Гуманизированное антитело к c-kit и его применение

Номер патента: 15923

Опубликовано: 30.12.2011

Авторы: Нг Гордон, Шен Вениан

Есть еще 22 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Агент, который специфично связывает фактор стволовых клеток (c-Kit), содержащий последовательность аминокислот гуманизированной легкой каппа-цепи, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2.

2. Агент по п.1, содержащий последовательность аминокислот, на 95% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2.

3. Агент по п.1, содержащий последовательность аминокислот, на 98% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2.

4. Агент по п.1, который дополнительно содержит последовательность аминокислот гуманизированной агликозированной тяжелой цепи LgG1 SEQ ID NO: 4.

5. Агент по п.1, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты в участке, определяющем комплементарность, причем аффинность его связывания c-Kit сохраняется.

6. Агент по п.5, отличающийся тем, что содержит одну консервативную замену аминокислоты.

7. Агент, который специфично связывает c-Kit и который содержит последовательность аминокислот гуманизированной агликозированной тяжелой цепи LgG1, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 4.

8. Агент по п.7, содержащий 25 последовательность аминокислот, на 95% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 4.

9. Агент по п.7, содержащий последовательность аминокислот, на 98% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO:4.

10. Агент по п.7, который дополнительно содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.

11. Агент по п.7, отличающийся тем, что он содержит по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты в участке, определяющем комплементарность, причем аффинность его связывания c-Kit сохраняется.

12. Агент по п.11, отличающийся тем, что содержит одну консервативную замену аминокислоты.

13. Агент, который специфично связывает c-Kit, содержащий последовательность аминокислот гуманизированной агликозированной тяжелой цепи LgG2, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 6.

14. Агент по п.13, содержащий последовательность аминокислот, на 95% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 6.

15. Агент по п.13, содержащий последовательность аминокислот, на 98% или более идентичную последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 6.

16. Агент по п.13, который дополнительно содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2.

17. Агент по п.13, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты в участке, определяющем комплементарность, причем аффинность его связывания c-Kit сохраняется.

18. Агент по п.17, отличающийся тем, что содержит одну консервативную замену аминокислоты.

19. Агент по любому из пп.1-18, который проявляет авидность к c-Kit с kd меньше чем 10-2 при определении способом поверхностного плазмонного резонанса.

20. Нуклеиновая кислота, кодирующая специфически связывающий агент по любому из пп.1-19, при этом указанный агент содержит последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности аминокислот, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 4 или 6.

21. Нуклеиновая кислота, кодирующая специфически связывающий агент по любому из пп.1-19, которая содержит последовательность нуклеиновых кислот, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности нуклеиновых кислот, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 3 или 5.

22. Вектор, который содержит нуклеиновую кислоту по любому пп.20, 21.

23. Клетка-хозяин, которая содержит вектор по п.22.

24. Способ получения агента, который специфично связывает c-Kit-, включающий культивирование клетки-хозяина по п.23 таким образом, что происходит экспрессия указанной нуклеиновой кислоты с образованием указанного специфически связывающего агента.

25. Способ по п.24, дополнительно включающий этап выделения указанного специфично связывающего агента из культуры клеток-хозяев.

26. Способ уменьшения или лечения фиброза, воспаления, аутоиммунной реакции или рака, связанных с c-Kit заболеваний или расстройств у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего агента по любому из пп.1-19.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанное расстройство или заболевание представляет собой фиброзное расстройство.

28. Способ по п.26, отличающийся тем, что связывающий агент выбран из группы, состоящей из антитела человека, гуманизированного антитела, одноцепочечного антитела, или фрагмента антитела.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что связывающий агент содержит Fc домен.

30. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанное фиброзное расстройство выбрано из группы, состоящей из склеродермии, интерстициального заболевания легкого, идиопатическего фиброза легкого, фиброза, обусловленного хроническим гепатитом B или C, индуцированного радиацией фиброза и фиброза, обусловленного заживлением раны.

31. Способ по п.30, дополнительно включающий введение второго антагониста профиброзного цитокина, при этом указанный цитокин выбран из трансформирующего фактора роста b (TGF-b), интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-5 (IL-5), интерлейкина-9 (IL-9), интерлейкина-13 (IL-13), гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), фактора некроза опухолей альфа 20 (ФНО-α), интерлейкина-1 b (IL-1G), фактора роста соединительной ткани (ФРСТ), интерлейкина-6 (IL-6), онкостатина M (OSM), фактора роста тромбоцитов (ТРФ), моноцитарного хемотаксического протеина 1 (CCL2/MCP-1) и хемокина, регулируемого легкими и активацией (CCL18/PARC).

32. Фармацевтическая композиция для уменьшения или предотвращения фиброза у субъекта, страдающего от фиброзного расстройства, включающая терапевтически эффективное количество связывающего агента по п.1.

Текст

Смотреть все

Дата публикации и выдачи патента Номер заявки Настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения связанных с c-Kit расстройств, таких как фиброз, в частности к композициям, которые содержат гуманизированные антитела к c-Kit. 015923 Область техники Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США,серийный номер 60/794,771, поданной 24 апреля, 2006 г., которая тем самым включена в настоящее описание посредством ссылки. Настоящее изобретение относится к композициям для лечения связанных с c-Kit воспалительных,фиброзных, аутоиммунных и раковых заболеваний и к композициям, содержащим гуманизированные антитела к c-Kit. Уровень техники Было показано, что тучные клетки вовлечены в опосредование воспалительных состояний, таких как астма, ревматоидный артрит и воспалительное заболевание кишечника, и их роль в аллергическом воспалении широко известна. Число тучных клеток повышено в эксплантатах легких пациентов, тяжелобольных астмой, и они являются основным источником клинически значимых воспалительных медиаторов, таких как лейкотриены, гистамин и Th2-цитокины. Тучные клетки являются основным источником ФНО (фактор некроза опухолей), ранее образовавшегося в подверженных болезни тканях. Фактор стволовых клеток (SCF) представляет собой гликопротеин, который передает сигналы через ассоциированный с клеткой и мембраной рецептор с тирозин-киназной активностью, далее именуемый cKit, и этот путь передачи сигналов играет ключевую роль при гемопоэзе, действуя как положительный и отрицательный регулятор, часто синергично с другими цитокинами. Растворимый отделившийся от клетки c-Kit рецептор может играть роль в регуляции SCF. c-Kit экспрессируется на плюрипотентных гематопоэтических стволовых клетках, которые являются предшественниками зрелых клеток, принадлежащих лимфоидной и эритроидной линиям. В отличие от других гематопоэтических клеток, предшественники тучных клеток и зрелые тучные клетки сохраняют высокие уровни экспрессии c-Kit. Следовательно, передача сигналов SCF через c-Kit жизненно важна для развития, функционирования, транспорта и выживаемости тучных клеток. Он также играет роль в гаметогенезе и меланогенезе. Мыши с инактивирующими c-Kit мутациями в W локусе фактически не имеют тучных клеток. Активирующие c-Kit мутации у людей связаны с мастоцитозом.c-Kit-положительные плюрипотентные гематопоэтические стволовые клетки являются предшественниками множества типов клеток, включая мезенхимальные клетки, фибробласты и тучные клетки. Фиброзное заболевание характеризуется отчасти избыточной активностью и пролиферацией фибробластов, что приводит к отложению внеклеточного матрикса. Было обнаружено, что c-Kit положительные плюрипотентные гематопоэтические стволовые клетки костного мозга являются источником фибробластов и тучных клеток в фиброзных тканях. Тучные клетки могут обеспечить постоянный источник воспалительных, ангиогенных, митогенных и фиброгенных медиаторов. Тучные клетки функционально и структурно связаны с фибробластами и играют непосредственную роль в активации фибробластов. Тучные клетки увеличивают кинетику и масштаб опосредованного фибробластами сокращения коллагена, отложения внеклеточного матрикса и могут превращать фибробласты в миофибробласты. Фибробласты, в свою очередь, секретируют SCF, что приводит к еще большей активировации и увеличению количества тучных клеток, и оба типа клеток являются компонентами фиброгенной сети. Количество тучных клеток и медиаторов тучных клеток значительно повышено при большинстве фиброзных заболеваний человека, включая идиопатический фиброз легких (ИФЛ) и склеродермию. Отличительные фенотипы в отношении тучных клеток обнаруживаются у некоторых пациентов со склеродермией и в Tsk модели склеродермии на мышах. Агрессивная системная форма мастоцитоза может быть охарактеризована миелофиброзом, что указывает на то, что тучные клетки могут быть эффекторными клетками при фиброзе. Гливек (Gleevec) и другие препараты данного класса, подобные Сутенту (Sutent), представляют собой имеющие множество мишеней ингибиторы рецептора с тирозин-киназной активностью, которые могут воздействовать на сигнальную активность c-Kit, но также ингибируют ряд других киназ. Эти ингибиторы киназ предназначены для онкологических заболеваний. Сообщали, что применение Гливека вызывает миелосупрессию, анемию и ряд побочных эффектов, включая кардиотоксичность и периферические отеки. Таким образом, указанные молекулы не обладают наилучшим соотношением польза/риск при длительном лечении заболеваний, связанных с передачей сигналов c-Kit. Следовательно,существует необходимость в создании новых способов лечения и реагентов, особенно таких, которые являются более действенными и селективными и имеют лучшие показатели безопасности в отношении лечения связанных с c-Kit воспалительных и фиброзных заболеваний. Такие соединения могут также проявлять значительно лучшие показатели эффективности и безопасности при онкологических заболеваниях, таких как лейкоз миелоидного происхождения, заболеваниях, связанных с мутациями c-Kit, таких как стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST) и мастоцитоз, заболеваниях, связанных с чрезмерной экспрессией c-Kit и/или избыточной аутокринной активностью SCF, как при меланоме и различных мелкоклеточных раках легкого (SCLC). На данный момент отсутствуют способы лечения и реагенты, нацеленные на c-Kit человека и обладающие терапевтической пользой в отсутствие значительных неблагоприятных эффектов.-1 015923 Краткое описание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает агенты, которые являются антагонистами и нейтральными антагонистами SCF, которые действуют на ассоциированные с клеткой и мембранные c-Kit рецепторы,такие как моноклональные антитела. В более конкретных вариантах реализации предусмотрены гуманизированные (не мышиные) моноклональные антитела, которые связывают c-Kit. В еще более конкретных вариантах реализации указанные гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению содержат последовательность аминокислот, выбранную из тех, которые представлены последовательностямиSEQ ID NO 2, 4 и 6. Настоящее изобретение также обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие любые из вышеуказанных антител или специфически связывающих агентов. В связанном варианте реализации настоящего изобретения предусмотрен вектор, который содержит любую из вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот. В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяин, которая содержит любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот или векторов. В одном варианте реализации c-Kit-связывающие агенты и нейтральные антагонисты могут содержать последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В другом варианте реализации любой из вышеуказанных агентов содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентична одной или более последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В таких вариантах реализации указанное отличие последовательности от SEQ ID NO: 2, 4 или 6, соответственно,может представлять собой, например, консервативную замену в соответствующей каркасной области IgG с применеием альтернативной аминокислоты человека в этом положении. В примерах вариантов реализации указанное антитело или специфически связывающий агент, который связывает c-Kit, содержит последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 2, 4 или 6. Тем не менее, предусмотрено, что антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой смесь изотипов антител IgG (например, смесь подтипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Любое из вышеуказанных антител может быть, например, нативным или мутированным IgG антителом (например, подтипа IgG1 или IgG3, или любого другого подтипа IgG). Вышеуказанные антитела могут проявлять авидность, характеризуемую kd менее чем 110-2, или менее чем 110-3, или 110-4, 1 10-5, 110-6, 110-7, 110-8 или 110-9, при определении посредством поверхностного плазмонного резонанса (анализ BIAcore). Вышеуказанные антитела могут иметь значение IC50, соответствующее нейтральным антагонистам менее чем 110-2, или менее чем 110-3, или 1 10-4, 110-5, 110-6, 110-7, 110-8 или 110-9, при определении посредством анализа в клеточной системе. В определенном варианте реализации аффинность и функциональная эффективность указанного гуманизированного антитела по меньшей мере сравнима с аффинностью и антитела мыши, из которого оно получено. В предпочтительном варианте реализации указанное гуманизированное антитело не является агонистом c-Kit рецептора и не активирует тучные клетки, что могло бы привести к анафилактическим реакциям, и должно проявлять фармакодинамику/фармакокинетику (ФД/ФК) и профиль иммуногенности, которые, по меньшей мере, сравнимы с таковыми для родительского антитела мыши. Настоящее изобретение охватывает множество способов. Например, предусмотрен способ получения вышеуказанного антитела или специфически связывающего агента, включающий культивирование вышеуказанной клеки-хозяина таким образом, что происходит экспрессия указанной нуклеиновой кислоты с образованием антитела или агента. Такие способы могут также включать этап получения указанного антитела или агента из культуры клеток-хозяев. В родственном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает очищенное антитело или агент, полученные вышеуказанным способом. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способы применения любого из вышеупомянутого антитела или специфически связывающего агента, например, для лечения или предотвращения связанного с c-Kit расстройства путем введения эффективного количества указанного антитела или агента. Одним примером подобного расстройства, которое лечат, является фиброзное заболевание. Краткое описание чертежей Фиг. 1: SR-1 ингибирует тучные клетки в модели активизации ранением. Фиг. 2: Количество тучных клеток в модели заживления ран. Фиг. 3: Гуманизированные изоформы SR-1 ингибируют индуцированную фактором стволовых клеток (SCF) активацию c-Kit и последующее фосфорилирование посредством c-Kit. Подробное описание изобретения Антитело мыши против c-Kit человека SR-1 описано в патенте США номер 5,919,911, и патенте США номер 5,489,516, каждый из которых включен в данную заявку посредством ссылки. SR-1 проявило подходящие свойства в отношении связывания с c-Kit и блокировало SCF-опосредованную передачу сигналов через рецептор, тем не менее, эта молекула не проявляла все свойства, которые были бы желательны при терапии человека, помимо существования очевидной проблемы иммуногенности. Broudy сообщил, что SR-1 в некоторой степени проявляло сходную с агонистическойактивность, которая могла привести к интернализации и фосфорилированию рецептора. J Cell Physiol., март 1994;158(3):545-54.-2 015923 Такие функциональные активности делали указанную молекулу менее эффективной и менее безопасной. Несмотря на то, что гуманизация моноклональных антител является хорошо известной методикой и то,что биологические молекулы, обладающие активностью, как правило, подразумевают надлежащую трансляцию, конформация указанного гуманизированного SR-1 антитела, зависящая от каркасной части антитела человека, может служить причиной различных присущих активностей, проявляемых в отношении c-Kit и, следовательно, биологических функций. В этом частном примере следовало бы добиваться необходимых фармакологических, а не нежелательных "агонистических" свойств, но методика для достижения этого результата еще не была опубликована. Участки, определяющие комплементарность SR-1 антитела, вставили в уникальную комбинацию тяжелых и легких цепей, различающихся по структуреIgG1 и IgG2, и IgG4 человека, при удивительном сохранении сходной аффинности в отношении c-Kit. Тем не менее, как оказалось, каждая из указанных каркасных областей имела свои недостатки. Было показано, что гуманизированное антитело SR-1 на основе IgG2 имело высокую аффинность кc-Kit, но в клетках многих типов было неспособно полностью блокировать SCF-опосредованную интернализацию рецептора, и в тестах с культивируемыми тучными клетками приводило к фосфорилированию c-Kit, сигналу выживаемости, и опосредовало необычную агрегацию указанных клеток. Указанные свойства теоретически нежелательны, так как целью терапевтической стратегии является обеднение популяции тучных клеток и предшественников за счет апоптоза путем блокировки сигнала выживаемостиSCF и избежать активации тучных клеток, которая может привести к анафилактическим реакциям inIgG1 человека, аффинность и функциональная эффективность также оставались неизменными, но эта основа является менее желательной вследствие активации комплемента и клеточно-опосредованной цитотоксичности, часто обнаруживаемых при применении этого изотипа антител. Когда CDR области SR-1 мыши вставляли в каркас IgG4 человека, аффинность и функциональная эффективность также сохранялись, но неожиданно эта молекула проявила значительную аггрегацию при очистке и наработке. Соответственно, авторы настоящего изобретения искали способы преодолеть недостатки каждой из этих молекул путем создания антитела, которое не активирует комплемент и не активирует c-Kit и тучные клетки, при этом сохраняя необходимые аффинность, эффективность нейтрального антагониста в отношении мембранного c-Kit рецептора, но не растворимого c-Kit рецептора. Такое антитело должно также проявлять надлежащие ФД/ФК и должно эффективно обеднять популяцию тучных клеток и не проявлять признаков агонизма тучных клеток in vivo. Легкая каппа цепь гуманизированного SR-1SEQ ID NO: 1 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую каппа цепь гуманизированного SR-1.SEQ ID NO: 2 представлена ниже, где жирным шрифтом отмечены CDR (например, CDR1 представляет собой аминокислоты с 43 по 58 последовательности SEQ ID NO: 2, CDR2 представляет собой аминокислоты с 74 по 80 последовательности SEQ ID NO: 2 и CDR3 представляет собой аминокислоты с 113 по 121 последовательности SEQ ID NO: 2): Зрелая гуманизированная легкая каппа цепь представляет собой аминокислоты с 20 по 248 последовательности SEQ ID NO: 2.SEQ ID NO: 3 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую не содержащую сахаров тяжелую цепь IgG1 гуманизированного SR-1CDR обозначены жирным шрифтом (например, CDR1 представляет собой аминокислоты с 50 по 54 последовательности SEQ ID NO: 4, CDR2 представляет собой аминокислоты с 69 по 85 последовательности SEQ ID NO: 4, и CDR 3 представляет собой аминокислоты с 118 по 125 последовательности SEQ IDSEQ ID NO: 5 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь IgG2 гуманизированного SR-1 Далее представлена полноразмерная последовательность аминокислот тяжелой цепи IgG2 SR-1, иSEQ ID NO: 7 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь SR-1 MULCSEQ ID NO:9 представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь IgG2a мыши SR-1(аминокислоты с 74 по 80 последовательности SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи SR-1 имеет последовательность QQNNEDPYT (аминокислоты с 111 по 121 последовательности SEQ ID NO: 8). CDR1 тяжелой цепи имеет последовательность SYNMH (аминокислоты с 50 по 54 последовательности SEQ ID NO: 10), CDR2 имеет последовательность VIYSGNGDTSYNQKFKG (аминокислоты с 69 по 85 последова-5 015923 тельности SEQ ID NO: 10), CDR3 имеет последовательность RDTRFGN, (аминокислоты с 118 по 125 последовательности SEQ ID NO: 10). Очевидно, что каждая из тяжелых и легких цепей, описанных в настоящей заявке, процессируется в клетке до зрелой формы. Соответственно, сигнальные пептиды отщепляются и, в случае тяжелых цепей антител, отщепляется C-концевой лизин. Соответственно, зрелая форма процессируется протеолитически и также проходит другие посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование в случае экспрессии в клетках млекопитающего. Сигнальный пептид для каждой тяжелой и легкой цепи представляет собой аминокислоты с 1 по 20 последовательностей SEQ ID NO: 2 и 10 и аминокислоты с 1 по 19 последовательностей SEQ ID NO: 4, 6 и 10. Последовательности нуклеотидов и аминокислот легкой цепи SR-1 мыши приведены в SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8. Последовательности нуклеотидов и аминокислот тяжелой цепи SR-1 мыши приведены в SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. Варианты с дополнительными заменами (например, консервативными заменами аминокислот мыши) также могут сохранять высокую аффинность связывания. Замены, делеции или вставки в положениях внутри CDR и каркаса можно производить, не оказывая влияния на аффинность. В одном варианте реализации указанное гуманизированное антитело содержит легкую цепь, в которой сохранены исходные CDR мыши из антитела SR-1 мыши, например аминокислоты в положениях приблизительно 44-58, приблизительно 74-80 и приблизительно 113-121 последовательности SEQ ID NO: 8. В других вариантах реализации указанное гуманизированное антитело содержит тяжелую цепь, в которой сохранены CDR мыши из антитела SR-1 мыши, например аминокислоты в положениях приблизительно 50-54, приблизительно 68-85 и приблизительно 118-125 последовательности SEQ ID NO:10, и имеет полученную из антител человека каркасную область. При использовании в данной заявке подразумевается, что термин "приблизительно" предусматривает изменения в положениях от двух до пяти аминокислот, при условии, что аффинность к c-Kit сохраняется. В одном варианте реализации такие агенты могут содержать последовательность аминокислот, соответствующую SEQ ID NO: 2, 4, или 6. В другом варианте реализации любой из вышеуказанных агентов содержит последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более идентична последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 2, 4 или 6. В подобных вариантах реализации изменение последовательности относительно SEQ ID NO: 2, 4 или 6, соответственно, может представлять собой, например, консервативную замену в соответствующей каркасной области IgG с использованием альтернативной аминокислоты человека в этом положении. В одном варианте реализации вышеуказанные антитела проявляют авидность, которая характеризуется kd менее чем 10-2, или менее чем 10-3, или 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, при определении с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore-анализ). В другом варианте реализации вышеуказанные антитела проявляют активность нейтрального антагониста с IC50 менее чем 110-2, или менее чем 110-3,или 110-4, 110-5, 110-6, 110-7, 110-8, 110-9, при определении с применением клеток. Настоящее изобретение обеспечивает множество специфично связывающихся и нейтральных антагонистических агентов, включая, но не ограничиваясь перечисленными: антитела человека или гуманизированные специфичные антитела к c-Kit, которые получены из SR-1 мыши и сохраняют желаемые свойства, такие как kd (константа скорости диссоциации) по отношению к c-Kit в диапазоне 110-2 или менее,или находящаяся в диапазоне до 110-9 или менее (например, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или менее) и/или IC50 нейтрального антагониста c-Kit в диапазоне 110-2 или менее, или находящаяся в диапазоне до 110-9 или менее (например, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или менее) и/или способность уменьшать выраженность симптомов связанного с c-Kit расстройства. Настоящее изобретение также обеспечивает нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды специфически связывающих агентов, векторы и рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат такие нуклеиновые кислоты, способы получения таких специфически связывающих агентов, фармацевтические лекарственные формы, которые содержат такие специфически связывающие агенты, способы получения фармацевтических лекарственных форм и способы лечения пациентов фармацевтическими лекарственными формами и соединениями. Нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные модифицированные вариабельные области легкой цепи, конструируют и совместно экспрессируют с нуклеиновыми кислотами, кодирующими CDRпривитую или гуманизированную тяжелую цепь, или наоборот, и возможно соединять с константными областями. Любую гуманизированную или химерную тяжелую цепь и легкие цепи можно объединить,при условии, что сохраняется подходящая аффинность связывания. Необходимые гены были введены в клетки млекопитающего и полученные рекомбинантные продукты иммуноглобулинов были экспрессированы, очищены и охарактеризованы. Термин "антитело" используют в его наиболее широком смысле и он включает полностью собранные антитела, моноклональные антитела (включая антитела человека, гуманизированные или химерные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), и фрагменты антител, которые могут связывать антиген (например, Fab', F'(ab)2, Fv, одноцепочечные(CDR), указанного выше, при условии, что они проявляют необходимую биологическую активность. Термин "антитело" в явной форме исключает антитело мыши (т.е. антитело, продуцированное мышиной гибридомой или имеющее ту же последовательность, что и антитело, продуцированное мышиной гибридомой) из объема данного термина. Термин "специфически связывающий агент" охватывает антитела согласно определению выше и рекомбинантные пептиды или другие соединения, которые содержат последовательности, полученные изCDR, имеющие необходимые антиген-связывающие свойства. Особенно включены в объем данного термина пептиды, которые содержат последовательности аминокислот, которые по меньшей мере на 80, 90 или 100% идентичны одной или более CDR области антитела SR-1 мыши, предпочтительно включающиеCDR3 тяжелой цепи. При использовании в данной заявке термин "нейтральный антагонист" означает специфически связывающий агент, который способен ингибировать агонистическую активность. Эти агенты включают антитела, как определено выше, и рекомбинантные пептиды или другие соединения, которые содержат последовательности, полученные из CDR, имеющие необходимые антиген-связывающие свойства. Особенно включены в объем данного термина пептиды, содержащие последовательности аминокислот, которые по меньшей мере на 80, 90 или 100% идентичны одной или более CDR области антитела SR-1 мыши, предпочтительно включающие CDR3 тяжелой цепи. Также включены в объем данного термина "пептидные антитела" -"peptibodies", которые представляют собой молекулы, содержащие Fc домен антитела в качестве "носителя", который присоединен к по меньшей мере одному антиген-связывающему пептиду. CDR области антител, происходящие из антителаSR-1, могут быть подходящими для введения в пептидное антитело, особенно включая CDR3 тяжелой цепи. Получение пептидных антител в общих чертах описано в публикации согласно PCT WO 00/24782,опубликованной 4 мая, 2000 г. Пептиды могут быть связаны тандемно (т.е., последовательно), в присутствии или в отсутствие линкеров. Пептиды, содержащие цистеиновый остаток, могут образовывать сшивку с другим Cys-содержащим пептидом, любой или каждый из которых может быть связан с носителем. Любой пептид, имеющий более чем один остаток Cys, также может образовать внутрипептидную дисульфидную связь. Любой из этих пептидов может быть модифицирован, например, карбоксильный конец может быть блокирован аминогруппой, могут быть блокированы цистеины, или остатки аминокислот могут быть замещены на молекулы, отличные от остатков аминокислот (см., например, Bhatnagar и др., J. Med. Chem. 39: 3814-9 (1996), и Cuthbertson и др., J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997), содержание которых полностью включено в данную заявку посредством ссылки). Последовательности пептидов могут быть оптимизированы, аналогично аффинному созреванию антител, или другим образом изменены аланин сканирующим или неспецифическим, или направленным мутагенезом, с последующим скринингом для определения пептидов, которые лучше всего связываются. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol.Struct. 26: 401-24 (1997). Различные молекулы можно вставлять в структуру специфически связывающего агента, например в саму пептидную часть или между частями пептида и носителя специфически связывающих агентов, при этом сохраняя необходимую активность специфически связывающего агента. Можно легко вставить,например, такие молекулы, как Fc домен или его фрагмент, полиэтиленгликоль или другие близкие молекулы, такие как декстран, жирная кислота, липид, холестериновая группа, небольшой карбогидрат,пептид, цитотоксический агент, химиотерапевтический агент, детектируемая молекула, как описано в данной заявке (включая флюоресцентные агенты, радиоактивные метки, такие как радиоактивные изотопы), олигосахарид, олигонуклеотид, полинуклеотид, интерферирующие (или другие) РНК, ферменты,гормоны, или тому подобные. Для специалиста в данной области очевидно, что существуют другие молекулы, подходящие для вставки таким путем, что также охвачено объемом настоящего изобретения. Сюда включена, например, вставка необходимой молекулы между двумя последовательными аминокислотами, возможно с соединением подходящим линкером."Выделенное" антитело представляет собой такое антитело, которое было идентифицировано и отделено от компонентов клетки, которая его экспрессирует. Контаминирующие компоненты клетки представляют собой материал, который будет препятствовать диагностическому или терапевтическому применению указанного антитела и может включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах реализации указанное антитело будет очищенным (1) до более чем 95 вес.% антитела и наиболее предпочтительно более чем 99 вес.%, (2) до степени,достаточной, чтобы получить по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней последовательности аминокислот, или (3) до однородности при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ/ДСН) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, при окраске Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное природное антитело включает антителоin situ внутри рекомбинантной клетки, после того, как по меньшей мере один компонент естественного окружения антитела будет отсутствовать. Обычно, тем не менее, очищенное антитело будет получено с применением по меньшей мере одного этапа очистки. Термин "моноклональное антитело", при использовании в данной заявке, относится к антителу, по-7 015923 лученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие указанную популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, направленными против отдельного антигенного сайта или эпитопа, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных эпитопов. В зависимости от последовательности аминокислот константного домена их тяжелых цепей, иммуноглобулины человека можно отнести к различным классам. Существует пять основных классов, IgA,IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы или изотипы, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, названы альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Субъединичные структуры и пространственные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Различные изотипы имеют различные эффекторные функции; напримерIgG1 и IgG3 изотипы имеют антителозависимую клеточно обусловленную цитотоксичность (ADCCактивность). Термин "гипервариабельный" участок относится к остаткам аминокислот антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область содержит остатки аминокислот из области,определяющей комплементарность, или CDR [т.е., остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 ое изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда; Мэриленд (1991)]. Даже единичная CDR область может узнать и связать антиген, хотя и с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания антигена, содержащий все имеющиеся CDR. Очевидно, что в области CDR антитела могут присутствовать дополнительные или отсутствовать последовательности за пределами конкретных ограничений, определяемых условием,что указанное антитело сохраняет свою способность связываться с целевой молекулой. Альтернативное определение остатков из гипервариабельной "петли" описано у Chothia и др., J.Mol.Biol. 196: 901-917 (1987), как остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи. Остатки "каркаса" или FR представляют собой остатки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельной области."Фрагменты антител" включают часть интактного полноразмерного антитела, предпочтительно антиген-связывающую или вариабельную область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты; димерные антитела; линейные антитела (Zapata и др., ProteinEng.,8(10):1057-1062 (1995; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Расщепление антитела папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых "Fab-фрагменты, каждый из которых содержит один антигенсвязывающий сайт, и остаточный "Fcфрагмент, который включает константную область. Fab-фрагмент содержит весь вариабельный домен,также, как и константный домен, легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fcфрагмент несет остатки сахаров и отвечает за многие эффекторные функции антитела (такие, как связывание комплемента и клеточных рецепторов), которые помогают отличать один класс антитела от другого. Обработка пепсином дает F(ab')2 фрагмент, который содержит два "одноцепочечных Fv" или "sFv" фрагмента антитела, включающих VH и VL домены антитела, при этом указанные домены представлены в виде одной полипептидной цепи. Fab-фрагменты отличаются от Fab' фрагментов присутствием нескольких дополнительных остатков в карбоксильном конце CH1 домена тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирного участка антитела. Предпочтительно Fv полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между VH И VL доменами, который позволяет Fv образовывать необходимую структуру для связывания антигена. Для обзора по sFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт узнавания и связывания антигена. Этот участок состоит из димера одной тяжелой и одной легкой цепи вариабельного домена, которые находятся в плотной нековалентной ассоциации. Он находится в такой конфигурации, что три области CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с формированием сайта связывания антигена на поверхности VH VL димера. Все вместе, шесть областей CDR придают антигенсвязывающую специфичность указанному антителу. Тем не менее, единичный вариабельный домен (или половина Fv, включающая только три CDR, специфичные к антигену) имеет способность узнавать и связывать антиген, хотя с более низкой аффинностью, чем целый сайт связывания. Термин "димеры антител" относится к малым фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, эти фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной полипептидной цепи (VH VL). С помощью линкера, который слишком короток, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на той же цепи, обеспечивают спари-8 015923 вание указанных доменов с комплементарными доменами другой цепи и создают два антигенсвязывающих сайта. Димеры антител описаны более подробно, например, в EP 404,097; WO 93/11161; и 30 Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Различные методики были разработаны для получения фрагментов антител. Как правило, эти фрагменты получали путем протеолитического расщепления интактных антител, но их также можно получить непосредственно из рекомбинантных клеток-хозяев. См., например, Better и др., Science 240: 10411043 (1988); Skerra и др. Science 240: 1038-1041 (1988); Carter и др., Bio/Technology 10:163-167 (1992). Как предусмотренно в данной заявке, в композициях и способах лечения воспалительных, аутоиммунных, онкологических и фиброзных расстройств можно применять один или более анти-c-Kit терапевтических агентов, которые применяют по отдельности или в комбинации с другим терапевтическим агентом, чтобы достичь необходимого эффекта. Примеры антифиброзных агентов, подходящих для применения в соответствии с настоящим изобретением, включают цитокины, причем указанный цитокин выбран из трансформирующего фактора роста(TGF-), интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-5 (IL-5),интерлейкина-9 (IL-9), интерлейкина-13(IL-13), гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), фактора некроза опухолей альфа (ФНО-), интерлейкина-1 бета (IL-1), фактора роста соединительной ткани (ФРСТ), интерлейкина-6 (IL-6), онкостатина M (OSM), фактора роста тромбоцитов (ТРФ), моноцитарного хемотаксического протеина 1 (CCL2/MCP-1) и хемокина, регулируемого легкими и активацией (CCL18/PARC). Антитела, полученные из антитела SR-1 согласно настоящему изобретению, предпочтительно получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК с применением одной из систем экспрессии антител, хорошо известных в данной области (см., например, Harlow и Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory (1988. Такие антитела также являются предпочтительно химерными рекомбинантными белками, имеющими полученные из иммуноглобулинов вариабельные последовательности и константные области антител человека, или более предпочтительно являются более похожими на моноклональные антитела человека (такие, как антитела человека или гуманизированные антитела),которые включают остатки антитела человека, но предпочтительно сохраняют, по меньшей мере, CDR области антитела SR-1 мыши. Кроме интактных, полноразмерных молекул, термин "антитело" также относится к их фрагментам или мультимерам, или агрегатам интактных молекул и/или фрагментов, которые связываются с c-Kit. Выражение "гуманизированное антитело" относится к антителу, полученному из антитела, не происходящего от человека, как правило, из моноклонального антитела мыши. В качестве альтернативы,гуманизированное антитело можно получить из химерного антитела, в котором сохранены или, по существу, сохранены антиген-связывающие свойства родительского, не происходящего от человека, антитела,но которое проявляет пониженную иммуногенность по сравнению с родительским антителом, когда оно введено в человека. Выражение "химерное/рекомбинантное антитело" при использовании в данной заявке относится к антителу, содержащему последовательность, полученную из двух различных антител (см.,например, патент США номер 4,816,567), которые, как правило, происходят из различных видов. В основном, химерные антитела содержат фрагменты антител человека и мыши, обычно константные области человека и вариабельные области мыши. Рекомбинантное получение антител Последовательность аминокислот интересующего иммуноглобулина можно определить путем непосредственного секвенирования белка, и подходящие кодирующие последовательности нуклеотидов можно разработать согласно универсальной таблице генетического кода. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующие указанные моноклональные антитела, можно выделить и секвенировать из гибридомных клеток с применением традиционных процедур (например, путем применения олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи указанных моноклональных антител). Определение последовательности, как правило, будет требовать выделения по меньшей мере части интересующего гена или кДНК. Обычно это требует клонирования ДНК или предпочтительно мРНК (т.е., кДНК), кодирующей указанные моноклональные антитела. Клонирование выполняют, применяя стандартные методики (см., например, Sambrook и др. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, тома 1-3, Cold Spring Harbor Press, которая включена в данную заявку посредством ссылки). Например, библиотеку кДНК можно сконструировать с помощью обратной транскрипции поли A + мРНК, предпочтительно ассоциированной с мембраной мРНК, и скрининга библиотеки с применением зондов, специфичных к последовательности генов полипептида иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте реализации, тем не менее, применяют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации кДНК (или части полноразмерных кДНК), кодирующих сегмент гена интересующего иммуноглобулина (например, вариабельный сегмент легкой цепи). Амплифицированные последовательности можно легко клонировать в любой подходящий вектор, например экспрессионные векторы, минигенные векторы, или векторы фагового дисплея. Должно быть очевидно, что конкретный применяемый способ клонирования не является критичным фактором, при условии, что возможно определить последовательность некоторой части полипептида интере-9 015923 сующего иммуноглобулина. При использовании в данной заявке "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты или "выделенная" последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая либо (1) идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике указанной нуклеиновой кислоты или (2) клонирована, амплифицирована, помечена, или другим образом отделена от фоновых нуклеиновых киелот, таким образом, что можно определить последовательность интересующей нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, которая находится в другой форме или окружении, чем те, в которых она находится в природе. Тем не менее, выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют указанное антитело, где, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты находится в положении на хромосоме, отличном от ее положения в природных клетках. Одним из источников РНК, используемых при клонировании и секвенировании, является гибридома, полученная посредством получения B-клеток из трансгенной мыши и слияния B-клетки с бессмертной клеткой. Преимуществом применения гибридом является то, что их можно легко подвергнуть скринингу и отобрать гибридомы, которые продуцируют интересующее моноклональное антитело человека. В качестве альтернативы, РНК можно выделить из B-клеток (или целой селезенки) иммунизированного животного. При применении источников, отличных от гибридомы, может быть желательным провести скрининг на последовательности, кодирующие иммуноглобулины или полипептиды иммуноглобулинов,обладающие свойствами специфичного связывания. Одним из способов подобного скрининга является применение технологии фагового дисплея. Фаговый дисплей описан, например, в Dower и др., WO 91/17271, McCafferty и др., WO 92/01047, и Caton и Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454(1990), содержание каждой из которых включено в данную заявку посредством ссылки. В одном варианте реализации, применяя технологию фагового дисплея, выделяют кДНК из иммунизированной трансгенной мыши (например, тотальную кДНК селезенки), применяют полимеразную цепную реакцию для амплификации последовательностей кДНК, которые кодируют часть полипептида иммуноглобулина,например CDR области, и амплифицированные последовательности вставляют в фаговый вектор. кДНК,кодирующие интересующие пептиды, например, пептиды вариабельных областей с необходимыми свойствами связывания, определяют с помощью стандартных методик, таких как пеннинг. Затем определяют последовательность амплифицированной или клонированой нуклеиновой кислоты. Как правило, определяют последовательность, кодирующую всю вариабельную область полипептида иммуноглобулина, тем не менее, иногда может быть более разумным секвенировать только часть вариабельной области, например CDR-кодирующую часть. Обычно секвенированая часть будет иметь длину по меньшей мере 30 оснований, чаще будут секвенированы основания, кодирующие по меньшей мере приблизительно одну треть или по меньшей мере приблизительно половину длины вариабельной области. Секвенирование можно проводить на клонах, выделенных из библиотеки кДНК, или, если применяется ПЦР, после субклонирования амплифицированной последовательности или путем прямого секвенирования амплифицированного с помощью ПЦР сегмента. Секвенирование проводят, применяя стандартные методики (см., например, Sambrook и др. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, тома 1-3,Cold Spring Harbor Press, и Sanger, F. и др. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, которые включены в данную заявку посредством ссылки). Путем сравнения последовательности клонированной нуклеиновой кислоты с опубликованными последовательностями генов и кДНК иммуноглобулинов человека специалист в данной области в зависимости от просеквенированого участка легко сможет определить:(i) использованный сегмент эмбрионального типа в гибридомном полипептиде иммуноглобулина (включая изотип тяжелой цепи) и (ii) последовательность вариабельных областей тяжелой и легкой цепей,включая последовательности, полученные в результате добавления N-участка и процесса соматической мутации. Одним из источников информации о последовательностях генов иммуноглобулинов являетсяNational Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health,Бетесда, Мерилэнд. После того как указанная ДНК выделена, ее можно функционально связать с последовательностями, контролирующими экспрессию, или поместить в экспрессионные векторы, которыми затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки африканской зеленой мартышки (клетки COS),клетки яичников китайского хомячка (CHO), или клетки миеломы, которые в противном случае не продуцируют белок иммуноглобулина, чтобы напрямую синтезировать моноклональные антитела в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантное получение антител хорошо известно в данной области. К последовательности, контролирующей экспрессию, относятся последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Контролирующие последовательности, которые подходят для прокариот, например,включают последовательность промотора, возможно оператора, и участок связывания рибосомы. Эукариотические клетки, как известно, используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры. Нуклеиновая кислота является функционально связанной в том случае, когда она приведена в функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК,- 10015923 кодирующая пропоследовательность или секреторную лидерную последовательность, является функционально связанной с ДНК, кодирующей полипептид, если он экспрессируется в виде пробелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию этой последовательности; или участок связывания рибосомы является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что облегчает трансляцию. Как правило, функционально связанныйозначает, что связанные таким образом последовательности ДНК являются непрерывными, и, в случае секреторной лидерной последовательности - непрерывной и в рамке считывания. Тем не менее, энхансеры не обязательно располагаются непрерывно. Соединение завершается лигированием в удобных сайтах рестрикции. Если таких сайтов не существует, применяют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой. Термины клетка, линия клеток и культура клеток часто применяют взаимозаменяемо, и все подобные обозначения в данной заявке включают потомство. Термины трансформанты и трансформированные клетки включают первичную клетку и культуры, полученные из них, вне зависимости от числа пересеваний. Также очевидно, что все потомство может быть не идеально идентично по содержанию в нем ДНК, вследствие преднамеренных или самопроизвольных мутаций. Мутантное потомство,которое имеет такую же функциональную или биологическую активность, что и подвергнутая скринигу оригинальная трансформированная клетка, также включено в объем термина. Настоящее изобретение также предусматривает выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие специфически связывающие агенты или антитела согласно настоящему изобретению, возможно функционально связанные с контрольными последовательностями, узнаваемыми клеткой-хозяином, векторы и клетки-хозяева, которые содержат указанные нуклеиновые кислоты, и рекомбинантные методики получения специфически связывающих агентов или антител, которые могут включать культивирование клетки-хозяина таким образом, что происходит экспрессия указанной нуклеиновой кислоты, и, возможно, получение указанного специфически связывающего агента или антитела из культуры клеток-хозяев или культуральной среды. Множество векторов известны в данной области. Компоненты вектора могут включать один или более из перечисленных далее: сигнальную последовательность (которая может, например, направлять секрецию указанного специфически связывающего агента или антитела), точку начала репликации, один или более генов селективных маркеров (которые могут, например, наделять устойчивостью к антибиотику или другому лекарственному препарату, комплементируют ауксотрофные дефициты, или поставляют важные питательные компоненты, отсутствующие в среде), энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции, каждый из которых хорошо известен в данной области. Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические, дрожжевые или высшие эукариотические клетки, описанные выше. Подходящие для этих целей прокариоты "включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratia marcescans, и Shigella, также, как и Bacilli такие как B. subtilis и B.licheniformis, Pseudomonas и Streptomyces. Кроме прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих специфически связывающие агенты являются эукариотические микробы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи, являются наиболее широко используемыми низшими эукариотами среди микроорганизмовхозяев. Тем не менее, ряд других родов, видов и штаммов общедоступны и применимы в рамках данной заявки, таких как Pichia, например, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, Yarrowia;Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и мицелиальные грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и хозяева Aspergillus,такие, как A. nidulans и A. niger. Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного специфически связывающего агента или антитела получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Было идентифицировано множество штаммов бакуловирусов и вариантов и соответствующих допустимых клеток-хозяев насекомых из таких организмов, как: Spodopterafrugiperda (гусеница), Aedes aegypti (москит), Aedes albopictus (москит), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и шелкопряд Bombyx mori. Множество вирусных штаммов для трансфекции таких клеток общедоступны, например L-1 вариант вируса совки калифорнийской люцерновой (Autographa californicaNPV) и Bm-5 штамм вируса Bombyx mori NPV. Тем не менее, большой интерес вызывали клетки позвоночных, и культивирование клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало обычной процедурой. Примерами подходящих линий клетокхозяев млекопитающих являются клетки яичников китайского хомячка, включая CHOK1 клетки (ATCCCCL61), DXB-11, DG-44, и клетки яичников китайского хомячка /-DHFR (CHO, Urlaub и др., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980; клетки почки обезьяны линии CV1, трансформированные вирусом SV40(COS-7, ATCC CRL 1651); линия эмбриональных клеток почки человека (293 или клетки 293, субклони- 11015923 рованные для выращивания в суспензионной культуре [Graham и др., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; клетки почек сирийского хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980; клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки гепатомы человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather и др., Annals N.YAcad. Sci. 383: 44-68 (1982; клетки MRC 5 или клетки FS4. Клетки-хозяева трансформируют или трансфецируют вышеописанными нуклеиновыми кислотами или векторами для получения специфически связывающего агента или антитела и культивируют в традиционной питетельной среде, модифицированной надлежащим образом для индукции промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих необходимые последовательности. Кроме того, новые векторы и трансфецированные линии клеток с множеством копий транскрипционных единиц, отделенные посредством селективного маркера, являются особенно пригодными и предпочтительными для экспрессии специфически связывающих агентов или антител. Клетки-хозяева, применяемые для получения специфически связывающего агента или антитела согласно настоящему изобретению, можно культивировать в ряде сред. Доступные для приобретения среды, такие как среда Ham's F10 (Sigma), минимальная необходимая среда MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла DMEM), Sigma), подходят для культивирования указанных клеток-хозяев. Вдобавок, любую из сред, описанных у Ham и др., Meth. Enz. 58: 44(1979), Barnes и др., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), в патентах США с номерами 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; WO90103430; WO 87/00195; или в патенте США рег. номер 30,985, можно применять в качестве культуральной среды для указанных клеток-хозяев. Любую из этих сред можно дополнить, если необходимо, гормонами и/или другими факторами роста (такими, как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими, как хлорид натрия, кальция, магния, и фосфаты), буферами (такими, как HEPES), нуклеотидами (такими, как аденозин и тимидин), антибиотиками(такими, как препарат Гентамицин), микроэлементами (определенными как неорганические соединения, обычно представленные в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые дополнительные вещества также могут быть включены в подходящих концентрациях, которые известны специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, pH, и тому подобные, применяют такие же, как и ранее применяемые для клеток-хозяев, отобранных для экспрессии, и очевидны для среднего специалиста в данной области. Экспрессионные векторы, pDC323 и pDC324, как описано в заявке на патент США номер 20030082735, содержащие подходящую соответствующую пару легкой цепи и тяжелой цепи, трансфицировали в CS9 линию клеток-хозяев. При культивировании указанных клеток-хозяев специфически связывающий агент или антитело могут продуцироваться внутри клетки, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретироваться в среду. Если специфически связывающий агент или антитело получено внутри клетки, в качестве первого этапа, частицы примесей, клетки-хозяева или лизированные фрагменты удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрации. Композицию специфически связывающих агентов или антител можно очистить, применяя, например, гидроксиапатитовую хроматографию, катионо- или анионообменную хроматографию или предпочтительно аффинную хроматографию, с использованием интересующего антигена или белка A или белкаG в качестве аффинного лиганда. Белок A можно применять для очистки специфически связывающих агентов или антител, которые основаны на 1, 2 или 4 тяжелых цепях человека (Lindmark и др., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983. Белок G рекомендуется для всех изотипов мыши и для у 3 человека (Guss и др., EMBO J. 5: 15671575 (1986. Матрица, к которой присоединяют аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, но другие матрицы также доступны. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стирол-дивинил) бензол, позволяют использовать более быструю скорость потока и более короткое время процедуры, чем достижимые при применении агарозы. Когда специфически связывающий агент или антитело содержит CH3 домен, смола BakerbondABX (J. Т. Baker, Phillipsburg, N.J.) пригодна для очистки. Другие методики очистки белков, такие как преципитация этанолом, обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого разрешения (ВЭЖХ),хроматофокусировка, ПААГ/ДСН и преципитация сульфатом аммония, также возможно зависят от очищаемого специфически связывающего агента или антитела. Химерные и гуманизированные антитела Химерные моноклональные антитела, в которых вариабельные домены Ig моноклонального антитела грызунов слиты с константными доменами Ig человека, можно получить, применяя стандартные процедуры, известные в данной области (См. Morrison, S. L, и др. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules;Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 68416855; и Boulianne, G. L, и др., Nature 312, 643-646 (1984. Хотя некоторые химерные моноклональные- 12015923 антитела проявляют меньшую иммуногенность у людей, вариабельные домены Ig грызунов все же могут привести к значительному ответу человека против белка грызунов. Гуманизированные антитела можно получить множеством способов, включая, например: (1) прививку не происходящих от человека участков, определяющих комплементарность, (CDR) на каркасную и константную области иммуноглобулинов человека (процесс, называемый в данной области гуманизированием через "CDR-прививку"), или, в качестве альтернативы, (2) перенос целых не принадлежащих человеку вариабельных доменов, но с их "маскировкой" под поверхность антител человека путем замены поверхностных остатков аминокслот (процесс, называемый в данной области "шлифовка"). Эти способы изложены, например, у Jones и др., Nature 321:522 525 (1986); Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.,81:6851 6855 (1984); Morrison и Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer и др., Science 239:1534 1536(1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); и Kettleborough, C.A. и др., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991), каждая из которых включена в данную заявку посредством ссылки. В частности, антитело грызуна при повторных in vivo введениях людям, либо отдельно, либо в виде конъюгата, приведет к иммунному ответу реципиента против антитела грызуна; так называемомуHAMA-ответу (ответу человека против антитела мыши). HAMA-ответ может ограничить эффективность фармацевтического препарата, если необходимо введение повторных доз. Иммуногенность указанного антитела можно уменьшить путем химической модификации антитела гидрофильным полимером, таким как полиэтиленгликоль, или путем применения способов генетической инженерии, чтобы сделать связывающую структуру антитела более подобной таковой у антитела человека.CDR-прививка включает введение одной или более из шести CDR областей из вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи Ig мыши в подходящие каркасные области вариабельного домена Ig человека. Эта методика (Riechmann, L, и др., Nature 332, 323 (1988 использует консервативные каркасные области(FR1-FR4) в качестве каркаса для поддержки CDR-петель, которые первыми вступают в контакт с антигеном. Значительным недостатком CDR-прививки, тем не менее, является то, что она может дать гуманизированное антитело, которое имеет, по существу, более низкую аффинность связывания, чем исходное антитело мыши, потому что аминокислоты каркасных областей могут вносить вклад в связывание антигена, и потому, что аминокислоты CDR-петель могут влиять на ассоциацию двух вариабельных доменовIg. Химерные SR-1 антитела не проявили подходящей функциональной эффективности в тестах, основанных на клеточной системе. Чтобы сохранить аффинность указанного гуманизированного моноклонального антитела, методикуCDR-прививки можно усовершенствовать путем выбора каркасных областей человека, которые наиболее близко похожи на каркасные области исходного антитела мыши, и путем сайтнаправленного мутагенеза отдельных аминокислот внутри каркаса или CDR с помощью компьютерного моделирования сайта связывания антигена (например, Co, M. S., и др. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976). Один способ гуманизации антител включает выравнивание последовательностей не принадлежащих человеку тяжелой и легкой цепей с последовательностями тяжелой и легкой цепей человека, выбор и замещение не принадлежащей человеку каркасной области на каркасную область человека на основании такого выравнивания, молекулярное моделирование с целью предсказать конформацию гуманизированной последовательности и сравнение с конформацией родительского антитела. После этого процесса следуют повторные обратные мутации остатков в CDR участке, которые нарушают структуру CDR, до тех пор, пока предсказанная конформация модели гуманизированной последовательности не будет близко походить на конформацию не принадлежащих человеку CDR областей родительского антитела, не принадлежащего человеку. Такие гуманизированные антитела можно дополнительно модифицировать,чтобы облегчить захват и клиренс, например, через рецепторы Ашвелла (см., например, Патенты США с номерами 5530101 и 5585089). В различных источниках сообщалось о нескольких гуманизациях моноклональных антител мыши с помощью конструктивного расчета (см., например, 20020091240, опубликованную 11 июля, 2002 г., WO 92/11018 и патент США номер 5693762, патент США номер 5766866). Конструирование гуманизированных антител также было описано, например, у Studnicka и др. патент США номер 5766886; Studnicka и др. Protein Engineering 7: 805-814 (1994). Получение вариантов антител Варианты последовательности аминокислот желательного специфически связывающего агента или антитела можно получить путем введения подходящих изменений нуклеотидов в кодирующей ДНК, или путем пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков внутри последовательностей аминокислот указанных специфически связывающих агентов или антител. Любую комбинацию делеции, вставки и замены применяют, чтобы достичь конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция проявляет необходимые свойства. Изменения аминокислот также могут влиять на посттрансляционные процессы специфически связывающего агента или гуманизированного или измененного антитела, такие как изменение числа или положения сайтов гликозилирования.- 13015923 Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих вариантные последовательности аминокислот специфически связывающего агента или антитела, получают с помощью множества способов, известных в данной области. Такие способы включают олигонуклеотид-опосредованный (или сайт-направленный) мутагенез, ПЦР-мутагенез и кассетный мутагенез ранее полученной измененной или неизмененной версии специфически связывающего агента или антитела. Пригодный способ идентификации определенных остатков или участков специфически связывающего агента или антитела, которые представляют собой предпочтительные положения для мутагенеза,называют "аланин сканирующий мутагенез", как описано у Cunningham и Wells, Science, 244:1081-1085(1989). В этом способе остаток или группу целевых остатков определяют (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и замещают на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (наиболее предпочтительно аланин или полиаланин), чтобы повлиять на взаимодействие указанных аминокислот с антигеном. Эти положения аминокислот, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, затем оптимизируют путем введения дополнительных или других вариантов рядом, или в самом сайте замены. Следовательно, хотя сайт для введения замен в последовательность аминокислот определяют заранее, нет необходимости определять заранее природу мутации per se. Например,чтобы проанализировать влияние некоторой мутации в данном сайте, проводят ala-сканирование или неспецифический мутагенез в целевом кодоне или участке, и экспрессированные варианты подвергают скринигу на необходимую активность. Обычно, варианты последовательности аминокислот указанного специфически связывающего агента или антитела имеют последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 60% идентична последовательности аминокислот с последовательностями аминокислот либо тяжелой, либо легкой цепи исходного специфически связывающего агента или антитела (мышиного или гуманизированного), или по меньшей мере 65%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% идентична, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентична, включая,например, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и 100%. Идентичность или гомология в отношении этих последовательностей определена в данной заявке как процент остатков аминокислот в рассматриваемой последовательности, которые идентичны остаткам в оригинальной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения разрывов (гэпов), если это необходимо, чтобы достичь максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривает любые консервативные замены (определенные в табл. 1 ниже) как составляющие идентичности последовательностей. Ни одно из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, делеций или вставок в последовательность специфически связывающего агента или антитела не должны быть истолкованы как влияющие на идентичность последовательности или гомологию. Следовательно, идентичность последовательностей можно определить с помощью стандартных способов, которые обычно применяют для сравнения схожести в положениях аминокислот двух полипептидов. Применяя компьютерные программы, такие как BLAST или FASTA, два полипептида выравнивают по оптимальному соответствию их соответствующих аминокислот (либо вдоль всей длины одной или обеих последовательностей, либо вдоль заранее определенной части одной или обеих последовательностей). Указанные программы обеспечивают штраф по умолчанию за открытие гэпов и штраф по умолчанию за увеличение гэпов, и матрицу переходов, такую как PAM 250 [стандартная матрица переходов; см. Dayhoff и др., в Atlas of Protein Sequenceand Structure, том. 5, прилож. 3 (1978)], можно применять вместе с указанными компьютерными программами. Например, процент идентичности можно затем рассчитать как: общее число идентичных совпадений, умноженное на 100 и затем поделенное на сумму длины более длинной последовательности в рамках совпадающего интервала и числа разрывов, введенных в более короткую последовательность,чтобы выровнять две последовательности. Вставки Вставки в последовательность аминокислот включают присоединения по амино- и/или карбоксилконцу, варьирующиеся в длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или более остатков, также, как и вставки внутри последовательности одного или множества остатков аминокислот. Примеры концевых вставок включают специфически связывающий агент или антитело с Nконцевым метиониловым остатком или специфически связывающий агент или антитело (включая фрагмент антитела), слитые с эпитопной меткой или эпитопом salvage-рецептора. Другие варианты вставки в молекулу специфически связывающего агента или антитела включают слияние с полипептидом, который увеличивает период полувыведения из сыворотки крови специфически связывающего агента или антитела, например на N-конце или C-конце. Примеры эпитопных меток включают полипептид HA вируса гриппа (flu HA tag) и его антитело 12CA5 [Field и др., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; метку c-myc и 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9E10 антитела к ней [Evan и др., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; и метку гликопротеина D вируса простого герпеса (gD) и антитело к ней [Paborsky и др., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)]. Другие примеры меток представляют собой полигистидиновые последовательности, как правило, около шести гистидиновых остатков, которые позволяют выделить соединение, помеченное таким образом, с помо- 14015923 щью хелатирования никеля. Другие метки и таги, такие как FLAG-таг (Eastman Kodak, Рочестер, НьюЙорк) хорошо известны и обычно применяются в данной области. Термин "эпитоп связывания с salvage-рецептором" относится к эпитопу Fc участка молекулы IgG(например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, который отвечает за увеличение in vivo периода полувыведения из сыворотки крови молекулы IgG). Замены Другой тип вариаций включает варианты с аминокислотными заменами. Такие варианты имеют по меньшей мере один остаток аминокислоты в молекуле специфически связывающего агента или антитела,который удаляется и на его место вставляется другой остаток. Замещающий мутагенез внутри любой из гипервариабельной или CDR области, или каркасной области также предусмотрен. Консервативные замены показаны в табл. 1. Наиболее консервативные замены можно найти под заголовком "предпочтительные замены". Если такие замены не приводят к изменению биологической активности, тогда можно ввести более существенные изменения, названные "примерные замены" в табл. 1, или как дополнительно описано ниже в ссылке на классы аминокислот, и подвергнуть скринингу продукты. Таблица 1 Существенные модификации в биологических свойствах специфически связывающего агента или антитела совершают путем отбора замен, которые отличаются значительно по их эффекту на поддержание (a) структуры полипептидной связи в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте, или (c) величины боковой цепи. Естественные остатки подразделяют на группы на основании общих свойств боковых цепей:(5) остатки, которые оказывают влияние на ориентацию цепи: gly, pro; и(6) ароматические: trp, tyr, phe. Консервативные замены вызывают замену аминокислоты на другой член того же класса. Неконсервативные замещения вызывают замену члена одного из данных классов на член другого класса. Любой остаток цистеина, не участвующий в сохранении правильной конформации специфически связывающего агента или гуманизированного или вариантного антитела, также можно заместить, как правило, на серин для повышения стабильности молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного сшивания. Напротив, цистеиновую связь(и) можно ввести в специфически связывающий агент или антитело для повышения стабильности (особенно, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент). Аффинное созревание Аффинное созревание включает получение и скрининг вариантов специфически связывающего агента или антитела, которые несут мутации (делеции, вставки или замены) внутри CDR родительского специфически связывающего агента или антитела, и отбора вариантов, которые имеют улучшенные биологические свойства, такие как аффинность связывания, по сравнению с родительским специфически связывающим агентом или антителом. Удобным путем получения таких вариантов с замещением является аффинное созревание с использованием фагового дисплея. Кратко, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) мутируют для получения всех возможных замен аминокислот в каждом сайте. Полученные таким образом варианты специфически связывающего агента или антитела мож- 15015923 но воспроизвести моновалентным образом из нитевидной фаговой частицы в виде слитых конструкций с продуктом гена III M13, упакованного внутри каждой частицы. Воспроизведенные в фаге варианты затем подвергают скринингу на их биологическую активность (например, аффинность связывания), как раскрыто в данном описании. Можно провести аланин сканирующий мутагенез, чтобы определить остатки гипервариабельной области, которые вносят значительный вклад в связывание антигена. В качестве альтернативы или в дополнение может быть полезным проанализировать кристаллическую структуру комплекса антигенантитело для идентификации точек контакта между специфически связывающим агентом или антителом и антигеном. Такие контактные остатки и смежные остатки представляют собой кандидаты на замещение по методикам, детально разработанным в данной заявке. При получении таких вариантов ряд вариантов подвергают скринингу, как описано в данной заявке, и можно отобрать для дальнейшей разработки в одном или более соответствующем тесте специфически связывающие агенты или антитела с наилучшими свойствами. Методики, в которых используется перетасовка генов и направленная эволюция, можно также использовать для получения и скрининга вариантов специфически связывающего агента или антитела на необходимую активность. Например, Jermutus и др., Proc Natl Acad Sci USA. 2 янв., 2001; 98(1): 75-80 сообщают, что доработанные стратегии селекции in vitro, основанные на рибосомном дисплее, совмещали с введением разнообразия in vitro путем перетасовки ДНК, чтобы изменить либо скорость выведения,либо термодинамическую стабильность одноцепочечных Fv фрагментов антител (scFv); Fermer и др.,Tumour Biol. 2004 Jan-Apr; 25 (1-2): 7-13 сообщили, что применение фагового дисплея в комбинации с перетасовкой ДНК увеличило аффинность почти на три порядка. Изменение характера гликозилирования Можно также получить варианты специфически связывающего агента или антитела, которые имеют измененный рисунок (паттерн) гликозилирования по сравнению с родительским специфически связывающим агентом или антителом, например, удалением одной или более молекул сахаров из специфически связывающего агента или антитела, и/или добавлением одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в специфически связывающем агенте или антителе. Гликозилирование полипептидов, включая антитела, является обычно либо N-связанным, либо Oсвязанным. N-связанное относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарани-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к аспарагиновой боковой цепи. Таким образом,наличие любой из данных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт для гликозилирования. Следовательно, N-связанные сайты гликозилирования можно ввести в специфически связывающий агент или антитело путем изменения последовательности аминокислот таким образом, что она будет содержать одну или более этих трипептидных последовательностей. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также можно использовать 5 гидроксипролин или 5-гидроксилизин. O-связанные сайты гликозилирования можно ввести в специфически связывающий агент или антитело путем вставки или замещения одного или более остатков серина или треонина в последовательности оригинального специфически связывающего агента или антитела. Другие модификации Можно удалить или ввести остаток(ки) цистеина в Fc участок, тем самым устраняя или стимулируя образование дисульфидной связи в цепи в этом участке. Гомодимерный специфически связывающий агент или антитело, полученное таким образом, может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенной опосредуемой комплементом киллерной для клеток функцией и антителозависимой клеточно обусловленной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron и др., J. Exp Med. 176: 1191-1195(1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Можно также получить гомодимерные специфически связывающие агенты или антитела с использованием гетеробифункциональных кросс-линкеров, как описано у Wolff и др., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). В качестве альтернативы, можно сконструировать специфически связывающий агент или антитело, которое обладает двойными Fc-областями, и тем самым можно повысить способность к комплементарному лизису и ADCC. См. Stevenson и др., AntiCancerDrug Design 3:219-230 (1989). Было показано, что последовательности внутри CDR могут вызывать связывание антитела с главным комплексом гистосовместимости (MHC) II класса и индуцировать нежелательный хелперный Tклеточный ответ. Консервативные замены позволят специфически связывающему агенту или антителу сохранить активность связывания, но снизить его способность индуцировать нежелательный Tклеточный ответ. Также предполагается, что могут быть удалены одна или более из 20 N-концевых аминокислот тяжелой или легкой цепи. Модификации для увеличения периода полувыведения из сыворотки крови также могут быть желательны, например, их можно произвести путем введения или добавления эпитопа связывания salvage- 16015923 рецептора (например, путем мутации подходящего участка или путем введения эпитопа в пептидную метку, которую затем сливают со специфически связывающим агентом или антителом на любом конце или в середине, например путем ДНК- или пептидного синтеза) (см., например, WO96/32478) или добавления молекул, таких как PEG или другие водорастворимые полимеры, включая полисахаридные полимеры. Эпитоп связывания salvage-рецептора предпочтительно образует участок, отличающийся тем, что любой один или более остатков аминокислот из одной или двух петлей Fc домена перенесены в аналогичные положения специфически связывающего агента или антитела, или фрагмента. Еще более предпочтительно, перенесены три или более остатков из одной или двух петлей Fc домена. Еще более предпочтительно указанный эпитоп брали из CH2 домена Fc участка (например, из IgG) и переносили в CH1,CH3 или VH участок, или более чем один такой участок, специфически связывающего агента или антитела. В качестве альтернативы, указанный эпитоп берут из CH2 домена Fc участка и переносят в CL участок или VL участок, или в оба участка, специфически связывающего агента или фрагмента антитела. См. также международные заявки на патент WO 97/34631 и WO 96/32478, которые описывают Fc варианты и их взаимодействие с salvage-рецептором. Регуляция гомеостаза IgG in vivo зависит от его связывания с неонатальным Fc рецептором (FcRn). Сообщали, что изменение взаимодействия между Fc доменом IgG и FcRn улучшает период полувыведения моноклональных антител из сыворотки крови. Мутации в Fc, которые приводят к более высокой аффинности связывания с неонатальным Fc рецептором (FcRn) и замедляют деградацию, и улучшают ФК профиль, будут предпочтительны. Сайт связывания FcRn на IgG расположен на границе CH2-CH3 домена. Мутации остатков в этой области (M428L и T250Q/M428L, T250Q/M428L, P257I/Q311I,M252Y/S254T/T256E, H433K/N434F/Y436H или M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H) приводят к повышению аффинности IgG1 к FcRn человека при pH 6.0 и pH 7.3. Дополнительно, некоторые из этих мутаций приводили к улучшению фармакокинетических свойств (замедленный клиренс, более долгий период полувыведения) при введении внутривенно обезьянам. Также были идентифицированы другие сайты константной области, которые отвечают за комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), такие как сайт связывания C1q, и/или антителозависимую клеточно обусловленную цитотоксичность (ADCC) [см., например, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992);Shields и др., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001), полностью включены в данную заявку посредством ссылки]. Мутация остатков внутри сайтов связывания Fc рецептора может привести к изменению (т.е. увеличению или уменьшению) эффекторной функции, как, например, измененная ADCC или CDC активность, или измененный период полувыведения. Как описано выше, потенциальные мутации включают вставку, делецию или замену одного или более остатков, включая замену на аланин, консервативную замену, неконсервативную замену, или замещение на соответствующий аминокислотный остаток в том же положении из другого подкласса (например, замещение IgG1 остатка на соответствующий IgG2 остаток в этом положении). Другие ковалентные модификации Ковалентные модификации указанного специфически связывающего агента или антитела также включены в объем настоящего изобретения. Их можно произвести путем химического синтеза или путем ферментативного или химического расщепления специфически связывающего агента или антитела, если они применимы. Другие типы ковалентных модификаций можно ввести в специфически связывающий агент или антитело путем проведения реакции целевых остатков аминокислот с органическим модифицирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или Cконцевыми остатками. Цистеиновые остатки наиболее часто приводят в реакцию с -галоацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлороацетамид, чтобы получить производные карбоксиметила или карбоксиамидометила. Цистеиновые остатки также дериватизируют с помощью реакции с бромтрифторацетон, -бром(5-имидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, Nалкилмалеимидами,3-нитро-2-пиридилдисульфидом,метил-2-пиридилдисульфидом,пхлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазоллом. Гистидиловые остатки модифицируют посредством взаимодействия с диэтилпирокарбонатом приpH 5.5-7.0, поскольку указанный агент является относительно специфичным для гистидиловой боковой цепи. Также применим пара-бромфенацилбромид; взаимодействие предпочтительно осуществляют в 0.1 М растворе какодилата натрия при pH 6.0. Лизиниловые и аминоконцевые остатки приводят во взаимодействие с янтарным ангидридом или ангидридами других карбоновых кислот. Модификация указанными агентами может приводить к изменению заряда лизиниловых остатков. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфааминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновая кислота; O-метилизомочевина; 2,4 пентан-дион и глиоксилат в реакции, катализируемой трансаминазой. Аргиниловые остатки модифицируют путем взаимодействия с одним или несколькими обычными- 17015923 реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Для дериватизации остатков аргинина требуется, чтобы взаимодействие осуществлялось в щелочной среде изза высокой рKа гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, такие реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также с эпсилон-аминогруппой аргинина. Можно также совершить необходимые модификации тирозиловых остатков, особенно интересны случаи введения спектральных меток в тирозиловые остатки с помощью реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Наиболее часто применяют N-ацетилимидизол и тетранитрометан для образования видов O-ацетил тирозила и 3-нитропроизводных, соответственно. Тирозиловые остатки йодируют, применяя 125I или 131I, для получения меченых белков для использования в радиоиммунологическом анализе. Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) селективно модифицируют путем взаимодействия с карбодиимидами (R-N=C=N=R'), где R и R' являются разными алкильными группами, такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4 диметилфенил)карбодиимид. Кроме того, аспартиловые и глутамиловые остатки превращают в аспарагиниловый и глутаминиловый остатки посредством взаимодействия с ионами аммония. Глутаминиловые и аспарагиниловые остатки часто деамидируют до соответствующих глутамиловых и аспартиловых остатков, соответственно. Эти остатки деамидируют в нейтральных или основных условиях. Деамидированная форма этих остатков входит в объем настоящего изобретения. Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп сериловых или треониловых остатков, метилирование альфа-аминогрупп лизина, боковых цепей аргинина и гистидина (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. FreemanCo., San Francisco, стр. 79-86 (1983, ацетилирование N-концевого амина и амидирование любойC-концевой карбоксильной группы. Другой тип ковалентных модификаций включает химическое или ферментативное присоединение гликозидов к специфически связывающему агенту или антителу. Эти процедуры являются преимущественными, так как они не требуют продукции указанного специфически связывающего агента или антитела в клетке-хозяине, которая способна осуществлять N- или O-связанное гликозилирование. В зависимости от применяемого способа присоединения, сахар(а) можно присоединить к (a) аргинину и гистидину,(b) свободным карбоксильным группам, (c) свободным сульфгидрильным группам, таким как группы цистеина, (d) свободным гидроксильным группам, таким как группы серина, треонина или гидроксипролина, (e) ароматическим остаткам, таким как остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (f) амидной группе глутамина. Эти способы описаны в WO 87/05330, опубликованной 11 сент. 1987, и вAplin и Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., стр. 259-306 (1981). Удаление любой молекулы углевода, присутствующей на указанном специфически связывающем агенте или антителе, можно совершить химически или ферментативно. Химическое дегликозилирование требует контакта специфически связывающего агента или антитела с трифторметансульфоновой кислотой, или эквивалентным соединением. Эта обработка приводит к расщеплению большинства или всех сахаров, кроме сшивающего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), при этом оставляя специфически связывающий агент или антитело интактными. Химическое дегликозилирование описано у Hakimuddin, и др. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) и у Edge и др. Anal. Biochem., 118: 131(1981). Ферментативное расщепление молекул углевода на специфически связывающем агенте или антителе можно совершить, применяя различные эндо- и экзогликозидазы, как описано у Thotakura и др.Meth. Enzymol. 138: 350 (1987). Другой тип ковалентных модификаций указанного специфически связывающего агента или антитела включает сшивание специфически связывающего агента или антитела с одним из множества небелковых полимеров, например полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем, полиоксиэтилированными полиолами, полиоксиэтилированным сорбитолом, полиоксиэтилированной глюкозой, полиоксиэтилированным глицерином, полиоксиалкиленами или полисахаридными полимерами, такими как декстран. Подобные способы известны в данной области, см., например, патенты США с номерами 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192, 4179337, 4766106, 4179337, 4495285, 4609546 или ЕР 315456. Терапевтические применения"Лечение" представляет собой вмешательство, выполненное с намерением предотвратить развитие или изменить патологию расстройства. Соответственно, "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже страдает указанным расстройством, а также тех, у которых указанное расстройство нужно предотвратить."Млекопитающее" для целей лечения относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных и животных для зоопарка, спорта, или домашних любимцев, таких как собаки, лошади, коты, коровы и т.д. Предпочтительно указанное млекопитающее представляет собой человека. При использовании в данной заявке выражение "терапевтически эффективное количество" подразумевается обозначающим такое количество терапевтического или профилактического гуманизирован- 18015923 ного антитела к c-Kit, которое обеспечивает снижение числа и/или активности тучных клеток или клеток-предшественников, уменьшение фиброзных элементов или предшествующих им образований, или которое обеспечивает снижение тяжести или прогрессирования симптомов, связанных с c-Kit-связанным заболеванием (т.е., которое обеспечивает "терапевтическую эффективность"). Тучные клетки и гематопоэтические плюрипотентные стволовые клетки-предшественники представляют собой типы первичных клеток, экспрессирующих c-Kit, и, следовательно, предусмотрено, что на клетки, которые получены из ГСК, такие как тучные клетки, и которые вовлечены в заболевания, можно воздействовать композициями и способами согласно настоящему изобретению. Выражение "активность, уменьшающая фиброз" подразумевается обозначающим способность ингибировать, полностью или частично и обращать воспаление, вызванное активацией иммунной системы и фиброзом. При использовании в данной заявке термин "фиброзное заболевание или расстройство" относится к патологическим состояниям, включающим фиброз одной или более тканей. При использовании в данной заявке термин "фиброз" относится к аберрантному образованию или развитию избытка фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в виде реактивного процесса, в противоположность образованию фиброзной ткани как нормальной составляющей или заживлению органа или ткани. Фиброз характеризуется накапливанием фибробластов и депонированием коллагена в избытке по отношению к нормальному депонированию в любой конкретной ткани. При использовании в данной заявке термин "фиброз" применяют синонимично с "аберрантное заживление, включающее превращение мезенхимальных клеток в фибробласты, избыточную пролиферацию, активность фибробластов и депонирование коллагена и других белков внеклеточного матрикса". Фибробласты представляют собой клетки соединительной ткани, которые рассредоточены по соединительной ткани во всем организме. Фибробласты секретируют эластичный внеклеточный матрикс,содержащий коллаген I типа и/или III типа. В ответ на повреждение ткани, близлежащие фибробласты или мезенхимальные клетки-предшественники в кровотоке мигрируют в рану, могут стать, в качестве альтернативы, активированными под влиянием других клеток, таких как тучные клетки и их медиаторы,пролиферировать и продуцировать большие количества коллагенового внеклеточного матрикса. Коллаген представляет собой фибриллярный белок, богатый глицином и пролином, который является основным компонентом внеклеточного матрикса и соединительной ткани, хряща и кости. Молекулы коллагена представляют собой тринитевые спиральные структуры, названные -цепями, которые обвиваются друг вокруг друга, образуя подобную веревке спираль. Коллаген существует в нескольких формах или типах; из них I тип является наиболее распространенным и обнаруживается в коже, сухожилиях и кости; и III тип обнаруживается в коже, кровеносных сосудах и внутренних органах. Связанные с тучными клетками фиброзные заболевания включают патологический фиброз или рубцевание (включая эндокардиальный фиброэластоз), идиопатический интерстициальный фиброз, интерстициальный фиброз легких, субадвентициальный фиброз стенок артерий, фиброз Симмерса, перицентральный фиброз, гепатит, дерматофиброму, билиарный цирроз, алкоголический цирроз, острый фиброз легких, идиопатический фиброз легких, синдром острой дыхательной недостаточности, фиброз почек/гломерулонефрит, фиброз почек/диабетическая нефропатию, склеродермию/системную, склеродермию/локальную, келоиды, гипертрофированные шрамы, тяжелое сращение суставов/артрит, миелофиброз, рубцевание роговицы, муковисцидоз, мышечную дистрофию (Дюшенна), фиброз сердца, фиброз мышц/отслоение сетчатки, стриктуру пищевода и болезнь пейрония. Дополнительно фиброзные расстройства могут быть индуцированы или инициированы операцией, включая удаление шрамов/пластическую хирургию, глаукому, фиброз задней капсулы хрусталика, рубцевание роговицы, сращивание связок, заболевание трансплантат против хозяина, операцию на сухожилии, ущемление нерва,контрактуру Дюпюитрена, гинеколигические спайки/фиброз, тазовые спайки, перидуральный фиброз,рестеноз. Также предполагается, что фиброзные патологические состояния, где депонирование фибронектина является причинным фактором, можно лечить согласно настоящему изобретению. Идиопатический фиброз легкого, индуцированный блеомицином фиброз легкого, кистозный фиброз и гломерулярная нефропатия, включая заболевания, характеризуемые отложениями фиброконектина в почках, в конечном счете, приводящие к почечной недостаточности, являются примерами патологических состояний,которые также можно лечить в соответствии с настоящим изобретением. Воспаление, включающее активацию иммунной системы и при котором тучные клетки секретируют воспалительные цитокины, такие как ФНО, и могут активировать и непосредственно взаимодействовать с лимфоцитами, также можно лечить в соответствии с настоящим изобретением. Склеродермию считают аутоиммунным заболеванием соединительной ткани, приводящим к фиброзному расстройству, характеризующемуся утолщением и уплотнением кожи, вызванным чрезмерной продукцией нового коллагена фибробластами в коже и других органах. Склеродермия может возникнуть как локальное или системное заболевание, затрагивающее ряд органов. Склеродермию также называют системным склерозом. Развитие склеродермической патологии связано с увеличением числа тучных клеток в пораженных подверженных болезни тканях/органах.- 19015923 Системный склероз характеризуется образованием гиалинизированной и утолщенной коллагеновой фиброзной ткани, с утолщением кожи и адгезией к подстилающим тканям, особенно на руках и лице. Указанное заболевание также можно охарактеризовать дисфагией вследствие потери перистальтики и подслизистым фиброзом пищевода, одышкой вследствие фиброза легких, фиброзом миокарда и изменениями почечных сосудов (Stedman's Medical Dictionary, 26 ое издание, WilliamsWilkins, 1995. Фиброз легких поражает от 30 до 70% пациентов со склеродермией, часто приводя к легочному фиброзу (Atamas и др. Cytokine and Growth Factor Rev 14: 537-550 (2003. Некоторые пациенты имеют одновременно склеродермию и другие заболевания соединительной ткани, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка и полимиозит. Когда признаки склеродермии присутствуют наряду с признаками полимиозита и системной красной волчанки, результирующее патологическое состояние называют смешанным заболеванием соединительной ткани (MCTD). Известно, что симптомы, присутствующие в некоторых формах дерматита, вызваны дегрануляцией тучных клеток кожи, приводящей, в частности, к высвобождению гистамина. Следовательно, другим связанным с тучными клетками расстройством, подходящим для лечения согласно настоящему изобретениею, является пигментная крапивница. Это расстройство представляет характерные кожные повреждения, которые представляют собой единичные или множественные пигментированные пятна или узелки, которые зудят при трении и содержат большое количество тучных клеток. Существуют различные формы связанных дерматитов (воспалений кожи), таких как эритема, отек, папулезная сыпь и зуд, которые могут присутствовать при дерматитах человека и животного, каждый из которых можно лечить согласно настоящему изобретению. Мастоцитоз представляет собой во многих случаях неопластическое заболевание и включает новый или аномальный рост тучных клеток и может являться последствием повышенной аутокринной передачи сигналов SCF или активирующей c-Kit мутации. Мастоцитоз может быть ограниченным или системным,включая множество органов, таких как костный мозг. Тучные клетки высвобождают некоторые медиаторы, или химические соединения, одним из которых является гистамин, в организм в ответ на некоторые события. Люди, страдающие системным мастоцитозом, проявляют повышенные количества тучных клеток или имеют тучные клетки неправильной формы, которые не могут нормально функционировать. Вдобавок, тучные клетки не могут отмирать, когда следует, что дополнительно увеличивает общий пул тучных клеток. Когда тучные клетки дегранулируются и высвобождают свое содержимое, это может привести ко многим острым и потенциально серьезным патологическим состояниям или заболеваниям. Расстройства, связанные с тучными клетками, также включают пролиферативные расстройства, приводящие к локализованным заболеваниям, таким как одиночные мастоцитомы кожи вплоть до более тяжелого заболевания, такого как тучноклеточный лейкоз. Примеры включают мастоцитому кожи, активный мастоцитоз, хронический мастоцитоз, мастоцитоз со связанным гематологическим расстройством, пигментную крапивницу, телеангиэктазию macularis eruptiva perstans (tmep), системное заболевание с участием тучных клеток, тучноклеточный лейкоз, миелоидную лейкемию, системный мастоцитоз (с наличием или без кожных проявлений, таких как пигментная крапивница), синдром/расстройство активации тучных клеток, и более распространенные педиатрические расстройств с участием тучных клеток, такие как одиночная мастоцитома и диффузный мастоцитоз кожи. Синдром или расстройство активации тучных клеток характеризуется нормальным или почти нормальным числом тучных клеток. Тем не менее, тучные клетки легко провоцируются с высвобождением их содержимого, что приводит ко многим аналогичным симптомам. С данным расстройством связана опасность анафилаксии и шока, но, в отличие от пролиферативных расстройств с участием тучных клеток, у этого синдрома может отсутствовать способность прогрессировать до более агрессивного или злокачественного состояния. Примеры подобных расстройств, связанных с дегрануляцией тучных клеток,могут включать боль в животе, крапивницу и сыпи, анафилаксию, воспаление пищевода, изменение кровяного давления и шок, интестинальные судороги и вздутие, боль костей (от легкой до тяжелой/изнуряющей), чесотку, с сыпями и без, боль в груди, печени, селезенке и окружении других органов,когнитивные затруднения/затуманенность сознания, расстройство всасывания, остеохондроз, мигрени,диарею, мышечную боль, головокружение/вертиго/дурноту, тошноту, потерю сознания, остеопороз/остеопению, утомляемость, периферическую нейропатию и парестезию, гиперемию, учащенное сердцебиение, гастроэзофагеальный рефлюкс и рвоту. Роль тучных клеток в аллергических заболеваниях была клинически доказана с помощью препаратов, которые блокировали специфичные медиаторы тучных клеток, такие как гистамин и кортикостероиды, которые помимо других активностей вызывают апоптоз тучных клеток. Дополнительные связанные с тучными клетками заболевания включают гистамин-опосредованные аллергические реакции, которые можно лечить путем ингибирования индуцированных хемокинами дегрануляции тучных клеток и базофилов и высвобождения гистамина. Примеры связанных с тучными клетками расстройств или заболеваний, которые можно эффективно лечить способами и композициями согласно настоящему изобретению,также включают, но не ограничены перечисленными, контактный дерматит, атопический дерматит, аллергический дерматит, экзематозный дерматит и дерматит, вызванный укусами или ужалениями насекомых.- 20015923 Другие связанные с тучными клетками показания, подходящие для лечения способами и композициями согласно настоящему изобретению, включают воспалительные состояния легких при интерстициальных заболеваниях легких, например саркоидоз, респираторный дистресс-синдром новорожденных(РДС), бронхопульмональную дисплазию (BPD) и состояния, характеризующиеся повышением сывороточной активности PLA2, такие как РДС взрослых (РДСВ). Также сообщалось, что тучные клетки играют роль при артрите. Количество тучных клеток повышено в воспаленных синовиальных тканях пациентов с ревматоидным артритом и остеоартритом, и Гливек, как было показано, вызывает апоптоз тучных клеток в синовиальных эксплантатах и контрольнодиагностические исследования людей показали эффективность для пациентов с ревматоидным артритом. Тучные клетки играют роль при септическом шоке, панкреатите, коллагенозе сосудов, острой почечной недостаточности, перитоните и аутоиммунном увеите. Исследования также позволили предположить, что тучные клетки участвуют в патофизиологии множественного склероза. Считают, что тучные клетки в мозге высвобождают вазоактивные амины, которые могут вызывать демиелинизацию. Высвобождение гистамина из тучных клеток может изменить целостность кровеносных сосудов и вызвать частичное нарушение гематоэнцефалического барьера,опять же участвующее в этиологии множественного склероза. Следовательно, предусмотрено, что способы и композиции согласно настоящему изобретению подходят для лечения или улучшения заболеваемости, связанной с множественным склерозом.C-Kit также экспрессируется на некоторых неиммунных клетках, таких как меланоциты и интестинальные клетки, также, как и на сперматоцитах. Настоящее изобретение может иметь применение при лечении меланомы и GIST и может иметь применение как мужской контрацептив. Введение и получение фармацевтических лекарственных форм Анти-c-Kit специфически связывающие агенты или антитела, используемые при осуществлении способа согласно настоящему изобретению, могут находиться в составе фармацевтических композиций,включающих носитель, подходящий для желаемого способа доставки. Подходящие носители включают любой материал, который при объединении с анти-c-Kit специфично связывающим и нейтральным антагонистическим агентом или антителом сохраняет их высокую аффинность связывания и эффективность по отношению к c-Kit и не вступает во взаимодействие с иммунной системой субъекта. Примеры носителей включают, но не ограничены, любой из ряда стандартных фармацевтических носителей, таких как стерильные фосфатно-солевые буферные растворы, бактериостатическая вода и тому подобные. Можно применять различные водные носители, например воду, забуференную воду, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин и тому подобные, и может включать другие белки для повышенной стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин, и т.д., подвергнутые легким химическим модификациям или тому подобным. Примерные концентрации антител в лекарственной форме могут изменяться в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 180 мг/мл или от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/мл,или от приблизительно 0,5 до приблизительно 25 мг/мл, или, в качестве альтернативы, от приблизительно 2 до приблизительно 10 мг/мл. Водную лекарственную форму указанного антитела можно получить вpH-забуференном растворе, например при pH в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5,или от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,5, или, в качестве альтернативы, приблизительно 5,0. Примеры буферов, которые подходят по pH в рамках этого диапазона, включают ацетат (например, ацетат натрия), сукцинат (такой как сукцинат натрия), глюконат, гистидин, цитрат и буферы других органических кислот. Концентрация буфера может быть от приблизительно 1 до приблизительно 200 мМ, или от приблизительно 10 до приблизительно 60 мМ, в зависимости, например, от конкретного буфера и необходимой изотоничности лекарственной формы. В лекарственную форму можно включить агент, влияющий на тоничность, который может также стабилизировать антитело. Примерные тоничные агенты включают полиолы, такие как маннитол, сахароза или трегалоза. Предпочтительно указанная водная лекарственная форма изотонична, хотя гипертонические или гипотонические растворы также могут являться подходящими. Примерные концентрации полиолов в лекарственной форме могут изменяться от приблизительно 1 до приблизительно 15% w/v(объемный вес). Поверхностно-активное вещество можно также добавить к лекарственной форме антитела для уменьшения аггрегации находящегося в лекарственной форме антитела и/или минимизирования образования твердых частиц в лекарственной форме и/или уменьшения всасывания. Примерные поверхностноактивные вещества включают неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбат 20 или полисорбат 80) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Примерные концентрации поверхностно-активного вещества могут изменяться в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,5%, или от приблизительно 0,005 до приблизительно 0,2%, или, в качестве альтернативы, от приблизительно 0,004 до приблизительно 0,01% w/v. В одном варианте реализации указанная лекарственная форма содержит обозначенные выше агенты(т.е. антитело, буфер, полиол и поверхностно-активное вещество) и является, по существу, свободной от одного или более консервантов, таких как бензиловый спирт, фенол, метакрезол, хлоробутанол и бензэ- 21015923 тония хлорид. В другом варианте реализации консервант может быть включен в лекарственную форму,например, в концентрации в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 2%, или, в качестве альтернативы, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1%. Один или более других фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ или стабилизаторов, таких как описанные вRemington's Pharmaceutical Sciences 16 ое изд., Osol, A. ред. (1980), могут быть включены в лекарственную форму при условии, что они не оказывают нежелательного влияния на необходимые свойства указанной лекарственной формы. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают дополнительные забуферивающие агенты; вспомогательные растворители; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие агенты, такие как EDTA; комплексные соединения металлов (например, комплексы Zn-белок); биодеградируемые полимеры, такие как полиэфиры; и/или солеобразующие противоионы, такие как натрий. Терапевтические лекарственные формы указанного антитела готовят для хранения и смешивания указанного антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington's PharmaceuticalSciences, 16 ое изд., Osol, A. Ed. (1980, в виде лиофилизованных лекарственных форм или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты(такие, как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалконий хлорид; бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и метакрезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин,глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы,включая глюкозу, маннозу, мальтозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара,такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN, PLURONICS или полиэтиленгликоль (ПЭГ). В одном варианте реализации подходящая лекарственная форма заявленного изобретения содержит изотоничный буфер, такой как фосфатный, ацетатный или TRIS буфер в комбинации с агентом, влияющим на тоничность, таким как полиол, сорбитол, сахароза или хлорид натрия, которые тонизируют и стабилизируют. Одним примером такого агента, влияющего на тоничность, является 5% сорбитол или сахароза. Кроме того, указанная лекарственная форма может включать поверхностно-активное вещество,например, для предотвращения аггрегации и для стабилизации, в количестве от 0,01 до 0,02% вес/об., pH указанной лекарственной формы может изменяться в диапазоне 4,5-6,5 или от 4,5 до 5,5. Другие примеры описания фармацевтических лекарственных форм для антител можно найти в US 2003/0113316 и патенте США номер 6171586, каждый полностью включен в данную заявку посредством ссылки. Заявляемая композиция может также включать более чем одно активное соединение, если необходимо для конкретного показания на лечение, предпочтительно таковые с комплементарными активностями, которые не оказывают нежелательного воздействия друг на друга. Например, может быть желательным дополнительно обеспечить иммуносупрессорным агентом. Такие молекулы подходящим образом присутствуют в комбинации, в количествах, которые эффективны для намеченного использования. Активные ингредиенты могут быть также включены в приготовленные микрокапсулы, например, с помощью методик коацервации или межфазной полимеризации, соответственно, например в микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из поли(метилметацилата), соответственно, в коллоидные системы для доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микрогранулы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Подобные методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16oe изд., Osol, A. ред. (1980). Также охвачены суспензии и кристаллические формы антител. Способы получения суспензий и кристаллических форм известны специалисту в данной области. Указанные лекарственные формы, применяемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Композиции согласно настоящему изобретению можно стерилизовать с помощью традиционных, широко известных методик стерилизации. Например, стерилизацию легко совершить путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. Полученные растворы можно упаковать для применения или фильтровать при асептических условиях и лиофилизировать, лиофилизированные препараты затем объединяют со стерильным раствором перед введением. Процесс замораживания-высушивания часто применяют для стабилизации полипептидов для длительного хранения, особенно когда полипептид относительно нестабилен в жидкой композиции. Цикл лиофилизации обычно состоит из трех этапов: замораживание, первичное высушивание и вторичное высушивание; Williams и Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, т. 38, номер 2, стр. 48-59 (1984). На этапе замораживания указанный раствор охлаждают до тех пор, пока он не замерзнет достаточно хо- 22015923 рошо. Вся вода в указанном растворе образует лед на этой стадии. Лед сублимируется на этапе первичного высушивания, который осуществляют путем уменьшения давления в камере ниже давления насыщенного пара льда, применяя вакуум. Наконец, абсорбированную или связанную воду удаляют на этапе вторичного высушивания при пониженном давлении в камере и повышенной температуре полки. В результате данного процесса образуется материал, известный как лиофилизированный пирог. После этого пирог можно ресуспендировать перед использованием. Стандартной процедурой ресуспендирования лиофилизированного материала является добавление некоторого объема чистой воды (обычно, эквивалентного объему, удаленному в процессе лиофилизации), хотя разбавленные растворы антибактериальных агентов иногда применяют при получении фармацевтических составов для парентерального введения; Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, т. 18, номера 11 и 12, стр. 1311-1354 (1992). Вспомогательные вещества в некоторых случаях, как было отмечено, действуют как стабилизаторы для лиофилизированных продуктов; Carpenter и др., Developments in Biological Standardization, том 74,страницы 225-239 (1991). Например, известные вспомогательные вещества включают полиолы (включая маннитол, сорбитол и глицерин); сахара (включая глюкозу и сахарозу) и аминокислоты (включая аланин,глицин и глутаминовую кислоту). Вдобавок, полиолы и сахара также часто используют для защиты полипептидов от повреждений,вызываемых замораживанием и высушиванием и для повышения стабильности во время хранения в высушенном состоянии. Обычно сахара, в частности дисахариды, являются эффективными как в процессах замораживания-высушивания, так и во время хранения. Другие классы молекул, включая моно- и дисахариды и полимеры, такие как поливинилпирролидон, также, как сообщалось, служили стабилизаторами лиофилизированных продуктов. Для инъецирования указанная фармацевтическая лекарственная форма и/или медикамент может быть порошком, подходящим для ресуспендирования в подходящем растворе, как описано выше. Примеры порошков включают, но не ограничены порошками, высушенными сублимацией, высушенными ротацией или полученными распылительной сушкой, аморфными порошками, гранулами, преципитатами или твердыми частицами. Для инъецирования указанные лекарственные формы могут содержать стабилизаторы, агенты, изменяющие pH, поверхностно-активные вещества, агенты, изменяющие биодоступность, и их комбинации. Можно приготовить препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие указанное антитело, данные матрицы находятся в виде имеющих определенную форму предметов, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт), полилактиды (патент США номер 3,773,919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-Lглутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислотыгликолевой кислоты, такие как Lupron Depot (инъекционные микрогранулы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и льюпролида ацетата) и поли-D-(-)-3-оксимасляную кислоту. Тогда как полимеры, такие как этиленвинилацетат и сополимер молочной и гликолевой кислот, позволяют добиться высвобождения молекул на протяжении 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких промежутков времени. Если инкапсулированные антитела остаются в организме в течение долгого времени, они могут денатурировать или аггрегировать в результате воздействия влаги при 37C, что приведет к потере биологической активности и возможно изменению иммуногенности. Целесообразные стратегии могут быть разработаны для стабилизации, в зависимости от вовлеченного механизма. Например, если обнаружили, что механизм аггрегации состоит в образовании межмолекулярных SS связей посредством тиодисульфидного обмена, стабилизации можно добиться путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контролирования содержания влаги, применения подходящих добавок и разработки специфичных композиций на основе полимерных матриц. Лекарственные формы согласно настоящему изобретению могут быть разработаны кратковременно действующими, быстро высвобождающими, длительно действующими или замедленно высвобождающими, как описано в данной заявке. Следовательно, указанные фармацевтические лекарственные формы также могут быть получены в лекарственной форме с контролируемым высвобождением или замедленным высвобождением. Конкретные дозировки можно подобрать в зависимости от состояния заболевания, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола и диеты субъекта, интервалов между дозами, путей введения, скорости выведения и комбинаций с другими лекарственными препаратами. Любые из вышеупомянутых форм дозировки, содержащих эффективные количества, ложатся в рамки обычного экспериментирования и, таким образом, ложатся в объем настоящего изобретениея. Указанный специфически связывающий агент или антитело вводят с помощью любых подходящих средств, включая парентеральное, подкожное, интраперитонеальное, внутрилегочное и интраназальное,- 23015923 и, если необходимо для локального лечения, введения внутрь поражения ткани. Парентеральные инфузии включают внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное, внутримышечное, интрадермальное или подкожное введение. Вдобавок, указанный специфически связывающий агент или антитело подходящим образом вводят путем импульсной инфузии, особенно со спадающими дозами указанного специфически связывающего агента или антитела. Предпочтительно дозу вводят путем инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, в зависимости, отчасти, от того, является ли введение кратковременным или продолжительным. Предлагаются также другие способы введения, включая топическое, особенно трансдермальное, трансмукозальное, ректальное, пероральное или локальное введение, например, с помощью катетера, помещенного рядом с желаемым местом. Наиболее предпочтительно специфически связывающий агент или антитело согласно настоящему изобретению вводили внутривенно в физиологическом растворе в дозе, находящейся в диапазоне между 0,01 и 100 мг/кг, с частотой от ежедневного введения до еженедельного, до ежемесячного (например, каждый день,через день, каждый третий день, или 2, 3, 4, 5 или 6 раз в неделю), предпочтительно в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 до 45 мг/кг, от 0,1 до 15 мг/кг или от 0,1 до 10 мг/кг, с частотой 2 или 3 раза в неделю,или вплоть до 45 мг/кг раз в месяц. Введение с другими агентами Антитела согласно настоящему изобретению также можно вводить совместно с другими противовоспалительными терапевтическими агентами. Совместное введение включает введение двух различных терапевтических агентов в различное время и различными путями, при условии, что существует перекрывание во времени, в течение которого указанные агенты оказывают свое терапевтическое действие. Примеры анти-c-Kit агентов, известные в данной области, включают иматиниба мезилат (Гливек). Следует отметить, что иматиниба мезилат также антагонизирует передачу сигналов от Abl тирозинкиназы и, таким образом, не является специфичным ингибитором c-Kit. Примеры Гуманизация SR-1. Антитело SR-1 гуманизировали прямой CDR-прививкой, и неожиданно оказалось, что не требуется обратных мутаций для сохранения аффинности, хотя необходимо было продемонстрировать желаемую функциональную активность. Каркасные области человека, которые сохранили большинство канонических остатков и не включали дополнительных остатков пролина, выбрали в качестве акцепторных последовательностей. На основании этого критерия акцепторная последовательность тяжелой цепи VH1 146 для каркаса I и II и VH1 1-е для каркаса III, с JH4 в качестве наиболее близкого J-участка (также известного как каркас IV). Акцепторная последовательность легкой цепи была VK4 B3 последовательность эмбрионального типа с JK2 в качестве наиболее близкого J-участка. Переключение изотипа совершали для получения IgG2, IgG1, IgG4P и агликозилированных IgG1 форм гуманизированного антитела человека. Консенсусный сайт N-связанного гликозилирования удаляли из последовательности константной области IgG1 человека путем мутации одного остатка аспарагина на глутаминовую кислоту в положении 297 (нумерация по Kabat). Гуманизированное антитело SR-1 в агликозилированной IgG1 (hSR-1 aIgG1) форме связывается необходимым образом с более высокой аффинностью к мембранному c-Kit по сравнению с растворимым cKit и является высоко мощным нейтральным антагонистом SCF и не опосредует напрямую агонизм c-Kit во всех тестах, основанных на клеточной системе, что проверяли с применением проксимального и дистального считывания сигналинга c-Kit. Агликозилированный IgG1 изотип выбрали, чтобы избежать эффекторной функции и лизиса клеток в результате неспецифических эффектов. Это антитело проявило неожиданный и желаемый период полувыведения, нелинейную ФК и насыщаемую опосредованную мишенью элиминацию антитела у обезьян. Оно также обедняло популяцию тучных клеток in vivo, как и ожидали. Связывание с c-Kit димером Активация c-Kit при его связывании фактором стволовых клеток (SCF) приводит к димеризации/олигомеризации, аутофосфорилированию и интернализации рецептора, наиболее вероятно, через клатрин-зависимый путь. Моноклональное антитело SR-1 связывает c-Kit димер с в 1000 раз большей аффинностью по сравнению с внеклеточным доменом растворимого c-Kit мономера, что определяли с помощью Biacore. Кинетическое моделирование позволило предположить, что SR-1 будет предпочтительно связывать нативный ассоциированный с мембраной рецептор, даже в присутствии нг/мл растворимого сброшенного мономера рецептора. Углеводы, присутствующие на гликопротеине, могут влиять на биологические и функциональные свойства. Гуманизация SR-1 до агликозилированной IgG1 формы показала, что параметры связывания были консервативны. Гуманизированное SR-1 aIgG1 связывалось с рекомбинантным c-Kit рецептор-Fc сKinExA kd равновесного связывания, равной 1.0 пМ, и, применяя Biacore анализ, hSR-1 aIgG1 блокировало связывание фактора стволовых клеток (SCF) с Ki=70 пМ. hSR-1 aIgG1 связывается с высокой аффинностью с димером рецептора, но не с мономером. Это важное свойство, перенос которого нельзя предсказать наверняка при гуманизации, и, как и растворимый c-Kit мономер, оно менее вероятно будет вы- 24015923 ступать в роли акцептора антитела in vivo. Ингибирование c-Kit-зависимой выживаемости клеток и передачи сигнала через рецептор Линии клеток мегакариобластов UT-7 человека необходим SCF для выживаемости и удаление SCF или его ингибирование приводит к быстрой потере жизнеспособности и пониженной пролиферации. Этот способ анализа пригоден для определения IC50 мощности SCF антагонистов. hSR-1 aIgG1 проявляло в среднем IC50, равную 35 пикомоль.hSR-1 aIgG1 эффективно ингибировало SCF-опосредованное c-Kit фосфорилирование и интернализацию в MO7e клетках, указывая на то, что указанное антитело может блокировать события SCFопосредованного c-Kit сигналинга. В противоположность обнаруженной природной способности SR-1 опосредовать интернализацию и фосфорилирование c-Kit, неожиданно, не было обнаружено никаких доказательств агонизма hSR-1 aIgG1 при проксимальном считывании фосфорилирования c-Kit рецептора в MO7e. Стоить заметить, для hSR-1 IgG2, IgG2 антитело было несколько менее эффективным и не ингибировало полностью SCF-опосредованную интернализацию c-Kit рецептора.hSR-1 aIgG1 при концентрации 1,0 мкг/мл проявило нейтрализацию синергитического действияSCF на образование колоний, произошедших от ГМ-КСФ культуры первичных очищенных CD34+,CD117+ (c-Kit) клеток костного мозга человека. В соответствии с нашим неожиданным открытием, hSR1 aIgG1 не опосредует интернализацию или фосфорилирование c-Kit, и не наблюдалось присущей hSR-1aIgG1 агонистической активности выживаемости вплоть до концентрации 10 мкг/мл указанного антитела в этом тесте. Фактически, указанное антитело было способно ингибировать выживаемость до более низкой, чем основной уровень выживаемости. Отсутствие аггрегации тучных клеток, активность CDC и FcR Культивируемые тучные клетки человека, полученные из CD34+ клеток костного мозга, использовали для оценки выраженной эффективности и упорядочивания соединений. hSR-1 aIgG1 ингибировалоSCF-зависимую выживаемость тучных клеток, не сообщало сигнал выживаемости тучным клеткам, не опосредовало фосфорилирование c-Kit рецептора (фиг. 3) и не проявляло способность опосредовать гомотипическую аггрегацию тучных клеток. Наоборот, hSR-1 IgG2 было способно блокировать SCFзависимую выживаемость тучных клеток, но само по себе проявило частичную агонистическую активность, сообщая сигнал выживаемости, опосредовало фосфорилирование c-Kit рецептора и приводило к воспроизводимому действию на кластеризацию тучных клеток. Не наблюдали неожиданных аномалий при использовании hSR-1 aIGg1, когда это антитело вводили in vivo не принадлежащим человеку приматам в дозе вплоть до 30 мг/кг раз в неделю в течение 4 недель или вплоть до 150 мг/кг подкожно раз в неделю в течение 2 недель.hSR-1 aIgG1 не проявило детектируемого неспецифичного связывания FcR с U-937 клетками, экспрессирующими Fc рецептор I = CD64, Fc рецептор II = CD32 и Fc рецептор III = CD16. Наоборот,связывание SR-1 IgG1 и IgG4P изотипов обнаруживалось предположительно с высокоаффинным FcyRI. Таким образом, не была предсказана ADCC активность для hSR-1 aIgG1, и экспериментальные данные на данный момент не проявили комплемент-зависимой цитотоксичной смерти клеток. Агликозилированные химерные IgG1 антитела мыши/человека, как сообщалось, сохраняли некоторую эффекторную функцию (Hybridoma. 1991 Apr; 10(2):211-7) и поэтому эти желаемые активности hSR-1 aIgG1 были неожиданными. Данные показывают, что применение стандартных методик и, таким образом, выбор обычных IgG2 или IgG1, или IgG4 изотипов не дал бы молекулу с подходящими свойствами, которая являлась бы высокоаффинным связывателем, функционально нейтральным антагонистом c-Kit и которое не активировало бы тучные клетки. Фармакокинетика Предварительные исследования ФК проводили, чтобы сравнить ФК hSR-1 IgG2 и hSR-1 aIgG1 у самцов яванского макака после однократного введения внутривенно или подкожно в количестве 3 мг/кг. Временные зависимости указывают на нелинейную ФК для обоих. Концентрации понижались более быстро при более низких концентрациях. Два антитела проявили сходные воздействие, что измеряли поC0/Cmax и AUC0-tкон, после однократного внутривенного или подкожного введения яванским макакам. На основании AUC0-tкон, выведение из сыворотки было приблизительно 0,3 мл/ч/кг для обоих гуманизированных антител. Биодоступность была приблизительно 82% и 69% для hSR-1 aIgG1 и hSR-1 IgG2 версий гуманизированного SR-1, соответственно, после подкожного введения. На основании предварительных данных воздействия SR-1 и гуманизированных антител при повторных введениях африканским зеленым обезьянам раз в неделю, гуманизированные антитела достигали большего воздействия по сравнению с SR-1. Стоит заметить, что hSR1-aIgG1 оказалось лучшим в группе по ФК, и ранее было продемонстрировано, что степень гликозилирования молекулы может изменять фармакокинетические свойства и, в случае антитела, его метаболизм и другие биологические свойства. Cancer Immunol Immunother. 1992;35(3): 165-74. Таблица 2. Оценка фармакокинетических параметров после однократного внутривенного (BB) или подкожного (ПК) введения hSR-1 IgG2 или hSR-1 aIgG1 в количестве 3 мг/кг самцам яванского макакаC0 - оцененная начальная концентрация после внутривенного введения дозыCmax - максимальная концентрация после подкожного введения дозы;AUC0-tкон - область под кривой концентрация-время, начиная с времени 0 до конечной точки времени с измеримой концентрацией;CL - клиренс после внутривенного введения дозы;CL/F - выраженный клиренс после подкожного введения дозы;a Клиренс рассчитывали на основании AUC0-tкон - не установлено;C0, Cmax, AUC0-кон, CL, CL/F и F% представлены на 3 значимых фигурах. Определение дозировок для людей Минимальной эффективной дозой в ФД модели ранения с экспансией тучных клеток является 0.3 мг/кг, вводимое раз в неделю в течение 2 недель обезьянам. На основании пересчета дозировки, основанного на поверхности тела, минимальная эффективная доза для человека рассчитана как 0.1 мг/кг с эквивалентным режимом дозировки. Тем не менее, это лишь предварительная оценка, так как соотношение ФК и фармакодинамики между степенью и продолжительностью hSR-1 aIgG1 ингибирования c-Kit у человека и клинический результат не известны на данный момент. Более точная оценка будет проведена,когда будет доступно больше фармакокинетических и фармакодинамических данных. Эффективность in vivo: обеднение тучными клетками базального легкого и толстой кишки у обезьян с помощью SR-1 и hSR-1 aIGg1. У человека тучные клетки MCt, экспрессирующие триптазу и не имеющие химазы, располагаются преимущественно в тканях слизистых, таких как легкое и толстая кишка, и этот подтип был обнаружен в коже и на высоких уровнях у некоторых пациентов, страдающих склеродермой, что позволило предположить возможную альтернативную активацию тучных клеток при этом патологическом состоянии. Тучные клетки MCtc, экспрессирующие как триптазу, так и химазу, также были колокализованы в некоторых из этих тканей и сходным образом были связаны со склеродермией и другими фиброзными патологическими состояниями. Следовательно, оба подтипа будут представлять первоочередные мишени для ингибитора c-Kit при заболеваниях с участием слизистой и соединительной ткани (например, ИФЛ, системный склероз, астма, ревматоидный артрит и воспалительное заболевание кишечника). Терапевтические препараты также должны быть высоко мощными, эффективными и иметь хороший объем распределения и ФК, так как тучные клетки, как правило, долгоживущие и постоянно находятся в ткани. Более того, тучные клетки в значительной степени неактивны до активации к дегрануляции и de novo синтезу медиаторов, после чего они играют ключевую роль в воспалительном ответе. Целью исследований in vivo было продемонстрировать обеднение базальной слизистой и соединительной ткани тучными клетками, такими как присутствующие в легком и толстой кишке, и определить эффекты на гемопоэз и эффекты на клетки-предшественники, а также вклад в эритропоэз, меланогенез и сперматогенез (таким образом, применение для контрацепции самцов) после продолжительного и высоко фракционного ингибирования c-Kit. Моноклональное антитело SR-1 было выбрано на основании его эквивалентной функциональной эффективности по отношению к c-Kit человека и обезьяны в CD34+ клетках костного мозга при анализе колониеобразующей активности (CFU) (ингибирование при концентрации 1,0 мкг/мл), и его ФК у обезьян.SR-1 вводили в дозах в диапазоне от 3 до 30 мг/кг раз в неделю в течение 4 недель. В некоторых исследованиях было показано, что популяция базальных тучных клеток толстой кишки была максимально обеднена после 2 доз на день 14 (минимальная концентрация препарата, определяемая непосредственно перед введением новой дозы Ctroughв 800 раз, чем 50% ингибиторная концентрация IC50 клеток), и, следовательно, день 14 был выбран как временная точка для определения фармакологической активности cKit антагонистов на базальных тучных клетках толстой кишки. В практических целях, базальные тучные клетки легкого оценивали на день 28 во время некропсии и окончания исследования. При дозе SR-1 3.0 мг/кг, вводимой раз в неделю, обеднение популяции базальных тучных клеток легкого наблюдали при уровне Ctrough ФКв 200 раз, чем UT-7 клеточная IC50. Влияние более низких дозSR-1 на базальные тучные клетки толстой кишки и тучные клетки легкого, меланогенез и сперматогенез не оценивали. Тем не менее, выполнили исследование с hSR-1 aIgG1 при более низких дозах, как 0,3, 1,0 и 3,0 мг/кг. Уровни Ctrough на день 14 были в 200, 2000 и 8000 раз, чем IC50 клеткок, и эти Ctrough уровни соответствовали отсутствию эффективности, обеднению примерно половины популяции (69%) и практически полному обеднению популяции (96%) базальных тучных клеток толстой кишки (данные суммированы в табл. 2). Соотношение воздействия, клеточной эффективности и действия hSR-1 aIgG1 соответствует таковым для обнаруженных у SR-1. Эффективность in vivo SR-1 и hSR-1 aIGg1 в фармакодинамической модели ранения с экспансией тучных клеток у обезьян За повреждением кожи следует сильный воспалительный ответ, при котором сначала нейтрофилы,а затем макрофаги и тучные клетки мигрируют из находящихся рядом тканей и из кровотока, происходит грануляция и реэпителизация тканей и связанное с фибробластами стягивание подстилающей рану соединительной ткани (Diegelmann RF, и др., Front. Biosci. 2004, янв. 1;9:283-9). Нанесение кожной раны является моделью для исследования механизмов, которые могут быть близки к таковым при фиброзе, так как многие из участвующих в нем типов клеток связаны с этим заболеванием. Более того, сообщали, что у людей ранение кожи связано с повышением количества происходящего от фибробластов SCF и активацией и увеличением плотностей тучных клеток (Trautmann A, и др., J. Pathol. 2000, янв; 190(1): 100-6). После ранения кожи обезьяны количество тучных клеток увеличивалось зависящим от времени образом с плато, которое достигалось через 14 дней после ранения, которое сравнимо с моделью для человека. Дозировки 0,3, 1 или 3 мг/кг SR-1, вводимые раз в неделю, позволили достичь примерно максимального ингибирования активированной ранением экспансии тучных клеток на день 14 (фиг. 1). Максимальное ингибирование определено как способность блокировать на 100% увеличение количества тучных клеток по отношению к исходному уровню на день 14 после ранения. Уровни Ctrough для дозы 0,3 мг/кг былив 7 раз большими, чем UT-7 IC50 на день 14 (табл. 3). К 3 неделе уровни в сыворотке были приблизительно в 2 раза большими, чем UT-7 IC50, и при этом воздействии наблюдали лишь частичное ингибирование (фиг. 1). На 3 неделе максимальная эффективность все еще наблюдалась как для 1 мг/кг,так и для 3 мг/кг групп, где уровни Ctrough в сыворотке сохранялись на уровнев 200 раз, чем IC50. Эти исследования позволяют предположить, что постоянное Ctrough воздействие концентрациив 7 раз, чемIC50, похоже, требуется для максимального ингибирования размножившихся после ранения тучных клеток. Дозировки 0,3, 1,0 и 3,0 мг/кг hSR-1 aIgG1 оценивали на основании максимальной эффективности,показанной для SR-1 в этой модели. При самой низкой тестируемой дозе (0,3 мг/кг) максимальное ингибирование индуцированной ранением экспансии тучных клеток наблюдали в пределах 2 недель. УровниCtrough в сыворотке к этому моменту былив 200 раз, чем UT-7 IC50 (табл. 3). В табл. 3 суммированы ФД/ФК эффекты SR-1 и hSR-1 aIGg1 в ФД модели ранения. Таблица 3 Наносили инцизионную рану, после чего следовала пункционная биопсия вплоть до 21 дня у человека (слева) или не принадлежащего человеку примата (справа) (фиг. 2). Тучные клетки и/или экспрессирующие SCF фибробласты выявляли хромогенной краской или иммуногистохимией, соответственно. У- 27015923 человека экспрессия SCF повышается и возвращается на исходный уровень и после этого следует временный подъем числа тучных клеток во время нормального заживления раны. Сходный ответ тучных клеток на ранение наблюдался у обезьяны. Во время фиброза и нарушенного заживления ран экспрессияSCF и число тучных клеток остаются повышенными (фиг. 2). Гемопоэз и меланогенез Генетика мышей показывает, что c-Kit играет роль в гемопоэзе во время эмбрионального развития, но у гетерозигот человека инактивирующие и/или с потерей функции мутации c-Kit у людей с идиопатической дисхромией кожи ("пегой кожей") не были связаны с гематологическими аномалиями. SCF и c-Kit важны для гемопоэза человека, так как SCF используется в комбинации с G-CSF для мобилизации гематопоэтических стволовых клеток. Более того, ингибитор множества киназ Гливек, который нацелен преимущественно наBCR-ABL, рецептор фактора роста тромбоцитов и c-Kit, имеет в качестве первичного фармакологического эффекта миелосупрессию, и тяжелые формы анемии и тромбоцитопении 3-4 степени сообщали для GIST пациентов (Hensley ML, и др., Semin. Hematol. 2003, Apr; 40 (2 Suppl 2):21-5). Генетика мышей свидетельствует о том, что c-Kit играет роль в мигрировании меланобластов из нервного гребня во время эмбриогенеза, и эта роль подтверждена для человека с пегой кожей. Сообщали, что Гливек вызывает "полосатую" депигментацию волос у небольшого числа GIST пациентов, но это было не постоянное наблюдение, и о гиперпигментации также сообщали. Нельзя исключать вклад других киназ, таких как ТРФ. Исследования на мышах с ингибиторами множества киназ и антителом к c-Kit показало, что ингибирование пигментации волос полностью обратимо, позволяя предположить, что ингибирование c-Kit влияет на функцию меланоцитов, а не на выживаемость в послеродовом окруженииSR-1 применяли в исследованиях на определение диапазона доз от 3 до 30 мг/кг, вводимых раз в неделю в течение 4 недель, чтобы определить воздействие, требуемое для ингибирования гемопоэза,сперматогенеза и активного меланогенеза. Исследование на цельной крови, включая расчет количества клеток, выполняли на образцах крови, взятых на исходном уровне, на день 4, 7, 14, 21 и 28 после начала исследования. Анализ свежевыделенных образцов крови выполняли в госпитале имени королевы Елизаветы, в лаборатории Клинической гематологии, в Барбадосе. Не было обнаружено значительного вклада SR-1, по сравнению с контрольными субъектами и исходными значениями, в любой из проанализированных гематологических параметров, хотя не наблюдали значительного уменьшения количества эритроцитов у животных, которых лечили препаратом, через 4 недели после начала введения доз. При самой высокой протестированной дозе, 30 мг/кг раз в неделю в течение 4 недель, были достигнуты уровни воздействия св 70,000 раз, чем UT-7 IC50 эффективностью. Отсутствие значительного влияния на гематологические параметры было подтверждено гистопатологическим анализом костного мозга, не показавшим различий между группой, которой назначали препарат и контрольной группами и не показавшим обеднения популяции CD117-положительных гематопоэтических стволовых клеток, что позволило предположить наличие потенциальных дополнительных путей гемопоэза у африканской зеленой обезьяны, как представителя не относящихся к человекообразным обезьянам приматов. Также исследовали эффект 3-30 мг/кг, вводимых раз в неделю в течение 4 недель,на меланогенез, так как его можно применить при меланоме. Для оценки влияния на активированные меланоциты, которые могут лучше отражать состояние заболевания, проводили удаление шерсти для активации меланогенеза. Нормальный цвет шерсти визуально не изменялся в любой группе. Тем не менее, ингибирование пигментации кожи до различных степеней наблюдали во вновьрастущей шерсти у обезьян, получающих дозу 30 мг/кг. Не наблюдали эффекта в группе, получавшей 10 мг/кг, что позволило предположить, что неэффективная доза находится в диапазоне между 10-30 мг/кг. В группе, получавшей 10 мг/кг, воздействие SR-1 былов 8000 раз, чем UT-7 IC50. Максимальная эффективность обеднения тучными клетками достигалась прив 7 раз, чем UT-7 IC50. Эти данные позволили предположить,что ингибирование c-Kit влияет на функцию меланоцитов, и что более высокие дозы/время воздействия могут быть необходимы для блокирования заболеваний, характеризующихся избыточной активностью меланоцитов. Сперматогенез Исследования на мышах показали, что c-Kit важен для сохранения и пролиферации дифференцированных c-Kit рецептор-позитивных сперматогониев, но не для начального этапа дифференцировки сперматогониальных клеток. Как самцы, так и самки пегих субъектов, которые являлись гетерозиготами по инактивированной аллели c-Kit рецептора, были фертильными, предполагая, что такая степень инактивации c-Kit, похоже, не влияет на развитие, сперматогенез или оогенез примордиальных клеток. Антитело SR-1 показало зависимое от дозы ингибирование сперматогенеза от 0.3-30 мг/кг. Доза 0.3 мг/кг раз в неделю приводила к меньшему, чем максимальный, эффекту, наблюдаемому при более высоких дозах, и для определения ED50 требуются более низкие диапазоны доз. Достигаемые воздействия были в 7 раз больше, чем UT-7 IC50, которая отражает воздействие, требуемое для максимальной эффективности в модели ранения с экспансией тучных клеток. Экстраполяция ФК позволила предположить,что указанное антитело может, видимо, окончательно выводиться через 1 месяц после последней дозы,- 28015923 но период в 9 месяцев был выбран в качестве консервативной точки времени для оценки восстановления. Нормальный сперматогенез обнаруживали через 9 месяцев у всех животных, которым вводили дозы, что показало что hSR-1 aIgG1-подобную молекулу можно применять в качестве контрацептива самцов. Резюме Гуманизированное анти-c-Kit агликозилированное IgG1 (hSR-1 aIgG1) антитело представляет собой высоко мощное и специфичное антитело, которое является нейтрализующим во всех тестах, основанных на клеточной системе, анализируемых с использованием проксимальной и дистальной оценки c-Kit сигналинга. По своей природе, оно не опосредует интернализацию или фосфорилирование c-Kit рецептора,как сообщали для родительского моноклонального SR-1 антитела мыши. Выбор агликозилированногоIgG1 изотипа из изотипов гуманизированных IgG1, IgG2 и IgG4 нельзя было бы предсказать на основании стандартных подходов. hSR-1 aIgG1 было выбрано опытным путем посредством новаторского экспериментирования, и было показано, что оно проявляло подходящие фармакологические свойства для мембранного c-Kit рецептора, не обладало агонистической активностью по отношению к c-Kit и тучным клеткам, также наблюдали отсутствие эффекторной функции и смерти клеток вследствие неспецифического действия. Это антитело проявило хорошие биодоступность при подкожном введении и период полувыведения, нелинейную ФК и насыщаемую опосредованную мишенью элиминацию антитела и обеднение популяции тучных клеток у обезьян. Эти данные указывают на подходящую эффективную для человека дозу обеднения популяции тучных клеток. Минимальная эффективная доза родительского SR-1 моноклонального антитела мыши в ФД модели ранения обезьян была 0,3 мг/кг (Ctroughв 7 раз, чем IC50 для клеток), и при несколько большем воздействии (Ctroughв 800 раз, чем IC50 для клеток) была также эффективной в обеднении тучными клетками базального слоя кожи, толстой кишки и легкого. Сходным образом, уровни воздействия выше, чемв 8000 раз, чем IC50 для клеток, были необходимы перед тем, как наблюдали количественное влияние на пигментацию шерсти в заново растущей шерсти. Ингибирование пигментации шерсти в заново растущей шерсти сообщалось для ингибиторов множества киназ и антител к c-Kit у грызунов, и hSR-1 aIgG1 может иметь применение в заболеваниях, связанных с избыточной активностью меланоцитов. Этот эффект обратим при прекращении лечения. Эффект ниже максимального на ингибирование сперматогенеза был показан при уровняхв 7 раз, чем IC50 для клеток, воздействие, которое придавало максимальную эффективность в ФД модели ранения. Все из вышеупомянутых патентов США, публикаций заявок на патент США, заявок на патент США, иностранных патентов, иностранных заявок на патент и не патентных публикаций, на которые ссылались в описании настоящего изобретения и/или перечисляли в перечне данных заявки, полностью включены в данную заявку посредством ссылки. Из упомянутого выше должно быть очевидно, что, хотя конкретные варианты реализации настоящего изобретения были описаны в данной заявке с целью иллюстрации, различные его модификации можно получить без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения.

МПК / Метки

МПК: A61P 43/00, C07K 16/28, A61P 35/00, A61P 37/00, A61K 39/395, C07K 16/32

Метки: гуманизированное, антитело, применение, c-kit

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/30-15923-gumanizirovannoe-antitelo-k-c-kit-i-ego-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Гуманизированное антитело к c-kit и его применение</a>

Похожие патенты