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 7. В дополнительных вариантах осуществления антитело сравнения содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В других вариантах осуществления антитело сравнения содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи,включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и (b) вариабельную область легкой-1 017491 цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. В еще дополнительных вариантах осуществления антитело сравнения содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Кроме того, в дополнительных вариантах осуществления антитело сравнения содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В еще более дополнительных вариантах осуществления антитело сравнения содержит: (а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В одном аспекте данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, которая является продуктом или происходит от гена VH 3-48 человека, где антитело специфически связывает фукозилGM1. Данное изобретение дополнительно относится к выделенному моноклональному антителу, или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область легкой цепи, которая является продуктом или происходит от гена VKL 15 человека, где антитело специфически связывает фукозил-GM1. Предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 13;(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 19;(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 25;(d) вариабельную область легкой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 31;(e) вариабельную область легкой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 37; и(f) вариабельную область легкой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 43. Другое предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 14;(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 20;(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 26;(d) вариабельную область легкой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 32;(e) вариабельную область легкой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 38; и(f) вариабельную область легкой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 44. Другое предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 15;(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 21;(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 27;(d) вариабельную область легкой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 33;(e) вариабельную область легкой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 39; и(f) вариабельную область легкой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 45. Другое предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 16;(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 22;(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 28;(d) вариабельную область легкой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 34;(e) вариабельную область легкой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 40; и(f) вариабельную область легкой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 46. Другое предпочтительное сочетание включает:(а) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 17;(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 23;(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 29;(d) вариабельную область легкой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 35;(e) вариабельную область легкой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 41; и(f) вариабельную область легкой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 47. Другое предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 18;(b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 24;(c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 30;(d) вариабельную область легкой цепи CDR1, включающую SEQ ID NO: 36;(e) вариабельную область легкой цепи CDR2, включающую SEQ ID NO: 42; и(f) вариабельную область легкой цепи CDR3, включающую SEQ ID NO: 48. Другие предпочтительные антитела по данному изобретению, или их антигенсвязывающие участки,содержат:(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 7. Другое предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 8. Другое предпочтительное сочетание включает:(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 9. Другое предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 10. Другое предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 11. Другое предпочтительное сочетание включает:(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 12. Антитела по данному изобретению могут представлять собой, например, полноразмерные антитела,например, изотипа IgG1 или IgG4. Альтернативно, антитела могут представлять собой фрагменты антител, такие как Fab или Fab'2 фрагменты, либо одноцепочечные антитела. Данное изобретение также относится к иммуноконъюгату, представляющему собой антитело по данному изобретению, или его антигенсвязывающий участок, связанное с терапевтическим средством,таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп. Данное изобретение также относится к биспецифической молекуле, представляющей собой антитело, или его антигенсвязывающий участок, по данному изобретению, связанное со вторым функциональным фрагментом, обладающим иной специфичностью связывания, чем указанное антитело или его антигенсвязывающий участок. Также предлагают композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающий участок, либо иммуноконъюгат, либо биспецифическую молекулу по данному изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Данное изобретение также охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие участки по данному изобретению, а также экспрессирующие векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие экспрессирующие векторы. Кроме того, данное изобретение относится к трансгенной мыши, обладающей трансгенами тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека, где мышь экспрессирует антитело по данному изобретению, а также к гибридомам, полученным из такой мыши, где гибридома продуцирует антитело по данному изобретению. Кроме того, в другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения или предотвращения заболевания, характеризующегося ростом опухолевых клеток, экспрессирующих фукозил-GM1,включающему введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего участка, по данному изобретению в количестве, эффективном для лечения или предотвращения заболевания. Заболевание может представлять собой, например, рак, например рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого). В предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способу лечения рака in vivo с использованием антифукозил-GM1 антитела. Антифукозил-GM1 антитело может представлять собой мышиное, химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Примеры других форм рака, которые можно лечить, применяя способы по данному изобретению, включают рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого, рак почки (например, почечноклеточный рак), глиобластому, опухоли головного мозга, хронические или острые лейкозы, включая острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), Т-клеточный лейкоз взрослых (T-ALL), хронический миелолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, лимфомы (например, лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, лимфоцитарную лимфому, первичную лимфому ЦНС, Т-клеточную лимфому,лимфому Беркитта, анапластические крупноклеточные лимфомы (ALCL), кожные Т-клеточные лимфомы, узелковые мелкоклеточные с расщепленными ядрами лимфомы, узловые Т-клеточные лимфомы,-3 017491 лимфомы Ленерта, иммунобластные лимфомы, Т-клеточный лейкоз/лимфомы (ATLL), энтеробластные/центроцитные (cb/cc) фолликулярные лимфомы, диффузные крупноклеточные лимфомы Вклеточной линии дифференцировки, ангиоиммунобластная лимфаденопатия (AILD)-подобную Тклеточную лимфому и ВИЧ-ассоциированные расположенные в полости тела лимфомы), эмбриональные карциномы, недифференцированные карциномы носоглотки (например, опухоль Шминке), болезнь Кастлемена, саркому Капоши, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема и другие Вклеточные лимфомы, носоглоточные карциномы, рак костей, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную злокачественную меланому, рак матки, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак яичка, рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак уретры, рак пениса, детские солидные опухоли, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карциному почечной лоханки, новообразования в центральной нервной системе (ЦНС) (CNS),опухолевый ангиогенез, опухоль оси позвоночника, глиому ствола головного мозга, аденому гипофиза,эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, формы рака, вызванные экологическими факторами, включая те, что вызваны асбестом, например мезотелиому, а также сочетания указанных форм рака. Другие особенности и преимущества изобретения станут очевидны из следующего далее подробного описания и примеров, которые не следует истолковывать как ограничивающие. Содержание всех ссылок, данных Genbank, патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных в тексте данной заявки, прямо включено сюда в качестве ссылок. Краткое описание чертежей На фиг. 1 А представлены нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 49) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 5 В 1. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 19) и CDR3 (SEQ ID NO: 25) области и указаны гаметические источники V, D и J; на фиг. 1 В - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 55) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 5 В 1. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 31), CDR2 (SEQ ID NO: 37) и CDR3 (SEQ ID NO: 43) области и указаны гаметические источники V и J; на фиг. 2 А - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 50) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 5 В 1 а. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 20) и CDR3 (SEQ ID NO: 26) области и указаны гаметические источники V, D и J; на фиг. 2 В - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 56) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 8) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 5 В 1 а. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 32), CDR2 (SEQ ID NO: 38) и CDR3 (SEQ ID NO: 44) области и указаны гаметические источники V и J; на фиг. 3 А - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 51) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 7D4. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 21) и CDR3 (SEQ ID NO: 27) области и указаны гаметические источники V, D и J; на фиг. 3 В - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 57) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 7D4. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 33), CDR2 (SEQ ID NO: 39) и CDR3 (SEQ ID NO: 45) области и указаны гаметические источники V и J; на фиг. 4 А - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 52) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 7 Е 4. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 22) и CDR3 (SEQ ID NO: 28) области и указаны гаметические источники V, D и J; на фиг. 4 В - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 58) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 10) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 7 Е 4. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 34), CDR2 (SEQ ID NO: 40) и CDR3 (SEQ ID NO: 46) области и указаны гаметические источники V и J; на фиг. 5 А - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 53) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 5) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 13 В 8. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 23) и CDR3 (SEQ ID NO: 29) области и указаны гаметические источники V, D и J; на фиг. 5 В - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 59) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 11) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 13 В 8. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 35), CDR2 (SEQ ID NO: 41) и CDR3 (SEQ ID NO: 47) области и указаны гаметические источники V и J; на фиг. 6 А - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 54) и аминокислотная последователь-4 017491 ность (SEQ ID NO: 63) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 3 С 4. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 66) и CDR3 (SEQ ID NO: 67) области и указаны гаметические источники V, D и J; на фиг. 6 В - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 60) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 64) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 3 С 4. Изображены CDR1 (SEQ ID NO: 68), CDR2 (SEQ ID NO: 69) и CDR3 (SEQ ID NO: 70) области и указаны гаметические источники V и J; на фиг. 7 - сравнительный анализ аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи 5 В 1, 5B1a, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5 с гаметической аминокислотной последовательностьюVH 3-48 человека (SEQ ID NO: 61); на фиг. 8 - сравнительный анализ аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5 с гаметической аминокислотной последовательностью VkL15 человека (SEQ ID NO: 62); на фиг. 9 А-С - результаты экспериментов ELISA, свидетельствующие о том, что человеческие моноклональные антитела против фукозил-GM1 специфически связываются с фукозил-GM1; на фиг. 10 А-С - результаты экспериментов ELISA с цельными клетками, свидетельствующие о том,что человеческие моноклональные антитела против фукозил-GM1 специфически связываются с клетками, экспрессирующими фукозил-GM1; на фиг. 11 А-С - результаты экспериментов проточной цитометрии, свидетельствующие о том, что человеческие моноклональные антитела против фукозил-GM1 связываются с клеточной поверхностью клеточных линий DMS79 и H-4-II-E, экспрессирующих фукозил-GM1 (А и В), и что, как установлено,клетки DMS79 продолжают экспрессировать фукозил-GM1 in vivo (т.е. после имплантации мыши) (С); на фиг. 12 А и В - результаты экспериментов Hum-Zap интернализации, свидетельствующие о том,что человеческие моноклональные антитела против фукозил-GM1 могут интернализоваться фукозилGM1+ клетками; на фиг. 13 А и В - результаты комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) в тесте на клеточную пролиферацию, свидетельствующие о том, что человеческие моноклональные антитела против фукозилGM1 убивают клеточные линии (A) DMS79 и (В) H-4-II-E, которые экспрессируют фукозил-GM1; на фиг. 14 А и В - результаты антителозависимой цитотоксичности (ADCC) в тесте на клеточную пролиферацию, свидетельствующие о том, что человеческие моноклональные антитела против фукозилGM1 убивают клеточные линии, экспрессирующие фукозил-GM1 в отсутствие блокады CD16; на фиг. 15 А-С представлены размеры опухоли с течением времени у отдельных мышей SCID, которым имплантировали опухолевые клетки мелкоклеточного рака легкого DMS79 (фукозил-GM1+). После образования опухоли к мышам применяли пять раз один из следующих видов терапии: (A) PBS (контроль со средой для лекарственного средства); (В) человеческие IgG1 (контроль по изотипу) в дозе 30 мг/кг на мышь; (С) антифукозил-GM1 моноклональное антитело 5 В 1 в дозе 10 мг/кг на мышь; (D) антифукозил-GM1 моноклональное антитело 5 В 1 в дозе 30 мг/кг на мышь; (Е) антифукозил-GM1 моноклональное антитело 7 Е 4 в дозе 10 мг/кг на мышь или (F) антифукозил-GM1 моноклональное антитело 7 Е 4 в дозе 30 мг/кг на мышь. Размер опухоли на первый день лечения составлял примерно 200 мм 3; на фиг. 16 А и В - средний и медианный размер опухоли соответственно мышей, представленных на фиг. 15; на фиг. 17 - средний групповой вес мышей, представленных на фиг. 15. Подробное описание В одном аспекте изобретение относится, в целом, к выделенным моноклональным антителам, в частности человеческим моноклональным антителам, которые специфически связываются с фукозил-GM1. В определенных вариантах осуществления антитела по данному изобретению обладают одним или большим количеством желаемых функциональных свойств, таких как высокая аффинность связывания с фукозил-GM1 и/или способность ингибировать рост опухолевых клеток in vitro или in vivo. В определенных вариантах осуществления антитела по данному изобретению происходят от определенных гаметических последовательностей тяжелой и легкой цепей и/или обладают определенными структурными особенностями, такими как CDR области, обладающие определенными аминокислотными последовательностями. Данное изобретение относится к выделенным антителам, способам получения таких антител, иммуноконъюгатам и биспецифическим молекулам, включающим такие антитела, а также фармацевтическим композициям, содержащим антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические молекулы по данному изобретению. Данное изобретение также относится к способам применения антител, таким как для лечения болезней, таких как рак. Для того чтобы изобретение было проще понять, прежде всего дают определение конкретным терминам. Дополнительные определения излагают в тексте подробного описания. Термин "иммунный ответ" означает действие, например, лимфоцитов, антигенпрезентирующих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеуказанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к изби-5 017491 рательному повреждению, разрушению или удалению из тела человека внедрившихся патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случаях аутоиммунности или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека."Путь сигнальной трансдукции" означает биохимическую взаимосвязь между различными молекулами-переносчиками сигнала, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. Как используют здесь, словосочетание "поверхностный клеточный рецептор" включает,например, молекулы и комплексы молекул, способные принимать сигнал и передавать такой сигнал через цитоплазматическую мембрану клетки. Примером "поверхностного клеточного рецептора" по настоящему изобретению является рецептор фукозил-GM1. Термин "антитело", как используют здесь, включает цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (например, "антигенсвязывающий участок"), либо их одиночные цепи. "Антитело" означает гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или его антигенсвязывающий участок. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (здесь используют сокращение VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (здесь используют сокращение VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена - CL. Области VH и VL можно дополнительно подразделять на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), находящиеся в промежутках между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Термин "антигенсвязывающий участок" антитела (или просто "антигенсвязывающий участок"), как используют здесь, означает один или больше фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например, фукозил-GM1). Установлено, что антигенсвязывающую функцию антитела могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином "антигенсвязывающий участок", антитела включают: (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и CH1 доменов; (ii) F(ab')2 фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, состоящий из VH и CH1 доменов; (iv) Fv фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела, (v) dAb фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), который состоит из VH домена; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv фрагента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединять, используя способы рекомбинации,при помощи синтетического линкера, который позволяет получать их в виде одной белковой цепи, в которой VL и VH области составляют пары с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426 и Huston et al. (1988) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагают, что такие одноцепочечные антитела также охвачены термином "антигенсвязывающий участок" антитела. Подобные фрагменты антител получают, используя общепринятые методы, известные специалистам в данной области, и скрининг фрагментов на полезность проводят таким же образом, как и цельных антител."Выделенное антитело", как используют здесь, должно означать антитело, которое является в основном свободным от других антител, обладающих другими антигенными специфичностями (например,выделенное антитело, которое специфически связывает фукозил-GM1, является в основном свободным от антител, которые специфически связывают антигены, отличные от фукозил-GM1). Кроме того, выделенное антитело может являться в основном свободным от другого клеточного материала и/или реактивов. Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела", как используют здесь, означают препарат молекул антитела одной молекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела обладает одной специфичностью связывания и аффинностью для конкретного эпитопа. Термин "человеческое антитело", как используют здесь, должен включать антитела, обладающие вариабельными областями, в которых как каркасные, так и CDR области происходят от гаметических иммуноглобулиновых последовательностей человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, константная область также происходит от гаметических иммуноглобулиновых последовательностей человека. Человеческие антитела по данному изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые гаметическими иммуноглобулиновыми последовательностями человека (например, мутации, введенные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в результате соматической мутации in vivo). Однако термин "человеческое антитело", как используют здесь,не предназначен охватывать антитела, в которых CDR последовательности, происходящие от гаметиче-6 017491 ской последовательности других видов млекопитающих, таких как мышь, вставлены в каркасные последовательности человека. Термин "человеческое моноклональное антитело" означает антитела, обладающие единственной специфичностью связывания, которые имеют вариабельные области, в которых как каркасные, так иCDR области происходят от гаметических иммуноглобулиновых последовательностей человека. В одном варианте осуществления человеческие моноклональные антитела продуцирует гибридома, которая содержит В-клетку, полученную из трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, обладающей геномом, содержащим трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи человека, слитую с иммортализованной клеткой. Термин "рекомбинантное человеческое антитело", как используют здесь, охватывает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами,такие как: (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам иммуноглобулинов человека, или гибридомы, полученной от него (описанной ниже), (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии человеческого антитела, например из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческих иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела обладают вариабельными областями, в которых каркасные и CDR области происходят от гаметических иммуноглобулиновых последовательностей человека. В определенных вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела можно подвергать мутагенезу in vitro (или,если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезуin vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности VH и VL областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи производными от или родственными гаметическим последовательностям VH и VL человека, могут не существовать естественным образом в гаметическом репертуаре антител человека in vivo. Как используют здесь, "изотип" означает класс антитела (например, IgM или IgG1), который кодируют гены константной области тяжелой цепи. Фразы "антитело, узнающее антиген" и "антитело, специфическое для антигена" здесь используют взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном". Термин "производные человеческого антитела" означает любую модифицированную форму человеческого антитела, например конъюгат антитела и другого средства или антитела. Термин "гуманизированное антитело" должен означать антитела, в которых CDR последовательности, происходящие от гаметических последовательностей других видов млекопитающих, таких как мышь, сращивают с каркасными последовательностями человека. Дополнительные модификации каркасной области можно осуществлять внутри каркасных последовательностей человека. Термин "химерное антитело" должен означать антитела, в которых последовательности вариабельной области происходят от одного вида, а последовательности константной области происходят от другого вида, такие как антитела, в которых последовательности вариабельной области происходят от мышиного антитела, а последовательности константной области происходят от человеческого антитела. Как используют здесь, антитело, которое "специфически связывается с фукозил-GM1", должно означать антитело, которое связывается с фукозил-GM1 с KD, равной 110-7 M или меньше, более предпочтительно 510-8 М или меньше, более предпочтительно 110-8 М или меньше, более предпочтительно 510-9 М или меньше. Термин "Kassoc" или "Ka", как используют здесь, должен означать скорость ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин "Kdis" или "Kd", как используют здесь, должен означать скорость диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин "KD", как используют здесь, должен означать константу диссоциации, которую получают из отношения Kd к Ka (т.е. Kd/Ka) и выражают в виде молярной концентрации (М). Значения KD для антител можно определять, применяя способы, общепризнанные в данной области. Предпочтительным способом определения KD антитела является использование поверхностного плазмонного резонанса предпочтительно с применением биосенсорной системы, такой как система Biacore. Как используют здесь, термин "высокая аффинность" применительно к IgG антителу означает антитело, обладающее KD, равной 10-8 М или меньше, более предпочтительно 10-9 М или меньше и еще более предпочтительно 10-10 М или меньше в отношении целевого антигена. Однако "высокоаффинное" связывание может отличаться для других изотипов антител. Например, "высокоаффинное" связывание для IgM изотипа означает антитело, обладающее KD, равной 10-7 М или меньше, более предпочтительно 10-8 М или меньше, еще более предпочтительно 10-9 М или меньше. Как используют здесь, термин "субъект" охватывает любого человека или животное, отличное от человека. Термин "животное, отличное от человека" охватывает всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, кроме человека, овцы, собаки, кошки, лошади, коро-7 017491 вы, куры, амфибии, рептилии и т.д. Различные аспекты данного изобретения описывают более подробно в следующих подразделах. Антифукозил-GM1 антитела. Антитела по данному изобретению характеризуются конкретными функциональными особенностями или свойствами антител. Например, антитела специфически связываются с фукозил-GM1, предпочтительно фукозил-GM1. Предпочтительно антитело по данному изобретению связывается с фукозилGM1 с высокой аффинностью, например с KD, равной 110-7 M или меньше. Антифукозил-GM1 антитела по данному изобретению предпочтительно обладают одной или большим количеством следующих характеристик:(b) связываются с клеточной линией DMS-79 мелкоклеточного рака легкого человека (Human SCLC АТССCRL-2049). Предпочтительно антитело связывается с фукозил-GM1 с KD, равной 510-8 М или меньше, связывается с фукозил-GM1 с KD, равной 110-8 M или меньше, связывается с фукозил-GM1 с KD, равной 510-9 М или меньше, или связывается с фукозил-GM1 с KD, равной от 110-8 до 110-10 M или меньше. Стандартные анализы для оценки связывающей способности антител в отношении фукозил-GM1 известны в данной области, включая, например, варианты ELISA, вестерн-блоттинга и РИА (RIA). Кинетику связывания (например, аффинность связывания) антител также можно оценивать при помощи стандартных анализов, известных в данной области, таких как ELISA, анализ Скэтчарда и Biacore. Моноклональные антитела 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5. Предпочтительными антителами по данному изобретению являются человеческие моноклональные антитела 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и 2. Аминокислотные последовательности VH 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5 представлены в SEQ ID NO: 1-6 соответственно. Аминокислотные последовательности VL 5B1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4,13 В 8 и 18D5 представлены в SEQ ID NO: 7-12 соответственно. При условии, что каждое из данных антител может связываться с фукозил-GM1, последовательности VH и VL можно "составлять в различных сочетаниях", чтобы получать другие антифукозил-GM1 связывающие молекулы по данному изобретению. Связывание фукозил-GM1 такими "составленными в различных сочетаниях" антителами можно тестировать, применяя анализы на связывание, описанные выше,а также в разделе примеров (например, варианты ELISA). Предпочтительно, если VH и VL цепи составляют в различных сочетаниях, последовательность VH из конкретного парного образования VH/VL замещают структурно сходной последовательностью VH. Таким же образом, предпочтительно последовательность VL из конкретного парного образования VH/VL замещают структурно сходной последовательностью VL. Соответственно в одном аспекте данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему:(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6; и(b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-12; где антитело специфически связывает фукозил-GM1, предпочтительно фукозил-GM1. Предпочтительные сочетания тяжелой и легкой цепей включают:(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQID NO: 1; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQID NO: 2; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQID NO: 3; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQID NO: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQID NO: 5; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность(а) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQID NO: 6; и (b) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 12. В другом аспекте данное изобретение относится к антителам, которые обладают областями CDR1,-8 017491CDR2 областей Vk из 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5 представлены в SEQ ID NO: 37-42 соответственно. Аминокислотные последовательности CDR3 областей Vk из 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5 представлены в SEQ ID NO: 43-48 соответственно. CDR области изображали, используя систему Кэбата (Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department ofHealth and Human Services, NIH Publication91-3242). При условии, что каждое из данных антител может связываться с фукозил-GM1 и что специфичность связывания антигена обеспечивают, главным образом, CDR1, CDR2 и CDR3 области, последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH, а также последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 Vk можно "составлять в различных сочетаниях" (т.е. области CDR из различных антител можно составлять в различных сочетаниях, хотя каждое антитело должно содержать VH CDR1, CDR2 и CDR3, а также Vk CDR1,CDR2 и CDR3) для получения других антифукозил-GM1 связывающих молекул по данному изобретению. Связывание фукозил-GM1 такими "составленными в различных сочетаниях" антителами можно тестировать, применяя анализы на связывание, описанные выше, а также в разделе примеров (например,варианты ELISA, анализ Biacore). Предпочтительно, если CDR последовательности VH составляют в различных сочетаниях, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной VH последовательности заменяют структурно сходной CDR последовательностью(ми). Таким же образом, если CDR последовательности Vk составляют в различных сочетаниях, последовательность CDR1, CDR2 и/или CDR3 из конкретной Vk последовательности предпочтительно заменяют структурно сходной CDR последовательностью(ми). Для квалифицированного специалиста в данной области совершенно очевидно, что новыеVH и VL последовательности можно получать, заменяя одну или больше последовательностей CDR области VH и/или VL структурно сходными последовательностями из CDR последовательностей, раскрытых здесь для моноклональных антител 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5. Соответственно в другом аспекте данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему:(f) вариабельную область CDR3 легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность,выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43-48; где антитело специфически связывает фукозил-GM1, предпочтительно фукозил-GM1. В предпочтительном варианте осуществления антитело содержит:(f) вариабельную область CDR3 легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 43. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело содержит:(f) вариабельную область CDR3 легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 44. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело содержит:(f) вариабельную область CDR3 легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 45. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело содержит:(f) вариабельную область CDR3 легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 46. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело содержит:(f) вариабельную область CDR3 легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 47. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело содержит:(нов), сам по себе может определять специфичность связывания антитела для узнаваемого антигена, и что можно предсказуемо получать множество антител, обладающих одинаковой специфичностью связывания, на основе общей CDR3 последовательности, см., например, Klimka et al., British J. of Cancer 83 (2): 252-260 (2000) (описывают получение гуманизированного анти-CD30 антитела с использованием только вариабельного CDR3 домена тяжелой цепи из мышиного анти-CD30 антитела Ki-4); Beiboer et al., J.(EGP-2) с использованием только CDR3 последовательности тяжелой цепи исходного мышиного антиEGP-2 антитела МОС-31); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (описывают панель гуманизированных анти-интегрин V3 антител с использованием вариабельного CDR3 домена тяжелой и легкой цепей мышиного антиинтегрин V3 антитела LM609, где каждое из данных антител содержит различную последовательность за пределами CDR3 домена и способно связывать тот же эпитоп,что и исходное мышиное антитело со значениями аффинности такими же или большими, чем исходное мышиное антитело); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (сообщают, что CDR3 домен обеспечивает наиболее значительный вклад в связывание антигена); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. SciU.S.A. 92:2529-2533 (1995) (описывают перенос CDR3 последовательностей тяжелой цепи трех Fab (SI-1,SI-40 и SI-32) против плацентарной ДНК человека в тяжелую цепь Fab против столбнячного токсина, тем самым заменяя существующую CDR3 тяжелой цепи и демонстрируя, что CDR3 домен сам по себе придает специфичность связывания); и Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (описывают исследования по переносу, где перенос только CDR3 тяжелой цепи исходного полиспецифического Fab LNA3 в тяжелую цепь связывающего столбнячный токсин Fab моноспецифического IgG антитела р 313 являлся достаточным для сохранения специфичности связывания исходного Fab). Полное содержание каждой из данных ссылок включено сюда в качестве ссылки. Соответственно в рамках определенных аспектов изобретение относится к моноклональным антителам, содержащим один или больше CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела, не принадлежащего человеку, такого как антитело мыши или крысы, где моноклональное антитело способно специфически связываться с фукозил-GM1. В рамках некоторых вариантов осуществления такие антитела,содержащие один или больше CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из антитела, не принадлежащего человеку, (а) способны конкурировать за связывание с; (b) сохраняют функциональные характеристики; (с) связывают тот же эпитоп и/или (d) обладают сходной аффинностью связывания, что и соответствующее исходное антитело, не принадлежащее человеку. В рамках других аспектов изобретение относится к моноклональным антителам, содержащим один или больше CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, такого как,например, человеческое антитело, полученное от животного, отличного от человека, где первое человеческое антитело способно специфически связываться с фукозил-GM1 и где CDR3 доменом из первого человеческого антитела заменяют CDR3 домен в человеческом антителе, которое не обладает специфичностью связывания в отношении фукозил-GM1, чтобы получить второе человеческое антитело, которое- 10017491 способно специфически связываться с фукозил-GM1. В рамках некоторых вариантов осуществления такие патентоспособные антитела, содержащие один или больше CDR3 доменов тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела: (а) способны конкурировать за связывание с; (b) сохраняют функциональные характеристики; (с) связывают тот же эпитоп и/или (d) обладают сходной аффинностью связывания, что и соответствующее исходное первое человеческое антитело. Антитела, обладающие конкретными гаметическими последовательностями. В определенных вариантах осуществления антитело по данному изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи из гена иммуноглобулина с конкретной гаметической тяжелой цепью и/или вариабельную область легкой цепи из гена иммуноглобулина с конкретной гаметической легкой цепью. Например, в предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт, или происходит от VH 3-48 гена человека,где антитело специфически связывает фукозил-GM1, предпочтительно фукозил-GM1. В другом предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт, или происходит от VK L15 гена человека, где антитело специфически связывает фукозил-GM1, предпочтительно фукозил-GM1. В еще одном предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, где антитело:(а) содержит вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или происходит от VH 3-48 гена человека (каковой ген кодирует аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 61);(b) содержит вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или происходит от VK L15 гена человека (каковой ген кодирует аминокислотную последовательность, изложенную в(c) специфически связывается с фукозил-GM1. Примерами антител, обладающих VH и VK от VH 3-48 и VK L15 соответственно, являются 5 В 1, 5 В 1 а,7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5. Как используют здесь, человеческое антитело содержит вариабельные области тяжелой или легкой цепи, которые представляют собой "продукт" или "происходят от" конкретной гаметической последовательности, если вариабельные области антитела получают из системы, в которой используют гаметические гены иммуноглобулинов человека. Такие системы включают иммунизацию трансгенной мыши, обладающей генами иммуноглобулинов человека, интересующим антигеном, или скрининг фаговодисплейной библиотеки генов иммуноглобулинов человека при помощи интересующего антигена. Человеческое антитело, которое представляет собой "продукт" или "происходит от" гаметической иммуноглобулиновой последовательности человека, можно распознать как таковое, сравнивая аминокислотную последовательность человеческого антитела с аминокислотными последовательностями гаметических иммуноглобулинов человека и выбирая человеческую гаметическую иммуноглобулиновую последовательность, которая является наиболее близкой по последовательности (т.е. наибольший % идентичности) с последовательностью человеческого антитела. Человеческое антитело, которое представляет собой"продукт" или "происходит от" конкретной гаметической иммуноглобулиновой последовательности человека, может иметь отличия по аминокислотам в сравнении с гаметической последовательностью, в результате, например, естественных соматических мутаций или намеренного внесения сайтнаправленной мутации. Однако выбранное человеческое антитело обычно является по меньшей мере на 90% идентичным по последовательности аминокислот аминокислотной последовательности, кодируемой гаметическим иммуноглобулиновым геном человека, и содержит аминокислотные остатки, которые идентифицируют человеческое антитело как человеческое при сравнении с гаметическими иммуноглобулиновыми аминокислотными последовательностями других видов (например, мышиными гаметическими последовательностями). В определенных случаях человеческое антитело может являться по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентичным по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности, кодируемой гаметическим иммуноглобулиновым геном. Обычно человеческое антитело, происходящее от конкретной гаметической последовательности человека, обладает не более чем 10 аминокислотными различиями с аминокислотной последовательностью, кодируемой гаметическим иммуноглобулиновым геном человека. В определенных случаях человеческое антитело может обладать не более чем 5 или даже не более чем 4, 3, 2 или 1 аминокислотным различием с аминокислотной последовательностью, кодируемой гаметическим иммуноглобулиновым геном.- 11017491 Гомологичные антитела В еще одном варианте осуществления антитело по данному изобретению содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, обладающие аминокислотными последовательностями, которые являются гомологичными аминокислотным последовательностям предпочтительных антител, описанных здесь, и где антитела сохраняют желаемые функциональные свойства антифукозил-GM1 антител по данному изобретению. Например, данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:(a) вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% гомологичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-6;(b) вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% гомологичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7-12; и антитело обладает одним или большим количеством следующих свойств:(d) антитело связывается с клеточной линией DMS-79 мелкоклеточного рака легкого человека (Human SCLC АТССCRL-2049). В других вариантах осуществления аминокислотные последовательности VH и/или VL могут являться на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичными последовательностям, приведенным выше. Антитело, обладающее VH и VL областями, имеющими высокий процент (т.е. 80% или больше) гомологии сVH и VL областями последовательностей, приведенных выше, можно получать посредством мутагенеза(например, сайт-направленного или ПЦР-опосредованного мутагенеза) молекул нуклеиновой кислоты,кодирующих SEQ ID NO: 49-60, с последующей проверкой кодированного измененного антитела на сохранение функции (т.е. функций, изложенных выше в (с) и (d с применением функциональных анализов, описанных здесь. Как используют здесь, процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями является равнозначным проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных позиций, являющихся общими для последовательностей (т.е. % гомологии = количество идентичных позиций/общее количество позиций 100), принимая во внимание число разрывов и длину каждого разрыва, которые следует вводить для оптимального сравнительного анализа двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять, используя математический алгоритм, как описано ниже в неограничивающих примерах. Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять,используя алгоритм Е. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988, который введен в состав программы ALIGN (версия 2.0), применяя таблицу весов остатков РАМ 120, штраф за длину разрыва, равный 12, и штраф за разрыв, равный 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять, используя алгоритм Needleman и Wunsch (J. Mol.www.gcg.com), применяя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу РАМ 250, и значение для разрыва, равное 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и значение для длины, равное 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Дополнительно или альтернативно, белковые последовательности по настоящему изобретению можно, кроме того, использовать как "запрашиваемую последовательность" для проведения поиска в общедоступных базах данных, чтобы, например, выявить родственные последовательности. Такие поиски можно осуществлять, используя программу XBLAST (версия 2.0) авторов Altschul, et al. (1990) J. Mol.Biol. 215:403-10. Поиск белков BLAST можно проводить с помощью программы XBLAST, количественный показатель = 50, длина слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам антитела по данному изобретению. Чтобы получить содержащие разрывы совмещения с целью сравнения, можно использовать Gapped BLAST, как описывают в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST) (см.www.ncbi.nlm.nih.gov). Антитела с консервативными модификациями. В определенных вариантах осуществления антитело по данному изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где одна или большее количество данных CDR последовательностей обладают заданными аминокислотными последовательностями, исходя из предпочтительных антител, описанных здесь (например, 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5), или их консервативных модификаций, и где антитела сохраняют желаемые функциональные- 12017491 свойства антифукозил-GM1 антител по данному изобретению. Соответственно данное изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где:(a) CDR3 последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей(b) CDR3 последовательность вариабельной области легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностейSEQ ID NO: 43-48 и их консервативных модификаций; и антитело обладает одним или большим количеством следующих свойств:(d) антитело связывается с клеточной линией DMS-79 мелкоклеточного рака легкого человека (Human SCLC АТССCRL-2049). В предпочтительном варианте осуществления CDR2 последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 19-24 и их консервативных модификаций; и CDR2 последовательность вариабельной области легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 37-42 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном варианте осуществления CDR1 последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 13-18, и их консервативных модификаций; и CDR1 последовательность вариабельной области легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 31-36 и их консервативных модификаций. Как используют здесь, термин "консервативные модификации последовательности" должен означать аминокислотные модификации, которые существенно не влияют или не изменяют характеристики связывания антитела, обладающего аминокислотной последовательностью. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, вставки или делеции. Модификации можно вносить в антитело по данному изобретению с помощью стандартных методов, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативными аминокислотными заменами являются такие, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, обладающим аналогичной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, обладающих аналогичными боковыми цепями, определены в данной области. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями(например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бетаразветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или больше аминокислотных остатков в CDR областях антитела по данному изобретению можно заменять на другие аминокислотные остатки из семейства с такими же боковыми цепями, и измененное антитело можно проверять на сохранение функции (т.е. функций, изложенных выше в (с) и (d с применением функциональных анализов, описанных здесь. Антитела, которые связывают тот же эпитоп, что и антифукозил-GM1 антитела по данному изобретению. В другом варианте осуществления данное изобретение относится к антителам, которые связывают тот же эпитоп на фукозил-GM1, что и любое из моноклональных антител к фукозил-GM1 по данному изобретению (т.е. антитела, которые обладают способностью перекрестно конкурировать за связывание фукозил-GM1 с любым из моноклональных антител по данному изобретению). В предпочтительных вариантах осуществления антитело сравнения для исследований по перекрестной конкуренции может представлять собой моноклональное антитело 5 В 1 (обладающее VH и VL последовательностями, как представлено в SEQ ID NO: 1 и 7 соответственно), или моноклональное антитело 5 В 1 а (обладающее VH иVL последовательностями, как представлено в SEQ ID NO: 2 и 8 соответственно), или моноклональное антитело 7D4 (обладающее VH и VL последовательностями, как представлено в SEQ ID NO: 3 и 9 соответственно), или моноклональное антитело 7 Е 4 (обладающее VH и VL последовательностями, как представлено в SEQ ID NO: 4 и 10 соответственно), или моноклональное антитело 13 В 8 (обладающее VH и VL последовательностями, как представлено в SEQ ID NO: 5 и 11 соответственно), или моноклональное антитело 18D5 (обладающее VH и VL последовательностями, как представлено в SEQ ID NO: 6 и 12 соответственно). Такие перекрестно конкурирующие антитела можно выявлять, исходя из их способности перекрестно конкурировать с 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5 в стандартном анализе на связывание фукозил-GM1. Например, можно использовать анализ BIAcore, анализы ELISA или проточной цитомет- 13017491 рии, чтобы продемонстрировать перекрестную конкуренцию с антителами по данному изобретению. Способность изучаемого антитела ингибировать связывание, например, 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5 с фукозил-GM1 свидетельствует о том, что изучаемое антитело может конкурировать с 5 В 1, 5 В 1 а,7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5 за связывание с фукозил-GM1 и, таким образом, связывает тот же эпитоп на фукозил-GM1, что и 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5. В предпочтительном варианте осуществления антитело, которое связывает тот же эпитоп на фукозил-GM1, что и 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5,представляет собой человеческое моноклональное антитело. Такие человеческие моноклональные антитела можно получать и выделять, как описано в примерах. Генно-инженерные и модифицированные антитела. Антитело по данному изобретению можно дополнительно получать, используя антитело, обладающее одной или большим количеством VH и/или VL последовательностей, раскрытых здесь, в качестве исходного материала для конструирования модифицированного антитела, каковое модифицированное антитело может обладать измененными свойствами по сравнению с исходным антителом. Антитело можно конструировать, изменяя один или больше остатков в составе одной или обеих вариабельных областей (т.е. VH и/или VL), например в составе одной или большего количества CDR областей и/или в составе одной или большего количества каркасных областей. Дополнительно или альтернативно, антитело можно конструировать, модифицируя остатки в составе константной области(ей), например, чтобы изменить эффекторную функцию(и) антитела. Одним видом конструирования вариабельной области, которое можно осуществлять, является перенесение CDR. Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами в основном через аминокислотные остатки, которые расположены в шести определяющих комплементарность областях (CDR) тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные остатки в CDR областях сильнее различаются между отдельными антителами, чем последовательности за пределами CDR областей. Поскольку CDR последовательности отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, возможно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител, создавая экспрессирующие векторы, которые содержат CDR последовательности из специфических природных антител, перенесенные в каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см.,например, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen,С. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; патент США 5225539, выданный Winter, и патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.) Соответственно другой вариант осуществления данного изобретения относится к выделенному моноклональному антителу, или его антигенсвязывающему участку, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2, и CDR3, обладающие аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-8, SEQ ID NO: 19-24 и SEQ IDNO: 25-30 соответственно, а также вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательностиCDR1, CDR2, и CDR3, обладающие аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31-36, SEQ ID NO: 37-42 и SEQ ID NO: 43-48 соответственно. Таким образом,подобные антитела содержат CDR последовательности VH и VL моноклональных антител 5 В 1, 5 В 1 а,7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5, хотя могут содержать отличающиеся каркасные последовательности из данных антител. Такие каркасные последовательности можно получать из общедоступных баз данных ДНК либо опубликованных литературных источников, которые содержат генные последовательности гаметичеких антител. Например, гаметические последовательности ДНК для человеческих генов вариабельной области тяжелой и легкой цепей можно найти в базе данных гаметических последовательностей человека"VBase" (доступно в сети Интернет на сайте www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat, E.A., et al.in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждой из ссылок специально включено сюда в качестве ссылки. В другом примере гаметические последовательности ДНК для человеческих генов вариабельной области тяжелой и легкой цепей можно найти в базе данных Genbank. Например, следующие гаметические последовательности тяжелой цепи, обнаруженные у мыши НСо 7 HuMAb, доступны в сопроводительных инвентарных номерах Genbank: 1-69 (NG0010109, NT024637 и ВС 070333), 3-33(NG0010109 и NT024637) и 3-7 (NG0010109 и NTJD24637). В качестве другого примера, следующие гаметические последовательности тяжелой цепи, обнаруженные у мыши НСо 12 HuMAb, доступны в сопроводительных инвентарных номерах Genbank: 1-69 (NG0010109, NT024637 и ВС 070333), 5-51(NG0010109 и NT024637), 4-34 (NG0010109 и NT024637), 3-30.3 и 3-23 (AJ406678). Предпочтительными каркасными последовательностями для использования в антителах по данному изобретению являются такие, которые сходны по структуре с каркасными последовательностями,имеющимися в выбранных антителах по настоящему изобретению, например сходными с каркасными последовательностями VH 3-48 (SEQ ID NO: 61) и/или каркасными последовательностями VK L15 (SEQID NO: 62), имеющимися в предпочтительных моноклональных антителах по данному изобретению.CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности VH и CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности VK можно переносить в каркасные области, которые обладают последовательностью, идентичной той, что обнаружена в гаметическом иммуноглобулиновом гене, от которого происходит каркасная последовательность,или CDR последовательности можно переносить в каркасные области, которые содержат одну или больше мутаций по сравнению с гаметическими последовательностями. Например, обнаружили, что в определенных случаях полезно осуществлять мутации остатков в составе каркасных областей, чтобы сохранять или усиливать антигенсвязывающую способность антитела (см., например, патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданных Queen et al.). Другой вид модификации вариабельной области заключается в том, чтобы осуществлять мутации аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 и/или CDR3 областях VH и/или VK, чтобы тем самым усовершенствовать одно или больше свойств связывания (например, аффинность) интересующего антитела. Можно проводить сайт-направленный мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез, чтобы ввести мутацию(и), и эффект на связывание или другое интересующее функциональное свойство антитела можно оценивать анализами in vitro или in vivo, как описывают здесь и предлагают в примерах. Предпочтительно вводят консервативные модификации (как обсуждали выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, вставки или делеции, однако предпочтительными являются замены. Кроме того, обычно изменяют не более чем один, два, три, четыре или пять остатков в составе CDR области. Соответственно в другом варианте осуществления данное изобретение относится к выделенным антифукозил-GM1 моноклональным антителам или их антигенсвязывающим участкам, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: (а) CDR1 область VH, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 и 18, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 и 18; (b) CDR2 область VH, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 и 24, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 и 24; (с) CDR3 область VH,включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 и 30, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 и 30; (d)CDR1 область VK, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35 и 36, или аминокислотную последовательность, имеющую одну,две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 31,32, 33, 34, 35 и 36; (е) CDR2 область VK, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 и 42, или аминокислотную последовательность,имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению сSEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 и 42; и (f) CDR3 область VK, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 и 48, или аминокислотную последовательность, имеющую одну, две, три, четыре или пять аминокислотных замен, делеций или вставок по сравнению с SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47 и 48. Генно-инженерные антитела по данному изобретению включают те, в которых осуществили модификации каркасных остатков в составе VH и/или VK, например, для усовершенствования свойств антитела. Обычно такие каркасные модификации осуществляют для уменьшения иммуногенности антитела. Например, один из подходов заключается в том, чтобы осуществить "обратную мутацию" одного или больше каркасных остатков в сторону соответствующей гаметической последовательности. Более конкретно, антитело, которое претерпело соматическую мутацию, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от гаметической последовательности, от которой произошло антитело. Такие остатки можно выявить, сравнивая каркасные последовательности антитела с гаметическими последовательностями, от которой произошло антитело. Например, для 7 Е 4, аминокислотный остаток 11 (в составе FR1) VH представляет собой серин,тогда как данный остаток в соответствующей гаметической последовательности VH 3-48 представляет собой лейцин. Для возвращения последовательностей каркасной области к их гаметической структуре можно осуществить соматические "обратные мутации" в сторону гаметической последовательности при помощи, например, сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза (например,для остатка 11 из FR1 VH из 7 Е 4 можно осуществить "обратную мутацию" с серина на лейцин). В качестве другого примера, для 5 В 1, 5B1a, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5, аминокислотный остаток 16(в составе FR1) VH представляет собой глутаминовую кислоту, тогда как данный остаток в соответствующей гаметической последовательности VH 3-48 представляет собой глицин. Для возвращения последовательностей каркасной области к их гаметической структуре можно, например, осуществить "обратную мутацию" остатка 16 из VH 5B1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5 с глутаминовой кислоты на глицин. Такие "обратно мутировавшие" антитела также предусмотрены для включения в область притязания данного изобретения.(в составе FR1) VH представляет собой валин, тогда как данный остаток в соответствующей гаметической последовательности VH 3-48 представляет собой аланин. Для возвращения последовательностей каркасной области к их гаметической структуре можно, например, осуществить "обратную мутацию" остатка 23 из VH 5B1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5 с валина на аланин. Такие "обратномутировавшие" антитела также предусмотрены для включения в область притязания данного изобретения. В качестве другого примера, для 7D4, аминокислотный остаток 24 (в составе FR1) VH представляет собой валин, тогда как данный остаток в соответствующей гаметической последовательности VH 348 представляет собой аланин. Для возвращения последовательностей каркасной области к их гаметической структуре можно, например, осуществить "обратную мутацию" остатка 24 из VH 7D4 с валина на аланин. Такие "обратномутировавшие" антитела также предусмотрены для включения в область притязания данного изобретения. В качестве другого примера, для 13 В 8, аминокислотный остаток 29 (в составе FR1) VH представляет собой лейцин, тогда как данный остаток в соответствующей гаметической последовательности VH 3-48 представляет собой фенилаланин. Для возвращения последовательностей каркасной области к их гаметической структуре можно, например, осуществить "обратную мутацию" остатка 29 из VH 13B8 с лейцина на фенилаланин. Такие "обратномутировавшие" антитела также предусмотрены для включения в область притязания данного изобретения. В качестве другого примера, для 7D4, 13 В 8 и 18D5, аминокислотный остаток 48 (в составе FR2)VH представляет собой изолейцин, тогда как данный остаток в соответствующей гаметической последовательности VH 3-48 представляет собой валин. Для возвращения последовательностей каркасной области к их гаметической структуре можно, например, осуществить "обратную мутацию" остатка 48 (остаток 13 в составе FR2) из VH 7D4, 13 В 8 и 18D5 с изолейцина на валин. Такие "обратномутировавшие" антитела также предусмотрены для включения в область притязания данного изобретения. В качестве другого примера, для 7D4 и 18D5, аминокислотный остаток 84 (в составе FR3) VH представляет собой серин, тогда как данный остаток в соответствующей гаметической последовательности VH 3-48 представляет собой аспарагин. Для возвращения последовательностей каркасной области к их гаметической структуре можно, например, осуществить "обратную мутацию" остатка 84 (остаток 18 в составе FR3) из VH 7D4 и 18D5 с серина на аспарагин. Такие "обратномутировавшие" антитела также предусмотрены для включения в область притязания данного изобретения. Другой вид каркасных модификаций включает осуществление мутации одного или большего количества остатков в каркасной области или даже в одной или большем количестве CDR областей, чтобы удалить Т-клеточные эпитопы и, тем самым, уменьшить потенциальную иммуногенность антитела. Такой подход также называют "деиммунизацией" и описывают более подробно в патентной публикации США 20030153043 авторов Cair et al. Дополнительно или альтернативно, к модификациям, осуществляемым в каркасных или CDR областях, антитела по данному изобретению можно конструировать так, чтобы вносить модификации в Fc область, обычно чтобы изменить одно или больше функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание Fc рецептора и/или зависящая от антигена клеточная цитотоксичность. Кроме того, антитело по данному изобретению можно химически модифицировать (например, одну или больше химических функциональных групп можно присоединять к антителу) или модифицировать, чтобы изменить его гликозилирование, опять-таки, чтобы изменить одно или больше функциональных свойств антитела. Каждый из данных вариантов осуществления описан более подробно ниже. Нумерация остатков в Fc области соответствует ЕС (EU) каталогу Kabat. В одном варианте осуществления шарнирную область СН 1 модифицируют таким образом, что число цистеиновых остатков в шарнирной области является измененным, например увеличенным или уменьшенным. Такой подход описан дополнительно в патенте США 5677425 авторами Bodmer et al. Число цистеиновых остатков в шарнирной области СН 1 изменяют, чтобы, например, облегчить сборку легкой и тяжелой цепей или увеличить либо уменьшить стабильность антитела. В другом варианте осуществления осуществляют мутацию шарнирной области Fc антитела, чтобы сократить биологическое время полужизни антитела. Более конкретно, одну или больше аминокислотных мутаций вводят в граничную область СН 2-СН 3 доменов Fc-шарнирного фрагмента таким образом,что антитело обладает пониженным связыванием стафилококкового протеина А (SpA) по сравнению с естественным связыванием Fc-шарнирным доменом SpA. Данный подход более подробно описан в патенте США 6165745 авторами Ward et al. В другом варианте осуществления антитело модифицируют для увеличения его биологического времени полужизни. Различные подходы являются возможными. Например, можно вводить одну или большее количество из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в патенте США 6277375, выданному Ward. Альтернативно, чтобы увеличить биологическое время полужизни, антитело можно изменять в СН 1 или CL области, чтобы оно содержало связывающий реутилизационный рецептор эпитоп, образованный двумя петлями СН 2 домена Fc области IgG, как описано в патентах США 5869046 и 6121022 авторами Presta et al.- 16017491 Кроме того, в других вариантах осуществления Fc область изменяют, замещая по меньшей мере один аминокислотный остаток другим аминокислотным остатком, чтобы изменить эффекторную функцию(и) антитела. Например, одна или больше аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, можно заменять на другой аминокислотный остаток так, чтобы антитело имело измененную аффинность для эффекторного лиганда, однако сохраняло способность связывать антиген, присущую исходному антителу. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменяют, может представлять собой, например, Fc рецептор или С 1 компонент комплемента. Данный подход описан более подробно в патентах США 5624821 и 5648260, авторами обоих являются Winter et al. В другом примере одна или большее количество аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322, можно заменять на другой аминокислотный остаток так, чтобы у антитела изменилось связывание C1q и/или уменьшилась или исчезла зависимая от комплемента цитотоксичность (CDC). Данный подход описан более подробно в патенте США 6194551 авторами Idusogie et al. В другом примере один или больше аминокислотных остатков на аминокислотных позициях 231 и 239 изменяют, чтобы, тем самым, изменить способность антитела фиксировать комплемент. Данный подход описан более подробно в РСТ публикации WO 94/29351 авторами Bodmer et al. Кроме того, в другом примере Fc область изменяют, чтобы увеличить способность антитела опосредовать антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) и/или увеличить аффинность антитела для Fc рецептора, изменяя одну или больше аминокислот на следующих позициях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289,290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331,333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Данный подход описан дополнительно в РСТ публикации WO 00/42072 автором Presta. Кроме того,определили положение центров связывания на человеческом IgG1 для FcR1, FcRII, FcRIII и FcRn и описали варианты с улучшенными показателями связывания (см. Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Установили, что специфические мутации на позициях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание FcRIII. Кроме того, показали, что следующие комбинированные мутации улучшают связывание FcRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A и S298A/E333A/K334A. В следующем дополнительном варианте осуществления изменяют гликозилирование антитела. Например, можно получить агликозилированное антитело (т.е. антитело без гликозилирования). Гликозилирование можно изменять для того, чтобы, например, повысить аффинность антитела для антигена. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, изменяя один или больше центров гликозилирования внутри последовательности антитела. Например, можно осуществлять одну или больше аминокислотных замен, которые приводят к потере одного или большего количества каркасных центров гликозилирования вариабельной области, чтобы, тем самым, устранить гликозилирование в данном центре. Такое агликозилирование может повысить аффинность антитела для антигена. Данный подход описан более подробно в патентах США 5714350 и 6350861 авторами Со et al. Дополнительно или альтернативно, можно получать антитело, которое обладает измененным типом гликозилирования, такое как гипофукозилированное антитело, обладающее пониженным количеством фукозильных остатков, либо антитело, обладающее повышенным содержанием биссекторных GlcNac структур. Установили, что такие измененные схемы гликозилирования повышают ADCC способность антител. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, посредством экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в данной области, и их можно использовать в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных антител по данному изобретению, чтобы, тем самым, получить антитело с измененным гликозилированием. Например, у клеточных линий Ms704, Ms705 и Ms709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, FUT8 (альфа(1,6)фукозилтрансфераза), так что у антител, экспрессированных в клеточных линиях Ms704, Ms705 и Ms709, в углеводах отсутствует фукоза. Клеточные линии Ms704, Ms705 и Ms709 FUT8-/- получили посредством направленного разрушения гена FUT8 в клетках CHO/DG44 с использованием двух векторов замещения (см. патентную публикацию США 20040110704 авторовYamane et al. и Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). В качестве другого примера в ЕР 1176195 авторы Hanai et al. описывают клеточную линию с функционально разрушенным геномFUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, так что антитела, экспрессированные в такой клеточной линии, являются гипофукозилированными из-за уменьшения содержания или элиминирования фермента,имеющего отношение к альфа 1,6 связи. Hanai et al. также описывают клеточные линии, которые обладают низкой ферментативной активностью в отношении присоединения фукозы к N-ацетилглюкозамину,который связывается с Fc областью антитела или не обладают ферментативной активностью, например крысиная миеломная клеточная линия YB2/0 (АТСС CRL 1662). В РСТ публикации WO 03/035835 авторPresta описывает вариант клеточной линии СНО, клетки Lec 13, с пониженной способностью присоединять фукозу к Asn(297)-связанным углеводам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессированных в такой клетке-хозяине (см. также Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733- 17017491 26740). В РСТ публикации WO 99/54342 авторы Umana et al. описывают клеточные линии, полученные генно-инженерными способами для экспрессии модифицирующих углеводы гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансфераза III (GnTIII, так что антитела, экспрессированные в генно-инженерных клеточных линиях, обладают повышенным содержанием биссекторных GlcNac структур, что приводит к повышенной ADCC активности антител (см. также Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Альтернативно, фукозные остатки антитела можно отщеплять, используя фермент фукозидазу. Например, фукозидаза альфа-L-фукозидаза удаляет фукозильные остатки с антител (Tarentino,A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23). Другой модификацией описанных здесь антител, которая предусмотрена по данному изобретению,является пегилирование. Антитело можно пегилировать, чтобы, например, увеличить биологическое (например, в сыворотке) время полужизни антитела. Чтобы пегилировать антитело, обычно проводят реакцию антитела или его фрагмента, с полиэтиленгликолем (PEG), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное PEG, в условиях, при которых одна или больше групп PEG становятся присоединенными к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно пегилирование проводят посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулойPEG (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). Как используют здесь,термин "полиэтиленгликоль" должен охватывать любую из форм PEG, которые применяют для получения производных других белков, такие как моно(С 1-С 10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль, либо полиэтиленгликоль-малеимид. В определенных вариантах осуществления антитело, которое пегилируют,представляет собой агликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны в данной области, и их можно применять к антителам по данному изобретению, см., например, ЕР 0154316 авторов Nishimura et al. и ЕР 0401384 авторов Ishikawa et al. Способы генно-инженерного получения антител. Как описано выше, антифукозил-GM1 антитела, обладающие описанными здесь VH и VK последовательностями, можно использовать для создания новых антифукозил-GM1 антител посредством модификации VH и/или VK последовательностей, либо соединенной с ними константной области (ей). Таким образом, в другом аспекте данного изобретения структурные особенности антифукозил-GM1 антитела по данному изобретению, например 5 В 1, 5B1a, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5, используют для создания структурно родственных антифукозил-GM1 антител, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител по данному изобретению, такое как связывание с фукозил-GM1. Например, одну или больше CDR областей 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 18D5 либо их мутантов можно рекомбинантно объединять с известными каркасными областями и/или другими CDR для создания дополнительных,генно-инженерных антифукозил-GM1 антител по данному изобретению, как обсуждали выше. Другие виды модификаций включают те, что описаны в предыдущем разделе. Исходным материалом для генноинженерного способа является одна или больше VH и/или VK последовательностей, предложенных здесь,либо их одна или большее количество CDR областей. Чтобы получить генно-инженерное антитело, нет необходимости получать в действительности (т.е. экспрессировать в виде белка) антитело, обладающее одной или большим количеством VH и/или VK последовательностей, предложенных здесь, либо их одной или большим количеством CDR областей. Скорее информацию, содержащуюся в последовательности(ях), используют в качестве исходного материала для получения "второго поколения" последовательности(ей), производной от оригинальной последовательности(ей), и затем "второе поколение" последовательности(ей) получают и экспрессируют в виде белка. Соответственно в другом варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения антифукозил-GM1 антитела, включающему:(а) получение: (i) последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, содержащейCDR1 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13-18, CDR2 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-24, и/или CDR3 последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25-30; и/или (ii) последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, содержащей CDR1 последовательность, выбранную из группы, состоящей из(b) изменение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и/или последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, чтобы получить по меньшей мере одну измененную последовательность антитела; и(c) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка. Для получения и экспрессии измененной последовательности антитела можно использовать стандартные молекулярно-биологические методы. Предпочтительно антитело, кодируемое измененной последовательностью(ми) антитела, представляет собой антитело, которое сохраняет одно, несколько или все функциональные свойства антифукозилGM1 антител, описанных здесь, каковые функциональные свойства включают, но без ограничения, следующее:(b) связывается с клеточной линией DMS-79 мелкоклеточного рака легкого человека (Human SCLC АТССCRL-2049). Функциональные свойства измененных антител можно оценивать, используя стандартные анализы,применяемые в данной области и/или описанные здесь, такие как те, что изложены в разделе примеров(например, проточную цитометрию, тесты на связывание). В определенных вариантах осуществления способов генно-инженерного получения антител по данному изобретению мутации можно вводить случайным образом либо избирательно, на протяжении всей или части последовательности, кодирующей антифукозил-GM1 антитело, и можно проводить скрининг полученных модифицированных антифукозил-GM1 антител на связывающую активность и/или другие функциональные свойства, как описано здесь. Способы осуществления мутаций описаны в данной области. Например, в РСТ публикации WO 02/092780 автор Short описывает способы получения и отбора мутаций антител с использованием насыщающего мутагенеза, сборки синтетическим лигированием или их сочетания. Альтернативно, в РСТ публикации WO 03/074679 авторы Lazar et al. описывают способы использования методов компьютерного скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела по данному изобретению. Другой аспект данного изобретения относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитела по данному изобретению. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной либо в основном очищенной форме. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "приведенной в основном чистое состояние", если ее очищают от других клеточных компонентов или других примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков,с помощью стандартных методов, включая щелочную/SDS обработку, разделение в CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие, хорошо известные в данной области, см. F.Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,New York. Нуклеиновая кислота по данному изобретению может представлять собой, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать интронных последовательностей. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК. Нуклеиновые кислоты по данному изобретению можно получать, используя стандартные молекулярно-биологические методы. Для антител, экспрессируемых гибридомами (например, гибридомами,полученными от трансгенных мышей, несущих гены человеческих иммуноглобулинов, как описано ниже), кДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, производимого гибридомой, можно получать стандартными методами ПЦР амплификации или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки иммуноглобулиновых генов (например, с использованием методов фагового дисплея), нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно извлекать из библиотеки. Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты по данному изобретению являются те, которые кодируют VH и VL последовательности моноклональных антител 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 или 3 С 4. Последовательности ДНК, кодирующие VH последовательности 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 18D5,представлены в SEQ ID NO: 49-54 соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие VL последовательности 5 В 1, 5 В 1 а, 7D4, 7 Е 4, 13 В 8 и 3 С 4, представлены в SEQ ID NO: 55-60 соответственно. Когда фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL сегменты, получены, с данными фрагментами ДНК можно далее проводить манипуляции стандартными методами для рекомбинантной ДНК, например,чтобы преобразовать гены вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, гены Fab фрагмента или в ген scFv. При данных манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Термин "функционально связанный", как используют в данном контексте,должен означать, что два фрагмента ДНК соединяют таким образом, чтобы аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, оставались внутри рамки считывания. Выделенную ДНК, кодирующую VH область, можно преобразовать в полноразмерный ген тяжелой цепи, функционально связывая ДНК, кодирующую VH, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и СН 3). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области (см., например, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication913242), и фрагменты ДНК, охватывающие данные области, можно получать стандартной ПЦР амплификацией. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2,IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, однако наиболее предпочтительно представляет собой константную область IgG1 или IgG4. Для гена тяжелой цепи Fab фрагмента ДНК, кодирующую VH, можно функционально связывать с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область СН 1 тяжелой цепи. Выделенную ДНК, кодирующую VL область, можно преобразовать в полноразмерный ген легкой цепи (а также ген легкой цепи Fab), функционально связывая ДНК, кодирующую VL, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области (см., например, Kabat, Е.А. et al. (1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication91-3242), и фрагменты ДНК, охватывающие данные области, можно получать стандартной ПЦР амплификацией. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда, однако наиболее предпочтительно представляет собой константную область каппа. Чтобы получить ген scFv, ДНК фрагменты, кодирующие VH и VL, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, так что VH и VL последовательности можно экспрессировать как сплошной одноцепочечный белок, в котором VL и VH области соединены гибким линкером (см., например, Bird et al. (1988)Nature 348:552-554). Получение моноклональных антител по данному изобретению. Моноклональные антитела (мАТ) (mAbs) по настоящему изобретению можно получать с помощью множества методов, включая общепринятую методику для моноклональных антител, например стандартный метод гибридизации соматических клеток Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495. Хотя способы гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе, можно применять другие методы для получения моноклонального антитела, например вирусную или онкогенную трансформацию В лимфоцитов. Предпочтительной животной системой для получения гибридом является система на мышах. Получение гибридомы в мыши является очень хорошо разработанным способом. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области. Сливающиеся клетки (например, клетки мышиной миеломы) и способы слияния также хорошо известны. Химерные или гуманизированные антитела по настоящему изобретению можно получать, исходя из последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК, кодирующую иммуноглобулины с тяжелой и легкой цепью, можно получать из интересующей мышиной гибридомы и конструировать так, чтобы она содержала не-мышиные (например, человеческие) иммуноглобулиновые последовательности, применяя стандартные молекулярно-биологические методы. Например,для получения химерного антитела мышиные вариабельные области можно соединять с человеческими константными областями, используя способы, известные в данной области (см., например, патент США 4816567, выданный Cabilly et al.). Для получения гуманизированного антитела мышиные CDR области можно встраивать в каркас человеческих молекул, используя способы, известные в данной области (см.,например, патент США 5225539, выданный Winter, и патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.). В предпочтительном варианте осуществления антитела по данному изобретению представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела, направленные против фукозил-GM1, можно получать, используя трансгенных или трансхромосомных мышей, обладающих частями человеческой иммунной системы вместо мышиной системы. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, называемых здесь HuMAb мыши и KM мыши соответственно и объединенных здесь под общим названием "мыши с человеческими Ig".HuMAb мышь (Medarex, Inc.) содержит минилокусы генов человеческих иммуноглобулинов, которые кодируют нереаранжированные последовательности тяжелой ( и ) илегкой цепи иммуноглобулина человека, совместно с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусыицепи (см., например, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474):856-859). Соответственно мыши обладают пониженной экспрессией мышиных IgM или , и в ответ на иммунизацию встроенные трансгены человеческой тяжелой и легкой цепей претерпевают переключение классов и соматическую мутацию с получением высокоаффинных человеческих IgG моноклональных антител (Lonberg, N. et al. (1994), supra; обзор в Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. и Huszar, D.(1996) Nature Biotechnology 14:845-851, содержание их полностью включено сюда в качестве ссылок, см. дополнительно патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429 - все выданы Lonberg и Kay; патент США 5545807, выданный Surani et al.;PCT публикацииWO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962 - все выданы Lonberg и Kay; и PCT публикациюWO 01/14424, выданную Korman et al. В другом варианте осуществления человеческие антитела по данному изобретению можно получать, используя мышь, которая несет человеческие иммуноглобулиновые последовательности в составе трансгенов и трансхромосом, такую как мышь, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому с легкой цепью человека. Таких мышей, называемых здесь "KM мыши", описывают под- 20017491 робно в РСТ публикации WO 02/43478, выданной Ishida et al. Еще, кроме того, альтернативные трансгенные животные системы, экспрессирующие гены человеческих иммуноглобулинов, являются доступными в данной области и их можно использовать, чтобы получать антифукозил-GM1 антитела по данному изобретению. Например, можно использовать альтернативную трансгенную систему, называемую ксеномышь (Xenomouse) (Abgenix, Inc.); такие мыши описаны, например, в патентах США 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, выданных Kucherlapati et al. Кроме того, альтернативные трансхромосомные животные системы, экспрессирующие гены человеческих иммуноглобулинов, являются доступными в данной области и их можно использовать, чтобы получать антифукозил-GM1 антитела по данному изобретению. Например, можно использовать мышей,несущих как трансхромосому с тяжелой цепью человека, так и трансхромосому с легкой цепью человека,называемых "ТС мыши"; такие мыши описаны в Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722727. Кроме того, в данной области описаны коровы, несущие трансхромосомы с тяжелой и легкой цепью человека (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894), и их можно использовать, чтобы получать антифукозил-GM1 антитела по данному изобретению. Человеческие моноклональные антитела по данному изобретению можно также получать, используя способы фагового дисплея для проведения скрининга библиотек генов человеческих иммуноглобулинов. Такие способы фагового дисплея для выделения человеческих антител разработаны в данной области, см., например, патенты США 5223409; 5403484 и 5571698, выданные Ladner et al.; патенты США 5427908 и 5580717, выданные Dower et al.; патенты США 5969108 и 6172197, выданныеMcCafferty et al.; и патенты США 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, выданные Griffiths et al. Человеческие моноклональные антитела по данному изобретению можно также получать, используя мышей SCID, в которых вводят иммунные клетки человека так, что при иммунизации можно вызвать образование человеческих антител. Такие мыши описаны, например, в патентах США 5476996 и 5698767, выданных Wilson et al. Иммунизация мышей с человеческими Ig. Если для получения человеческих антител по данному изобретению используют мышей с человеческими Ig, таких мышей можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом антигена фукозил-GM1 и/или рекомбинантным фукозил-GM1 либо слитным белком фукозил-GM1, как описывают вLonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845851 и РСТ публикациях WO 98/24884 и WO 01/14424. Предпочтительно при первой инфузии возраст мышей должен составлять 6-16 недель. Например, очищенный или рекомбинантный препарат антигена фукозил-GM1 (5-50 мкг) можно использовать для внутрибрюшинной иммунизации мышей с человеческими Ig. Подробные способы для получения полностью человеческих моноклональных антител к фукозилGM1 описаны ниже в примере 1. Накопленный опыт с различными антигенами показал, что у трансгенных мышей развивается ответ, если первоначально их иммунизировать внутрибрюшинно (в/б) (IP) антигеном в полном адъюванте Фрейнда, с последующими в/б иммунизациями раз в две недели (в общей сложности до 6) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Однако установлено, что другие адъюванты,помимо адъюванта Фрейнда, также являются эффективными. Кроме того, установлено, что целые клетки в отсутствие адъюванта являются высокоиммуногенными. Иммунный ответ можно контролировать на протяжении курса иммунизации по протоколу с помощью образцов плазмы, полученных при взятии крови из ретроорбитального синуса. Скрининг плазмы затем можно проводить анализом ELISA (как описано ниже), и мышей с подходящими титрами антифукозил-GM1 иммуноглобулинов человека можно использовать для процедур слияния. Можно проводить стимуляцию мышей антигеном внутривенно за 3 дня до умерщвления и извлечения селезенки. Считают, что может потребоваться проводить 2-3 слияния для каждой иммунизации. Для каждого антигена обычно иммунизируют от 6 до 24 мышей. Как правило,используют как НСо 7, так и НСо 12 линии. Кроме того, обе линии НСо 7 и НСо 12 трансгенных мышей можно скрещивать между собой, получая одну мышь, которая обладает двумя различными трансгенами тяжелой цепи человека (НСо 7/НСо 12). Альтернативно или дополнительно, можно использовать линиюKM мышей, как описано в примере 1. Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по данному изобретению. Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела по данному изобретению, спленоциты и/или клетки лимфатических узлов из иммунизированных мышей можно выделять и проводить их слияние с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Полученные гибридомы можно подвергать скринингу на продукцию антител, специфических к антигену. Например, можно проводить слияние одноклеточных суспензий лимфоцитов селезенки из иммунизированных мышей с одной шестой количества клеток несекретирующей мышиной миеломы Р 3 Х 63-Ag8.653 (АТСС, CRL 1580) при помощи 50% PEG. Альтернативно,можно проводить слияние одноклеточных суспензий лимфоцитов селезенки из иммунизированных мы- 21017491 шей, применяя способ электрослияния на основе электрического поля с использованием электропоратора для слияния клеток с большой камерой Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Клетки высаживают в концентрации примерно 2105 на плоскодонный планшет для микротитрования, затем в течение одной недели инкубируют в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей Lглутамин и пируват натрия (Mediatech, Inc., Herndon, VA) и дополнительно содержащей 20% фетальную бычью сыворотку (Hyclone, Logan, UT), 18% P388DI кондиционированную среду, 5% фактор клонирования гибридом Origen Hybridoma cloning factor (BioVeris, Gaithersburg, VA), 4 мМ L-глутамин, 5 мМHEPES, 0,055 мМ (3-меркаптоэтанол, 50 единиц/мл пенициллин, 50 мг/мл стрептомицин и 1X среду гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT) (Sigma; HAT добавляют спустя 24 ч после слияния). Через одну неделю клетки культивируют в среде, в которой используемую HAT заменяют на НТ. Затем проводят скрининг отдельных лунок методом ELISA на человеческие моноклональные IgM и IgG антитела. Когда происходит быстрый рост гибридомы, среду можно проверять, как правило, через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, можно заново высаживать, вновь подвергать скринингу и, если они попрежнему являются положительными по человеческим IgG, моноклональные антитела можно субклонировать по меньшей мере дважды методом серийных разведений. Стабильные субклоны можно затем культивировать in vitro для получения небольших количеств антитела в среде культивирования для снятия характеристик. Чтобы очистить человеческие моноклональные антитела, выбранные гибридомы можно выращивать в двухлитровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать, прежде чем проводить аффинную хроматографию на протеин Асефарозе (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Элюированные IgG можно проверять гель-электрофорезом и высокоэффективной жидкостной хроматографией для подтверждения чистоты. Буферный раствор можно заменять на PBS, и концентрацию можно определять при OD280, используя коэффициент экстинкции 1,43. Моноклональные антитела можно разделять на аликвоты и хранить при -80 С. Получение трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела по данному изобретению. Антитела по данному изобретению можно также получать в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, сочетание методов рекомбинантных ДНК и способов трансфекции генов, как хорошо известно в данной области (например, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Например, чтобы экспрессировать антитела, или фрагменты антител, последовательности ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, можно получать стандартными молекулярно-биологическими методами (например, ПЦР амплификацией или клонированием кДНК с использованием гибридомы, которая экспрессирует интересующее антитело), и последовательности ДНК можно встраивать в экспрессирующие векторы таким образом, что гены являются функционально связанными с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию. В данном контексте термин "функционально связанный" должен означать, что ген антитела является лигированным в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в составе вектора, выполняют предназначенную им функцию регулирования транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессирующий вектор и последовательности, контролирующие экспрессию, выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с экспрессией, которую использует клетка-хозяин. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встраивать в отдельные векторы или, более типично, оба гена встраивают в один и тот же экспрессирующий вектор. Гены антитела встраивают в экспрессирующий вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на генном фрагменте антитела и векторе или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют). Вариабельные области легкой и тяжелой цепи антител, описанных здесь, можно использовать для получения генов полноразмерного антитела любого изотипа антител посредством встраивания их в экспрессирующие векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи желаемого изотипа таким образом, чтобы VH сегмент являлся функционально связанным сCH сегментом(ми) в составе вектора, и VK сегмент являлся функционально связанным с CL сегментом в составе вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, что сигнальный пептид является связанным в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из не-иммуноглобулинового белка). В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессирующие векторы по данному изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" должен охватывать промоторы,энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигналы полиаденилирования),которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990. Специалисты в данной области признают, что конструкция экспрессирующего вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких- 22017491 факторов, как выбор клетки-хозяина, которую трансформируют, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые задают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, происходящие из цитомегаловируса (CMV),вируса обезьян 40 (SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP) и полиомы. Альтернативно, можно использовать невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или промотор -глобина. Кроме того, регуляторные элементы, составленные из последовательностей из различных источников, такие как SR промоторная система, которая содержит последовательности из раннего промотора SV40 и длинный концевой повтор из вируса человеческого Тклеточного лейкоза типа 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессирующие векторы по данному изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вируса в клетках-хозяевах (например,точки начала репликации), и селектируемые маркерные гены. Селектируемый маркерный ген облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые встроен вектор (см., например, патенты США 4399216, 4634665 и 5179017, авторы всех Axel et al.). Например, обычно селектируемый маркерный ген придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую встроен вектор. Предпочтительные селектируемые маркерные гены включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клетках-хозяевах с селекцией метотрексатом/амплификацией) и ген neo (для селекции с помощью G418). Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессирующий вектор(ы), кодирующий тяжелую и легкую цепи, вводят трансфекцией в клетку-хозяина стандартными методами. Различные формы термина"трансфекция" должны охватывать широкое разнообразие методов, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электропорацию,кальциево-фосфатную преципитацию, DEAE-декстрановую трансфекцию и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по данному изобретению либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках и наиболее предпочтительно в клетках-хозяевах млекопитающих является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотические клетки и в особенности клетки млекопитающих с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, осуществят сборку и секрецию антитела в правильной конформации и иммунологически активно. Сообщают, что прокариотическая экспрессия генов антитела является не эффективной для продукции больших количеств активного антитела (Boss, M. A. и Wood, С. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессирования рекомбинантных антител по данному изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (СНО клетки) (включая dhfrCHO клетки, описанные в Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R.J. Kaufman и P.A. Sharp (1982) Mol.Biol. 159:601-621), клетки миеломы NSO, COS клетки и SP2 клетки. В частности, для применения с клетками миеломы NSO другой предпочтительной системой экспрессии является система экспрессии генаGS, описанная в WO 87/04462, WO 89/01036 и ЕР 338841. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, продукция антител происходит при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного, чтобы произошла экспрессия антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно секреция антитела в среду культивирования, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела можно извлекать из среды культивирования,используя стандартные способы очистки белков. Характеристика связывания антитела с антигеном. Антитела по данному изобретению можно тестировать на связывание с фукозил-GM1 с помощью,например, стандартного анализа ELISA. Вкратце, планшеты для микротитрования покрывают очищенным фукозил-GM1 в концентрации 0,25 мкг/мл в PBS, а затем блокируют 5% бычьим сывороточным альбумином в PBS. Серийно разведенное антитело (например, серийно разведенная плазма от мышей,иммунизированных фукозил-GM1) добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1-2 ч при 37 С. Планшеты промывают PBS/Tween и затем инкубируют с вторичным реактивом (например, для человеческих антител, Fc-специфические поликлональные антитела козы против IgG человека), конъюгированным со щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37 С. После промывания в планшеты добавляют для развития окраски субстрат pNPP (1 мг/мл) и анализируют при OD, равном 405-650. Предпочтительно для процедуры слияния используют мышей, которые обладают наиболее высокими титрами антител. Описанный выше анализ ELISA можно также применять для скрининга гибридом, которые проявляют положительную реакцию в отношении иммуногена фукозил-GM1. Гибридомы, которые связывают с высокой авидностью фукозил-GM1, субклонируют и дополнительно характеризуют. Один клон от каждой гибридомы, который сохраняет реакционную способность исходных клеток (по ELISA), можно выбрать для получения банка клеток из 5-10 ампул, который хранят при -140 С, и для очистки антитела. Чтобы очистить антифукозил-GM1 антитела, выбранные гибридомы можно выращивать в двухлит- 23017491 ровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Супернатанты можно фильтровать и концентрировать, прежде чем проводить аффинную хроматографию на протеин А-сефарозе (Pharmacia,Piscataway, N.J.). Элюированные IgG можно проверять гель-электрофорезом и высокоэффективной жидкостной хроматографией для подтверждения чистоты. Буферный раствор можно заменять на PBS, и концентрацию можно определять при OD280, используя коэффициент экстинкции 1,43. Моноклональные антитела можно разделять на аликвоты и хранить при -80 С. Чтобы определить, связываются ли выбранные антифукозил-GM1 моноклональные антитела с уникальными эпитопами, каждое антитело можно биотинилировать, используя коммерчески доступные реактивы (Pierce, Rockford, IL). Конкурентные исследования с использованием немеченых моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител можно проводить, используя планшеты дляELISA с нанесенным фукозил-GM1, как описано выше. Связывание биотинилированных мАТ можно определять при помощи зонда стрептавидин-щелочная фосфатаза. Для определения изотипа очищенных антител можно проводить варианты ELISA для изотипов, используя реактивы, специфические для антител конкретного изотипа. Например, для определения изотипа человеческого моноклонального антитела лунки планшета для микротитрования можно покрывать 1 мкг/мл антителами к иммуноглобулину человека в течение ночи при 4 С. После блокирования 1% BSA в планшете проводят реакцию с тестируемыми моноклональными антителами или очищенными контролями по изотипу в концентрации 1 мкг/мл или меньше при температуре окружающей среды в течение 1 или 2 ч. Затем в лунках можно проводить реакцию с конъюгированными со щелочной фосфатазой зондами, специфическими либо к человеческим IgG1, либо человеческим IgM. Планшеты обрабатывают для развития окраски и анализируют, как описано выше. Человеческие IgG против фукозил-GM1 можно дополнительно тестировать на взаимодействие с антигеном фукозил-GM1 с помощью вестерн-блоттинга. Вкратце, можно получить фукозил-GM1 и подвергнуть его электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 10% фетальной телячьей сывороткой и обрабатывают моноклональными антителами, которые тестируют. Связывание человеческих IgG можно выявить, используя антитела против IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой, и проявляя таблетками субстрата BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.). Иммуноконъюгаты. В другом аспекте изобретение относится к антифукозил-GM1 антителу или его фрагменту, конъюгированному с терапевтическим фрагментом, таким как цитотоксин, лекарственное средство (например,иммунодепрессант) или радиотоксин. Такие конъюгаты здесь называют "иммуноконъюгаты". Иммуноконъюгаты, которые содержат один или больше цитотоксинов, называют "иммунотоксины". Цитотоксин или цитотоксическое средство включает любое средство, которое причиняет вред (например, убивает) клеткам. Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды,прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги и гомологи. Терапевтические средства также включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6 тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацилдекарбазин), алкилирующие средства (например, мехлорэтамин,тиоэйкозопентаеновой кислоты хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатину(II)(АМС, а также антимитотические средства (например, винкристин и винбластин). Другие предпочтительные примеры терапевтических цитотоксинов, которые можно конъюгировать с антителом по данному изобретению, включают дуокармицины, калихимицины, майтансины и ауристатины, а также их производные. Пример конъюгата калихимицина с антителом является коммерчески доступным (Mylotarg; Wyeth-Ayerst). Примеры терапевтических цитотоксинов можно найти, например,в патентах США 6548530 и 6281354 и заявках на патент СШАUS 2003/0064984, US 2003/0073852 и US 2003/0050331. Цитотоксины можно конъюгировать с антителами по данному изобретению, применяя линкерный метод, известный в данной области. Примеры типов линкеров, которые используют для получения конъюгата цитотоксина с антителом, включают, но без ограничения, гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и пептидсодержащие линкеры. Можно выбирать линкер, который, например, подвержен разрушению при низких значениях рН внутри лизосомального пространства или подвержен разрушению протеазами, такими как протеазы, преимущественно экспрессируемые в опухолевой ткани,такие как катепсины (например, катепсины В, С, D). Для дополнительного обсуждения типов цитотоксинов, линкеров и способов конъюгирования терапевтических средств с антителами см. также Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail,P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen,- 24017491T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. и Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264. Антитела по настоящему изобретению можно также конъюгировать с радиоактивным изотопом,чтобы получить цитотоксические радиофармацевтические препараты, также называемые радиоиммуноконъюгатами. Примеры радиоактивных изотопов, которые можно конъюгировать с антителами для диагностического или терапевтического применения, включают, но без ограничения, йод 131, индий 111, иттрий 90 и лютеций 177. Способы получения радиоиммуноконъюгатов известны в данной области. Примеры радиоиммуноконъюгатов являются коммерчески доступными, включая Zevalin (IDEC Pharmaceuticals) и Bexxar (Corixa Pharmaceuticals), и аналогичные способы можно применять для получения радиоиммуноконъюгатов по данному изобретению. Конъюгаты с антителом по данному изобретению можно использовать, чтобы модифицировать имеющийся биологический ответ, и лекарственный фрагмент не следует истолковывать как ограниченный рамками классических химических терапевтических средств. Например, лекарственный фрагмент может представлять собой белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент,такой как абрин, рицин А, синегнойный экзотоксин или дифтерийный токсин; такой белок, как фактор некроза опухолей или интерферон-; либо модуляторы биологической реакции, такие как, например,лимфокины, интерлейкин-1 ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор ("GM-CSF"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF") или другие ростовые факторы. Методы конъюгирования таких терапевтических фрагментов хорошо известны, см., например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "AntibodiesThorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). Биспецифические молекулы. В другом аспекте изобретение относится к биспецифическим молекулам, содержащим антифукозил-GM1 антитело или его фрагмент, по данному изобретению. Можно получать производное от антитела по данному изобретению или его антигенсвязывающих участков или связывать его с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом рецептора), чтобы получить биспецифическую молекулу, которая связывается по меньшей мере с двумя различными связывающими центрами либо целевыми молекулами. Фактически, можно получать производное от антитела по данному изобретению или связывать его с более чем одной другой функциональной молекулой, чтобы получать мультиспецифические молекулы, которые связываются с более чем двумя различными связывающими центрами и/или целевыми молекулами; такие мультиспецифические молекулы также должны быть охвачены термином "биспецифические молекулы", как используют здесь. Чтобы получить биспецифическую молекулу по данному изобретению, антитело по данному изобретению можно функционально связывать (например, химическим связыванием, генетическим слиянием,нековалентной ассоциацией или иным способом) с одной или большим количеством других связывающих молекул, таких как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик, получая, таким образом, биспецифическую молекулу. Соответственно изобретение охватывает биспецифические молекулы, обладающие по меньшей мере одной первой специфичностью связывания для фукозил-GM1 и второй специфичностью связывания для второго целевого эпитопа. В конкретном варианте осуществления данного изобретения вторым целевым эпитопом является Fc рецептор, например человеческий FcRI (CD64) или человеческий Fc рецептор (CD89). Вследствие этого данное изобретение охватывает биспецифические молекулы, способные связываться как с эффекторными клетками, экспрессирующими FcR либо FcR (например, моноцитами, макрофагами или полиморфноядерными клетками (PMN, так и с целевыми клетками, экспрессирующими фукозил-GM1. Данные биспецифические молекулы делают клетки, экспрессирующие фукозил-GM1, мишенью для эффекторных клеток и запускают активности эффекторных клеток, опосредованные Fc рецепторами, такие как фагоцитоз экспрессирующих фукозил-GM1 клеток, антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), высвобождение цитокинов или образование аниона супероксида. В варианте осуществления данного изобретения, в котором биспецифическая молекула является мультиспецифической, молекула может дополнительно включать третью специфичность связывания в дополнение к анти-Fc специфичности связывания и антифукозил-GM1 специфичности связывания. В- 25017491 одном варианте осуществления третья специфичность связывания представляет собой участок, направленный против фактора усиления (EF), например молекулу, которая связывается с поверхностным белком, задействованным в цитотоксической активности, и благодаря этому усиливает иммунный ответ против клетки-мишени. "Участок, направленный против фактора усиления" может являться антителом,функциональным фрагментом антитела или лигандом, который связывается с данной молекулой, например антигеном или рецептором, и вследствие этого приводит к усилению эффекта связывающих детерминант для Fc рецептора либо антигена клетки-мишени. "Участок, направленный против фактора усиления" может связывать Fc рецептор или антиген клетки-мишени. Альтернативно, участок, направленный против фактора усиления, может связываться с объектом, отличным от объекта, с которым связываются первая и вторая специфичности. Например, участок, направленный против фактора усиления, может связывать цитотоксичную Т-клетку (например, через посредство CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM1 или другую иммунную клетку, что приводит к усиленному иммунному ответу против клетки-мишени). В одном варианте осуществления биспецифические молекулы по данному изобретению включают в качестве специфичности связывания по меньшей мере одно антитело или фрагмент такого антитела,включая Fab, Fab', F(ab')2, Fv или одиночную цепь Fv. Антитело может также являться димером легкой цепи или тяжелой цепи или их любым наименьшим фрагментом, таким как Fv или конструкт единичной цепи, как описано в Ladner et al., патент США 4946778, содержание которого специально включено в качестве ссылки. В одном варианте осуществления специфичность связывания для Fc рецептора обеспечивается моноклональным антителом, связывание которого не блокирует человеческий иммуноглобулин G (IgG). Как используют здесь, термин "IgG рецептор" относится к любому из восьми генов -цепей, локализованных в хромосоме 1. Данные гены кодируют в общей сложности двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые сгруппированы в три класса Fc рецепторов: FcRI (CD64),FcRII (CD32) и FcRIII (CD16). В одном предпочтительном варианте осуществления Fc рецептором является высокоаффинный человеческий FcRI. Человеческий FcRI представляет собой 72 кДа молекулу, которая обладает высокой аффинностью для мономерных IgG (108-109 М-1). Получение и характеристика определенных предпочтительных анти-Fc моноклональных антител описаны в Fanger et al., PCT публикации WO 88/00052 и в патенте США 4954617, идеи которых полностью включены сюда в качестве ссылок. Данные антитела связываются с эпитопом FcRI, FcRII илиFcRIII по сайту, который отличается от Fc связывающего сайта рецептора и, таким образом, их связывание существенно не блокируют физиологические уровни IgG. Специфическими анти-FcRI антителами, применимыми по данному изобретению, являются мАТ 22, мАТ 32, мАТ 44, мАТ 62 и мАТ 197. Гибридома, продуцирующая мАТ 32, доступна в Американской коллекции типовых культур, АТСС инвентарныйНВ 9469. В других вариантах осуществления антитела против Fc рецептора представляют собой гуманизированную форму моноклонального антитела 22 (Н 22). Получение и характеристика антитела Н 22 описаны в Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol. 155(10):4996-5002 и РСТ публикации WO 94/10332. Линия клеток, продуцирующих Н 22 антитело, депонирована в Американской коллекции типовых культур под названием HA022CL1 и имеет инвентарный номер CRL 11177. В других предпочтительных вариантах осуществления специфичность связывания для Fc рецептора обеспечивается антителом, которое связывается с человеческим IgA рецептором, например Fc-альфа рецептором (FcRI (CD89, связывание которого предпочтительно не блокирует человеческий иммуноглобулин A (IgA). Термин "IgA рецептор" должен охватывать генный продукт одного -гена (FcRI), локализованного в хромосоме 19. Известно, что данный ген кодирует несколько альтернативно сплайсированных трансмембранных изоформ от 55 до 110 кДа. FcRI (CD89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не в популяциях неэффекторных клеток. FcRI имеет умеренную аффинность ( 5107 М-1) как для IgA1, так и для IgA2, которая возрастает при воздействии цитокинов, таких как G-CSF или GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) CriticalReviews in Immunology 16:423-440). Описаны четыре FcRI-специфичных моноклональных антитела,идентифицированных как A3, А 59, А 62 и А 77, которые связывают FcRI за пределами лигандсвязывающего домена IgA (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).FcRI и FcRI являются предпочтительными пусковыми рецепторами для применения в биспецифических молекулах по данному изобретению, так как они (1) первично экспрессируются на иммунных эффекторных клетках, например моноцитах, PMN, макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются в больших количествах (например, 5000-100000 на клетку); (3) являются медиаторами цитотоксических активностей (например, ADCC, фагоцитоза); (4) опосредуют повышенную антигенную презентацию антигенов, включая аутоантигены, являющихся для них мишенью. Хотя человеческие моноклональные антитела являются предпочтительными, другими антителами,которые можно применять в биспецифических молекулах по настоящему изобретению, являются мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела. Биспецифические молекулы по настоящему изобретению можно получать конъюгированием составляющих специфичностей связывания, например анти-FcR и антифукозил-GM1 специфичностей свя- 26017491 зывания, с помощью способов, известных в данной области. Например, каждую специфичность связывания биспецифической молекулы можно получать отдельно, а затем конъюгировать друг с другом. Когда специфичности связывания представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации можно применять большое разнообразие связывающих или перекрестно сшивающих средств. Примеры перекрестно сшивающих средств включают протеин А, карбодиимид, N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат(SATA), 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойную кислоту) (DTNB), о-фенилендималеимид (oPDM), Nсукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M.A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:8648). Другие способы включают те, что описаны в Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83 и Glennie et al (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими средствами являютсяSATA и сульфо-SMCC - оба коммерчески доступны у Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). Когда специфичности связывания являются антителами, их можно конъюгировать путем образования сульфгидрильных связей в С-концевых шарнирных областях двух тяжелых цепей. В особенно предпочтительном варианте осуществления шарнирную область модифицируют так, чтобы она перед конъюгацией содержала нечетное число сульфгидрильных остатков, предпочтительно один. Альтернативно, обе специфичности связывания могут быть закодированы в одном и том же векторе, экспрессированы и собраны в одной и той же клетке-хозяине. Такой способ особенно применим, если биспецифической молекулой является слитый белок мАТмАТ, MATFab, FabF(ab')2 или лигандFab. Биспецифической молекулой по данному изобретению может являться одноцепочечная молекула, содержащая одно одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту, или одноцепочечная биспецифическая молекула, содержащая две связывающие детерминанты. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Способы получения биспецифических молекул описаны, например, в патенте США 5260203; патенте США 5455030; патенте США 4881175; патенте США 5132405; патенте США 5091513; патенте США 5476786; патенте США 5013653; патенте США 5258498 и патенте США 5482858. Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтверждать, например, иммуноферментным анализом (ELISA), радиоиммунным анализом (RIA), FACS анализом, биотестом (например, ингибированием роста) или вестерн-блоттингом. Каждый из данных анализов обычно выявляет наличие комплексов белок-антитело, представляющих особый интерес, посредством применения меченого реактива (например, антитела), специфического для интересующего комплекса. Например,комплексы FcR-антитело можно обнаружить, к примеру, с помощью связанного с ферментом антитела или фрагмента антитела, которое распознает и специфически связывается с комплексами антитело-FcR. Альтернативно, комплексы можно обнаружить с помощью любого из множества других иммунных анализов. Например, антитело можно радиоактивно метить и использовать в радиоиммунном анализе (RIA)Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, включенном сюда в качестве ссылки). Радиоактивный изотоп можно обнаружить такими средствами, как -счетчик или сцинтилляционный счетчик либо авторадиографией. Фармацевтические композиции. В другом аспекте изобретение относится к композиции, например фармацевтической композиции,содержащей одно или сочетание моноклональных антител либо его(их) антигенсвязывающий(ие) участок(ки) по настоящему изобретению, составленные в виде препарата с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут включать одно или сочетание (например, двух или более различных) антител, или иммуноконъюгатов, или биспецифических молекул по данному изобретению. Например, фармацевтическая композиция по данному изобретению может содержать сочетание антител (или иммуноконъюгатов, или биспецифических молекул), которые связываются с различными эпитопами целевого антигена или которые обладают комплементарными активностями. Фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить при комбинированной терапии, т.е. совместно с другими средствами. Например, комбинированная терапия может включать антифукозил-GM1 антитело по данному изобретению в сочетании по меньшей мере с одним другим противовоспалительным или иммуносупрессорным средством. Примеры терапевтических средств, которые можно использовать при комбинированной терапии, описаны более подробно ниже в разделе по использованию антител по данному изобретению. Как используют здесь, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие абсорбцию средства и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, посредством инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело, иммуноконъюгат или биспецифическая молекула, можно покрывать материалом для защиты этого соединения от действия кислот и других природных- 27017491 условий, которые могут инактивировать данное соединение. Фармацевтические соединения по данному изобретению могут включать одну или больше фармацевтически приемлемых солей. "Фармацевтически приемлемая соль" означает соль, которая сохраняет желаемую биологическую активность исходного соединения и не привносит какие-либо нежелательные токсикологические эффекты (см., например, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Кислотно-аддитивные соли включают те, которые образованы из нетоксических неорганических кислот, таких как соляная,азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодисто-водородная, фосфористая и т.п., а также нетоксическими органическими кислотами, такими как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты,фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Основно-аддитивные соли включают те, которые образованы из щелочно-земельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксических органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п. Фармацевтическая композиция по данному изобретению может также включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как пальмитат аскорбила, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ),лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) средства, образующие хелаты с металлом, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и т.п. Примеры соответствующих водных и неводных носителей, которые можно применять в фармацевтических композициях по данному изобретению, включают воду, этанол, многоатомные спирты (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их соответствующие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, а также пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Необходимую подвижность можно поддерживать, например, используя покрытие, такое как лецитин, выдерживая необходимые размеры частиц в случае дисперсий и применяя сурфактанты. Такие композиции могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие средства, эмульгаторы и диспергирующие средства. Предохранение от присутствия микроорганизмов можно обеспечить как заранее проведенными процедурами стерилизации, так и включением различных противомикробных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательным включать в композиции изотонические средства, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, более длительной абсорбции инъецируемой лекарственной формы можно добиться включением средств, замедляющих абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением случаев, когда общепринятые среды или средства являются несовместимыми с активным соединением, их использование в фармацевтических композициях по данному изобретению предусмотрено. В композиции можно также включать и дополнительные активные соединения. Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно составлять в виде раствора, микроэмульсии, липосомы, либо другой организованной структуры, подходящей для высоких концентраций лекарственных средств. Носитель может являться растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол,многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их соответствующие смеси. Необходимую подвижность можно поддерживать, например, используя покрытие, такое как лецитин, выдерживая необходимые размеры частиц в случае дисперсий и применяя сурфактанты. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические средства, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннитол, сорбитол или хлорид натрия. Более длительной абсорбции инъецируемых композиций можно добиться включением в композицию средства, которое замедляет абсорбцию, например моностеаратных солей и желатина. Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством внесения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или сочетанием ингредиентов, перечисленных выше, как это необходимо, с последующей стерилизацией микрофильтрованием. Обычно дисперсии получают внесением активного соединения в стерильную среду для лекарственного средства,содержащую основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофильная сушка (лиофилизация), в результате которых получают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный же- 28017491 лательный ингредиент из его предварительно отфильтрованного до стерильности раствора. Количество активного ингредиента, который можно объединять с материалом носителя для получения монолитной лекарственной формы, будет различаться в зависимости от индивида, подлежащего лечению, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, который можно объединять с материалом носителя для получения монолитной лекарственной формы, будет обычно таким количеством композиции, которое дает терапевтический эффект. Обычно, исходя из ста процентов, данное количество будет находиться в пределах от примерно 0,01 до примерно 99% активного ингредиента,предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 70%, наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 30% активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Схемы приема лекарственного средства подбирают так, чтобы обеспечить оптимальный желательный ответ (например, терапевтический ответ). Например, можно вводить один болюс, можно вводить несколько раздельных доз на протяжении времени или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать в зависимости от требований терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно составлять парентеральные композиции в виде стандартной лекарственной формы для легкости введения и единообразия дозировки. Стандартная лекарственная форма, как используют здесь, означает физически раздельные единицы, приспособленные в качестве однократных доз для индивидов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанного так, чтобы произвести желательный терапевтический эффект совместно с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по данному изобретению обусловлена и напрямую зависит от: (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, которого нужно достичь, и (b) ограничений, характерных для области составления соединений, таких как активное соединение для лечения сенситивности у индивидов. Для введения антитела дозировка находится в пределах от примерно 0,0001 до 100 мг/кг и более типично от 0,01 до 5 мг/кг массы тела пациента. Например, дозировки могут быть 0,3, 1, 3, 5 или 10 мг/кг массы тела или в пределах от 1 до 10 мг/кг. Типичный режим лечения определяет порядок введения один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели, один раз в четыре недели, один раз в месяц,один раз в 3 месяца или один раз каждые от 3 до 6 месяцев. Предпочтительные схемы приема лекарственного средства для антифукозил-GM1 антитела по данному изобретению включают 1 или 3 мг/кг массы тела при внутривенном введении, вводя антитело согласно одной из следующих схем дозирования: (i) каждые четыре недели для шести доз, затем каждые три месяца; (ii) каждые три недели; (iii) 3 мг/кг массы тела единовременно, а затем по 1 мг/кг массы тела каждые 3 недели. В некоторых способах два или больше моноклональных антител с разными специфичностями связывания вводят одновременно, и в этом случае доза каждого вводимого антитела находится в указанных пределах. Антитело обычно вводят в несколько приемов. Промежутки между единичными дозами могут быть, например, недельными, месячными, трехмесячными или годовыми. Промежутки также могут быть нерегулярными согласно показаниям измерений в крови у пациента уровней антител против целевого антигена. В некоторых способах дозировку подбирают так, чтобы достичь концентрации антител в плазме примерно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах - примерно 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитело можно вводить в виде препарата с замедленным высвобождением, и тогда требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируют в зависимости от времени полужизни антитела у пациента. В основном человеческие антитела имеют самое длительное время полужизни, затем следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела, отличные от человеческих. Дозировка и частота введения могут варьировать в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактических применениях относительно малые дозы вводят с относительно нечастыми промежутками в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца жизни. При терапевтических применениях иногда бывают необходимы относительно высокие дозы при относительно коротких промежутках до тех пор, пока не замедлится или прекратится прогрессирование заболевания и предпочтительно, пока у пациента не обнаружат частичное или полное уменьшение интенсивности симптомов заболевания. С этого времени пациент может быть переведен на профилактический режим введения. Фактические уровни дозирования активных ингредиентов в фармацевтических композициях по настоящему изобретению можно изменять так, чтобы получать количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желаемой ответной реакции для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсичности для пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от множества фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций по настоящему изобретению или их сложных эфиров, солей или амидов, способа введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, прочих лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в сочетаниях с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и предыдущего анамнеза заболевания излечиваемого пациента, и т.п. факторов, хорошо известных в медицинской области.

МПК / Метки

МПК: A61K 39/395, A61P 35/00, C07K 16/30

Метки: антитела, антифукозил-gm1, человеческие, моноклональные, антител, применения, способы, фукозил-gm1

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-17491-chelovecheskie-monoklonalnye-antitela-k-fukozil-gm1-i-sposoby-primeneniya-antifukozil-gm1-antitel.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Человеческие моноклональные антитела к фукозил-gm1 и способы применения антифукозил-gm1 антител</a>

Похожие патенты