Способ получения т-клеточной популяции и ее применение

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ получения T-клеточной популяции, в которой T-клетки экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, включающий стадию культивирования клеточной популяции, содержащей T-клетки, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси и в присутствии лиганда CD3, причем экспрессия полученными T-клетками CD45RA и по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, на 5% или более превышает таковую T-клетками, полученными в случае их культивирования в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси.

2. Способ по п.1, где культивирование T-клеточной популяции проводят в течение 4-14 дней.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что стадия культивирования в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси составляет по меньшей мере один день или более.

4. Способ по любому из пп.1-3, где лиганд CD3 представляет собой антитело к CD3.

5. Способ по любому из пп.1-4, где фрагмент фибронектина представляет собой полипептид, включающий по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-8, 13 списка последовательностей, или полипептид, включающий по меньшей мере одну из указанных последовательностей с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или более аминокислот, обладающий теми же самыми свойствами, что и исходный полипептид.

6. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий выделение клеточной популяции, которая экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 и CD28.

7. Способ по любому из пп.1-6, дополнительно включающий стадию трансдукции чужеродного гена в клетки полученной клеточной популяции.

8. Способ по п.7, где чужеродный ген трансдуцируют с помощью ретровирусного вектора, аденовирусного вектора, аденоассоциированного вирусного вектора, лентивирусного вектора или вектора на основе вируса обезьян.

9. T-клеточная популяция, полученная способом по любому из пп.1-8, где T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28.

10. Лекарственное средство для иммунотерапии, включающее в качестве эффективного ингредиента T-клеточную популяцию, полученную способом по любому из пп.1-8.

11. Способ лечения или предотвращения рака, лейкемии, злокачественной опухоли, гепатита или инфекционных заболеваний, включающий стадию введения субъекту эффективного количества T-клеточной популяции, полученной способом по любому из пп.1-8.

12. Применение T-клеточной популяции, полученной способом по любому из пп.1-8, в производстве лекарственного средства для иммунотерапии.

13. Способ приготовления стимулированной T-клеточной популяции, отличающийся тем, что способ включает в себя стадию стимулирования T-клеточной популяции, полученной способом по любому из пп.1-8, по меньшей мере одним стимулирующим фактором, выбранным из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, презентировавшей антиген, антигена, лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин.

14. T-клеточная популяция, полученная способом по п.13.

15. Лекарственное средство для иммунотерапии, включающее в качестве активного ингредиента T-клеточную популяцию, полученную способом по п.13.

16. Способ лечения или предотвращения рака, лейкемии, злокачественной опухоли, гепатита или инфекционных заболеваний, включающий стадию введения субъекту эффективного количества T-клеточной популяции, полученной способом по п.13.

17. Применение T-клеточной популяции, полученной способом по п.13, в производстве лекарственного средства для иммунотерапии.

18. Лекарственное средство для иммунотерапии, включающее:

(а) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента T-клеточную популяцию, полученную способом по любому из пп.1-8; и

(б) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента по меньшей мере один стимулирующий фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, презентировавшей антиген, антигена, лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, где указанные препараты включены в лекарственное средство в виде двух отдельных препаратов, вводимых совместно или раздельно.

19. Способ лечения рака, лейкемии, злокачественной опухоли, гепатита или инфекционных заболеваний, включающий следующие стадии (а) и (б):

(а) введение пациенту T-клеточной популяции, полученной способом по любому из пп.1-8; и

(б) введение пациенту по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, презентировавшей антиген, антигена, лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин.

Текст

Смотреть все

В изобретении предлагается способ получения T-клеточной популяции, в котором T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, отличающийся тем, что способ включает в себя стадию культивирования клеточной популяции, содержащей T-клетку, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси. 016168 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу получения T-клеточной популяции, которая используется в области медицины. Уровень техники Живой организм защищается от чужеродных субстанций главным образом с помощью иммунной системы, и иммунная система организована из различных клеток и продуцируемых ими растворимыми факторами. Ключевую роль среди них играют лейкоциты, особенно лимфоциты. Лимфоциты делят на два больших типа: B-лимфоциты (которые обозначают в настоящем документе как B-клетки) и Tлимфоциты (которые обозначают в настоящем документе как T-клетки); оба типа специфически распознают антиген и воздействуют на антиген, защищая живой организм. На периферии T-клетки в основном представлены CD4-T-клетками, имеющими CD (кластер дифференцировки) 4-маркер и CD8-T-клетками, имеющими CD8-маркер. Большинство CD4-T-клеток называют хелперными T-клетками (в настоящем документе обозначенными как TH), оказывают помощь в продукции антител, они вызывают различные иммунные ответы и они дифференцируются в Th1 илиTh2, которые отличаются по виду от цитокинов, продуцируемых антигенной стимуляцией. БольшинствоCD8-T-клеток дифференцируется в цитотоксическую T-клетку (TC: цитотоксический T-лимфоцит, также обозначаемый как киллерная T-клетка, которая далее может быть обозначена как CTL), демонстрирующую цитотоксическую активность при антигенной стимуляции. Например, при таком патологическом состоянии, как рак, в последние годы иммунотерапия привлекает к себе интерес в качестве четвертого вида терапии после хирургии, химиотерапии и радиотерапии. Поскольку иммунотерапия использует иммунокомпетентность, естественно принадлежащую человеку, то считают, что физическая нагрузка на пациента, вызванная иммунотерапией, является легкой по сравнению с нагрузкой, оказываемой другими терапиями. В качестве иммунотерапии известны терапия,включающая в себя стадию переноса лимфокин-активированных клеток, полученных размножениемCTL или лимфоцитов периферической крови, индуцированным ex vivo, или нечто подобное согласно различным способам, NKT клетки, T клетки и т.п.; терапия с переносом дендритных клеток или терапия пептидной вакциной, при которой предполагается индукция антиген-специфических CTL in vivo;Th1 клеточная терапия; иммунная генетическая терапия, далее включающая в себя стадию трансдукции гена, для которого можно ожидать различные эффекты в вышеупомянутых клетках ex vivo и перенос преобразованной клетки в организм; и т.п. Фибронектин представляет собой гигантский гликопротеин, имеющий молекулярный вес 250 тысяч, который присутствует в крови животных организмов, на поверхности культивируемой клетки или во внеклеточном матриксе, и известно, что он выполняет различные функции. Его доменную структуру подразделяют на семь частей (фиг. 1 и далее), где в его аминокислотной последовательности содержатся три вида сходных последовательностей, и повторения каждой из данных последовательностей формируют полную последовательность. Три вида сходных последовательностей обозначают как тип I, тип II и тип III. Из них тип III включает в себя от 71 до 96 аминокислотных остатков, где идентичность аминокислотных остатков составляет от 17 до 40%. В фибронектине присутствует четырнадцать последовательностей III типа, из которых 8, 9 или 10 последовательности (каждая обозначается далее как III-8, III-9 или III-10) содержатся в домене, связывающем клетки, и 12, 13 или 14 последовательности (каждая обозначается далее как III-12, III-13 или III-14) содержатся в гепаринсвязывающем домене. Кроме того,VLA-5 (very late activation antigen, антиген очень поздней активации) - связывающий регион находится вIII-10, и его внутренняя последовательность представляет собой RGDS. Кроме того, регион, обозначенный как IIICS, присутствует на C-концевой стороне гепаринсвязывающего домена. Участок, обозначенный как CS-1, состоящий из 25 аминокислот и обладающий связывающей активностью для VLA-4, присутствует в IIICS (например, непатентные публикации 1-3). Среди видов иммунотерапии, при терапии, включающей в себя стадию переноса лимфокинактивированных клеток, полученных размножением CTL или лимфоцитов периферической крови, индуцированных ex vivo, или нечто подобное в соответствии с эффектами IL-2 или анти-CD3-антитела, авторы изобретения уже изучили эффекты использования фибронектина или его фрагментов в отношении таких недостатков, как, например, сохранение цитотоксической активности в тех случаях, когда размножают CTL, индуцированные ex vivo, как можно эффективно размножать лимфоциты и т.п. (например,патентные публикации с 1-3). По сообщениям последних лет о применении в иммунотерапии T-лимфоцитов в случае, когда вводят интактные T-клетки или более недифференцированные T-клетки центральной памяти, то при их введении в живой организм можно ожидать значительно более высокий терапевтический эффект, чем в случае, когда вводят уже окончательно дифференцированные эффекторные T-клетки (например, непатентные публикации 4 и 5). Далее, также для терапии с переносом дендритных клеток, терапии пептидной вакциной или подобной терапии, в которой предполагается индукция антиген-специфических CTL invivo, считается, что интактные T-клетки, источники из которых могут быть индуцированы CTL, например, в организме пациента с прогрессирующим раком, являются малочисленными, поэтому зачастую нельзя ожидать достаточного эффекта.-1 016168 Непатентная публикация 1: Fibronectin, Academic Press Inc., 1-8, authored by Deane F. Momer, опубликовано в 1988 г. Непатентная публикация 2: Kimizuka F. et al., J. Biochem., 1991, 110(2), 284-291. Непатентная публикация 3: Hanenberg H. et al., Human gene Therapy, 1997, 8(18), 2193-2206. Непатентная публикация 4: Gattinoni L. et al., J. Clin. Invest., 2005, 115(6) 1616-1626. Непатентная публикация 5: Benigni F. et al., J. Immunol., 2005, 175(2), 739-748. Патентная публикация 1: WO 03/016511. Патентная публикация 2: WO 03/080817. Патентная публикация 3: WO 2005/019450. Раскрытие изобретения Проблемы, решаемые изобретением. Целью настоящего изобретения является предоставление способа приготовления T-клеточной популяции, которая является эффективной при введении в живой организм. Средства для решения проблем. Первое воплощение (invention) настоящего изобретения относится к способу получения Tклеточной популяции, где T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, отличающемуся тем, что данный способ включает в себя стадию культивирования клеточной популяции, содержащей Tклетки, в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси. В первом изобретении настоящего изобретения общее число дней культивирования, включая стадию культивирования, в качестве примера считают равным приблизительно от 4 до 14 дней. Также в качестве примера считают, что культивирование в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси осуществляется, по меньшей мере, при стимуляции культуры и далее предпочтительно культивирование производится по меньшей мере в течение одного дня или более. Кроме того, в первом воплощении настоящего изобретения в качестве примера считают, что стадия культивирования в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси осуществляется в присутствии лиганда CD3. Также CD3 считают в качестве примера анти-CD3-антителом. В первом воплощении настоящего изобретения фрагмент фибронектина представлен в качестве примера полипептидом (m), содержащим по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 1-8 списка последовательностей, или полипептидом (n), содержащим по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в любую из вышеуказанных аминокислотных последовательностей,где полипептид (n) имеет функцию, эквивалентную функции вышеуказанного полипептида (m). Фрагмент фибронектина также представлен в качестве примера полипептидом, включающим в себя аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO: 1-3 и с 5-8 списка последовательностей. Кроме того, в первом изобретении настоящего изобретения также представлен в качестве примера способ получения, включающий в себя далее стадию выделения клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один маркер из группы, включающей в себя CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 и CD28. В способе получения при трансдукции может быть использован ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, аденоассоциированный вирусный вектор, лентивирусный вектор, обезьяний вирусный вектор. Второе воплощение настоящего изобретения относится к T-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где T-клеточная популяция экспрессируетCD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L,CCR7, CD27 и CD28. Третье воплощение настоящего изобретения относится к медикаменту, содержащему в качестве эффективного ингредиента T-клеточную популяцию, полученную по способу настоящего изобретения,где T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28. Четвертое воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения заболевания, включающему в себя стадию введения субъекту эффективного количества T-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы,состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28. Пятое воплощение настоящего изобретения относится к использованию T-клеточной популяции,полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, в производстве медикамента. Шестое воплощение настоящего изобретения относится к способу получения T-клеточной популяции, отличающемуся тем, что способ включает в себя стадию стимуляции T-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей изCD62L, CCR7, CD27 и CD28, по меньшей мере одним стимулирующим фактором, выбранным из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный анти-2 016168 ген, антигена, CD3 лиганда, CD28 лиганда, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин. Седьмое воплощение настоящего изобретения относится к T-клеточной популяции, полученной по способу шестого изобретения настоящего изобретения. Восьмое изобретение настоящего изобретения относится к медикаменту, содержащему в качестве эффективного ингредиента T-клеточную популяцию, полученную по способу шестого изобретения настоящего изобретения. Девятое воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения заболевания, включающему в себя стадию введения субъекту эффективного количества T-клеточной популяции, полученной по способу шестого воплощения настоящего изобретения. Десятое воплощение настоящего изобретения относится к использованию T-клеточной популяции,полученной по способу шестого воплощения настоящего изобретения, в производстве медикамента. Одиннадцатое воплощение настоящего изобретения относится к медикаменту, содержащему:(a) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента T-клеточную популяцию, полученную по способу первого воплощения настоящего изобретения, где T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из(b) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента по меньшей мере один стимулирующий фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки,имеющей презентированный антиген, антигена, CD3 лиганда, CD28 лиганда, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, где препараты содержатся в медикаменте в виде двух отдельных препаратов, введенных совместно или отдельно. Двенадцатое воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания, отличающемуся тем, что способ включает в себя следующие стадии (a) и (b):(a) введение пациенту T-клеточной популяции, полученной по способу первого воплощения настоящего изобретения, где T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28; и(b) введение пациенту по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы,состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген,антигена, CD3 лиганда, CD28 лиганда, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин. Эффекты изобретения. По способу получения настоящего изобретения предоставляется T-клеточная популяция, которая экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28. Клеточная популяция, полученная по способу получения изобретения, имеет высокий процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, и является высокоэффективной в лечении заболевания с помощью клеточной терапии. Наилучший способ воплощения изобретения. Настоящее изобретение дополнено выводами о том, что при включении стадии культивирования в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси (которые могут быть обозначены в настоящем документе как "эффективный ингредиент") получают клеточную популяцию, которая содержит высокий процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28. В данном случае используемый в настоящем документе термин "T-клеточная популяция, которая экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28" означает T-клеточную популяцию, которая содержит высокий процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28. Кроме того, "высокий процент" означает в настоящем документе, что если культивирование проводят в одинаковых условиях, за исключением присутствия или отсутствия эффективного ингредиента в настоящем воплощении (invention), то процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, вT-клеточной популяции, полученной культивированием в присутствии эффективного ингредиента в настоящем воплощении, является выше, чем в случае отсутствия эффективного ингредиента в настоящем воплощении. Предпочтительно T-клеточная популяция содержит вышеупомянутые T-клетки в более высоком проценте, предпочтительно на 5% или более и более предпочтительно на 10% или более, по сравнению с их количеством в случае отсутствия эффективного ингредиента в настоящем воплощении. Процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, в полученной T-клеточной популяции меняется в зависимости от различных внешних факторов, например индивидуальных различий и физического состояния субъекта, который дает клетки для получения T-клеток, таких как мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs). Следовательно, безусловное определение вышеупомянутого"высокого процента" в числовом значении не представляется возможным. Кроме того, T-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, означает популяцию, содержащую T-клетки и клетки, не являющиеся T-клетками, например другие лимфоциты, такие как NK-клетки, и также может присутствовать клеточный компонент крови, не относящийся к лимфоцитам. Настоящее изобретение будет объяснено конкретно далее в настоящем документе.(1) Фибронектин и его фрагменты, использованные в настоящем изобретении. Фибронектин и его фрагменты, описанные в настоящем документе, могут быть натурального происхождения и искусственно синтезированные. Фибронектин и его фрагмент могут быть получены в существенно чистом виде из субстанции природного происхождения на основе описания изобретения, например, Ruoslahti E., at al., J. Biol. Chem., 256(14), 7277-7281 (1981). Термин "существенно чистый фибронектин или фрагмент фибронектина", описанный в настоящем документе, означает, что данный фибронектин и фрагмент фибронектина не содержат, по существу, других белков, встречающихся вместе с фибронектином в природе. Каждый из вышеупомянутых фибронектина и его фрагментов может быть использован в настоящем изобретении отдельно или в смеси многочисленных разновидностей. К тому же известно, что существует большое количество сплайсинговых вариантов фибронектина. В качестве фибронектина, используемого в настоящем изобретении, может быть использован любой вариант при условии, что проявляются эффекты настоящего изобретения. Например, в случае фибронектина, полученного из плазмы крови, известно, что удаляются регион, обозначаемый как ED-B, присутствующий перед доменом, связывающим клетки, и регион, обозначаемый как ED-A, присутствующий между доменом, связывающим клетки, и гепаринсвязывающим доменом. Данный фибронектин, полученный из плазмы крови, также может быть использован в настоящем изобретении. Полезная информация о фрагментах фибронектина, которые могут быть использованы в настоящем изобретении и о получении данных фрагментов, может быть получена из Kimiduka F. et al., J. Biochem.,110, 284-291 (1991), Kornbrihtt A.R. et al., EMBO, 4(7), 1755-1759 (1985), Sekiguchi K. et al., Biochemistry,25(17), 4936-4941 (1986) и т.п. Кроме того, последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая фибронектин, или последовательность аминокислот фибронектина раскрыта в генбанке, номера доступаNM002026 и NP002017. В настоящем изобретении фрагмент фибронектина представлен в качестве примера полипептидом(m), включающим в себя по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую любой из регионов III-8 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 1 списка последовательностей), III-9 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 2 списка последовательностей), III-10 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 3 списка последовательностей), III-11 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 4 списка последовательностей), III-12 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 5 списка последовательностей), III-13 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 6 списка последовательностей), III-14 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 7 списка последовательностей) и CS-1 (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 8 списка последовательностей) (см. фиг. 1), и полипептидом (n), включающим в себя по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, содержащую замещение, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в любую из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где полипептид (n) имеет функцию, эквивалентную функции вышеуказанного полипептида (m). Длина фрагмента составляет, например, в пересчете на количество аминокислот предпочтительно от 20 до 1000 и более предпочтительно от 100 до 800. В данном документе "несколько" представляет собой понятие, которое охватывает некоторое число и составляет предпочтительно от 2 до 12, более предпочтительно от 2 до 10 и еще более предпочтительно от 2 до 8 и которое в дальнейшем обозначает то же самое. Кроме того, в качестве фрагмента предпочтительно используют фрагмент, обладающий клеточно-адгезивной активностью и/или гепаринсвязывающей активностью. Клеточно-адгезивную активность можно определить известным способом, проведя количественный анализ связывания фрагмента (его домена, связывающего клетки), использованного в настоящем изобретении, с клеткой. Например, вышеупомянутый способ включает в себя способ Williams D.A. et al., Nature, 352, 438-441 (1991). Данный способ представляет собой определение связывания клетки с фрагментом, иммобилизованным на культуральном планшете. Дополнительно можно оценить известным способом гепаринсвязывающую активность, проведя количественный анализ связывания фрагмента (его гепаринсвязывающего домена), использованного в настоящем изобретении, с гепарином. Например, связывание фрагмента с гепарином можно оценить аналогичным способом, используя гепарин, например меченый гепарин вместо клетки в вышеупомянутом способе Williams D.A. etal. Далее фрагмент фибронектина представляют в качестве примера полипептидом, выбранным из группы, состоящей из C-274 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 9 списка последовательностей), H-271 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 10 списка последовательностей), H-296 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 11 списка последовательностей), CH-271 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 12 списка последовательностей), CH-296 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 13 списка по-4 016168 следовательностей), C-CS1 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 14 списка последовательностей) и CH-296Na (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 15 списка последовательностей). Каждый из вышеупомянутых фрагментов CH-271, CH-296, CH-296Na, C-274 и C-CS1 представляет собой полипептид, имеющий домен, связывающий клетки, с VLA-5 связывающей активностью. Кроме того, C-CS1, H-296, CH-296 и CH-296Na являются полипептидами, имеющими CS-1 с VLA-4 связывающей активностью. Далее H-271, H-296, CH-271, CH-296 и CH-296Na являются полипептидами, имеющими гепаринсвязывающий домен. В данном документе CH-296Na представляет собой полипептид, содержащий регион из домена, связывающего клетки, к CS-1 фибронектина плазмы крови. В настоящем изобретении также может быть использован фрагмент, в котором модифицирован каждый из вышеупомянутых доменов. Гепаринсвязывающий домен фибронектина образован тремя последовательностями типа III (III-12, III-13 и III-14). Фрагмент, содержащий гепаринсвязывающий домен,имеющий делецию в одной или двух последовательностях вышеупомянутого типа III, также может быть использован в настоящем изобретении. Примерами фрагментов могут быть CHV-89 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 16 списка последовательностей), CHV-90 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 17 списка последовательностей) и CHV-92 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 18 списка последовательностей), которые представляют собой фрагменты, в которых связаны участок связывания клеток фибронектина (VLA-5 связывающий домен: сPro1239 по Ser1515) и одна из последовательностей типа III. CHV-89, CHV-90 и CHV-92 содержат III-13,III-14 и III-12 соответственно, CHV-179 содержит III-13 и III-14 и CHV-181 содержит III-12 и III-13 соответственно. Кроме того, в настоящем изобретении может быть использован фрагмент, имеющий присоединение дополнительной аминокислоты к любому из вышеупомянутых фрагментов. Например, фрагмент может быть получен добавлением желаемой аминокислоты к любому из вышеупомянутых фрагментов. Например, H-275-Cys (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 21 списка последовательностей) представляет собой фрагмент, имеющий гепаринсвязывающий домен фибронектина и остаток цистеина на C-конце. Фрагмент, использованный в настоящем изобретении, может быть фрагментом, содержащим полипептид с аминокислотной последовательностью, имеющей замещение, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность полипептида, формирующего фрагмент, содержащий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности встречающегося в природе фибронектина, представленного ранее в качестве примера, где полипептид имеет функцию,эквивалентную функции фрагмента, при условии получения желаемых эффектов настоящего изобретения. Предпочтительно замещение аминокислот и т.п. проводят в той мере, которая может изменить физико-химические характеристики и т.п. полипептида в диапазоне, где может быть сохранена наследственная функция полипептида. Например, замещение и т.п. аминокислот является консервативным в диапазоне, где собственные характеристики полипептида (например, гидрофобность, гидрофильность, электрический заряд, pK и т.п.) существенно не меняются. Например, предпочтительно замещение аминокислот представляет собой замещения внутри каждой из групп: 1) глицин, аланин; 2) валин, изолейцин,лейцин; 3) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин, глутамин; 4) серин, треонин; 5) лизин, агринин; 6) фенилаланин, тирозин; и делеция, добавление или вставка представляют собой делецию,добавление или вставку аминокислот, имеющих сходные характеристики с аминокислотами вокруг области воздействия в полипептиде в диапазоне, где характеристики аминокислот, окружающих область воздействия, существенно не меняются. В тех случаях, когда фрагмент, использованный в настоящем изобретении, был получен методом генной инженерии, то полипептид получают, например, используя Escherichia coli и т.п. в качестве хозяина, метионин на N-конце иногда удаляют действием метионинпептидазы из Escherichia coli, и вышеупомянутый пептид может быть использован в настоящем изобретении. Другими словами, полипептид, имеющий делецию метионина на N-конце полипептидов, показанных в SEQ ID NO: 15 и 21 списка последовательностей, также предпочтительно может быть использован в настоящем изобретении. Замещение и т.п. аминокислот может быть таким, которое встречается в природе и вызвано различием видов или особей, или может быть вызвано искусственно. Искусственная индукция может быть выполнена известным способом и является практически неограниченной. Искусственная индукция может быть проведена путем получения, например, заданной нуклеиновой кислоты, имеющей замену, делецию, добавление или вставку одного или нескольких нуклеотидов в нуклеиновую кислоту, кодирующую вышеупомянутый регион, и данный фрагмент получен из натурального фибронектина по известному способу, и использование нуклеиновой кислоты, в соответствии с чем может быть получен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую замену и т.п. в аминокислотной последовательности полипептида, формирующего фрагменты и т.п., имеющие функцию, эквивалентную функции вышеупомянутого региона, и данный фрагмент получен из натурального фибронектина.-5 016168 Кроме того, фраза "имеющие функцию, эквивалентную" относится к тому, что доля T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28 в T-клеточной популяции, полученной с применением полипептида, является выше, чем в T-клеточной популяции, полученной без применения полипептида, которая представляет собой контроль для сравнения. Вышеупомянутое действие может быть подтверждено в соответствии с методом, описанным в примерах 1, 2 и 6, изложенных далее. Кроме того, в качестве фрагмента, включающего в себя полипептид, имеющий замену аминокислот и т.п., предпочтителен фрагмент, обладающий клеточно-адгезивной активностью и/или гепаринсвязывающей активностью, и также предпочтителен фрагмент, имеющий CS-1 домен. Клеточно-адгезивная активность и/или гепаринсвязывающая активность могут быть оценены вышеупомянутыми способами. В качестве фрагмента, включающего в себя полипептид, имеющий замену аминокислот и т.п. в настоящем изобретении, также может быть использован, например, фрагмент, имеющий одну или более аминокислоту, вставленную как линкер между двух различных доменов. В данном случае, в качестве фибриногена, аналогичного вышеупомянутому фрагменту, в настоящем изобретении может быть использован полипептид, имеющий аминокислотную последовательность,имеющую замену, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность полипептида фибронектина, где доля T-клеток, которые экспрессируютCD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L,CCR7, CD27 и CD28 в T-клеточной популяции, полученной с применением полипептида, является выше,чем в T-клеточной популяции, полученной без применения полипептида, которая представляет собой контроль для сравнения. Кроме того, в качестве фибронектина или его фрагмента, использованного в настоящем изобретении, при условии получения желаемых эффектов настоящего изобретения, может быть использован полипептид, имеющий гомологию 50% или более, предпочтительно полипептид, имеющий гомологию 70% или более, более предпочтительно полипептид, имеющий гомологию 90% и более, и наиболее предпочтительно пептид, имеющий гомологию 95% и более, с аминокислотной последовательностью полипептида, формирующего фибронектин или его фрагмент, где полипептид, сформированный фибронектином или его фрагментом, имеет функцию, эквивалентную функции природного фибронектина или фрагмента,содержащего по меньшей мере часть его аминокислотной последовательности, представленной ранее в виде примера. В данном случае для расчета гомологии может быть использована, например, программа DNASISPro версия 2.6 (производство TAKARA BIO INC.) В данном случае фрагмент фибронектина, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, включает в себя полипептид, содержащий в аминокислотной последовательности все III-8 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 1 списка последовательностей), III-9 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 2 списка последовательностей), III-10 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 3 списка последовательностей), III-12 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 5 списка последовательностей), III-13 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 6 списка последовательностей), III-14 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 7 списка последовательностей) и CS-1 (последовательность аминокислот, показанная в SEQ ID NO: 8 списка последовательностей), другими словами, полипептид, содержащий гепаринсвязывающий домен, домен, связывающий клетки, и CS-1, и более предпочтительно фрагмент фибронектина включают в себя вышеупомянутый CH-296, или полипептид с аминокислотной последовательностью, имеющей замещение, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность полипептида, формирующего фрагмент, имеющий функцию, эквивалентную функции CH-296. Другой полипептид фибронектина, предпочтительно используемый в настоящем изобретении, включает в себя H-296, CH-271, H-271 и C-CS1, как показано в примере 18, или полипептиды с аминокислотной последовательностью, имеющей замещение, делецию, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность полипептида, формирующего фрагмент, имеющий функцию, эквивалентную функции данных полипептидов. Фрагмент фибронектина, описанный в настоящем документе, также может быть получен в виде фрагмента рекомбинантного фибронектина из генетического рекомбинанта на основе, например, описания спецификации патента США 5198423. Например, каждый из вышеупомянутых фрагментов H-271(SEQ ID NO: 10), H-296 (SEQ ID NO: 11), CH-271 (SEQ ID NO: 12) и CH-296 (SEQ ID NO: 13) и способ получения указанных фрагментов подробно описаны в спецификации указанного патента. Кроме того,CH-296Na (SEQ ID NO: 15) и способ его получения описаны в международном патенте WO 2005/019450. Кроме того, вышеупомянутый C-274 (SEQ ID NO: 15) фрагмент может быть получен по способу, описанному в патенте США 5102988. Далее, C-CS-1 (SEQ ID NO: 14) фрагмент может быть получен по способу, описанному в спецификации Японской патентной газеты 3104178. Каждый из вышеупомянутых фрагментов CHV-89 (SEQ ID NO: 16), CHV-90 (SEQ ID NO: 17) или CHV-179 (SEQ ID NO: 19) может быть получен по способу, описанному в спецификации Японской патентной газеты 2729712. Кроме того, CHV-181 (SEQ ID NO: 20) фрагмент может быть получен по способу, описанному в между-6 016168 народном патенте WO 97/18318. CHV-92 (SEQ ID NO: 18) фрагмент может быть получен методом генной инженерии с помощью плазмиды, сконструированной традиционным способом на основе плазмиды,описанной в литературе по ссылке на спецификацию Японской патентной газеты 2729712 и международный патент WO 97/18318. Данные фрагменты или фрагменты, которые могут быть произведены из них традиционным способом, могут быть получены с помощью микроорганизмов, депонированных в Международном патентном депозитарии организмов, Национальном институте передовой индустриальной науки и технологии, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan (почтовый индекс 305-8566) со следующими номерами доступа, или полученные модификацией плазмидой, введенной в каждый микроорганизм по известному способу.FERM P-12183 (Escherichia coli, содержащая плазмиду, кодирующую CHV-179, дата депозита: 8 апреля 1991). Поскольку фибронектин представляет собой гигантский гликопротеин, то заведомо непросто в промышленном отношении получить и использовать природный белок для производства медикамента. Кроме того, поскольку фибронектин представляет собой многофункциональный белок, то могут быть рассмотрены некоторые недостатки, вызванные тем, что регион отличен от региона, демонстрирующего эффект с помощью метода настоящего изобретения в зависимости от условий его применения. По указанным причинам в смысле доступности, работы и безопасности предпочтительно используют фрагмент фибронектина и более предпочтительно фрагмент рекомбинантного фибронектина, полученный, как описано ранее в настоящем изобретении. Кроме того, предпочтительно использовать вышеупомянутый фрагмент фибронектина в смысле реализации высокой степени размножения. Кроме того, молекулярный вес фрагмента фибронектина, использованного в настоящем изобретении, не ограничен и предпочтительно составляет от 1 до 200 кДа, более предпочтительно от 5 до 190 кДа и наиболее предпочтительно от 10 до 180 кДа. Молекулярный вес может быть определен, например, электрофорезом в SDSполиакриламидном геле. В аминокислотной последовательности полипептида, формирующего фрагмент фибронектина настоящего изобретения, часть аминокислотной последовательности другая, чем аминокислотная последовательность полипептида, формирующего фрагмент природного фибронектина, является произвольной и неограниченной при условии, что не ингибируется проявление желаемых эффектов настоящего изобретения.(2) Способ получения T-клеточной популяции. Способ получения T-клеточной популяции настоящего изобретения будет конкретно объяснен далее. Настоящее изобретение представляет собой способ получения клеточной популяции, которая содержит высокий процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, и предпочтительно Tклеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L и CCR7. Способ настоящего изобретения отличается тем, что данный способ включает в себя стадию культивирования клеточной популяции, содержащей T-клетки, в присутствии вышеупомянутого фибронектина, его фрагмента или их смеси.CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 и CD28 представляют собой маркеры клеточной поверхности лимфоцитов и известно, что они экспрессируются в недифференцированных клетках, таких как интактные Tклетки. Другими словами, T-клетки, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, содержащиеся в высоком проценте в клеточной популяции, полученной по способу получения настоящего изобретения, могут быть отнесены к недифференцированным клеткам перед дифференциацией в T-клетки памяти, т.е. интактные T-клетки, в виду фенотипа антигенного маркера клеточной поверхности. Как описано в вышеупомянутых непатентных публикациях 4 и 5, интактные T-клетки обладают высоким коэффициентом-7 016168 выживаемости, эффектом клеточной пролиферации, эффектом аккумуляции в опухоли, высокой степенью производства опухолеспецифичных эффекторных клеток в живом организме, при введении интактных T-клеток, и интактные T-клетки полезны в области клеточной терапии. Как показано далее в примере 3, T-клеточная популяция, полученная по способу получения настоящего изобретения, превращается в активированные T-клетки, производящие большое количество IL2, при стимулировании T-клеточной популяции анти-CD3-антителом или анти-CD28-антителом. Кроме того, как показано далее в примере 4, поскольку T-клеточная популяция, полученная по способу получения настоящего изобретения, демонстрирует хемотаксис в ответ на CCL21, который является хемокином,T-клеточная популяция также обладает способностью мигрировать в лимфоузел. Кроме того, как показано далее в примерах с 5-8, к T-клеточной популяции применяют антигенную стимуляцию, в результате чего индуцируются CTL, имеющие антигенспецифические цитотоксические активности. Далее, как показано в примере 9, поскольку T-клеточная популяция демонстрирует высокую жизнеспособность в присутствии небольшого количества IL-2 или без него по сравнению с T-клеточной популяцией, полученной в отсутствие фибронектина, его фрагмента или их смеси, то ожидают, что T-клеточная популяция также демонстрирует высокую жизнеспособность в живом организме. По существу, в примере 11, представленном далее, показано, что когда мышам NOD/scid вводят T-клеточную популяцию, полученную по способу настоящего изобретения, то T-клетки имеют более высокую степень приживления в селезенке и более высокий процент выживаемости по сравнению с T-клеточной популяцией, полученной без фибронектина, его фрагмента или их смеси. Далее, в примере 11 также показано, что поскольку вводимая Tклеточная популяция также вызывает GVHD реакцию, то индуцируются клетки, имеющие высокие цитотоксические активности. Принимая во внимание вышесказанное, T-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, имеет не только фенотип антигенного маркера клеточной поверхности, но также функцию, подходящую для применения в области клеточной терапии, принадлежащую интактным T-клеткам. Однако, как показано в п.(4) примера 7, п.(2) примера 8, п.(4) примера 15 и п.(2) примера 16, неожиданно было обнаружено, что индуцированные CTL из T-клеточной популяции, полученной дальнейшим воздействием на T-клеточную популяцию, полученную с помощью описанного выше способа на стадии выделения клеточной популяции, которая экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 и CD28, упоминаемого далее, обладают более высокой цитотоксической активностью и способностью распознавать специфический антиген, чем интактные T-клетки, полученные из PBMC, и T-клетки, имеющие сходный фенотип, но полученные в отсутствие эффективного ингредиента настоящего изобретения. Другими словами, T-клеточная популяция, полученная вышеупомянутыми способами, имеет значительно более высокую цитотоксическую активность после дифференцировки в CTL по сравнению с нормальными интактными T-клетками. При этом вышеупомянутая T-клеточная популяция представляет собой T-клеточную популяцию, содержащую новые интактные T-подобные клетки, имеющие более эффективные свойства, которые отличаются от интактных T-лимфоцитов. Можно ожидать, что сильные терапевтические эффекты T-клеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, как упоминалось ранее, будут проявляться сходным образом в CD8+ иCD4+ интактных T-подобных клетках. Далее, как описано в упомянутой выше патентной публикации 2,размножение T-клеток проводят в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси, в результате чего получают очень высокую степень пролиферации. Поэтому T-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, является очень подходящей для применения в области клеточной терапии. Примерами клеточной популяции, содержащей T-клетки, использованные в способе получения настоящего изобретения, являются PBMC, интактные T-клетки, T-клетки памяти, гемопоэтические стволовые клетки, мононуклеарные клетки крови из пуповины и т.п. Кроме того, в настоящем изобретении могут быть использованы клетки при условии, что они являются клетками крови. Могут быть использованы любые из данных клеток, которые получают из живого организма или культивированием ex vivo, например может быть использована непосредственно T-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, или T-клеточная популяция, которую подвергали хранению в замороженном состоянии. Кроме того, может быть использована, например, клеточная популяция, полученная с помощью различных процедур выделения из клеток, использованных в получении вышеупомянутой T-клеточной популяции, полученной из живого организма, например любой клеточной популяции, полученной разделением клеток, таких как PBMC на CD8+ или CD4+. В данном случае в способе получения T-клеточной популяции настоящего изобретения может быть использован материал, содержащий вышеупомянутые клетки, например кровь, такая как периферическая кровь или пуповинная кровь; материал, полученный удалением из крови таких компонентов, как эритроциты и плазма; спинно-мозговая жидкость и т.п. Предпочтительно способ получения T-клеточной популяции настоящего изобретения осуществляют в общее число дней культивирования, предпочтительно от 4 до 14 дней. Другими словами, если общее число дней культивирования составляет от 4 до 14 дней, то процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей изCD62L, CCR7, CD27 и CD28, в финальной T-клеточной популяции является высоким, таким образом делая ее очень подходящей для использования в области клеточной терапии. Если общее число дней культивирования составляет менее 4 дней, то не может быть получено достаточное число клеток для применения в общей иммунотерапии. В настоящем изобретении общее число дней культивирования составляет более предпочтительно от 5 до 14 дней и наиболее предпочтительно от 7 до 14 дней. В способе получения T-клеточной популяции настоящего изобретения предпочтительно культивирование в настоящем изобретении проводят в присутствии эффективного ингредиента, особенно предпочтительно, по меньшей мере, на ранней стадии полного периода культивирования. Предпочтительно в настоящем изобретении культивирование проводят в присутствии эффективного ингредиента, более предпочтительно, по меньшей мере, в начале культивирования. Культивирование в присутствии эффективного ингредиента в настоящем изобретении может быть проведено в начальный период периода культивирования или во время другой части периода. Другими словами настоящее изобретение охватывает те воплощения, которые включают в себя вышеуказанную стадию в части стадий получения Tклеток. Предпочтительно культивирование в присутствии эффективного ингредиента в настоящем изобретении проводят в течение одного дня или более, более предпочтительно в течение 3 дней или более и наиболее предпочтительно в течение 4 дней и более от начала культивирования. В настоящем изобретении концентрация фибронектина, его фрагмента или их смеси во время культивирования особенно не ограничена и составляет, например, предпочтительно от 0,001 до 500 мкг/мл и особенно предпочтительно от 0,01 до 500 мкг/мл. В настоящем изобретении предпочтительно культивирование в присутствии фибронектина, его фрагмента или их смеси проводят в присутствии лиганда CD3 с позиции эффективного стимулирования комплекса TCR-CD3 T-клетками для пролиферации клеток. В настоящем изобретении лиганд CD3 особенно не ограничен при условии, что субстанция имеет связывающую активность к CD3 и представлена, например, анти-CD3-антителом, особенно предпочтительно анти-CD3 моноклональным антителом и, например, ОКТ 3. Концентрация лиганда CD3 в среде особенно не ограничена. Например, в случае, когда используют моноклональное антитело, концентрация составляет, например, от 0,001 до 100 мкг/мл и особенно предпочтительно от 0,01 до 100 мкг/мл. Кроме того, в настоящем изобретении может быть добавлен другой костимуляторный фактор, такой как лиганд CD28, чтобы обеспечить, при необходимости, костимуляцию. Примерами являются антиCD28-антитело, CD80, B7-1, B7-2 и т.п. Среда, использованная для получения T-клеточной популяции в способе настоящего изобретения,особенно не ограничена и может быть использована известная среда, полученная смешиванием компонентов, необходимых для размножения T-клеток. Например, может быть соответственно выбрана для использования коммерчески доступная среда. Данные среды могут содержать цитокины, соответствующие белки и другие компоненты в дополнение к неотъемлемым компонентам. Примерами цитокинов могут служить IL-2, IL-7, IL-12, IFN- и т.п., и предпочтительно используют среду, содержащую IL-2. Концентрация IL-2 в среде особенно не ограничена и составляет, например, от 0,01105 ед/мл и более предпочтительно от 0,1 до 1104 ед/мл. Примером подходящего белка является анти-IL-4-антитело. Также может быть добавлен лимфоцит-стимулирующий фактор, такой как лектин. Концентрация компонента в среде особенно не ограничена при условии, что могут быть получены желаемые эффекты. Кроме того, при культивировании в среду могут быть добавлены сыворотка крови или плазма. Количества сыворотки и плазмы, добавленные к среде, особенно не ограничены и представляют, например,от 0 до 20 об.%, количества сыворотки и плазмы могут быть изменены в зависимости от стадии культивирования. Например, сыворотка или плазма могут быть использованы с постадийным снижением их концентрации. В данном случае источник сыворотки или плазмы может быть либо аутологичным (означает, что источник тот же самый, что и для культивируемой клетки) или неаутологичным (означает, что источник отличается от источника культивируемой клетки). С точки зрения безопасности предпочтительно может быть использована аутологичная сыворотка или плазма. Получение T-клеточной популяции настоящего изобретения обычно проводят в среде, содержащей указанные компоненты, в присутствии упомянутого выше эффективного ингредиента в настоящем изобретении. Число клеток в закладке культуры, использованной в настоящем изобретении, особенно не ограничено и составляет, например,предпочтительно от 1 клетки/мл до 1108 клеток/мл, более предпочтительно от 1 клетки/мл до 5107 клеток/мл, наиболее предпочтительно от 1 клетки/мл до 2107 клеток/мл. Кроме того, условия культивирования особенно не ограничены и могут быть использованы обычно применяемые для клеточной культуры условия. Например, клетки могут быть культивированы в условиях 37C и в присутствии 5% CO2 и т.п. Кроме того, среда может быть разведена добавлением свежей среды к раствору клеточной культуры,среда может быть заменена или может быть заменено оборудование клеточной культуры в соответствующие интервалы времени. Оборудование клеточной культуры, использованное в способе получения T-клеточной популяции настоящего изобретения, особенно не ограничено и могут быть использованы, например, чашки Петри,матрас для культивирования, контейнер, большой культуральный бак, биореактор и т.п. В качестве кон-9 016168 тейнера может быть использован CO2-проницаемый контейнер для культивирования клеток. Кроме того,в случае, когда T-клетки производят промышленно в большом количестве, то может быть использована большая культуральная камера. Кроме того, культивирование может быть проведено в открытой или закрытой системе. С точки зрения безопасности полученных T-клеток культивирование предпочтительно проводят в закрытой системе. В данном случае эффективный ингредиент в настоящем изобретении, лиганд CD3, другой костимуляторный фактор и подходящие белки, цитокины и другие компоненты, содержащиеся в упомянутой выше среде, могут быть растворены для совместного представления или могут быть иммобилизованы и применены на подходящей твердой фазе, например на оборудовании для клеточной культуры (включая любое оборудование открытой или закрытой системы), таком как чашка Петри, матрас для культивирования или контейнер, или на носителе клеточной культуры, таком как бусы, мембрана или предметное стекло. Материалы для указанных твердых фаз особенно не ограничены при условии, что материалы могут быть использованы для культивирования клеток. При иммобилизации компонентов, например, на упомянутое выше оборудование предпочтительно иммобилизовать указанное количество каждого компонента с учетом количества помещаемой в оборудование среды, для того чтобы после помещения среды в оборудование, она содержалась в пропорции, сходной с пропорцией желаемой концентрации, когда компоненты растворяют в среде и затем применяют. Количество иммобилизованных компонентов особенно не ограничено при условии, что могут быть получены желаемые эффекты. Упомянутый выше носитель применяют путем погружения носителя в культуральную среду в оборудовании для клеточной культуры во время культивирования. При иммобилизации на носитель упомянутых выше компонентов предпочтительно иммобилизовать указанное количество каждого компонента с учетом количества помещаемой в оборудование среды, для того чтобы после помещения носителя в среду она содержалась в пропорции, сходной с пропорцией желаемой концентрации, когда компоненты растворяют в среде и затем применяют. Количество иммобилизованных компонентов особенно не ограничено при условии, что могут быть получены желаемые эффекты. Способ для иммобилизации на твердой фазе эффективного ингредиента в настоящем изобретении,лиганда CD3, и другого костимуляторного фактора особенно не ограничен. Например, упомянутые выше субстанции могут быть иммобилизованы путем их контактирования с твердой фазой в подходящем буферном растворе. Кроме того, что касается иммобилизации фрагмента фибронектина на твердой фазе, то иммобилизация также может быть проведена по способам, описанным в международных патентах WO 97/18318 иWO 00/09168. После того как в настоящем изобретении упомянутые выше различные компоненты или эффективный ингредиент иммобилизуют на твердой фазе, T-клеточная популяция, полученная с помощью метода настоящего изобретения, может быть легко отделена от эффективного ингредиента и т.п. простым отделением T-клеточной популяции от твердой фазы, для того чтобы можно было предотвратить загрязнениеT-клеточной популяции эффективным ингредиентом и т.п. Кроме того, способ получения настоящего изобретения может далее включать в себя стадию выделения T-клеточной популяции, которая экспрессирует по меньшей мере один из маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD45RA, CD62L, CCR7, CD27 и CD28, из T-клеточной популяции, полученной культивированием в присутствии эффективного ингредиента в настоящем изобретении. Другими словами, T-клеточная популяция, полученная культивированием в присутствии эффективного ингредиента в настоящем изобретении, как описано выше, содержит большой процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей изCD62L, CCR7, CD27 и CD28. Поэтому далее проводят процедуры выделения клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один поверхностный антигенный маркер, выбранный из группы, состоящей изCD45RA, CD62L, CCR7, CD27 и CD28, при помощи которых могут быть более эффективно получены интактные T-подобные клетки или T-клеточная популяция, содержащая еще больше интактных Tподобных клеток. В данном случае T-клетки, которые необходимо отделить, особенно не ограничены и представляют собой, например, клетки, которые экспрессируют CD45RA, и предпочтительно представляют собой клетки, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер,выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, и более предпочтительно клетки, которые экспрессируют CD45RA и CD62L, и клетки, которые экспрессируют CD45RA и CCR7. Процедуры выделения особенно не ограничены и выделение проводят по известному способу с помощью клеточного сортера, магнитных бус, колонки и т.п. Например, при выделении клеток, которые экспрессируютCD45RA и CCR7, выделение может быть проведено, как описано в разделе (3) примера 3, описанного далее. Кроме того, T-клетки, полученные по способу настоящего изобретения, клонируют, в результате чего T-клетки могут быть сохранены в виде стабильных T-клеток. Кроме того, T-клеточную популяцию далее культивируют по способу настоящего изобретения или известным способом, используя Tклеточную популяцию, полученную с помощью способа настоящего изобретения, в результате чего Tклеточная популяция может быть получена вновь. Причем применяют антигенную стимуляцию и т.п. по- 10016168 известному способу, например, таким же образом, как в примерах 5-8, описанных далее, с использованием T-клеточной популяции, полученной с помощью способа настоящего изобретения, посредством чего могут быть получены антиген-специфические CTL.T-клеточная популяция, полученная с помощью способа настоящего изобретения, содержит высокий процент T-клеток, которые экспрессируют CD45RA и экспрессируют по меньшей мере один маркер,выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, которые представляют собой недифференцированные T-клетки, как упоминалось выше, и T-клеточная популяция также содержит T-клетки,имеющие цитотоксические активности, в зависимости от вида клеток, использованных в культуре. Цитотоксическая активность T-клеточной популяции также может быть оценена известным тестом in vitro. Поскольку T-клеточная популяция, полученная в настоящем изобретении, содержит высокий процент недифференцированных интактных T-подобных клеток, как упоминалось ранее, то T-клеточная популяция, полученная с помощью способа настоящего изобретения, не обязательно показывает высокую цитотоксическую активность в упомянутой выше системе. Заболевания, при которых вводят T-клеточную популяцию, полученную с помощью способа настоящего изобретения, не являются особенно ограниченными и представляют собой, например, рак, лейкемию, злокачественную опухоль, гепатит и инфекционные заболевания, вызванные вирусом, таким как вирус гриппа, HIV, бактерией или грибком, например туберкулез, MRSA, VRE и глубокий микоз. Кроме того, далее при трансдукции чужеродного гена, как описано ниже, также можно ожидать эффекты при различных генетических заболеваниях. T-клеточная популяция, полученная с помощью способа настоящего изобретения, также может быть использована для донорской лимфоцитарной инфузии и т.п., с целью предотвращения инфекционного заболевания после трансплантации костного мозга или рентгеновского облучения и для ремиссии рецидивирующей лейкемии. Далее, настоящее изобретение предоставляет T-клеточная популяция, полученная с помощью способа для получения T-клеточной популяции настоящего изобретения, упомянутого выше, в котором Tклеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет медикамент (терапевтический агент), содержащий T-клеточную популяцию в качестве эффективного ингредиента. Упомянутый выше терапевтический агент, содержащий T-клеточную популяцию, адекватно используют в иммунотерапии. При иммунотерапии T-клетки, подходящие для лечения пациента, вводят пациенту, например, внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрибрюшинной инъекцией или капельно. Терапевтический агент очень подходит для использования при упомянутых выше заболеваниях и для донорской лимфоцитарной инфузии. Терапевтический агент может быть приготовлен в виде капель или инфузии, например, смешиванием T-клеточной популяции, полученной способом настоящего изобретения, в качестве эффективного ингредиента, с известным органическим или неорганическим носителем, подходящим для парентерального введения, вспомогательным средством, стабилизирующим агентом и т.п., по способу, известному в фармацевтической области. В данном случае количество Tклеточной популяции настоящего изобретения, содержащееся в терапевтическом агенте, доза терапевтического агента и состояния для терапевтического агента могут быть определены соответствующим образом в соответствии с известной иммунотерапией. Например, количество T-клеточной популяции настоящего изобретения, содержащееся в медикаменте, особенно не ограничено и составляет предпочтительно от 1103 до 11011 клеток/мл, более предпочтительно от 1104 до 11010 клеток/мл и наиболее предпочтительно от 1105 до 1109 клеток/мл. Доза медикамента настоящего изобретения также особенно не ограничена и, например, составляет предпочтительно от 1106 до 11012 клеток/день, более предпочтительно от 1107 до 51011 клеток/день и наиболее предпочтительно от 1108 до 21011 клеток/день для взрослого в день. Далее, иммунотерапия терапевтическим агентом может быть проведена в комбинации с известной фармакотерапией или радиотерапией при введении лекарства или при хирургическом лечении. Способ получения T-клеточной популяции настоящего изобретения далее может включать в себя стадию трансдукции чужеродного гена в T-клетки. Другими словами, одно воплощение настоящего изобретения предоставляет способ получения T-клеточной популяции, далее включающий в себя стадию трансдукции чужеродного гена в T-клетки. Термин "чужеродный ген" обозначает ген, который искусственно вводят в T-клетки, в которых ген должен быть трансдуцирован и также охватывает ген, полученный из некоторых видов,как вид, из которого происходят T-клетки, в которые должен быть трансдуцирован ген. Путем осуществления способа получения T-клеток настоящего изобретения усиливают способность к пролиферации культивируемых клеток. При совмещении способа получения T-клеток настоящего изобретения со стадией трансдукции гена ожидают увеличения эффективности трансдукции гена. Средства для трансдукции чужеродного гена особенно не ограничены и подходящий способ для применения может быть выбран из известных способов трансдукции гена. Стадия трансдукции гена может быть проведена в любой заданной точке во время получения T-клеточной популяции. Например, с точки зрения эффективности работы предпочтительно проводить данную стадию одновременно или в- 11016168 течение упомянутого выше получения T-клеточной популяции либо после данной стадии. В настоящем изобретении в качестве упомянутого выше способа трансдукции гена могут быть использованы любые способы с применением и без применения вирусного вектора. Детали данных способов опубликованы в многочисленных литературных источниках. Упомянутый выше вирусный вектор не является особенно ограниченным, и применяют известный вирусный вектор, обычно используемый в способе трансдукции гена, например ретровирусный вектор,лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, аденосвязанный вирусный вектор, обезьяний вирусный вектор, коровий вирусный вектор, Сендай вирусный вектор и т.п. Особенно предпочтительно в качестве вирусного вектора используют ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, аденосвязанный вирусный вектор, лентивирусный вектор или обезьяний вирусный вектор. В качестве упомянутого выше вирусного вектора предпочтительными являются те вирусные векторы, которые не имеют репликационной активности так, чтобы вирусный вектор не мог самореплицироваться в инфицированной клетке. Кроме того,после генетической трансдукции также может быть применена субстанция, которая усиливает эффективность трансдукции гена, такая как Ретронектин (RetroNectin) (зарегистрированная торговая марка, производимая TAKARA BIO INC.). Ретровирусный вектор и лентивирусный вектор используют для генной терапии и т.п. потому, что они могут стабильно включать в свой состав чужеродный ген, вставляемый в то место ДНК хромосомы клетки, в которое должны трансдуцироваться векторы. Поскольку векторы имеют высокую эффективность инфицирования клеток во время деления и пролиферации, то генетическую трансдукцию предпочтительно проводят на стадии получения в настоящем изобретении. В качестве способа трансдукции гена без применения вирусного вектора в настоящем изобретении без ограничения может быть использован способ с применением носителя, такого как липосома или лиганд-полилизин, метод с применением фосфата кальция, метод электропорации, метод бомбардировки частицами и т.п. В данном случае трансдуцируют чужеродный ген, заключенный в плазмидную ДНК,линейную ДНК или РНК. Чужеродный ген, который можно трансдуцировать в T-клетки в настоящем изобретении, особенно не ограничен и может быть выбран любой ген, который хотят трансдуцировать в упомянутые выше клетки. В качестве гена, который описан выше, помимо гена, кодирующего белок (например, ферменты,цитокины, рецепторы и т.п.) может быть использован ген, кодирующий антисмысловую нуклеиновую кислоту, si-РНК (малая интерферирующая РНК) или рибозим. Кроме того, одновременно может быть трансдуцирован подходящий маркерный ген, который делает возможной селекцию клеток, в которые трансдуцируется ген. Упомянутый выше чужеродный ген может быть вставлен, например, в вектор, плазмиду и т.п. для его экспрессии под контролем подходящего промотора и использования. Кроме того, для достижения эффективной транскрипции гена в векторе могут присутствовать другие регуляторные элементы, которые объединены с промотором или с сайтом инициации транскрипции, например энхансерная последовательность или терминаторная последовательность. Кроме того, с целью вставки чужеродного гена в хромосому T-клеток, в которой ген должен трансдуцироваться с помощью гомологичной рекомбинации,например, чужеродный ген может быть размещен между фланкирующими последовательностями, содержащими нуклеотидные последовательности, каждая из которых обладает гомологией к нуклеотидным последовательностям, расположенным на обеих сторонах сайта желаемой целевой вставки гена в хромосому. Чужеродный ген, который трансдуцируют, может представлять собой ген, который имеет естественное происхождение или создан искусственно, или может быть геном, в котором молекулы ДНК,имеющие различное происхождение, соединены известными средствами, такими как сшивка. Кроме того, чужеродный ген может быть геном, имеющим последовательность, в которой мутацию вносят в природную последовательность в зависимости от ее назначения. По способу настоящего изобретения, например, ген, кодирующий фермент, связанный с устойчивостью к лекарству, применяемому для лечения пациента от рака или т.п., может быть трансдуцирован в Tклетки, давая тем самым T-клеткам устойчивость к лекарству. Если T-клетки используют, как описано выше, то иммунотерапия и лекарственная терапия могут быть применены в комбинации и вследствие этого могут быть получены более сильные терапевтические эффекты. Примером гена лекарственной устойчивости является ген множественной лекарственной устойчивости. С другой стороны, в противоположность упомянутому выше воплощению, в T-клетки может быть трансдуцирован ген для получения чувствительности к определенному лекарству, придавая тем самымT-клеткам чувствительность к лекарству. В данном случае T-клетки после того, как их трансплантируют в живой организм, могут быть удалены введением лекарства. Ген для придания чувствительности к лекарству представляет собой, например, ген тимидинкиназы. Другие гены, которые можно трансдуцировать, представлены, например, геном, кодирующим TCR,который распознает поверхностный антиген клеток-мишеней, и геном, кодирующим химерный рецептор, который имеет антиген-распознающий сайт антитела к поверхностному антигену клеток-мишеней и- 12016168 внутриклеточный регион TCR (CD3 или подобный ему). Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или предотвращения заболевания,включающий в себя стадию введения субъекту эффективного количества T-клеточной популяции, полученной с помощью вышеупомянутого способа. Термин "субъект", использованный в настоящем документе, особенно не ограничен и предпочтительно относится к пациенту с описанным выше заболеванием, которому вводят T-клеточную популяцию, полученную с помощью способа настоящего изобретения. Кроме того, термин "эффективное количество", использованный в настоящем документе, обозначает количество упомянутой выше T-клеточной популяции, демонстрирующее терапевтический или профилактический эффект, в случае, когда T-клеточную популяцию вводят упомянутому выше субъекту, по сравнению с субъектом, которому не вводили T-клеточную популяцию. Конкретное эффективное количество назначают соответствующим образом в зависимости от его формы введения, способа введения,цели применения и возраста, веса, симптома и т.п. у субъекта, и оно не является постоянным. Tклеточная популяция предпочтительно может быть введена в таком же эффективном количестве, как упомянутый выше медикамент. Способ введения также является неограниченным. Например, Tклеточная популяция может быть введена капельно, с помощью инъекции или подобными способами,аналогичным образом как в случае упомянутого выше медикамента. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет применение упомянутой выше T-клеточной популяции в производстве медикамента. Способ производства осуществляют таким же образом, как и для упомянутого выше медикамента. Кроме того, заболевания, при которых вводят медикамент, особенно не ограничены и являются такими же, как те заболевания, при которых вводят упомянутый выше медикамент. Кроме того, настоящее изобретение позволяет получить активированную T-клеточную популяцию путем стимулирования T-клеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, при котором T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD2 7 и CD28, по меньшей мере одним стимулирующим фактором, выбранным из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин. Далее, настоящее изобретение предоставляет T-клеточную популяцию, полученную с помощью упомянутого выше способа получения. Активированная T-клеточная популяция, полученная, как описано выше, может быть использована в качестве эффективного ингредиента медикамента, как и в случае T-клеточной популяции, полученной с помощью упомянутого выше способа получения. В настоящем документе термин "стимулирование с помощью стимулирующего фактора" не является особенно ограниченным при условии, что T-клеточная популяция, полученная с помощью упомянутого выше способа настоящего изобретения, активируется стимулирующим фактором, и примером стимулирования является культивирование T-клеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, в присутствии стимулирующего фактора. Клетка, способная презентировать антиген, как использовано в настоящем документе, не является особенно ограниченной при условии, что клетку обычно используют как антиген-презентирующую клетку, и она представлена, например, дендритной клеткой, T-клеткой, моноцитом, B-клеткой, T-клеткой,макрофагом, фибробластом, клеткой Лангерганса, клеточной популяцией, содержащей по меньшей мере одну клетку из упомянутых выше клеток, и особенно предпочтительно она представлена дендритной клеткой, T-клеткой, T-клеткой, B-клеткой, моноцитом, макрофагом, клеточной популяцией, содержащей по меньшей мере одну клетку из упомянутых выше клеток. Кроме того, происхождение клетки может быть аутологичным или неаутологичным для пациента, которому вводят клетку, и предпочтительно используют аутологичную клетку. В настоящем документе под клеткой, способной презентировать антиген, понимают клетку, которая способна презентировать антиген, но не презентирует антиген. В качестве клетки, имеющей презентированный антиген, для целей настоящего документа может быть использована клетка, в которой подходящий антиген был искусственно добавлен к упомянутой выше клетке, способной презентировать антиген, или клетка, уже презентирующая антиген при ее заборе из живого организма. Клетка,имеющая презентированный антиген, также может быть получена таким же образом, как описано в разделе (5) примера 5, описанном далее, и использована. В настоящем документе фраза "клетка, способная презентировать антиген" не включена в значение фразы "клетка, имеющая презентированный антиген". Антиген, использованный в настоящем документе, не является особенно ограниченным при условии, что пептид презентуется на антиген-презентирующей клетке и распознается T-клетками так, что Tклетки эффективно активируются. Примером антигена является пептид, гликопептид, экстракт опухолевых клеток, обработанный ультразвуком продукт опухолевой клетки и гидротермально обработанный продукт опухолевой клетки, вирус, бактерия, белок и т.п. Кроме того, описанные выше лиганд CD3 и лиганд CD28 представляют собой конкретные примеры лиганда CD3 и лиганда CD28.- 13016168 В настоящем документе T-клеточную популяцию, которая экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, полученная по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, костимулируют анти-CD3-антителом и анти-CD28-антителом, как описано в примере 3 далее, в результате чего может быть получена активированная популяция лимфоцитов, способная продуцировать цитокин. Цитокин, используемый в настоящем документе, не является особенно ограниченным при условии,что цитокин может действовать на T-клетки и активировать T-клетки. Например, цитокин представленIL-2, IFN-, TGF-, IL-15, IL-7, INF-, IL-12, CD40L, IL-27 и т.п. и особенно предпочтительно представлен IL-2, IFN- и IL-12 с точки зрения усиления клеточного иммунитета. Хемокин, используемый в настоящем документе, не является особенно ограниченным при условии,что хемокин действует на T-клетки и демонстрирует миграционную активность. Например, хемокин представлен RANTES, CCL21, MIP1 , MIP1 , CCL19, CXCL12, IP-10 и MIG. Клетка, способная продуцировать цитокин, используемая в настоящем документе, не является особенно ограниченной при условии, что клетка способна продуцировать упомянутый выше цитокин. Например, предпочтительно используют клетку Th1 с точки зрения усиления клеточного иммунитета. Кроме того, T-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, содержит высокий процент интактных T-подобных клеток, которые являются не дифференцированными и не стимулированными антигеном. Поэтому в качестве стимулирующего фактора, использованного в настоящем документе, особенно предпочтительно использовать клетку, способную презентировать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген и/или антиген. Например, как показано в разделе (5) примера 5, в разделе (8) примера 6, в разделе (2) примера 7, в разделе (1) примера 8, в разделе(7) примера 14 и в разделе (2) примера 15, описанных далее, антигенную стимуляцию предоставляют Tклеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, при помощи которого могут быть индуцированы полезные антигенспецифические CTL, имеющие очень высокую цитотоксическую активность и высокую способность распознавать антиген. Кроме того, культивирование может быть проведено в присутствии упомянутого выше фибронектина, его фрагмента или их смеси и известного компонента, который используют в культуре T-клеток в дополнение к упомянутому выше стимулирующему фактору. T-клеточная популяция, полученная, как описано выше, является очень полезной T-клеточной популяцией, имеющей сильные терапевтические эффекты. Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или предотвращения заболевания,включающий в себя стадию введения субъекту эффективного количества T-клеточной популяции, полученной по упомянутому выше способу. Кроме того, настоящее изобретение также предоставляет применение упомянутой выше T-клеточной популяции в производстве медикамента. Способ для производства медикамента осуществляют таким же образом, как и способ для производства упомянутого выше медикамента. Кроме того, заболевания, при которых вводят медикамент, особенно не ограничены и являются такими же, как заболевания, при которых вводят упомянутый выше медикамент. Далее настоящее изобретение предоставляет медикамент, содержащий:(a) препарат, включающий в себя в качестве эффективного ингредиента T-клеточную популяцию,полученную по способу настоящего изобретения, упомянутому выше, в котором T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28; и(b) препарат, включающий в себя в качестве эффективного ингредиента по меньшей мере один стимулирующий фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген,клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, в которых препараты включают в медикамент в виде двух отдельных препаратов, вводимых совместно или отдельно. Как упоминалось ранее, T-клеточная популяция, полученная по способу настоящего изобретения,содержит высокий процент интактных T-подобных клеток. Поэтому упомянутые выше стимулирующие факторы вводят совместно или отдельно с T-клеточной популяцией пациента, в результате чего эффекты вводимой T-клеточной популяции могут максимально проявиться и могут быть показаны более высокие терапевтические эффекты при заболеваниях. В качестве стимулирующего фактора предпочтительным является фактор, который может обеспечить антигенную стимуляцию, другими словами, фактор, который может быть использован как вакцина, например по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген,антигена, лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин,и наиболее предпочтительно в настоящем изобретении используют клетку, способную презентовать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген и антиген. Может быть приготовлен и организован в препарат (a) препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента T-клеточную популяцию, полученную по упомянутому выше способу настоящего изобретения, при котором T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, в медикаменте, таким же- 14016168 образом, как в случае медикамента, содержащего T-клеточную популяцию в качестве эффективного ингредиента, как упоминалось выше. Кроме того, содержимое в медикаменте, доза и форма введения Tклеточной популяции, которая экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер,выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, не является особенно ограниченным и может быть, например, таким же, как для медикамента, содержащего T-клеточную популяцию, полученную по упомянутому выше способу настоящего изобретения. Кроме того, в виде (b) может быть использован препарат, содержащий в качестве эффективного ингредиента по меньшей мере один стимулирующий фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки,способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лигандаCD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, в медикаменте,например препарат, сформированный совмещением стимулирующего фактора с подходящим носителем. Кроме того, в качестве конкретных примеров по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из клетки, способной презентировать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, могут быть использованы стимулирующие факторы, приведенные в примерах выше. Например, если клетку, способную презентировать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген, антиген, лиганд CD3, лиганд CD28, цитокин, хемокин или клетку, способную продуцировать цитокин, используют в качестве стимулирующего фактора, то препарат может быть сформирован объединением стимулирующего фактора с подходящим фармацевтическим носителем для капельного введения или инъекции без особого ограничения. Кроме того, если используют антигенный пептид, то антигенный пептид может быть объединен с подходящим адъювантом без особого ограничения. Если используют цитокин или хемокин, то препарат может быть сформирован включением цитокина или хемокина в липосому известным способом. Кроме того, состав стимулирующего фактора в препарате может быть выбран соответствующим образом в зависимости от вида используемого стимулирующего фактора,и он не является особенно ограниченным. Например, если в качестве стимулирующего фактора используют клетку, способную презентировать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген, антиген,лиганд CD3, лиганд CD28, цитокин, хемокин или клетку, способную продуцировать цитокин, то состав представлен, например, предпочтительно от 1103 до 1109 клеток/мл, более предпочтительно от 1103 до 1108 клеток/мл, наиболее предпочтительно от 1104 до 1107 клеток/мл. Кроме того, форма введения стимулирующего фактора может быть выбрана подходящим образом в зависимости от вида используемого стимулирующего фактора и она не является особенно ограниченной. Например, стимулирующий фактор вводят внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрибрюшинно, перорально и т.п. Доза не является особенно ограниченной при условии, что доза является эффективной для лечения или улучшения состояния при заболевании. Например, если вводят клетку, способную презентировать антиген, то доза составляет, например, от 1103 до 11011 клеток/мл, более предпочтительно от 1103 до 11010 клеток/мл, наиболее предпочтительно от 1104 до 1109 клеток/мл. Если вводят антигенный пептид, то доза составляет, например, предпочтительно от 0,001 до 100 мг/день, более предпочтительно от 0,003 до 30 мг/день и особенно предпочтительно от 0,01 до 10 мг/день. В данном случае, в качестве предпочтительного примера введения препарата (b) предпочтительно совместить клетку, способную презентировать антиген, с антигеном для создания препарата (b) и введения. Например, предпочтительно дендритную клетку совмещают с антигенным пептидом и вводят. В данном случае состав и доза клетки, способной презентировать антиген, и антигена в препарате могут быть осуществлены, как упоминалось ранее. Кроме того, введение препарата (a) и препарата (b) в медикаменте представляет собой совместное или раздельное введение их пациенту. В настоящем документе термин "совместно" означает, что препараты вводят пациенту в виде отдельных препаратов совместно с точки зрения времени или препарат (a) и препарат (b) смешивают перед введением пациенту и затем вводят. Например, в случае, если препарат (a) и препарат (b) вводят капельно, то настоящее изобретение охватывает воплощение, в котором указанные выше препараты смешивают перед введением пациенту. Кроме того, термин "раздельно" означает, что препарат (a) и препарат (b) вводят раздельно с точки зрения времени. Интервалы между введением препарата (a) и препарата (b) особенно не ограничены при условии, что симулирование стимулирующего фактора, содержащегося в препарате (b), предоставляется T-клеточной популяции, содержащейся в препарате (a), в организме пациента. Предпочтительно препарат (b) вводят после введения препарата (a). Кроме того, количество введений особенно не ограничено, и каждый препарат может быть введен однократно или несколько раз отдельными частями. Кроме того, настоящее изобретение также предоставляет способ лечения заболевания, включающий в себя стадии (a) введения пациенту T-клеточной популяции, полученной по упомянутому выше способу настоящего изобретения, при котором T-клеточная популяция экспрессирует CD45RA и экспрессирует по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27 и CD28, и (b) введения пациенту по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоя- 15016168 щей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена,лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин. Как упоминалось ранее, способ лечения может показать очень сильные терапевтические эффекты. В настоящем документе в качестве стимулирующего фактора предпочтительным является фактор, который может обеспечить антигенную стимуляцию, другими словами, фактор, который может быть использован как вакцина, например по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из клетки,способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда CD3,лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки, способной продуцировать цитокин, и наиболее предпочтительно в настоящем изобретении используют клетку, способную презентовать антиген, клетку, имеющую презентированный антиген или антиген. В способе лечения стадия (a) введения пациенту T-клеточной популяции, полученной по способу настоящего изобретения, не является особенно ограниченной и, например, осуществляется с использованием дозы и формы введения, которые подобны дозе и форме введения в способе введения упомянутого выше медикамента. Кроме того, стадия (b) введения пациенту по меньшей мере одного стимулирующего фактора, выбранного из группы, состоящей из клетки, способной презентовать антиген, клетки, имеющей презентированный антиген, антигена, лиганда CD3, лиганда CD28, цитокина, хемокина и клетки,способной продуцировать цитокин, также не является особенно ограниченной и, например, может быть осуществлена с использованием дозы и формы введения, которые подобны дозе и форме введения для упомянутого выше медикамента. Кроме того, интервалы между введениями упомянутых выше стадий (a) и (b) могут быть осуществлены таким же образом, как в случае упомянутого выше медикамента, содержащего препарат (a) и препарат (b), другими словами, интервалы особенно не ограничены при условии, что симулирование стимулирующего фактора, введенного на стадии (b), добавляют к T-клеточной популяции, введенной на стадии (a) в организм пациента, и стадии могут быть выполнены совместно или раздельно. Предпочтительно введение стадии (b) выполняют после введения стадии (a). Количество введений особенно не ограничено, и каждый препарат может быть введен однократно или несколько раз отдельными частями. Примеры Далее настоящее изобретение будет более подробно описано с помощью примеров, но без намерения ограничить рамки настоящего изобретения. Пример 1. Анализ CD45RA+CD62L+ T-клеток.(1) Выделение и хранение PBMC. Кровь была получена от здорового донора при его информированном согласии. Собранный образец крови разводили в 2 раза фосфатно-буферным солевым раствором (обозначаемым далее как PBS), наслаивали на фиколл-пак (производства Amersham Bioscience) и центрифугировали при 600g в течение 20 мин. Мононуклеарные клетки периферической крови (обозначаемые далее как PBMC) в среднем слое собирали пипеткой и отмывали. Собранные PBMC суспендировали в растворе для хранения из 90% FBS(производство Cambrex Corporation)/10% DMSO (производство SIGMA) или в растворе для хранения из равных объемов CP-1 (производство KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.), содержащего 8% человеческого сывороточного альбумина (производство Baxter Limited, обозначаемый далее как HSA), и среды RPMI 1640 (производство SIGMA) и хранили в жидком азоте. Во время размноженияT-клеток указанные хранящиеся PBMC быстро размораживали на водяной бане при 37C и отмывали средой RPMI 1640, содержащей 10 мкл/мл ДНКазы (производство Calbiochem). Затем подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски с трипановым синим. Затем клетки использовали в эксперименте.(2) Иммобилизация античеловеческого CD3-антитела и фрагмента CH-296. Античеловеческое CD3-антитело и фрагмент CH-296 иммобилизовали на культуральном оборудовании, использованном в следующем эксперименте. Подробно, 1,9 мл PBS, содержащего античеловеческое CD3-антитело (производство JANSSEN PHARMACEUTICAL K.K.) (конечная концентрация 5 мкг/мл), добавляли в 12-луночный культуральный планшет (производство Becton Dickinson). Затем добавляли CH-296 до конечной концентрации 25 мкг/мл. Затем данные культуральные устройства инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч и затем хранили при 4C до использования. Непосредственно перед использованием PBS, содержащего антитело, и CH-296 удаляли аспирацией из указанных культуральных устройств и каждую лунку дважды отмывали PBS и затем однократно средой RPMI 1640 и использовали культуральные устройства в эксперименте.AIM-V), с тем, чтобы получить клеточную суспензию с концентрацией 1106 клеток/мл. Затем 1% AIMV добавляли в планшет с иммобилизованным античеловеческим CD3-антителом или в планшет с иммобилизованным античеловеческим CD3-антителом и CH-296, приготовленными в разделе (2) примера 1, в- 16016168 объеме 2 мл/лунку, и добавляли упомянутую выше клеточную суспензию в объеме 1 мл/лунку. Добавляли IL-2 (PROLEUKIN, производство Chiron) до конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали планшеты при 37C в 5% CO2 (нулевой день культивирования). На четвертый день культивирования или позже проводили пассирование культуры с помощью 1% AIM-V на чистый, пустой 12,5-см 2 матрас для культивирования клеток (производство Becton Dickenson), и добавляли IL-2 до конечной концентрации 500 ед/мл (объем культуральной среды равен 6 мл). Подробно пассирование культуры проводили при плотности 0,05106 клеток/мл на четвертый день от начала культивирования при плотности 0,1106 клеток/мл на седьмой день и при плотности 0,15106 клеток/мл на десятый день. На седьмой, десятый и четырнадцатый дни от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и вычисляли кратность размножения путем сравнения с количеством клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Как показано в табл. 1, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизациейCH-296 на ранней стадии T-клеточного размножения, кратность размножения T-клеточной популяции была выше на любой стадии культивирования по сравнению с контрольной группой.(4) Анализ CD45RA+CD62L+ T-клеток в каждый день культивирования. Клетки, полученные в каждый день культивирования в разделе (3) примера 1, отмывали PBS и затем PBS, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина (производство SIGMA, далее обозначаемого как BSA) (далее обозначаемого как 1% BSA/PBS). Клетки суспендировали в 1% BSA/PBS и в качестве отрицательного контроля добавляли FITC-меченный мышиный IgG1/RD1-меченный мышиныйFITC-меченное мышиное античеловеческое CD62L антитело (производство SIGMA)/RD1-меченное мышиное античеловеческое CD45RA антитело (производство Beckmann Coulter). После добавления каждого антитела клетки инкубировали на льду в течение 30 мин. После инкубации клетки отмывали 1%BSA/PBS и затем ресуспендировали в PBS. Проводили проточную цитометрию клеток (Cytomics FC500,производство Beckmann Coulter) и рассчитывали процент CD45RA+CD62L+ T-клеток. Результаты представлены в табл. 2. Таблица 2 Как показано в табл. 2, в группе, где применяли культуральное оборудование с иммобилизациейCH-296 фрагмента, при культивировании получили большую CD45RA+CD62L+ T-клеточную популяцию в T-клетках по сравнению с контрольной группой на седьмой, десятый и четырнадцатый дни культивирования. Из данных результатов понятно, что количество T-клеток может быть увеличено с одновременным увеличением процентного количества CD45RA+CD62L+ T-клеток в T-клеточной популяции с 7 по 14 дни размножения в присутствии CH-296 фрагмента на ранней стадии размножения. Пример 2. Анализ CD45RA+CCR7+ T-клеток.PBMC, которые получали в разделе (1) примера 1, суспендировали в AIM-V, содержащем 3% человеческого сывороточного АВ (обозначаемого далее как 3% AIM-V), чтобы получить клеточную суспензию с плотностью 1106 клеток/мл. Затем 3% AIM-V добавляли в планшет с иммобилизованным античеловеческим CD3-антителом или в планшет с иммобилизованным античеловеческим CD3-антителом иCH-296, приготовленном в разделе (2) примера 1, в объеме 2 мл/лунку, и затем добавляли упомянутую выше клеточную суспензию в объеме 1 мл/лунку. Добавляли IL-2 до конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали планшеты при 37C в 5% CO2 (нулевой день культивирования). На четвертый день культивирования каждую группу разводили в AIM-V, содержащем 1% человеческого сывороточного AB,до плотности 0,075106 клеток/мл (объем 6 мл), разведение переносили на чистый, пустой 12,5-см 2 матрас для культивирования клеток и добавляли IL-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. Концентрацию сыворотки устанавливали из расчета, что PBMC, полученные из 30 мл образца крови, культивировали в- 17016168 10 л культуральной среды. Продолжали культивирование и на седьмой день каждую группу переносили на чистый, пустой 25-см 2 матрас для культивирования клеток (производство Becton Dickenson), используя культуральную среду (объем 12,6 мл), полученную разведением с AIM-V, содержащим 0,05% человеческого сывороточного AB, для получения плотности 0,25106 клеток/мл. К каждой группе добавлялиIL-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На одиннадцатый день каждую группу переносили на чистый, пустой 25-см 2 матрас для культивирования клеток, используя культуральную среду, полученную разведением с AIM-V, содержащим человеческий сывороточный AB, в такой же концентрации, как и на седьмой день, для получения плотности 1,04106 клеток/мл (объем 12,6 мл). К каждой группе добавляли IL-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На четырнадцатый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и вычисляли кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с количеством клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Как показано в табл. 3, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизациейCH-296 на ранней стадии T-клеточного размножения, кратность размножения T-клеточной популяции была выше на любой стадии культивирования по сравнению с контрольной группой. Ясно показано, что использование CH-296 фрагмента при размножении T-клеток соответствует требованиям и в данном примере ясно показано, что CH-296 фрагмент также целесообразно использовать во время 14-дневного размножения T-клеток.(2) Анализ CD45RA+CCR7+ T-клеток в субпопуляциях CD48+ T-клеток и CD48- T-клеток. Клетки, полученные в разделе (1) примера 2, отмывали PBS и затем 1% BSA/PBS. Клетки суспендировали в PBS, содержащем 1% BSA, и затем добавляли в качестве отрицательного контроля FITCмеченный мышиный IgG1/RD1-меченный мышиный IgG1/PC5-меченный мышиный IgG1 + ECDмеченный мышиный IgG1 (производство Beckmann Coulter). Подобным образом RD1-меченное мышиное античеловеческое антитело CD45RA/FITC-меченное мышиное античеловеческое антитело CCR7Beckmann Coulter). После того как добавляли каждое антитело, клетки инкубировали на льду в течение 30 мин. Во время инкубации инкубационную смесь осторожно перемешивали каждые 10 мин. После инкубации клетки отмывали 1% BSA/PBS и ресуспендировали в PBS. Проводили проточную цитометрию и группировали клетки по CD8+ T-клеточному региону и CD8- T-клеточному региону с помощью их способности окрашиваться (stainability) CD8. Для каждой клеточной популяции рассчитывали процентное содержание CD45RA+CCR7+ T-клеток. Результаты представлены в табл. 4 и 5. Таблица 4 Как показано в табл. 4, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизациейCH-296, получили более высокие результаты CD45RA+CCR7+ T-клеточной популяции в T-клетках при культивировании по сравнению с контрольной группой. Данный феномен наблюдали также в случае,когда анализировали CD8- T-клетки, т.е. клеточную популяцию, в которой преобладали CD4+ T-клетки(табл. 5). Из результатов ясно видно, что T-клеточная популяция может быть увеличена с одновременным увеличением процентного содержания CD45RA+CCR7+ T-клеточной популяции T-клеток при культивировании в присутствии CH-296 фрагмента на ранней стадии 14-дневного размножения. Пример 3. Анализ цитокинпродуцирующей способности CD45RA+CCR7+ T-клеток и CD45RACCR7- T-клеток в T-клеточной популяции, увеличенной с помощью CH-296.PBMC, которые получали в разделе (1) примера 1, суспендировали в GT-T503 (производство TAKARA BIO, INC.), содержащем 0,5% человеческого сывороточного AB и 0,2% HSA (обозначаемый далее как 0,5% GT-T503), для получения клеточной суспензии с плотностью 0,25106 клеток/мл. Затем 0,5%- 18016168 иммобилизованным античеловеческим CD3-антителом и CH-296, приготовленным в разделе (2) примера 1, в объеме 0,5 мл/лунку и затем добавляли указанную выше суспензию в объеме 1 мл/лунку. Затем добавляли IL-2 до получения конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали планшеты при 37C в 5% CO2 (нулевой день культивирования). На четвертый день от начала культивирования культуральную среду каждой группы разводили примерно в 8 раз 0,5% GT-T503 и 6 мл разведения переносили на чистый пустой 12,5-см 2 матрас для культивирования клеток и затем добавляли IL-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. Продолжали культивирование и на седьмой день среду клеточной культуры из каждой группы разводили примерно в 4,2 раза 0,5% GT-T503 и 12,6 мл разведения переносили на чистый пустой 25-см 2 матрас для культивирования клеток. К каждой группе добавляли IL-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На десятый день среду клеточной культуры из каждой группы разводили примерно в 2 раза 0,5% GT-T503, содержащим 0,2% HSA, и 12,6 мл разведения переносили на чистый пустой 25-см 2 матрас для культивирования клеток. К каждой группе добавляли IL-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На четырнадцатый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и вычисляли кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с количеством клеток в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 6. Таблица 6 Как показано в табл. 6, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизациейCH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции (обозначаемой далее как "CH-296 группа"), кратность увеличения T-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.(2) Анализ CD45RA+CCR7+ T-клеток. Клетки, полученные в разделе (1) примера 3, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими,как указано далее. Подробно, окрашивание проводили с FITC-меченным мышиным IgG1/RD1-меченным мышинымIgG1/PC5-меченным мышиным IgG1 и с RD1-меченным мышиным античеловеческим CD45RA антителом/FITC-меченным мышиным античеловеческим CCR7 антителом. Данные окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре и подсчитывали процентное количество CD45RA+CCR7+ T-клеток. Результаты представлены в табл. 7. Таблица 7 Как показано в табл. 7, в группе CH-296 получили более высокие результаты CD45RA+CCR7+ Tклеточной популяции в T-клетках при культивировании по сравнению с контрольной группой.(3) Выделение CD45RA+CCR7+ T-клеток и CD45RA-CCR7- T-клеток после размножения Tклеточной популяции. Клетки, полученные в разделе (1) примера 3, окрашивали аналогичным образом, как в разделе (2) примера 2, и затем клетки отмывали 1% BSA/PBS и суспендировали в среде GT-T503. Проводили сортинг CD8+ T-клеток с помощью MoFlo (производство DAKO DENMARK A/S) на CD45RA+CCR7+ Tклетки и CD45RA-CCR7- T-клетки и аналогично проводили сортинг CD8T-клеток, большинство которых являлось CD4+ T-клетками, на CD45RA+CCR7+ T-клетки и CD45RA-CCR7- T-клетки. Кроме того,окрашенные клетки перед сортингом подвергали проточной цитометрии и группировали их по CD8+ Tклеточному региону и CD8T-клеточному региону согласно их способности окрашиваться CD8. Подсчитывали процентное количество CD45RA+CCR7+ T-клеток для клеточной популяции. Результаты представлены в табл. 8 и 9. Как показано в табл. 8 относительно CD8+ T-клеток, в группе CH-296 получили в результате более высокое процентное содержание CD45RA+CCR7+ T-клеточной популяции в T-клетках после культивирования по сравнению с контрольной группой. Данный феномен наблюдали также в случае, когда анализировали CD8T-клетки, т.е. клеточную популяцию, в которой преобладали CD4+-T-клетки (табл. 9).(4) Иммобилизация античеловеческого CD3-антитела и античеловеческого CD28-антитела. Античеловеческое CD3-антитело и античеловеческое CD28-антитело иммобилизовали на культуральном оборудовании, использованном в следующем эксперименте. Подробно, в 96-луночный планшет для культивирования клеток (производство Becton Dickinson) добавляли по 80 мкл ацетатного буфера (pH 5,3), содержащего античеловеческое CD3-антитело (2 мкг/мл). Далее добавляли по 80 мкл ацетатного буфера, содержащего античеловеческое CD28-антитело(производство DAKO DENMARK A/S) (20 мкг/мл). Античеловеческое CD3-антитело добавляли до получения конечной концентрации 1 мкг/мл и античеловеческое CD28-антитело добавляли до получения конечной концентрации 10 мкг/мл. После этого культуральное оборудование культивировали при комнатной температуре в течение 5 ч и затем хранили при 4C до использования. Непосредственно перед использованием ацетатный буфер, содержащий антитело, удаляли аспирацией из указанного культурального оборудования и каждую лунку дважды промывали PBS и однократно средой GT-T503 и использовали культуральное оборудование в эксперименте.(5) Стимуляция клеток. Известно, что интактные T-клетки и центральные T-клетки памяти продуцируют IL-2 в большом количестве после стимуляции антигеном в организме. Кроме того, эффекторные T-клетки памяти продуцируют INF- или IL-4 в большом количестве после стимуляции антигеном. Чтобы подтвердить, что каждая из клеточных фракций, полученных в разделе (3) примера 3, сохраняет свои функции, определяли их цитокинпродуцирующую способность после стимуляции анти-CD3-антителом и анти-CD28 антителом. Собирали каждую клеточную популяцию, полученную в разделе (3) примера 3, затем клетки суспендировали в 0,5% GT-T503 и подсчитывали число клеток. Клетки добавляли в каждую лунку планшета с иммобилизованным античеловеческим CD3-антителом и античеловеческим CD28-антителом,приготовленными в разделе (4) примера 3, так чтобы их плотность составляла 2105 клеток/0,2 мл, и культивировали клетки при 37C в 5% CO2. Через 24 ч собирали супернатант культуры и использовали в эксперименте для определения цитокина методом ELISA.(6) Определение цитокиновой продукции методом ELISA. Как показано в разделе (3) примера 3 в группе CH-296 были получены результаты с более высоким процентным содержанием CD45RA+CCR7+ T-клеток по сравнению с контрольной группой. Чтобы подтвердить, что данная CD45RA+CCR7+ T-клеточная популяция сохраняет свои свойства в виде интактныхT-подобных клеток, оценивали цитокинпродуцирующую способность CD45RA+CCR7+ T-клеток иCD45RA-CCR7- T-клеток, изолированных после размножения T-клеточной популяции. Продукцию IL-2 или INF- определяли с помощью набора ELISA Development Kit (производство RD Systems) и продукцию IL-4 определяли с помощью набора READY-SET-GO Human Interleukin-4 (производство Bioscience). Результаты продукции каждого цитокина в контрольной группе и в группе CH-206 показаны в табл. 10 и 11 соответственно. Таблица 10CH-296. В обеих группах CD8T-клетки имели большую продукцию цитокинов, чем CD8+T-клетки иCD45RA+CCR7+ T-клеточная популяция, полученная размножением T-клеточной популяции, обладает свойствами интактных T-подобных клеток. С другой стороны, IFN- и IL-4 в основном продуцировалисьCD45RA-CCR7- T-клетками в контрольной группе и в группе CH-296, что предполагает, что CD45RACCR7- T-клеточная популяция представляет собой популяцию, в которой поддерживается эффекторная функция памяти. Пример 4. Анализ хемотаксиса T-клеточной популяции, выращенной с использованием CH-296.(1) Иммобилизация античеловеческого CD3-антитела и фрагмента CH-296. Иммобилизацию проводили аналогичным образом, как в разделе (2) примера 1, за исключением того, что PBS, содержащий античеловеческое CD3-антитело (конечная концентрация 5 мкг/мл) добавляли в объеме 0,45 мл.(2) Размножение T-клеточной популяции. Проводили аналогичные процедуры, как в разделе (1) примера 3, за исключением того, что на четвертый день культивирования культуральную среду разводили примерно в 14 раз и 10 мл разведения добавляли в чистый 25-см 2 матрас для культивирования клеток (производство Corning), так что на восьмой день от начала культивирования культуральную среду разводили примерно в 2 раза и 10 мл разведения добавляли в чистый 25-см 2 матрас для культивирования клеток (производство Corning), так что на одиннадцатый день от начала культивирования 10 мл среды GT-T503, содержащей 0,2% HAS, добавляли к каждому из матрасов. Результаты кратности увеличения показаны в табл. 12. Таблица 12 Как показано в табл. 12, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизациейCH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции (обозначаемой далее как "CH-296 группа"), кратность увеличения T-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой. Как показано в табл. 13, в группе CH-296 были получены результаты более высокого содержанияCD45RA+CCR7+ T-клеточной популяции в T-клетках при культивировании по сравнению с контрольной группой.(4) Анализ хемотаксиса. В группе CH-296 были получены результаты более высокого процентного содержанияCD45RA+CCR7+ T-клеточной популяции по сравнению с контрольной группой. CCR7-положительные клетки, такие как интактные T-клетки и T-клетки центральной памяти, демонстрируют хемотаксис в ответ на хемокин CCL21. Миграция из кровеносных сосудов в лимфатические узлы является важным событием для данных клеток, что подтверждали, если клетки, полученные после размножения, обладали хемотаксисом в ответ на CCL21. Клетки, полученные в разделе (2) примера 4, центрифугировали, супернатант удаляли и суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 0,5% BSA (называемая далее реакционной средой), чтобы получить плотность 5106 клеток/мл. В нижнюю камеру системы Transwell (Transwell Polycarbonate, 24-луночный планшет, размер пор 5 мкм, производство Corning) добавляли 600 мкл реакционной среды, содержащей CCL21 (производство RD Systems) с конечной концентрацией 1 мкг/мл, и в верхнюю камеру добавляли 100 мкл приготовленной клеточной суспензии. Определяли количество клеток, мигрировавших в нижнюю камеру после культивирования при 37C в течение 2 ч, и число клеток, оставшихся в верхней камере. Процентное содержание клеток, которые участвуют в хемо- 21016168 таксисе, рассчитывают по следующей формуле (1): процентное содержание (%) клеток, которые участвуют в хемотаксисе=(число клеток, мигрировавших в нижнюю камеру/(число клеток, оставшихся в верхней камере+число клеток, мигрировавших в нижнюю камеру 100. Результаты представлены в табл. 14. Таблица 14 Как показано в табл. 14, присутствие клеток, которые демонстрировали хемотаксис в ответ наCCL21, было подтверждено как в контрольной группе, так и в группе CH-296, и их процентное содержание было выше в группе CH-296. Другими словами, выяснили, что клетки, обладающие способностью мигрировать в лимфатические узлы, были получены в большом количестве с помощью использования(2) Размножение T-клеточной популяции. Осуществляли аналогичные процедуры как в разделе (2) примера 4. Результаты кратности увеличения показаны в табл. 15. Таблица 15 Как показано в табл. 15, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизациейCH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции (обозначаемой далее как "СН-296 группа"), кратность увеличения T-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.(3) Анализ CD45RA+CCR7+ и CD45RA+CD62L+ T-клеток. Клетки, полученные в разделе (2) примера 5, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими,как указано далее. Подробно, окрашивание проводили с FITC-меченным мышиным IgG1/RD1-меченным мышиным(здесь и далее античеловеческое CD62L-антитело является продуктом производства eBioscience). Данные окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре и подсчитывали процентное количество Как видно из табл. 16, в группе CH-296 обнаружены более высокие уровни обоих маркеров клеточной поверхности по сравнению с контрольной группой.(4) Хранение культивированных клеток. Клетки, полученные на четырнадцатый день культивирования в разделе (2) примера 5, суспендировали в растворе для хранения, состоящем из равных объемов 90% FBS/10% DMSO или CP-1, содержащего 8% HSA и среды RPMI 1640, и хранили суспензию в жидком азоте. При индукции CTL хранящиеся клетки быстро размораживали на водяной бане при 37C и отмывали средой RPMI 1640, содержащей 10 мкл/мл ДНКазы. Затем подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим. Затем клетки использовали в эксперименте.(5) Индукция CTL, специфических для опухолеассоциированного антигена (MART-1). Индукцию CTL, специфических для опухолеассоциированного антигена (меланомный антиген,распознаваемый T-клетками: MART-1), проводили с использованием клеток, полученных в разделе (4) примера 5. Индукцию CTL, специфических для опухолеассоциированного антигена (MART-1), проводили по частично модифицированному методу Plebanski M. et al., Eur. J. Immunol., 25(6), 1783-1787 (1995). Подробно, используя PBMC, полученные в разделе (1) примера 1, в качестве антиген-представляющих- 22016168 клеток PBMC инкубировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% человеческого сывороточного AB (далее обозначаемого как 5HRPMI) и содержащей в качестве антигенного пептида 40 мкг/мл пептида эпитопа, происходящего из антиген меланомы MART-1 (пептид, связывающий HLA-A2.1 описан в SEQ IDNEAA, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамата (производство Cambrex) и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина (производство MEIJI SEIKA KAISHA, LTD.) в инкубаторе в 5% CO2 при 37C в течение 2 ч. После окончания инкубации смесь облучали рентгеновским облучением (1,42 Кл/кг) и доводили плотность 5HRPMI до значений от 3 до 4106 клеток/мл. С другой стороны, культивированные клетки, полученные в разделе (4) примера 5, суспендировали в 5HRPMI, чтобы получить плотность 2106 клеток/мл, и добавляли суспензию в 24-луночный культуральный планшет (производство Becton Dickenson) в объеме 0,5 мл/лунку. В каждую лунку добавляли антигенпрезентирующие клетки, полученные по вышеупомянутому способу, в объеме 0,5 мл/лунку и добавляли IL-7 (производство RD Systems) и KLH (производство Calbiochem) до получения конечной концентрации 25 нг/мл и 5 мкг/мл соответственно. Планшет культивировали в инкубаторе в 5% CO2 при 37C. В первый день инкубирования культуры 1 мл 5HRPMI, содержащий 60 ед/мл IL-2, добавляли в каждую лунку. На четвертый день культивирования удаляли половину объема культурального супернатанта и добавляли в каждую лунку 1 мл 5HRPMI, содержащий 60 ед/мл IL-2. На седьмой день антигенпрезентирующие клетки получали тем же способом, как указано выше, затем облучали смесь рентгеновским облучением (1,42 Кл/кг) и клетки получали так, чтобы плотность составляла 4106 клеток/мл, и добавляли клетки в чистый 24-луночный планшет для культивирования клеток в объеме 0,5 мл/лунку. Иммунореактивные клетки, которые культивировали в течение одной недели (часть клеток продолжали культивировать для исследования цитотоксической активности), суспендировали в 5HRPMI,чтобы получить плотность от 1,8 до 2,0106 клеток/мл, и добавляли суспензию в аналогичный планшет в объеме 0,5 мл/лунка. Далее IL-7 добавляли до конечной концентрации 25 нг/мл для рестимуляции клеток. На восьмой день в каждую лунку добавляли 1 мл 5HRPMI, содержащий 60 ед/мл IL-2. На одиннадцатый день клетки в каждой лунке суспендировали, распределяли в две лунки по половине объема в каждую и добавляли 1 мл 5HRPMI, содержащий 60 ед/мл IL-2, в каждую лунку и продолжали культивировать клетки до пятнадцатого дня.(6) Определение кратности размножения. В отношении клеток, полученных в разделе (5) примера 5, на седьмой и четырнадцатый дни от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью окраски трепановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 17. Таблица 17 Как видно из табл. 17, для популяции CTL, индуцированной в группе CH-296, обнаруженные кратности размножения были выше, чем в контрольной группе. Другими словами, ясно показано, что популяция CTL может быть получена в большом количестве при проведении индукции CTL в культивируемых клетках, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным CH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции.(7) Анализ цитотоксической активности. Цитотоксическую активность CTL оценивали на пятнадцатый день культуры, полученной в разделе(5) примера 5, с помощью метода анализа цитотоксической активности с использованием кальцеина-AM[Lichtenfels R. et al., J. Immunol. Methods., 172(2), 227-239 (1994)]. Подробно, клетки HLA-A2.1 ограниченной клеточной линии T2 (ATCC CRL-1992), которые культивировали в течение ночи вместе с пептидом эпитопа или без него, суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% FBS, для получения плотности 1106 клеток/мл, затем добавляли кальцеин-AM (производство DOJINDO LABORATORIES) до конечной концентрации 25 мкг и культивировали клетки при 37C в течение 1 ч. Клетки отмывали средой без кальцеина-AM и затем получали кальцеин меченные клетки-мишени. Кальцеин меченные клетки-мишени смешивали с 30-кратным количеством клеток К 562 (Human Science Research ResourcesBank JCRB0019), чтобы предоставить клетки для анализа цитотоксической активности. Клетки К 562 использовали для исключения неспецифической цитотоксической активности из-за примеси NK клеток в отвечающих клетках.CTL, полученные в разделе (5) примера 5, серийно разводили 5HRPMI в качестве эффекторных клеток, так чтобы получить плотность от 3105 до 3106 клеток/мл. Затем разведение распределяли по 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования клеток и к данным планшетам добав- 23016168 ляли клетки для анализа цитотоксической активности в объеме 100 мкл/лунку, приготовленные так, что кальцеин меченные клетки-мишени имели плотность 1105/мл. После определения отношение эффекторных клеток (E) к кальцеин меченным клеткам-мишеням (T) выражали как отношение E/T и проводили определение отношения E/T 30, 10 и 3. Планшет, содержащий упомянутую выше суспензию, центрифугировали при 400g в течение 1 мин и затем клетки инкубировали в инкубаторе 5% CO2 при 37C в течение 4 ч. Затем собирали 100 мкл супернатанта культуры из каждой лунки и определяли количество кальцеина, высвобожденного в культуральный супернатант с помощью флуоресцентного планшетного ридера (спектрофлуориметра) (производство BERTHOLD TECHNOLOGIES) (возбуждение при 485 нм/измерение при 538 или 535 нм). Рассчитывали специфическую цитотоксическую активность (%) по следующей формуле (2): специфическая цитотоксическая активность (%)=(измеренное значение в каждой лункеминимальное высвобожденное количество)/максимальное высвобожденное количество-минимальное высвобожденное количество)100. В указанной выше формуле минимальное высвобожденное количество представляет собой количество кальцеина, высвобожденное в лунке, содержащей только клетки для анализа цитотоксической активности, показывающее количество кальцеина, естественно высвобождающееся из кальцеин меченных клеток-мишеней. Максимальное высвобожденное количество обозначает количество кальцеина, высвобождаемое, когда клетки полностью разрушены при добавлении 0,1% сурфактанта Тритон X-100 (производство Nakalai Tesque Inc.) к клеткам для анализа цитотоксической активности. Результаты исследования цитотоксической активности показаны в табл. 18. Таблица 18 Как видно из табл. 18, для популяции CTL, индуцированной в группе CH-296, специфическая цитотоксическая активность популяции CTL была выше, чем в контрольной группе. Другими словами, ясно показано, что культивируемые клетки, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным CH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию CTL, имеющую более высокую специфическую цитотоксическую активность. Пример 6. Аллогенная MLR и индукция анти-MART-1 CTL клеточной популяции, увеличенной с использованием газопроницаемого культурального мешка после стимуляции CH-296 на ранней стадии.(1) Иммобилизация анти-CD3-антитела и фрагмента CH-296. Античеловеческое CD3-антитело и фрагмент CH-296 иммобилизовали на культуральное оборудование, использованное в следующем эксперименте. Подробно, 9 мл PBS, содержащего античеловеческоеCD3-антитело (конечная концентрация: 5 мкг/мл) добавляли на 75-см 2 матрас для культивирования клеток (производство Becton Dickinson). Затем к группе добавляли CH-296, так чтобы получить конечную концентрацию 25 мкг/мл. Затем данное культуральное оборудование инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч и хранили культуральное оборудование при 4C до использования. Непосредственно перед использованием PBS, содержащего антитело и CH-296, удаляли аспирацией из данного культурального оборудования, затем каждый матрас дважды отмывали PBS и затем один раз средой RPMI и использовали культуральное оборудование в эксперименте.PBMC, которые получали в разделе (1) примера 1, суспендировали в 0,5% GT-T503 для получения клеточной суспензии с плотностью 0,5106 клеток/мл. Затем на матрас с иммобилизованным античеловеческим CD3-антителом или на матрас с иммобилизованным античеловеческим CD3-антителом и CH296, приготовленными в разделе (1) примера 6, предварительно добавляли 0,5% GT-T503 в объеме 21 мл/матрас и добавляли упомянутую выше клеточную суспензию в объеме 9 мл/матрас. Затем добавлялиIL-2 до конечной концентрации 1000 ед/мл и культивировали матрасы при 37C в 5% CO2 (нулевой день культивирования). На четвертый день от начала культивирования 14 мл культуральной среды из каждой группы и 186 мл 0,5% GT-T503 переносили в пустой газопроницаемый культуральный мешок (200 см 2,производство TAKARA BIO, INC., серийный код КВ 210) и затем добавляли IL-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. Продолжали культивирование и на восьмой день 100 мл клеточной культуральной- 24016168 среды каждой группы удаляли из культурального мешка, оставшиеся в мешке 100 мл клеточной культуральной среды разводили в 2 раза 0,5% GT-T503, чтобы довести объем до 200 мл клеточного разведения в мешке. Далее к каждой группе добавляли IL-2 до конечной концентрации 500 ед/мл. На одиннадцатый день культивирования добавляли 200 мл среды GT-T503, содержащей 0,2% HSA, чтобы развести в 2 раза клеточную культуральную среду каждой группы. Далее к каждой группе добавляли IL-2 до получения конечной концентрации 500 ед/мл. На четырнадцатый день культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью метода окраски трипановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты кратности увеличения показаны в табл. 19. Таблица 19 Как показано в табл. 19, даже в том случае, когда клетки культивировали в газопроницаемом культуральном мешке, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизацией CH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции (обозначаемой далее как CH-296 группа), кратность увеличения T-клеточной популяции была выше по сравнению с контрольной группой.(3) Анализ CD45RA+CCR7+ T-клеток, CD45RA+CD62L+ T-клеток, CD45RA+CD27+ T-клеток,CD45RA+CD28+ T-клеток, CD27+CD28+ T-клеток и CD45RA+CCR7+ CD62L+ T-клеток в T-клеточной популяции, культивируемой в газопроницаемом культуральном мешке. Клетки, полученные в разделе (2) примера 6, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими,как указано далее. Подробно, окрашивание проводили с FITC-меченным мышиным IgG1/RD1-меченным мышинымCD45RA антителом/FITC-меченным мышиным античеловеческим CD28-антителом (производство eBioscience),RD1-меченным мышиным античеловеческим CD45RA-антителом/PC5-меченным мышиным античеловеческим CD27-антителом (производство Beckmann-Coulter) и RD1-меченным мышиным античеловеческим CD45RA-антителом/FITC-меченным мышиным античеловеческим CCR7-антителом/PC5-меченным мышиным античеловеческим CD62L-антителом. Данные окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре и подсчитывали процентное количество CD45RA+CCR7+ T-клеток, CD45RA+CD62L+ Tклеток, CD45RA+CD27+ T-клеток, CD45RA+CD28+ T-клеток, CD27+CD28+ T-клеток и Как видно из табл. 20, в группе CH-296 обнаружены более высокие уровни любого из маркеров клеточной поверхности по сравнению с контрольной группой. Известно, что CD27 и CD28 имеют высокий процент экспрессии в недифференцированных клетках, таких как интактные T-клетки. Следовательно, в анализе с указанными маркерами ясно показано, что процентное содержание интактных Tподобных клеток увеличивается в T-клеточной популяции при действии CH-296 на ранней стадии культуры.(4) Аллогенная MLR. Аллогенную MLR проводили с использованием клеток, полученных в разделе (2) примера 6. Подробно, PBMC, полученные аналогичным образом, как в разделе (1) примера 1, выделенные от аллогенного донора ("чужой" донор: донор является другим, чем донор, который был в разделе (2) примера 6), облучали рентгеновским облучением (0,88 Кл/кг) и суспендировали клетки с 5HRPMI, чтобы получить плотность 2106 клеток/мл (стимулирующие клетки). С другой стороны, культивированные клетки, полученные в разделе (2) примера 6, суспендировали в 5HRPMI, чтобы получить плотность 2106 кле- 25016168 ток/мл (отвечающие клетки). Полученные стимулирующие клетки и отвечающие клетки добавляли в 24 луночный культуральный планшет в объеме 0,5 мл/лунка. В каждую лунку добавляли IL-2 до конечной концентрации 500 ед/мл и затем клетки на планшете культивировали в инкубаторе 5% CO2 при 37C. На третий день культивирования в каждую лунку добавляли 1 мл 5HRPMI, содержащей 1000 ед/мл IL-2. На пятый день культивирования удаляли половину объема супернатанта и в каждую лунку добавляли 1 мл 5HRPMI, содержащей 1000 ед/мл IL-2. Дополнительно, на седьмой день клетки в каждой лунке суспендировали, суспензию распределяли поровну в две лунки, по половине объема в каждую, в каждую лунку добавляли 1 мл 5HRPMI, содержащей 1000 ед/мл IL-2, и продолжали культивирование до десятого дня.(5) Определение кратности размножения. В отношении клеток, полученных в разделе (4) примера 6, на седьмой и на десятый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью окраски трепановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 21. Таблица 21 Как видно из табл. 21, в случае, когда аллогенную MLR проводили с использованием группы CH296, кратность размножения была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, ясно показано, что когда аллогенную MLR проводили с использованием культивируемых клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным CH-296 на ранней стадии размножения(6) Анализ цитотоксической активности. Цитотоксическую активность клеток, полученных в разделе (4) примера 6, оценивали на десятый день культуры, аналогичным образом, как в разделе (7) примера 5. В качестве кальцеин меченных клеток-мишеней использовали при определении собственные PBMC или не собственные PBMC, которые подвергали бластогенезу с фитогемагглютинином (далее обозначаемым как PHA) в течение 10 дней. При исследовании цитотоксической активности смешивали 30-кратное количество клеток К 562 с кальцеин меченными клетками-мишенями. Результаты анализа цитотоксической активности показаны в табл. 22. Таблица 22 Как видно из табл. 22, в случае, когда аллогенную MLR проводили с использованием группы CH296, аллоантиген-специфическая цитотоксическая активность, исходя из реакции, была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, для культивированных клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным CH-296 на ранней стадии размножения Tклеточной популяции, ясно показано, что может быть получена клеточная популяция, имеющая более сильную аллоантиген-специфическую цитотоксическую активность в аллогенной MLR.(7) Хранение культивированных клеток. Клетки, полученные на четырнадцатый день культивирования в разделе (2) примера 6, хранили вCTL, специфических к опухолеассоциированному антигену (MART-1), проводили аналогичным образом,как в разделе (5) примера 5, и продолжали культивирование в течение тринадцати дней, при этом проводили модификации, как изложено далее. Особенности заключались в том, что культивированные клетки,полученные в разделе (7) примера 6, суспендировали в 5HRPMI так, чтобы получить плотность 1106 клеток/мл; на второй день культивирования в каждую лунку добавляли 1 мл 5HRPMI, содержащей 60 ед/мл IL-2, на шестой день культивирования отвечающие клетки суспендировали в 5HRPMI так, чтобы получить плотность от 0,3 до 1,3106 клеток/мл, и антигенпрезентирующие клетки суспендировали в нем так, чтобы получить плотность 1,6106 клеток/мл; на седьмой день культивирования в каждую лунку добавляли 1 мл 5HRPMI, содержащий 60 ед/мл IL-2, на десятый день культивирования суспендировали клетки в каждой лунке и разделяли на две лунки, по половине объема в каждую, и добавляли в каждую лунку 1 мл 5HRPMI, содержащий 60 ед/мл IL-2.(9) Анализ цитотоксической активности. На четырнадцатый день от начала индукции анализировали цитотоксическую активность CTL, полученных в разделе (8) примера 6, аналогичным образом, как в разделе (7) примера 5, за исключением того, что отношение E/T для 90 дней устанавливали вновь. Результаты анализа цитотоксической активности показаны в табл. 23. Таблица 23 Как видно из табл. 23, в популяции CTL, индуцированной из группы CH-296, специфическая цитотоксическая активность была выше по сравнению с контрольной группой и группой PBMC. Другими словами, ясно показано, что клетки, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным CH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию CTL, имеющую более сильную специфическую цитотоксическую активность. Пример 7. Индукция анти-MART-1 CTL из CD45RA+CCR7+CD8+ T-клеток и CD45RA-CCR7-CD8+T-клеток, полученных из развившихся клеток.(1) Выделение CD45RA+CCR7+CD8+ T-клеток и CD45RA-CCR7-CD8+ T-клеток. Клетки, полученные в разделе (1) примера (1) и в разделе (7) примера (6), окрашивали аналогичным образом, как в разделе (2) примера 2. Затем клетки отмывали 1% BSA/PBS и суспендировали в средеIMDM (производство Invitrogen). Клетки анализировали на высокоэффективном клеточном сортереMoFlo и изолировали фракцию CD45RA+CCR7+CD8+ и фракцию CD45RA-CCR7-CD8+ соответственно,получая при этом чистоту фракции от 92 до 99%.(2) Индукция CTL, специфических к опухолеассоциированному антигену (MART-1). Используя клетки, полученные в разделе (1) примера 7, проводили индукцию CTL, специфических к опухолеассоциированному антигену (MART-1), аналогичным образом, как в разделе (8) примера 6, и продолжали культивирование в течение тринадцати дней, при этом проводили модификации, как изложено далее. Особенности заключались в том, что в начале культивирования клетки, инициирующие культуру и антигенпрезентирующие клетки, добавляли в объеме 0,25 мл, каждый, в 48-луночный культуральный планшет (производство Becton Dickenson) и на второй день культивирования 0,5 мл в каждую лунку добавляли 1 мл 5HRPMI, содержащей 60 ед/мл IL-2, на четвертый день культивирования удаляли половину объема супернатанта и в каждую лунку добавляли 0,5 мл 5HRPMI, содержащего 60 ед/мл IL-2.(3) Определение кратности размножения. В отношении клеток, полученных в разделе (2) примера 7, на тринадцатый день от начала культивирования подсчитывали число живых клеток с помощью окраски трепановым синим и рассчитывали кратность размножения путем сравнения количества подсчитанных клеток с их количеством в начале культивирования. Результаты представлены в табл. 24.CD45RA+CCR7+CD8+ T-клеток, изолированных из культивированных клеток, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизацией CH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции (обозначаемой далее как CH-296 группа), кратность увеличения CTL популяции была выше по сравнению с контрольной группой. Другими словами, ясно показано, что CTL популяцию получили в большем количестве путем индукции CTL из CD45RA+CCR7+ T-клеток, содержащихся с высоким процентом в культивированных клетках, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным CH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции.(4) Анализ цитотоксической активности. На тринадцатый день от начала индукции анализировали цитотоксическую активность CTL, полученных в разделе (2) примера 7, аналогичным образом, как в разделе (7) примера 5. Результаты анализа цитотоксической активности показаны в табл. 25. Таблица 25CD45RA+CCR7+CD8+ T-клеток, изолированных из группы CH-296, специфическая цитотоксическая активность популяции CTL была выше по сравнению с контрольной группой и группой PBMC. Далее, специфическая цитотоксическая активность была выше, чем активность в популяции CTL, индуцированной с использованием CD45RA-CCR7-CD8+ T-клеток. Другими словами, ясно показано, чтоCD45RA+CCR7+CD8+ T-клетки, которые содержатся с высоким процентом в культивированных клетках,для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным CH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию CTL, специфическая цитотоксическая активность которой была выше. Пример 8. Измерение антигенраспознающей способности CTL.(2) Измерение антигенраспознающей способности. Антигенраспознающую способность CTL, полученных в разделе (1) примера 8, определяли на четырнадцатый день после инициации индукции с помощью частичной модификации способа Valmori D. etal., J. Immunol., 160 1750-1758 (1998). Другими словами, клетки T2 суспендировали в среде RPMI 1640,содержащей 5% FBS, для получения плотности 1106 клеток/мл, затем добавляли кальцеин-AM до конечной концентрации 25 мкг и культивировали клетки при 37C в течение 1 ч. Инкубированные клетки отмывали средой без кальцеина-AM и доводили плотность до 2105 клеток/мл. Кальцеин меченные клетки-мишени распределяли по 50 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования клеток. В каждую лунку, в которой находились данные клетки, помещали 5HRPMI, содержащий от 0 до 20 мкМ антигенного пептида (эпитоп пептида, полученного из меланомного антигена MART-1) в объеме 50- 28016168 мкл/лунка. Планшет инкубировали в инкубаторе с 5% CO2 при 37C в течение 1 ч. После инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл суспензии, содержащей 30-кратное количество клеток К 562 (доведенную до плотности 6106 клеток/мл).CTL, полученные в разделе (1) примера 8, разводили 5HRPMI, так чтобы получить плотность 6106 клеток/мл в качестве эффекторных клеток, и затем в каждую лунку планшета добавляли клетки в объеме 50 мкл/лунка. Планшет, в который помещали вышеупомянутую клеточную суспензию, центрифугировали при 400g в течение 1 мин, затем клетки инкубировали в инкубаторе с 5% CO2 при 37C в течение 4 ч. Затем собирали 100 мкл супернатанта культуры из каждой лунки и определяли количество кальцеина,высвобожденного в культуральный супернатант с помощью флуоресцентного планшетного ридера(спектрофлуориметра) (485 нм/535 нм). Рассчитывали специфическую цитотоксическую активность (%) по формуле (2). Результаты измерения антигенраспознающей способности представлены в табл. 26. Антигенраспознающую способность выражали как относительную величину цитотоксической активности для каждой концентрации добавленного пептида, где цитотоксическую активность принимали равной 100 при концентрации пептида, добавленного к клеткам-мишеням, равной 10 мкМ. Таблица 26 Как показано в табл. 26, в CTL популяции, индуцированной из группы CH-296, уничтожались даже клетки-мишени с антигеном, добавленным в более низкой концентрации, по сравнению с контрольной группой и группой PBMC, так что специфическая антигенраспознающая способность популяции CTL была высокой. Другими словами, ясно показано, что культивированные клетки, для которых использовали культуральное оборудование с иммобилизованным CH-296 на ранней стадии размножения Tклеточной популяции, могут быть индуцированы в популяцию CTL, имеющую более высокую специфическую цитотоксическую активность. Пример 9. Анализ жизнеспособности клеточной популяции, полученной при размножении Tклеточной популяции с использованием CH-296.(1) Размножение T-клеточной популяции. Процедуры проводили аналогичным образом, как в разделе (1) примера 3, за исключением того, что для иммобилизации античеловеческого CD3-антитела и фрагмента CH-296 использовали ацетатный буфер, и на четвертый день культивирования культуральную среду разводили примерно в 14 раз и 6,3 мл разведения помещали на чистый 25-см 2 культуральный матрас, и на восьмой день культивирования культуральную среду разводили примерно в 2 раза и 6,3 мл разведения помещали на чистый 25-см 2 культуральный матрас. Результаты представлены в табл. 27. Таблица 27 Как показано в табл. 27, в группе, где использовали культуральное оборудование с иммобилизованным фрагментом CH-296 на ранней стадии размножения T-клеточной популяции (обозначаемой далее как CH-296 группа), получали более высокую кратность увеличения T-клеточной популяции по сравнению с контрольной группой.(2) Анализ CD45RA+CCR7+ T-клеток и CD45RA+CD62L+ T-клеток. Клетки, полученные в разделе (1) примера 9, окрашивали с каждым антителом и анализировали аналогичным образом, как в разделе (4) примера 1, при условии, что комбинации антител были такими,- 29

МПК / Метки

МПК: C12N 5/10, A61P 31/12, A61P 31/04, A61P 1/16, A61K 35/14, A61P 31/10, A61P 31/16, A61P 37/04, A61P 35/00

Метки: применение, т-клеточной, способ, популяции, получения

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-16168-sposob-polucheniya-t-kletochnojj-populyacii-i-ee-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ получения т-клеточной популяции и ее применение</a>

Похожие патенты