Способ диагностики и прогнозирования вич инфекции у человека

Номер патента: 5290

Опубликовано: 30.12.2004

Автор: Эуген-Ольсен Йеспер

Есть еще 17 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ диагностики или прогнозирования ВИЧ-инфекции у индивидуума, содержащий этапы

(a) проведения in vitro измерения в образце биологической жидкости индивидуума уровня содержания одного или более маркеров в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR) и/или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR), и/или одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и

(b) использования полученного измеренного значения для оценки состояния индивидуума.

2. Способ диагностики или прогнозирования ВИЧ-инфекции у индивидуума, содержащий этапы

(a) проведения in vitro измерения в образце биологической жидкости индивидуума уровня содержания маркера в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR) или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и

(b) использования полученного измеренного значения для оценки состояния индивидуума.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что образцом биологической жидкости является образец мочи, причем измерение маркера нормируется к общему концентрационному уровню образца.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что этап (a) осуществляют с помощью щупа-индикатора.

5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что этап (a) осуществляют с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа ELISA.

6. Способ оценки развития состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией, содержащий этапы

(a) проведения in vitro измерения в каждом из нескольких образцов биологической жидкости индивидуума уровня содержания одного или более маркеров в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), и/или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR), и/или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), причем образцы отбирают в различные моменты времени, и

(b) использования полученных измеренных значений для оценки развития состояния индивидуума.

7. Способ оценки развития состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией, содержащий этапы

(a) проведения in vitro измерения в каждом из нескольких образцов биологической жидкости индивидуума уровня содержания маркера в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR) или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), причем образцы отбирают в различные моменты времени, и

(b) использования полученных измеренных значений для оценки развития состояния индивидуума.

8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что индивидуум, состояние которого оценивается, находится в стадии лечения.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что пациент подвергается высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ).

10. Применение набора ELISA, содержащего

(a) планшет с несколькими ячейками,

(b) один или несколько улавливающих агентов, иммобилизованных на поверхности ячеек и способных улавливать один или несколько маркеров в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), и/или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR), и/или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и

(c) связывающийся компонент, способный связываться с указанным маркером, причем связывающийся компонент содержит

(d) систему метки,

в качестве набора для оценки физического состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией.

11. Применение набора ELISA, содержащего

(a) планшет с несколькими ячейками,

(b) улавливающий агент, иммобилизованный на поверхности ячеек и способный улавливать маркер в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR) или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и

(c) связывающийся компонент, способный связываться с указанным маркером, причем связывающийся компонент содержит

(d) систему метки,

в качестве набора для оценки физического состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией.

12. Набор щупа-индикатора для оценки физического состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией, содержащий

(a) щуп-индикатор, приспособленный для приведения в контакт с образцом биологической жидкости и содержащий устройства для визуального представления результата оценки,

(b) один или несколько улавливающих агентов, иммобилизованных на поверхности щупа-индикатора и способных улавливать один или несколько маркеров в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), и/или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR), и/или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и

(c) связывающийся компонент, способный связываться с указанным маркером, причем связывающийся компонент содержит

(d) систему метки.

13. Набор щупа-индикатора для оценки физического состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией, содержащий

(a) щуп-индикатор, приспособленный для приведения в контакт с образцом биологической жидкости и содержащий устройства для визуального представления результата оценки,

(b) улавливающий агент, иммобилизованный на поверхности щупа-индикатора и способных улавливать маркер в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR), или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и

(c) связывающийся компонент, способный связываться с указанным маркером, причем связывающийся компонент содержит

(d) систему метки.

14. Набор по п.12 или 13 или применение по п.10 или 11, отличающиеся тем, что улавливающий агент является антителом к маркеру.

15. Набор по любому из пп.12-14 или применение по любому из пп.10, 11 или 14, отличающиеся тем, что связывающийся компонент является антителом к маркеру.

 

Текст

Смотреть все

1 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к диагностике и/или прогнозированию ВИЧ-инфекции. Конкретнее оно относится к измерениям концентрации растворимого рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) в биологических жидкостях человека (мокроте,кистозной жидкости, асцитах, сыворотке, плазме, моче) как средству диагностирования ВИЧинфекции, а также прогнозирования развития болезни. Уровень техники Клеточный рецептор для урокиназы(uPAR, CD87) имеет множественные функции в миграции и адгезии клеток, внеклеточном протеолизе и регенерации тканей [Blasi, 1997].uPAR экспрессируется большинством лейкоцитов, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы и тромбоциты. uPAR является антигеном активации в моноцитах и Т-клетках [Min, 1992;Nykjaer, 1994], а Т-клетки от инфицированных ВИЧ-1 индивидуумов дают повышенный уровень экспрессии uPAR [Nykjaer, 1994]. Заражение лейкоцитов ВИЧ-1 in vitro приводит к регуляции с активацией экспрессии uPAR на клеточной поверхности в процессе, который, повидимому, на какое-то время согласуется с началом вирусной репликации [Frank, 1996; Speth,1998].uPAR может высвобождаться с клеточной поверхности, образуя растворимую форму рецептора (suPAR), лишeнную якорной части дляGPI. Механизм высвобождения не вполне понятен, но оно может происходить путем гидролитического отщепления якорной части для GPIGPI-специфической фосфолипазой D [Wilhelm,1999]. Растворимые формы uPAR (suPAR) были идентифицированы в надосадочных жидкостях культур клеток и в различных биологических жидкостях, таких как асциты опухолей, кистозная жидкость, сыворотка, плазма, а недавно также и в моче [Pedersen, 1993; Ronne, 1995;Stephens, 1997; Sier, 1998; Chavakis, 1998; Stephens, 1999; Wahlberg, 1998; Sier, 1999]. Уровни suPAR в сыворотке, плазме и моче повышены у пациентов, страдающих различными типами рака [Stephens, 1997; Sier, 1998; Stephens, 1999; Sier, 1999], имеющих синдром спазматической ночной гемоглобинуремии(PNH-синдром) [Ronne, 1995; Ninomiya, 1997], и у пациентов с ревматоидным артритом [Slot,1999]. Кроме того, уровень suPAR в плазме является прогностическим маркером общей выживаемости у пациентов с раком яичников и прямой кишки [Sier, 1998; Stephens, 1999] и восприимчивости к терапии при лейкемии[Mustjoki, 1999]. Клеточное происхождение циркулирующего suPAR неизвестно. Многие (если не все) из клеток, экспрессирующих uPAR, высвобождают также растворимые формы рецептора при куль 005290 2 тивировании in vitro. Было высказано предположение, что источник избыточного сывороточного suPAR у раковых пациентов связан с раковыми клетками и/или просачивающимися в опухоль макрофагами, так как эти клетки часто обнаруживают высокий уровень экспрессииuPAR [Stephens, 1997], а опыты на мышах с пересадками ткани, имеющих опухоли человека,действительно продемонстрировали, что опухолевая ткань не высвобождает suPAR в кровоток и мочу [Holst-Hansen, 1999]. Инфицированные ВИЧ-1 люди представляют собой единственную когда-либо в истории наиболее полно обследованную группу пациентов. Несмотря на эти очень интенсивные обследования, для широкого клинического использования были признаны достаточно надeжными только несколько прогностических маркеров,обеспечивающих долгосрочные предсказания клинической картины. Обычно используемые прогностические маркеры развития заболевания у не подвергавшихся лечению пациентов, инфицированных ВИЧ-1, по существу, ограничиваются определением концентрации в крови СD4-позитивных лимфоцитов (подсчeт СD4 клеток), уровня РНК ВИЧ-1 в плазме (вирусная нагрузка) и возраста пациента. Подсчeт CD4+ Т-клеток является общим маркером иммунодефицита, тогда как вирусная нагрузка ВИЧ даeт прямую информацию о вирусной репликации. Хотя эти два параметра основаны на различных подходах, они оба дают информацию об ожидаемой клинической картине и прогноз для пациента. В некоторых случаях один из двух анализов полезнее другого, поэтому считают, что оба маркера являются независимыми параметрами для многопараметрического анализа. Следовательно, предпочтительно одновременное использование обоих маркеров. Другие потенциально прогностические маркеры, такие как возраст пациентов или уровень 2-микроглобулина, дают дополнительную информацию, однако, их значение обычно уменьшается, если они используются в многопараметрических анализах вместе с анализом CD4+ или вирусной нагрузки. После начала высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) вирусная нагрузка резко снижается, а подсчeты CD4 Т-клеток стабилизируются, что снижает клиническую пользу этих маркеров для прогностических/диагностических целей. Следовательно, для мониторинга пациентов при ВААРТ крайне необходимы новые маркеры. Измерения количества СD4-клеток и вирусной нагрузки ВИЧ-1 дороги и требуют специального оборудования (проточные цитометры и ПЦР-аппараты), которое едва ли доступно для широкого использования в таких развивающихся странах, как Уганда, Руанда и Намибия. В этих странах инфицировано около 30% населе 3 ния в возрасте от 20 до 49 лет (данные на октябрь 1999 г.). Сущность изобретения Техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в том, чтобы предоставить новый маркер для диагностики и прогнозирования ВИЧ-инфекции. Другая техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение,состоит в том, чтобы предоставить маркер указанного типа, который прост и доступен для измерения. Настоящее изобретение обеспечивает решение указанных выше технических проблем,при этом изобретение направлено на способ диагностики или прогнозирования ВИЧинфекции у индивидуума, содержащий следующие этапы:(a) проведение in vitro измерений в образце биологической жидкости индивидуума уровня содержания маркера в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (urokinaseplasminogen activator receptor, uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (soluble urokinase plasminogenactivator receptor, suPAR), (iii) активатора плазминогена урокиназного типа (urokinase-typeplasminogen activator, uPA), (iv) одного или более продуктов расщепления (деградации) (i), (ii) или (iii), и/или (v) мРНК для (i), (ii) или (iii), и(b) использование полученного измеренного значения для оценки состояния индивидуума. Изобретение основано на обнаружении того, что уровень содержания растворимого uPAR(suPAR) повышен в сыворотке, плазме и моче ВИЧ-инфицированных индивидуумов и что уровень содержания suPAR может быть использован как диагностический маркер. К тому же уровень suPAR у ВИЧ-инфицированных индивидуумов является прогностическим для развития СПИДа, снижения количества CD4 Т-клеток и смерти. Уровень suPAR является новым и в высокой степени диагностическим и прогностическим показателем, даже при наличии других известных прогностических показателей, относящихся к ВИЧ-заболеванию. Действительно, в различных многопараметрических анализах,включающих все известные в настоящее время существенные параметры, связанные с выживанием, suPAR был вторым по значению наиболее надежным параметром вслед за подсчетом CD4 Т-клеток. В сравнении с анализом CD4, suPAR сохранял свое высоко достоверное прогностическое значение (коэффициент риска (КР) был равен 2,5 при р 0,001), тогда как другие маркеры с меньшей достоверностью были связаны с выживаемостью. Кроме того, настоящее изобретение основано на обнаружении того, что по крайней мере у некоторых ВИЧ-пациентов не только повышен общий уровень suPAR, но изменяется также соотношение между различными вариантами 4 продуктов расщепления suPAR. Распределение этих вариантов у некоторых подгрупп пациентов четко отличается от распределения у здоровых доноров крови. Поэтому измерение содержания одного или более из продуктов расщепления suPAR также можно использовать в качестве маркера для диагностики и прогнозирования ВИЧ-инфекции. Далее, настоящее изобретение основано на понимании того, что количество suPAR коррелирует с количеством uPAR, а также и с количеством uРА и что поэтому количества uPAR иuРА в равной степени могут служить диагностическими и прогностическими индикаторами ВИЧ-инфекции. Наконец, если uPAR, suPAR и uРА присутствуют в больших количествах, т.е. уровень их экспрессии высок, это означает, что наличествует высокий уровень содержания мРНК для указанных белков и поэтому указанные мРНК в равной степени пригодны как диагностические и прогностические индикаторы ВИЧ-инфекции. Дополнительное преимущество настоящего изобретения состоит в том, что измерение количества suPAR можно осуществлять с использованием, например, простого метода твердофазного иммуноферментного анализа ELISA,или даже с помощью щупа-индикатора (stick). Поэтому такое измерение может быть очень недорогим, простым и быстрым дополнением к обычно используемым средствам прогнозирования для ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Таким образом, в развивающихся странах,не имеющих средств для проведения дорогостоящих анализов, используемых в западных странах, уровни suPAR можно использовать 1) для определения ВИЧ-статуса (диагноз),2) для отбора пациентов для лечения (прогноз) и 3) для слежения за ходом лечения. Кроме того, настоящее изобретение имеет то преимущество, что, в то время как для измерений содержания СD4-клеток и вирусной нагрузки ВИЧ необходим отбор пробы крови,уровни содержания suPAR могут быть измерены также и в образцах мочи, а получить пробы мочи, безусловно, гораздо легче. Далее, настоящее изобретение относится к способу оценки изменения состояния ВИЧинфицированного индивидуума, содержащему следующие этапы:(a) проведение in vitro измерения в каждом из нескольких образцов биологической жидкости индивидуума уровня содержания маркера в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR), (iii) активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), (iv) одного или более продуктов расщепления (i), (ii) или (iii), и/или(b) использование полученных измеренных значений для оценки развития состояния индивидуума. Этот способ может быть применeн для постоянного мониторинга состояния пациента. Наконец, настоящее изобретение относится к набору для ELISA в соответствии с п.8 формулы изобретения и к набору щупаиндикатора в соответствии с п.9 формулы изобретения. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 показывает так называемое представление в виде столбцов с усами (boxwhisker plot) концентраций suPAR для группы здоровых доноров крови и для группы ВИЧпозитивных индивидуумов. Фиг. 2 показывает так называемый анализ выживаемости по Kaplan-Meier, представляющий зависимость вероятности выживания от времени в месяцах для 191 ВИЧ-позитивных пациентов, разделенных на 3 группы на основании концентраций suPAR в сыворотке. Фиг. 3 показывает соотношение концентраций suPAR и креатинина в моче для группы ВИЧ-негативных добровольцев и для группы пациентов, подвергнутых ВААРТ. Фиг. 4 показывает уровни suPAR для двух групп пациентов в ходе ВААРТ, определенных по U-тесту Mann-Whitney (p=0,05). Фиг. 5 показывает распределение времени начала СПИДа для пациентов с высоким и низким уровнем suPAR. Фиг. 6 представляет график длительности выживания для пациентов с высоким и низким уровнем suPAR. Фиг. 7 представляет диаграмму, показывающую подсчеты CD4 Т-клеток для пациентов с высоким и низким уровнем suPAR. Фиг. 8 представляет диаграмму, показывающую уровень suPAR для пациентов с ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Фиг. 9 представляет график периода выживания для всех ВИЧ-позитивных пациентов. Фиг. 10 представляет график периода выживания для всех позитивных по ВИЧ-1 пациентов. Фиг. 11 представляет график периода выживания для всех позитивных по ВИЧ-2 пациентов. Фиг. 12 представляет диаграмму, показывающую уровень suPAR для негативных и позитивных по туберкулезу пациентов. Фиг. 13 представляет диаграмму уровнейsuPAR у пациентов со стадиями А, В и С заболевания, вызванного ВИЧ-1. Фиг. 14 представляет зависимость коэффициента выживаемости от времени для пациентов с низким, средним и высоким уровнемsuPAR. Фиг. 15 показывает принцип предпочтительного осуществления метода ELISA, пригод 005290 6 ного для использования в способе по настоящему изобретению. Фиг. 16 показывает принцип предпочтительного осуществления другого метода ELISA,пригодного для использования в способе по настоящему изобретению. Фиг. 17 представляет диаграмму уровняCD4 Т-клеток для негативных по фрагменту D1 и позитивных по фрагменту D1 пациентов. Фиг. 19 представляет диаграмму уровняsuPAR для негативных по фрагменту D1 и позитивных по фрагменту D1 пациентов. Фиг. 20 представляет диаграмму уровня мРНК ВИЧ для негативных по фрагменту D1 и позитивных по фрагменту D1 пациентов. Фиг. 21 представляет диаграмму, показывающую корреляцию между уровнем suPAR и уровнем uPAR. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Далее изобретение для простоты разъясняется, в частности, в отношении suPAR. Это не должно быть понято так, что охват изобретения ограничивается suPAR. Более того, соответствующие экстраполяции на uPAR, uPA и продукты расщепления всех трех указанных веществ находятся в пределах квалификации специалистов в данной области. Заявители неожиданно обнаружили, что концентрация suPAR - молекулы, которая, как вообще известно, участвует в процессах миграции и адгезии клеток, повышена в сыворотке и моче ВИЧ-инфицированных индивидуумов по сравнению с контрольными пробами от здоровых людей. Повышенная концентрация suPAR в сыворотке указала 91,6% ВИЧ-инфицированных пациентов (n=191) со специфичностью 93,8%(см. пример 1). Более того, в подгруппах пациентов соответственно с низкими, промежуточными и высокими уровнями содержания suPAR обнаружены существенные различия в выживаемости (см. пример 2). Пациенты в группе с промежуточным уровнем suPAR имели повышенный коэффициент риска (КР), равный 2,17,тогда как повышенные уровни suPAR в сыворотке были даже более опасны (КР=3,29, см. ниже табл. 1). Прогностическое значение уровня suPAR оставалось значимым, даже если его анализировали в многопараметрическом анализе совместно с доступными ныне наиболее важными известными параметрами. Фактически было обнаружено, что уровень suPAR является вторым по значению из наиболее надежных прогностических показателей, непосредственно вслед за числом CD4+ Т-клеток, и даже при прямом сопоставлении с CD4 (или с любым из других параметров) уровень suPAR сохранял свое независимое прогностическое значение(р 0,001). Эти результаты позволили предполо 7 жить, что только уровни suPAR в сыворотке сами по себе (предпочтительно в сочетании с определением CD4+ и вирусной нагрузки ВИЧ) могут быть мощным клиническим способом получения диагноза/прогноза у ВИЧ-пациентов. То же самое верно и в отношении содержанияsuPAR в моче, как показано на фиг. 3. Анализ фрагментации suPAR в биологической жидкости организма также дает дополнительную информацию. Образцом биологической жидкости может быть любая жидкость, которую можно получить у человека (например, мокрота, кистозная жидкость, асциты, кровь, сыворотка, плазма и моча). Моча предпочтительна, так как ее легко собрать. Если в качестве образца биологической жидкости используется моча, результаты измерений маркера необходимо нормировать к общему уровню концентрации образца - например, нормируя результат измерения маркера к содержанию в образце креатинина. Предпочтительно до проведения измерений хранить образец биологической жидкости при температуре ниже 0 С, более предпочтительно при температуре от -20 до -80 С. Измерение маркера в образце биологической жидкости можно провести, используя для этого любые доступные метод или прибор. Примерами таких методов и/или приборов являются ELISA, РИА (радиоиммуноанализ), вестерн-блотирование, анализ с помощью активируемого флюоресценцией анализатора клеток(fluorescence activated cell sorter - FACS), анализ с помощью щупов-индикаторов и т.д. Измерения можно также проводить, определяя уровень экспрессии мРНК с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой(ОТ-ПЦР), нозерн-блотирования, анализа защиты от РНКазы или с помощью микропланшетного метода и т.д. Предпочтительными методами и/или приборами для измерений являютсяELISA можно осуществлять в виде различных вариантов, многие из которых применимы в настоящем изобретении. Один из вариантов осуществления ELISA, особенно полезный для применения в настоящем изобретении,описан в работах [Holst-Hansen, 1999] и [Stephens, 1999], которые включены в настоящее описание этой ссылкой. Измерение маркера можно проводить, используя любой щуп-индикатор (stick). Предпочтительно щуп - это щуп, содержащий в качестве улавливающего агента антитела к данному маркеру. Предпочтительно проводить измерениеuPAR или uРА в образце биологической жидкости с помощью анализа FACS, вестерн-блотирования или ELISA. Уровни мРНК можно определять с помощью ОТ-ПЦР, нозерн-блотирования,микропланшетов или методом защиты от РНКазы. 8 Измерение содержания продуктов расщепления uPAR/suPAR/uPA предпочтительно проводить с помощью вестерн-блотирования. Измерение uPAR проводят в образцах биологической жидкости, содержащих экспрессирующие uPAR клетки, то есть в образцах крови. Измеренные значения уровня маркера, полученные на этапе (а), могут быть использованы для оценки состояния индивидуума путем сравнения измеренной величины с уровнем содержания маркера у индивидуумов, не инфицированных ВИЧ. Как указано выше, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу оценки развития состояния индивидуума, инфицированного ВИЧ. В частности, этот способ применим для мониторинга индивидуумов,подвергающихся лечению, например, с помощью высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ). Измеренные значения уровня маркера, полученные в этапе (а), могут быть использованы для оценки развития состояния индивидуума путем сравнения измеренных величин с уровнем содержания маркера у индивидуумов, не инфицированных ВИЧ, и/или путем сравнения изменения во времени измеренных величин с величинами, полученными у индивидуумов, не инфицированных ВИЧ. Далее, настоящее изобретение относится к набору ELISA для оценки физического состояния индивидуума, инфицированного ВИЧ, содержащемуa) иммобилизованный улавливающий агент,способный улавливать маркер в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR),(iii) активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), (iv) одного или более продуктов расщепления (i), (ii) или (iii), и/или (v) мРНК дляb) связывающийся компонент, способный связываться с маркером, причем связывающийся компонент содержитc) систему метки. Улавливающим агентом может быть антитело к маркеру. Связывающимся компонентом может быть антитело к маркеру. Предпочтительно система метки соединена (конъюгирована) со связывающимся компонентом. Система метки может быть любой из обычно используемых систем метки - такой, например, как антитело к связывающемуся агенту,соединенное с ферментом, например конъюгат иммуноглобулин-щелочная фосфатаза. Далее, настоящее изобретение относится к щупу-индикатору для оценки физического состояния индивидуума, инфицированного ВИЧ,содержащему а) иммобилизованный улавливающий агент, способный улавливать маркер в 9 форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR), (iii) активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), (iv) одного или более продуктов расщепления (i), (ii) или (iii), и/или(v) мРНК для (i), (ii) или (iii), и b) связывающийся компонент, способный связываться с маркером, причем связывающийся компонент содержит с) систему метки. Улавливающим агентом может быть антитело к маркеру. Связывающимся компонентом может быть антитело к маркеру. Предпочтительно система метки соединена (конъюгирована) со связывающимся компонентом. Система метки может быть любой из обычно используемых систем метки - такой, например, как антитело к связывающемуся агенту,соединенное с ферментом, например конъюгат иммуноглобулин-щелочная фосфатаза. Определения В контексте настоящего изобретения ВИЧ определяется как вирус иммунодефицита человека 1 или 2 типа. В контексте настоящего изобретения uPAR определяется как любая форма uPAR (то же самое, что CD87), присутствующая на поверхности экспрессирующих uPAR клеток в биологических жидкостях. Выражение экспрессирующие uPAR клетки относится ко всем экспрессирующимuPAR (CD87) клеткам, таким как моноциты,лейкоциты, макрофаги и нейтрофилы. В контексте настоящего изобретения suPAR(растворимый uPAR) определяется как любая форма uPAR (то же, что CD87), присутствующая в биологических жидкостях в не связанном с клетками виде. В контексте настоящего изобретенияuРА определяется как общее из любых формuPAR, и растворимый uРА. Биологические жидкости определяются как любая жидкость, которая может быть получена у людей, то есть мокрота, кистозная жидкость, асциты, кровь, сыворотка, плазма и моча. Выражение продукт расщепления suPAR,uPAR и uРА в том смысле, как оно использовано здесь, означает все их фрагменты, наблюдаемые с помощью вестерн-блотирования или антител соответственно к suPAR, uPAR и uРА. В частности, данное выражение включает фрагменты suPAR D1, D2 и D3. Примеры Пример 1. Диагностика ВИЧ-инфекции путем измерения уровня содержания suPAR в сыворотке. Цель. Определить, имеют ли ВИЧ-пациенты повышенное содержание suPAR в сыворотке, то 10 есть можно ли использовать уровни содержанияsuPAR для диагностики ВИЧ-инфекции. Описание опыта. С помощью ELISA измеряли концентрацию и фрагментацию suPAR в образцах сыворотки от здоровых доноров и от ВИЧ-инфицированных пациентов. Уровни suPAR измеряли ретроспективно в размороженных образцах сыворотки методомELISA, как описано в работах [Holst-Hansen,1999] и [Stephens, 1999]. Были применены следующие незначительные модификации метода: в качестве блокирующего реагента использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) вместо SuperBlock (Pierce Biochemicals), а вместо измерений кинетики определяли конечные точки. Было показано, что эти модификации не влияют заметным образом на чувствительность и/или специфичность анализа. Результаты. Полученные результаты представлены на фиг. 1, которая является так называемой диаграммой в виде столбцов с усами (box-whiskerplot), показывающей повышенные концентрации suPAR в сыворотках 191 ВИЧ-позитивных индивидуумов в сравнении со здоровыми донорами крови. Согласно U-тесту Mann-Whitney статистическая достоверность различий высока(р 0,0001). Высокие уровни suPAR (выше, чем средний уровень suPAR у здоровых доноров с добавленным к нему двукратным значением стандартного отклонения) были обнаружены у 91,6% пациентов, тогда как только у 6,3% здоровых доноров уровень был повышен. Высокие концентрации suPAR в сыворотке(пороговое значение: 2,61 нг/мл=средний уровень у здоровых доноров+двукратное стандартное отклонение) были важным индикаторов ВИЧ-инфекции с 91,6% чувствительностью и 93,3% специфичностью. Анализы выживаемости показали, что кроме диагностического значения уровней suPAR в сыворотке они обладали также высокой индикаторной способностью в отношении выживаемости пациентов. Вывод. Результаты опыта позволяют предположить, что с помощью анализа сыворотки методом ELISA можно дешевым и удобным способом проводить диагностику и/или скрининг пациентов на ВИЧ-инфекцию. Это может быть особенно полезно в слаборазвитых странах, где наиболее существенны цена, легкость осуществления и низкая опасность. Пример 2. Прогноз ВИЧ-инфекции с помощью измерения уровня suPAR в сыворотке. Описание опыта. Полученные в примере 1 результаты были использованы при проведении анализа выживаемости по Kaplan-Meier для 191 ВИЧ-позитивного пациента. Пациенты были по значениям концентрации suPAR в сыворотке разделены на 3 равные группы (по трети в каждой, т.е. соот 11 ветственно n=63, n=64 и n=64). В соответствии с тестом по логарифмическим разрядам (log-ranktest) общее различие между группами имело высокую статистическую достоверность(р 0,0001). Результаты. Результаты представлены ниже на фиг. 2 и в табл. 1. В табл. 1 представлены результаты анализа выживаемости в коэффициентах пропорционального риска Кокса (Сох) на основе параметров третьих частей группы, показывающие прогностическое значение уровней suPAR самих по себе и в сравнении с другими прогностическими показателями в группе из 191 ВИЧ-инфицированного пациента. Все параметры обрабатывались как третьи части в соответствии с фиг. 2. Как и ожидалось, большинство из параметров частично утрачивали свою статистическую достоверность в многопараметрических анализах по сравнению с однопараметрической параллелью. В особенности, это относится к возрасту и уровню 2-микроглобулина. Однако измерения количества CD4+ клеток и, в особенности,suPAR полностью сохраняли свою значимость. В многопараметрические анализы были включены 138 пациентов. КР: коэффициент риска; ДИ: доверительный интервал; нд: различие недостоверно. Вывод. Величина уровня suPAR обладает надежным прогностическим значением, которое не зависит от большинства имеющих отношение к делу других маркеров: подсчета CD4+ Т-клеток и вирусной нагрузки ВИЧ. Уровни suPAR не связаны с нагрузкой ВИЧ и находятся лишь в слабой корреляции с CD4+ (R=0,303). Это независимый параметр в многопараметрическом анализе выживаемости, что указывает на то, чтоsuPAR дает дополнительную информацию для прогноза. Это подразумевает, что suPAR может быть особенно полезным при обстоятельствах,когда эти другие маркеры не могут быть использованы, например для слежения за пациентами в ходе ВААРТ. Пример 3. Прогноз ВИЧ-инфекции у пациентов с ВААРТ с помощью измерения уровняsuPAR в моче. Цель. Определить, имеют ли пациенты ВААРТ повышенный уровень suPAR по сравнению с ВИЧ-негативными контролями. Если так, suPAR может сохранять прогностическое значение у пациентов с ВААРТ, у которых вирусная нагрузка не может быть далее измерена (и поэтому не имеет прогностического значения), а количество CD4 Т-клеток остается постоянным (и поэтому не имеет прогностического значения). Описание опыта. Двадцать ВИЧ-инфицированных пациентов без СПИДа, проходящих курс ВААРТ, любезно предоставляли образцы мочи. Кроме того, 005290 12 образцы мочи предоставляли 10 ВИЧ-негативных работников госпиталя. В образцах мочи измеряли содержание креатинина и suPAR, результаты представляли в виде отношенияsuPAR/креатинин. Пациенты с ВААРТ имели достоверно более высокий уровень отношенияsuPAR/креатинин по сравнению со здоровыми контролями (фиг. 3). Результаты. Полученные результаты приведены на фиг. 3, которая демонстрирует повышенные концентрации suPAR в моче, полученной от пациентов с ВААРТ, в сравнении с уровнямиsuPAR к концентрации креатинина. Значимость различий между обеими группами была высокой согласно U-тесту Mann-Whitney (р 0,0001). Вывод. Пациенты, получающие курс ВААРТ,имеют повышенные уровни suPAR. Это можно использовать для слежения за успехом терапии,например, чтобы предсказать повторную вспышку вирусной инфекции у пациентов, получающих ВААРТ. Пример 4. Уровень suPAR обладает предсказующей способностью для падения количества CD4 Т-клеток у ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Введение. В примерах 2 и 3 было показано, чтоsuPAR является важным прогностическим показателем. В Копенгагенском ВИЧ-иммунном контингенте (Copenhagen HIV Immune Cohort,CHIC) (см. ссылки 18-25) было далее показано,что различные показатели могут прогнозировать срок жизни. В этом примере исследуется, могут ли различные прогностические показатели предсказывать падение числа CD4 Т-клеток. Материалы и методы. Для анализа соотношения между индивидуальными количествами CD4-клеток в течение одногодичного врачебного наблюдения после первого измерения, с одной стороны, и возможными пригодными для объяснения переменными, с другой стороны, были использованы регрессионные модели с усредненным коэффициентом. Количества СD4-кпеток были использованы как зависимые переменные в натуральной логарифмической шкале, в предположении о наличии индивидуального линейного изменения в течение годичного периода врачебного наблюдения. В качестве начального базового модельного расчета индивидуального изменения количества СD4-клеток как функции вирусной нагрузки и возраста индивидуума было использовано выражение 13 С помощью этой модели рассчитывается базовый наклон зависимости и производится оценка вклада вирусной нагрузки и возраста в наклон зависимости количества СD4-клеток от времени. В модель поочередно вводили нижеследующие независимые переменные, чтобы рассчитать, если известны вирусная нагрузка и возраст, имеют ли какие либо из этих переменных сколько-нибудь значимое влияние на наклон зависимости количества СD4-клеток от времени. Этими переменными являются бета 2-микроглобулин, IgА (иммуноглобулин А), ИФН-гаммаLAK (активируемые лейкоцитами киллеры),титр TTV (вируса ТТ). Оценивались также любые воздействия на наклон кривой количестваCD4 наличия антиретровирусного лечения в момент регистрации или начала антиретровирусного лечения в ходе одногодичного периода врачебного наблюдения. Результаты. Полученные в CHIC результаты были использованы как основа для вычислений в данном примере. Результаты следуют, например, из ссылок 18-25. При введении в исходную модель вместе с показателями возраста и вирусной нагрузки уровень suPAR был единственной переменной,показывающей какую бы то ни было достоверную корреляцию с падением числа CD4 Тклеток. В этой модели повышение уровняsuPAR на 1 нг/мл соответствует понижению на 0,11 величины log(CD4). В сравнении с этим,повышение log10 уровня РНК ВИЧ в плазме на 1 соответствует снижению log(CD4) на 0,48, тогда как больший на 1 год возраст соответствует снижению log(CD4) на 0,02 в течение года врачебного наблюдения. В линейном масштабе эти фигуры переводят повышение уровня suPAR на 1 нг/мл, повышение содержания РНК ВИЧ в плазме на 1log10 и больший на 1 год возраст в годичное снижение числа СD4-клеток соответственно на 10,4, 38,2 и 2,0%. Эти числа сводятся к более высокой в среднем на 79,5% потере количества СD4-клеток у пациента с наиболее высоким уровнем suPAR (15,5 нг/мл) по сравнению с пациентом с наиболее низким уровнем suPAR. Вывод. Контингент CHIC - один из наиболее изученных в мире контингентов в смысле определения прогностических показателей (ссылки 1825). Было установлено, что количество CD4 Тклеток, вирусная нагрузка ВИЧ, бета-2-микроглобулин, IgA, ИФН-гамма, MIP-1-бета, suPAR,активность клеток LAK, возраст и вирусная нагрузка вируса ТТ являются прогностическими показателями смертельного исхода. В данном исследовании авторы изучали, может ли какойнибудь из этих прогностических показателей предсказывать падение количества CD4 Т 005290 14 клеток. Регрессионная модель с усредненным коэффициентом показала, что только возраст пациента, вирусная нагрузка ВИЧ и уровеньsuPAR в сыворотке достоверно связаны с падением количества CD4 Т-клеток. Пример 5. По уровню suPAR можно предсказывать итог терапии у ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Введение. Приблизительно половина из пациентов, у которых была начата высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ), претерпевают повторение вирусной вспышки через 6 месяцев лечения. В этом примере исследуется, снижается ли уровень suPAR в сыворотке в ходе ВААРТ и можно ли по уровню suPAR перед началом ВААРТ предсказать потенциальную эффективность лечения. Материалы и методы. В данном исследовании принимали участие 33 ВИЧ-позитивных пациента из больницыHvidovre University Hospital (Департамент инфекционных болезней). У 16 пациентов через 6 месяцев после начала ВААРТ не обнаруживалось вирусной РНК, а у 17 пациентов через 6 месяцев после начала ВААРТ регистрировалось заметное содержание вирусной РНК (более 200 копий в 1 мл). У 28 пациентов до начала ВААРТ был проведен курс антиретровирусного лечения,а 5 пациентов ранее не подвергались лечению. От каждого пациента были получены 5 образцов: 2 образца перед ВААРТ и 3 образца после начала ВААРТ. Образцы получили маркировку от S1 до S5. S1 были получены в среднем за 3,9 месяца до начала ВААРТ (диапазон от 1,1 до 106,6 мес.), S2 получены в среднем за 0,6 месяца до начала ВААРТ (диапазон от 0,3 до 5,7 мес.), S3 получены в среднем через 1,9 месяца после начала ВААРТ (диапазон от 0,7 до 8,6 мес.), S4 получены в среднем через 6,4 месяца после начала ВААРТ (диапазон от 1,8 до 16,1 мес.), S5 получены в среднем через 21,4 месяца после начала ВААРТ (диапазон от 5,7 до 39,6 мес.). Количество CD4 Т-клеток определяли обычным анализом с помощью FACS. Вирусную нагрузку ВИЧ определяли с помощью набора Roche Amplicor HIV RNA в соответствии с инструкциями поставщика. Уровни suPAR измеряли методом ELISA, в качестве улавливающих антител использовали R2, а в качестве детектирующих антител - поликлональные кроличьи антитела к альфа-uPAR. Процедуру ELISA осуществляли, как указано в ссылке 26. Результаты. После проведения ВААРТ (образцы S5) уровень suPAR снижался в среднем на 15% по сравнению с последним образцом, взятым перед началом ВААРТ (S2). У пациентов, которым терапия не принесла облегчения (зафиксированная повторная вспышка вируса через 6 месяцев после лечения),уровни suPAR были выше как до, так и после 15 ВААРТ. Уровни suPAR в последних образцах перед началом ВААРТ (S2) были выше у тех пациентов, у которых после ВААРТ обнаруживалась повторная вспышка вируса. На фиг. 4 показаны уровни suPAR для образцов S1-S5 с сопоставлением по U-тесту Mann-Whitney при разделении на 2 группы по восприимчивости к ВААРТ; р=0,05. Вывод. Это исследование охватывало 33 пациента,которые наблюдались до и после начала терапии. Пациенты отбирались по признакам успешности или неуспешности терапии, что определялось по тому, имелась или не имелась у них повторная вспышка вируса через 6 месяцев после лечения. Даже при том, что количество пациентов в этом исследовании было небольшим,было установлено, что те пациенты, которые испытывали повторную вирусную вспышку,имели в образцах сыворотки, отобранных до начала лечения, существенно более высокие уровни suPAR, чем те пациенты, вирусная нагрузка ВИЧ у которых оставалась полностью подавленной через 6 месяцев после ВААРТ. И хотя эти данные необходимо подтвердить в более обширных исследованиях, они весомо указывают на то, что уровни suPAR дают важную информацию об исходе ВААРТ. Пример 6. Уровень suPAR в сыворотке повышается в процессе ВИЧ-инфекции и может дать прогноз выживаемости. 15 ВИЧ-позитивных пациентов с гемофилией подвергались врачебному наблюдению в течение периода до 17 лет после первого ВИЧпозитивного результата анализа. Измеряли уровень suPAR в сыворотке и количество CD4 Тклеток. В течение наблюдения 8 пациентов умерли. Уровень suPAR в сыворотке значимо повышался в ходе развития инфекции, и как повышение уровня, так и общий уровень suPAR были достоверно связаны с выживаемостью. При проведении однопараметрического анализа(анализа с одной переменной) по Коксу (Сох) и первое определенное количество CD4 Т-клеток,и первый определенный уровень suPAR были достоверно связаны с выживаемостью. Если эти два параметра были включены в многопараметрическую регрессионную модель Кокса с несколькими переменными, оба эти значения оставались достоверно связаны с выживаемостью. Кроме того, уровень suPAR был предсказательным для снижения количества CD4 Т-клеток со временем. Пример 7. Уровень растворимого uPAR в сыворотке является прогностическим показателем для развития СПИДа и смерти от ВИЧинфекции. Введение. В примерах 2-6 было продемонстрировано,что растворимая форма рецептора урокиназного активатора плазминогена (suPAR) является важным и независимым прогностическим пока 005290 16 зателем развития заболевания, связанного с ВИЧ. В данном примере важное прогностическое значение suPAR подтверждено в другом датском контингенте. Кроме того, исследовано возможное прогностическое значение полиморфизма 4G/5G в промоторе РАI-1. Ранее прогностическое значение suPAR было исследовано на контингенте CopenhagenHIV Immune Cohort (CHIC) [26]. Было обнаружено, что уровень suPAR в сыворотке является в этом датском контингенте важным прогностическим маркером. Кроме того, эффективность прогноза не зависела от количества CD4 Тклеток и содержания РНК ВИЧ. Причина, по которой suPAR имеет высокое прогностическое значение, неизвестна. Ранее было обнаружено, что uРА связывается с консервативной последовательностью -GPRG(A/V)верхушки петли V3 в gp120 [27]. Эта последовательность имеет большое значение для функционирования вируса и вовлечена в связывание с хемокинными рецепторами. Поэтому возможно, что uРА может образовывать мостик междуuPAR, находящимся на поверхности клетки, и ВИЧ. Если это так, то uРА имеет прогностическое значение. Поэтому РАI-1, который может связывать и интернализовать комплексы uPA/uPAR [28], и количество PAI могут влиять на количество доступных комплексов uPA/uPAR. Было показано, что генетический полиморфизм 4G/5G в промоторе РАI-1 влияет на уровень содержания РАI-1 в плазме [29]. На этом основании в данном примере были исследованы у датского контингента ВИЧ-инфицированных гомосексуальных мужчин различные компоненты системы активатора плазминогена и их возможная прогностическая роль. Индивидуумы и образцы. Все испытуемые индивидуумы составляют часть Копенгагенского контингента СПИД (Copenhagen AIDS Cohort, CAC). Этот контингент представляет собой серопреобладающий (seroprevalent - с преобладанием индикаторов вирусной инфекции в сыворотке) контингент, выявленный между 1984 и 1988 гг., причем большинство (81%) из 153 индивидуумов зарегистрированы в 1985 г. [30]. Все индивидуумы - гомосексуальные мужчины-датчане. При регистрации проводилось тщательное физическое обследование и были взяты образцы крови. Использованные в этом исследовании подсчеты количества CD4 Т-клеток были соотнесены со временем отбора проб сыворотки. Все участники были информированы, было получено их согласие. Контингент был утвержден Комитетом по медицинской этике Копенгагенского округа (MedicalEthics Committee of Copenhagen County). Диагноз СПИД был поставлен в соответствии с критериями 1987 г. (AIDS-87) Центра контроля и предупреждения заболеваний (Center for DiseaseControl and Prevention). У 8 пациентов в момент отбора проб сыворотки был развившийся СПИД. 17 Из 133 пациентов, от которых получали сыворотку, 89 человек умерли в течение врачебного наблюдения. Из них 8 человек умерли по неустановленной причине, диагноз СПИД не был у них установлен. Для анализа промотора РАI-1 у 113 пациентов получали ДНК. Измерение уровня suPAR. Уровень содержания suPAR измеряли, как описано ранее [9]. Статистика. Анализ продолжительности жизни и анализ времени, необходимого для развития СПИДa,проводили с помощью регрессионного анализа по Коксу и анализа по Kaplan-Meyer. Сравнения между группами проводили с применением Ткритерия Стьюдента. Результаты. Уровень suPAR измеряли ретроспективно в сыворотках 133 пациентов с помощью ELISA. Все пациенты имели измеряемые уровни suPAR. Средний уровень suPAR составлял 1,87 нг/мл. Разделение пациентов на 2 группы по величине среднего уровня suPAR (67/66) показало, что у пациентов с высоким уровнем suPAR СПИД развивался достоверно быстрее, как показывает тест Kaplan-Meyer (фиг. 5). Среднее время развития СПИДа в группе с низким уровнем suPAR составляло 8,0 лет, тогда как у пациентов с высоким уровнем suPAR СПИД развивался в среднем через 4,2 года. Подобным же образом,анализ продолжительности жизни показал, что пациенты с низким уровнем suPAR умирали в среднем через 8,5 лет после определения suPAR,а пациенты с высоким уровнем suPAR умирали в среднем через 6,6 лет (фиг. 6) (р 0,05). Регрессионный анализ по Коксу (табл. 2) показал,что и уровень suPAR, и логарифм числа трансформированных CD4 Т-клеток достоверно связаны с временем развития СПИДа и продолжительностью жизни и что прогностическое значение suPAR не зависит от числа CD4 Т-клеток. Это продемонстрировано также на фиг. 7, на которой не видно достоверного различия между количествами CD4 Т-клеток у индивидуумов с низким и высоким уровнем suPAR (р=0,9 по Ткритерию). Связь между полиморфизмами 4G/5G в промоторе РАI-1 и развитием СПИДa и продолжительностью жизни не обнаружена (р=0,6). Вывод. В этом исследовании было обнаружено,что уровень растворимого урокиназного рецептора является важным прогностическим показателем при ВИЧ-инфекции. Причина этого неизвестна, но это может быть связано со специфической ролью урокиназной системы в инфекции/репликации ВИЧ. Возможно, что в ВИЧинфекции могут играть активную роль комплексы suPAR/uPA. Было отмечено, что полиморфизм 4G в РАI-1 приводит к повышению уровня содержания белка РАI-1 по сравнению с генотипом 5G РАI-1. В данном исследовании не 18 было обнаружено влияния полиморфизма в промоторе РАI-1 на развитие заболевания, вызванного ВИЧ. Заключение. Подтверждены предшествующие результаты, показывающие, что suPAR является важным прогностическим показателем в ВИЧ-инфекции. Более того, прогностическое значение suPAR не зависит от числа CD4 Т-клеток. Пример 8. Важное прогностическое значение suPAR у индивидуумов из Гвинеи-Биссау,инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Введение. В течение последнего десятилетия в большинстве стран третьего мира продолжала развиваться пандемия ВИЧ - как по интенсивности,так и по разнообразию. Несмотря на снижение вследствие успехов в терапии числа вновь возникающих случаев СПИДа в США и Западной Европе, каждый год появляется постоянное число новых случаев ВИЧ-инфекции. Однако подавляющее большинство новых случаев ВИЧинфекции все еще появляется в развивающихся странах, и Африка остается в центре внимания,поскольку эпидемия быстро развивается во многих странах на юге и востоке континента,затрагивая все слои общества. Несомненно, расширение осведомленности общественности является важным показателем в ограничении распространения заболевания, однако, в попытках снизить остроту и вероятность фатального исхода заболевания в развивающихся странах основным средством является разработка недорогих диагностических/прогностических приемов и способов антивирусного лечения. В предыдущих примерах отмечалось, что растворимая форма урокиназного рецептора(suPAR) является важным и независимым прогностическим показателем в контингенте датских ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Уровень suPAR в сыворотке является также прогностическим маркером общей продолжительности жизни пациентов с раком яичников и прямой кишки и эффективности терапии при лейкемии [10, 14]. Урокиназный рецептор (uPAR) является антигеном активации у моноцитов и Тклеток, и Т-клетки индивидуумов, инфицированных ВИЧ-1, имеют повышенный уровень экспрессии uPAR [3]. Инфекция лейкоцитов ВИЧ-1 in vitro вызывает регуляцию с активацией (up-regulation) экспрессии uPAR на клеточной поверхности в процессе, который, повидимому, временно совпадает с началом вирусной репликации [5]. Рецептор активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR/CD87) зацеплен за плазматическую мембрану гликозилфосфатидилинозитольной (GPI) связью.uPAR может быть высвобожден с клеточной поверхности, что дает растворимую форму рецептора (suPAR), утрачивающую якорную частьGPI. Растворимые формы uPAR (suPAR) были идентифицированы в надосадочных культу 19 ральных жидкостях и в биологических жидкостях, таких как кистозная жидкость, сыворотка,плазма и моча [31]. Содержание suPAR измеряется простым методом ELISA и может поэтому быть полезным в таких ареалах, как Африка, где дорогое оборудование для измерения числа CD4+ Тклеток и вирусной нагрузки ВИЧ может быть недоступным. Поэтому в этом примере исследуется, имеют ли инфицированные ВИЧ-1 и/или ВИЧ-2 африканцы из Гвинеи-Биссау повышенные уровни содержания suPAR и имеет ли уровень suPAR прогностическое значение. Индивидуумы и методы. Сыворотки от 262 пациентов имелись в распоряжении в программе исследования туберкулеза (ТБ). После информирования индивидуумов и получения их согласия на участие в исследованиях отбирали пробы крови и анализировали сыворотки на наличие антител к ВИЧ. 5 индивидуумов (1 позитивный по ВИЧ-1 и 4 ВИЧ-негативных) обследовались только на стадии клинического наблюдения, но не при исходном наборе группы. Определение ВИЧ проводили в National Public Health Laboratory. Скрининг сывороток проводили с использованием набора Enzygnost Anti-HIV 1+2 Plus (фирмаDiagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France). Образцы с двойной реакцией отправляли в замороженном состоянии в Стокгольм в SwedishHIV-12 Bispot (Orgenics, Yavne, Israel). Режим обследования был утвержден Центральным комитетом по этике Дании и Министерством здравоохранения Гвинеи-Биссау. Путь внесения ВИЧ-инфекции неизвестен, хотя в большинстве случаев имеет место половой путь переноса. Гомосексуальность в Гвинее-Биссау встречается редко. Число CD4- и CD8-клеток определяли с помощью иммунофосфатазного метода (ImmunoAlkaline phosphatase, IA) [32]. Уровень suPAR измеряли ретроспективно в размороженных образцах сыворотки с помощью чувствительной системы ELISA [9]. Были введены следующие небольшие модификации метода: в качестве блокирующего агента использовали бычий сывороточный альбумин (2% раствор в фосфатном буфере с NaCl) вместоSuperBlock и вместо определения кинетики проявления субстрата останавливали реакцию через 30 мин добавлением 100 мкл 1 М NaOH. Эти модификации не влияли на чувствительность и специфичность анализа. Статистика. Все статистические анализы проводили с помощью статистической программы SSPS, 10-я 20 версия. Сопоставление соотношений проводили с помощью теста хи-квадрат. Сопоставление непарных наблюдений проводили с помощью теста Kruskal-Wallis. Графическое представление в виде кривых Kaplan-Meier получали, разделяя всех ВИЧ-позитивных пациентов на группы в соответствии со средним уровнем suPAR. Различия между кривыми Kaplan-Meier анализировали в тесте с логарифмическим масштабом, а различия между группами - методом регрессии по Коксу. Способность уровня suPAR в сыворотке предсказывать смертельный исход на фоне других известных прогностических маркеров формально устанавливали с помощью модели пропорциональных рисков Кокса. Переменные вводили в непрерывной шкале, используя максимальную трансформацию (определенную на основании значения 2 по Уолду (Wald индивидуальных переменных (количество CD4 клеток в логарифмическом масштабе, уровеньsuPAR в линейном масштабе и диагноз ТБ как да/нет). Уровень значимости был выбран равным 5%. Результаты. Анализировали сыворотки 262 пациентов. Все пациенты имели измеримый уровень suPAR(интервал 0,9-18,7 нг/мл, среднее значение 3,3 нг/мл). Из 262 пациентов 113 были ВИЧ-позитивными (28 с ВИЧ-1, 66 с ВИЧ-2 и 19 имели оба вида инфекции), а 149 были ВИЧ-негативными. Что касается пульмонологии, было определено, что 198 пациентов являются ТБ-позитивными (диагноз подтвержден анализом мокроты или предполагается на основании клинического обследования), а 64 пациента были сочтены имеющими отличное от ТБ заболевание(пневмония или бронхит). Уровень suPAR является прогностическим в отношении продолжительности жизни у ВИЧпозитивных африканских индивидуумов. Имелась тенденция повышения уровняsuPAR у ВИЧ-позитивных индивидуумов по сравнению с ВИЧ-негативными индивидуумами(р=0,061, тест Kruskal-Wallis). He было обнаружено различий в уровнях suPAR у инфицированных ВИЧ-1, ВИЧ-2 или дважды инфицированных (фиг. 8). Индивидуумы ВИЧ+/ТБ+(N=87) имели более высокий уровень suPAR,чем индивидуумы ВИЧ+/ТБ-негативные (N=26)(р=0,049) (табл. 3). Тест Kaplan-Meyer. ВИЧ-позитивные индивидуумы были разделены на 2 группы по среднему уровню suPAR. В группе с низким уровнем suPAR (N=57) средняя продолжительность жизни составляла 933 дня (95% доверительный интервал, ДИ: 6841182 дня). В группе с высоким уровнем suPAR(N=56) средняя продолжительность жизни была 495 дней (95% ДИ: 202-788 дней). Разница в продолжительности жизни была статистически достоверной (фиг. 8, р=0,012, логарифмический масштаб) (фиг. 9). При разделении ВИЧ-пози 21 тивных пациентов по признаку, инфицированы ли они ВИЧ-1 (группа ВИЧ-1 включала также дважды инфицированных) или ВИЧ-2, уровеньsuPAR был прогностическим относительно исхода как для инфицированных ВИЧ-1 (фиг. 10),так и для инфицированных ВИЧ-2 (фиг. 11). Регрессия по Коксу. Было обнаружено, что нижеследующие параметры достоверно связаны с продолжительностью жизни в однопараметрическом регрессионном анализе по Коксу: это числа трансформированных СD4-клеток (р=0,030, N=90),диагноз ТБ (0,004, показатель Уолда 8,1,КР=1/0,388, N=113) и suPAR (p0,001, показатель Уолда 19,3, КР=1,2, N=113) (табл. 1). Возраст и число CD8 Т-клеток не были достоверно связаны с продолжительностью жизни (р=0,7 и 0,5 соответственно). В многопараметрической регрессионной модели Кокса (все данные имелись в распоряжении у 90 пациентов) с продолжительностью жизни были связаны suPAR(р 0,001, показатель Уолда 19,1, КР=1,2 на каждый нанограмм увеличения уровня suPAR) и диагноз ТБ (р=0,005, показатель Уолда 8,0,КР=3,12 для ТБ+), но не логарифм числа СD4 клеток (р=0,35, показатель Уолда 0,8). У ТБ-позитивных пациентов уровеньsuPAR повышен, но он не имеет прогностического значения. Было обнаружено, что из 149 ВИЧ-негативных индивидуумов 111 были ТБ-позитивными. У ТБ-позитивных пациентов были достоверно более высокие уровни suPAR по сравнению с 38 индивидуумами, которые в результате клинического обследования были диагностированы как ТБ-негативные (р=0,001, тест KruskalWallis) (фиг. 12). В ходе последующего врачебного наблюдения 20 из ТБ-позитивных пациентов умерли. Уровень suPAR для ТБ+ индивидуумов не был достоверно связан с выживаемостью (N=111, р=0,23, табл. 3). В табл. 3 показаны уровни suPAR у ВИЧинфицированных индивидуумов в соответствии с типом инфекции, а также у ВИЧ-негативных пациентов в соответствии с ТБ-статусом. В регрессионный анализ по Коксу значения уровняsuPAR были введены непреобразованными, тогда как количества CD4-клеток вводили в преобразованной форме в виде lоg10. Вывод. Был измерен уровень suPAR в сыворотке 262 индивидуумов, зарегистрированных в составе контингента по подозрению ТБ. Было обнаружено, что из них 113 индивидуумов являются ВИЧ-позитивными. У этих ВИЧ-позитивных индивидуумов была сильная корреляция уровня suPAR с выживаемостью. Не наблюдалось различий в уровне suPAR у индивидуумов,инфицированных ВИЧ-1, ВИЧ-2 или дважды инфицированных, что указывает на то, что уровень suPAR имеет общее прогностическое значение при ВИЧ-инфекции. Другими прогности 005290 22 ческими показателями были число CD4 Тклеток (в логарифмическом преобразовании) и ТБ статус. В многовариантном анализе по Коксу только уровень suPAR и ТБ статус были связаны с продолжительностью жизни. В предшествующих исследованиях число CD4-клеток было достоверно связано с выживаемостью в многовариантной модели [26]. Это различие может быть объяснено использованием в этих двух исследованиях различных методов определенияCD4 Т-клеток, то есть FACS и иммунофосфатазного метода [33]. Было обнаружено, что из 149 ВИЧ-негативных индивидуумов 111 были ТБ-позитивными. У ТБ-позитивных/ВИЧ-негативных пациентов наблюдались достоверно более высокие уровниsuPAR, чем у ТБ-негативных/ВИЧ-негативных пациентов. Однако не было установлено прогностического значения уровня suPAR у ТБ-позитивных/ВИЧ-негативных пациентов, из которых 20 умерли в период врачебного наблюдения. Важная прогностическая роль suPAR у ВИЧ-инфицированных индивидуумов может подразумевать прямое участие системы активатора плазминогена в ВИЧ-инфекции. Наоборот,при сравнении ТБ-позитивных/ВИЧ-негативных пациентов с ТБ-негативными/ВИЧ-негативными пациентами прогностическая роль suPAR не была обнаружена и повышенный уровеньsuPAR у ТБ-позитивных пациентов может отражать общую иммунную активацию. Необходимо найти дешевые и эффективные способы мониторинга и лечения ВИЧ-заболевания в Африке. Измерение уровня suPAR технически достаточно просто (ELISA с последующим измерением оптической плотности при 405 нм). Пример 9. Уровень содержания растворимого рецептора активатора плазминогена урокиназного типа является эффективным и независимым прогнозирующим параметром выживаемости при ВИЧ-инфекции. Резюме. Было установлено, что инфекция ВИЧ-1 имеет следствием регуляцию с активацией invitro и in vivo экспрессии на лейкоцитах рецептора активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR/CD87). Цель данного исследования состояла в исследовании того, параллельна ли эта регуляция с активацией повышения уровней содержания растворимого uPAR (suPAR) у пациентов с развитым заболеванием, вызванным ВИЧ-1, и можно ли по уровню suPAR в сыворотке предсказать клинический исход. С использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) был измерен ретроспективно уровень suPAR в образцах сыворотки от 314 позитивных по ВИЧ-1 индивидуумов. При анализе по Kaplan-Meier и регрессионному анализу по Коксу была установлена корреляция уровней suPAR в сыворотке с продолжительностью жизни при смертельном исходе вследствие(выше среднего значения) согласовались с низкой общей выживаемостью, а анализ по KaplanMeier у пациентов, стратифицированных по уровню suPAR, продемонстрировал монотонное повышение смертности с повышением уровняsuPAR. После включения в исследование общепринятых прогностических маркеров, включая установленные Центром по контролю за заболеваниями (Center for Disease Control, CDC) клинические стадии, число CD4-клеток, вирусную нагрузку, 2-микроглобулин и возраст, достоверность прогностического потенциала suPAR осталась высокой, что указывает на то, что уровень suPAR в сыворотке является новым, эффективным и независимым прогнозирующим параметром выживаемости при инфекции ВИЧ 1. Данное описание является первым, демонстрирующим важную связь между системой активатора плазминогена и развитием заболевания при инфекции ВИЧ-1. Введение. Система активатора плазминогена урокиназного типа состоит из протеиназы (uРА), рецептора (uPAR) и ингибиторов. Эта система участвует в протеолизе в окружающем клетки пространстве, в миграции клеток и в регенерации тканей. Способы действия системы различны - это протеолиз, передача сигнала и активности хемокинного типа [1, 34]. При физиологических условиях uРА и uPAR преимущественно экспрессируются клетками крови, в том числе нейтрофилами, моноцитами, макрофагами и активированными Т-клетками [35], для которых,как полагают, эти факторы играют важную роль в клеточной активации, адгезии, миграции и транссудации [36, 37, 38]. Ранее высокие уровни в сыворотке suPAR(растворимой формы uPAR) связывали с низкой общей выживаемостью раковых больных [10,12], и предполагалось, что при раке избытокsuPAR в кровотоке обеспечивается клетками опухоли или проникающими в опухоль макрофагами [10, 12, 7, 17], которые часто имеют высокий уровень экспрессии uPAR [39]. Тот факт, что повышенные уровни suPAR в сыворотке указывают на регуляцию с активацией экспрессии клеточного uPAR, в соединении с ранее опубликованными данными о том,что инфекция ВИЧ-1 приводит к повышенной экспрессии uPAR на клеточной поверхности моноцитов и Т-лимфоцитов как in vitro, так и invivo [3, 4, 5], побудил авторов настоящего изобретения исследовать соотношение между уровнями suPAR в сыворотке инфицированных ВИЧ-1 индивидуумов и развитием заболевания. Методы. Пациенты. Копенгагенский ВИЧ-иммунный контингент (Copenhagen HIV Immune Cohort, CHIC) это серопреобладающий (seroprevalent) контингент, состоящий из 347 инфицированных ВИЧ-1 24 пациентов, зарегистрированных в Департаменте инфекционных заболеваний в Rigshospitalet,Copenhagen, Denmark, между сентябрем 1991 г. и октябрем 1992 г., как описано ранее [25]. Врачебное наблюдение над пациентами контингента проводилось с момента зачисления вплоть до июня 1997 г., хотя в данном исследовании наблюдение контролировалось с момента получения ингибитора протеазы первым пациентом контингента (1 мая 1996 г.). Из данного исследования были исключены 33 пациента (9,5%), у которых не имелось в наличии образцов сыворотки. Между пациентами, участвовавшими в настоящем исследовании и исключенными из него, не было существенных различий в длительности наблюдения, возрасте, числе СD4 клеток, вирусной нагрузке и уровне 2-микроглобулина. При регистрации в CHIC были взяты образцы крови для определения числа CD4 клеток и других серологических параметров,имеющих отношение к развитию ВИЧ-1. Из 314 образцов сыворотки, имевшихся в наличии для измерений уровня suPAR, 208 были получены в момент регистрации (базовая линия), а остальные 106 - близко к моменту регистрации (среднее значение - за 0,9 месяца до регистрации,интервал от 8,4 месяца до регистрации до 7,2 месяца после). Все другие использованные в данном исследовании серологические показатели представляли собой базовые значения. Распределение пациентов по клиническим стадиям проводилось в соответствии с установленными в 1993 г. Центром контроля над заболеваниями(CDC) нормативами определения состояний СПИДа для подростков и взрослых. Из 314 включенных в настоящее исследование пациентов 230 (73,2%) подвергались антиретровирусному лечению, получая один или несколько нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (НИОТ) (nucleoside reverse trancriptaseinhibitors, NRTI) перед регистрацией или в ходе врачебного наблюдения. Из этих пациентов 140(60,9%) получали один НИОТ, 88 (38,3%) - два НИОТ и 2 (0,9%) - три НИОТ. Ни один из пациентов не получал три НИОТ одновременно. Длительность наблюдения рассчитывалась от даты регистрации до момента смерти (вызванной СПИДом), или наблюдение считалось прерванным 1 мая 1996 г. Данные перекрестно проверялись Датской национальной регистрационной системой (Danish National Registry System),и пациенты, контакт с которыми был в ходе наблюдения утрачен, считались исключенными из наблюдения в последний день, когда было известно, что они живы. Измерение suPAR, числа СD4-клеток, вирусной нагрузки и 2-микроглобулина. Уровень suPAR измеряли ретроспективно в размороженных образцах сывороток с помощью чувствительной системы ELISA [12, 17]. Измерения дублировались, и при необходимо 25 сти вводили поправку на отклонения между планшетами путем использования на всех планшетах референсного образца. Были применены следующие незначительные модификации опубликованного метода: в качестве блокирующего реагента использовали бычий сывороточный альбумин (2% раствор в фосфатном буфере с NaCl) и вместо измерений кинетики проявления субстрата определяли конечные точки. У большинства из этих пациентов число CD4 клеток, вирусная нагрузка и уровень 2-микроглобулина были определены раньше [20, 18]. Статистический анализ. Все статистические анализы проводили с помощью пакетов статистических программ(SSPS, версия 8, и SAS, версия 6.12), наблюдаемые различия признавались значимыми, если значение р было меньше 0,05. Сопоставление соотношений проводили с помощью теста хиквадрат. Сопоставление непарных наблюдений проводили с помощью теста Kruskal-Wallis илиU-теста Mann-Whitney. Корреляции рассчитывали с помощью теста ранжирования Spearman. Кривые по Kaplan-Meier получали, разделяя пациентов на группы (стратифицируя) по уровню suPAR в сыворотке так, чтобы получить равное число пациентов во всех группах. Различия между кривыми Kaplan-Meier анализировали в тесте с логарифмическим масштабом и методом регрессии по Коксу. Способность уровняsuPAR в сыворотке предсказывать смертельный исход на фоне других известных прогностических маркеров формально устанавливали с помощью многовариантной модели пропорциональных рисков Кокса. Переменные вводили в непрерывной шкале, используя преобразования,согласующиеся наилучшим образом на основании значения 2 по Уолду (вирусная нагрузка,количество СD4-клеток и 2-микроглобулина в логарифмическом масштабе, а уровень suPAR и возраст - в линейном масштабе). Результаты. Уровни suPAR в сыворотке. Все 314 пациентов, инфицированных ВИЧ 1, имели измеримые уровни suPAR в сыворотке со средним значением 3,69 нг/мл (диапазон 1,15-15,60 нг/мл). Разделение всех пациентов на две равных группы по среднему уровню suPAR выявило несколько существенных различий(табл. 3). Пациенты с высоким уровнем suPAR имели более короткий срок врачебного наблюдения (р 0,0001), что вызвано повышенной частотой смертельного исхода вследствие СПИДа(р 0,0001), более низкое число CD4-клеток(р 0,0001), более высокую вирусную нагрузку(р=0,002), более высокий уровень 2-микроглобулина (р 0,0001) и были старше (р=0,007). Не было обнаружено достоверных различий в отношении пола пациентов (р=0,7), пути внесения инфекции (р=0,2) или того, подвергались ли 26 пациенты антиретровирусному лечению на момент регистрации (р=0,3). Разделение пациентов на 3 группы в соответствии с определенными CDC клиническими стадиями А, В и С (фиг. 10) продемонстрировало,что более развитое заболевание, вызванное ВИЧ-1,связано с более высокими уровнями suPAR в сыворотке (р 0,0001, тест Kruskal-Wallis). На фиг. 13 представлены уровни suPAR в сыворотке пациентов с определенными CDC стадиями вызванного ВИЧ-1 заболевания А, В и С. Каждый пациент обозначен кружочком, а зачерненный кружочек указывает, что пациент умер в течение наблюдения. Средние значения уровня suPAR в каждой группе обозначены горизонтальными отрезками. Уровни suPAR в сыворотке у пациентов различных клинических стадий достоверно различались (р 0,0001, тестKruskal-Wallis). Доля выживших пациентов на всех трех стадиях по CDC была достоверно выше (по тесту хи-квадрат) среди пациентов с низкими уровнями suPAR (ниже среднего значения в соответствующей группе) - в стадии А: р=0,006; в стадии В: р=0,03; в стадии С: р=0,03. Внутри каждой группы с клинической стадией А, В или С доля выживших была достоверно (р=0,03, тест хи-квадрат) выше среди пациентов с уровнем suPAR ниже среднего уровня, что указывает на возможную корреляцию между уровнями suPAR и выживаемостью на различных стадиях развития ВИЧ-1 инфекции. Корреляции ранжирования по Spearman продемонстрировали слабую, но не являющуюся значимой отрицательную корреляцию между уровнем suPAR и числом CD4-клеток (р=-0,33,р 0,0001) и слабые, но значимые положительные корреляции между уровнем suPAR и вирусной нагрузкой (р=0,28, р 0,0001), между уровнем suPAR и содержанием 2-микроглобулина(р=0,45, р 0,0001) и между уровнем suPAR и возрастом (р=0,18, р 0,002). Анализ по Kaplan-Meier. Для исследования связи между уровнямиsuPAR и выживаемостью был проведен анализ по Kaplan-Meier (фиг. 14). У 314 инфицированных ВИЧ-1 пациентов установлена связь между уровнем suPAR в сыворотке и общей выживаемостью. Пациенты были разделены на 3 группы по уровню suPAR в сыворотке с одинаковым числом пациентов(N=104-105) в каждой группе. Три кривые на этой фигуре представляют пациентов с уровнем(высокий). Уровень значимости общего различия между группами был высоким (р 0,0001,2=63, тест в логарифмическом масштабе). Число пациентов в группе риска через каждые 12 месяцев указано под фигурой. При отсутствии каких-либо приемлемых пороговых значений для уровня suPAR в сыво 27 ротке были установлены уровни suPAR 33 и 66% от максимального значения, что дало 3 одинаковые по количеству группы пациентов(N=104-105 пациентов), представлявших низкий, средний и высокий уровни suPAR в сыворотке. Кривые выживаемости для пациентов с низким уровнем suPAR в сыворотке достоверно отличались от кривых для пациентов со средним уровнем suPAR (р 0,0008, 2=11, тест в логарифмическом масштабе), которые, в свою очередь, достоверно отличались от кривых для пациентов с высоким уровнем suPAR (р 0,0001,2=26, тест в логарифмическом масштабе). Регрессионный анализ по Коксу. Сравнение 3 групп пациентов в представлении Kaplan-Meier (фиг. 14) путем регрессионного анализа по Коксу продемонстрировало монотонно возрастающий риск смертельного исхода с повышением уровня suPAR. В сравнении с пациентами с низким уровнем suPAR,средний уровень suPAR был связан с коэффициентом риска (КР), равным 2,2 (95%-ный доверительный интервал, 95% ДИ: 1,4-3,4, р 0,0001),а высокий уровень suPAR был связан с КР, равным 4,7 (95% ДИ: 3,1-7,2, р 0,0001). В сравнении с пациентами со средним уровнем suPAR,высокий уровень suPAR был связан с КР, равным 2,2 (95% ДИ: 1,6-3,1, р 0,0001). Если уровень suPAR вводили как непрерывную переменную в модель Кокса, охватывающую всех пациентов, высокие уровниsuPAR были достоверно связаны с повышенной смертностью (табл. 5). Повышение уровня suPAR в сыворотке на 1 нг/мл было связано с КР, равным 1,6 (95% ДИ: 1,5-1,8, р 0,0001). Другими клиническими и серологическими переменными, обладавшими существенным прогностическим значением в однопараметрическом анализе по Коксу, являлись число CD4-клеток, вирусная нагрузка, уровень 2-микроглобулина, возраст,клиническая стадия и лечение лекарствами на момент регистрации. Как и ожидалось, хорошо укоренившийся и используемый клинически прогностический маркер - число СD4-клеток по оценке с помощью величины 2 Уолда - наилучшим образом согласовался с однопараметрическим анализом. Пациентам, для которых имелись в распоряжении все серологические параметры (N=231),были затем в многопараметрической регрессионной модели Кокса приданы значения уровняsuPAR в этом суженном наборе пациентов(N=231) была, по существу, идентична тому случаю, когда анализ проводили для всех 314 пациентов (данные не показаны). В многопараметрической модели Кокса suPAR, число СD4 клеток, вирусная нагрузка, уровень 2 микроглобулина и стадия С по нормативам CDC предоставляли статистически достоверную независимую прогностическую информацию. Со 005290 28 гласно значениям 2 Уолда, suPAR был более надежным предсказателем выживаемости, чем число СD4-клеток и вирусная нагрузка. Вывод. В данной работе представлено доказательство того, что уровень suPAR в сыворотке является надежным независимым прогностическим параметром в инфекции ВИЧ-1. В анализе выживаемости по Kaplan-Meier более высокие уровни suPAR в сыворотке связаны с более быстрым продвижением к смертельному исходу. После введения всех известных относящихся к делу маркеров развития вызванного ВИЧ-1 заболевания в многопараметрический регрессионный анализ по Коксу уровень suPAR остается высокозначимым независимым прогнозирующим параметром выживаемости. Насколько известно, это является первым сообщением, демонстрирующим связь между системой урокиназного активатора плазминогена и развитием заболевания при инфекции ВИЧ-1. Одно из возможных объяснений прогностического значения уровня suPAR в сыворотке при инфекции ВИЧ-1 состоит в том, что suPAR имеет происхождение, по крайней мере частично, из инфицированных ВИЧ-1 клеток. Было известно, что моноциты и Т-лимфоциты, инфицированные ВИЧ-1, имеют повышенный уровень экспрессии на клеточной поверхностиuPAR [3, 4, 5] и что уровень suPAR в сыворотке может коррелировать с размером резервуара инфицированных ВИЧ-1 клеток в организме. Эта модель предсказывает, что уровни suPAR должны быть выше у инфицированных ВИЧ-1 индивидуумов, чем у здоровых людей. Данное исследование не посвящено изучению этой возможности. Однако в соответствии с этой гипотезой представленные данные демонстрируют,что уровень suPAR выше у пациентов с более развитой инфекцией ВИЧ-1. Поразительная корреляция между уровнями suPAR в сыворотке и риском прогрессирования заболевания позволяет предполагать непосредственное участие uPAR в инфекции ВИЧ-1. Было установлено, что uРА, природный лигандuPAR с высоким сродством, связывается с гликопротеином gр 120 вируса ВИЧ-1 и усиливает инфекцию ВИЧ-1 макрофагов in vitro [27]. Во взаимодействии между uРА и gр 120 участвуют функционально важная петля V3 gр 120 и каталитический домен uРА, но необходимый для связывания лиганда домен uРА остается свободным для взаимодействия с uPAR [27]. Поэтому возможно, что uРА может образовывать мостик между gр 120 вируса и uPAR на поверхности клетки, что может идентифицироватьuPAR как клеточный сорецептор для ВИЧ-1. Действительно, необходимо отметить, что основными типами клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ-1, являются те, в которых преимущественно экспрессируется uPAR (макрофаги, активированные моноциты и Т-клетки). 29 Исследования, направленные на выяснение такого участия, являются в настоящее время в высокой степени оправданными. Наконец, необходимо подчеркнуть, что циркулирующий suPAR может играть непосредственную роль в патогенезе инфекции ВИЧ-1. Действительно, фрагменты suPAR имеют хемокиноподобные активности и suPAR способен модулировать такие процессы, как адгезия, миграция и пролиферация клеток in vitro [1, 34]. Независимо от объяснений с точки зрения биологии, уровень suPAR в сыворотке остается надежным и независимым прогностическим параметром развития заболевания при инфекции ВИЧ-1. Использование единичного измерения уровня suPAR в сыворотке и произвольных конечных точек сделало возможным определить группы пациентов, связанные с различными степенями риска (hazard ratios) прогрессирования заболевания. Это позволяет предположить,что измерения уровня suPAR можно использовать как средство прогноза в инфекции ВИЧ-1. Имеется лишь слабая совместная корреляция уровня suPAR, числа CD4-клеток и вирусной нагрузки, и все три параметра предоставляют высоко значимую независимую прогностическую информацию в многопараметрическом анализе по Коксу. Это означает, что уровеньsuPAR обеспечивает важную дополнительную прогностическую информацию. В связи с этим особенно важно установить, может ли уровеньsuPAR быть полезным в определении того, необходимо ли и когда начинать высоко активную антиретровирусную терапию (ВААРТ). Все еще существуют серьезные разногласия относительно того, какое сочетание числа СD4-клеток и вирусной нагрузки является показателем необходимости терапии, и это отражено в различных национальных регламентах. Вирусологические и иммунологические аргументы в пользу раннего начала терапии следует сопоставлять с такими минусами лечения, как необходимость длительного применения нескольких лекарств, высокой ценой, побочными эффектами и риском развития лекарственной устойчивости. Поскольку уровень suPAR дает надежную и независимую информацию о положении с прогрессированием заболевания, он может помочь в мониторинге пациентов и в принятии важного клинического решения о том, когда начинать ВААРТ. В настоящем исследовании период врачебного наблюдения фиксировался от момента,когда первый пациент контингента получил ингибитор протеаз. Поэтому пациенты получали в сравнении с ВААРТ только относительно щадящее антиретровирусное лечение. Лечение антиретровирусными препаратами на момент регистрации в Копенгагенском ВИЧ-иммунном контингенте было связано при однопараметрическом анализе по Коксу с низкой выживаемостью, но оно не давало достоверной прогности 005290 30 ческой информации при многопараметрическом анализе по Коксу. Возможно, это отражает тот факт, что пациенты, подвергавшиеся лечению на момент регистрации, являлись пациентами с более прогрессировавшим заболеванием, для которых терапия одним или двумя лекарствами не давала заметного продления срока жизни. Поэтому настоящее исследование скорее отражает развитие болезни, похожее на естественный ход развития инфекции ВИЧ-1, и на возможное прогностическое значение suPAR при ВААРТ следует обратить внимание в других,более адекватно спланированных исследованиях. Хотя настоящее исследование показывает высокую степень связи между уровнями suPAR и развитием заболевания, важно уяснить, что сумма данных настоящего единичного исследования не может быть основанием для предложения об использовании уровня suPAR как одного из стандартных прогностических параметров. Во-первых, эти данные нуждаются в подтверждении в независимом контингенте. Во-вторых,поскольку данный контингент состоит из пациентов европейской страны и относится ко времени до эры ВААРТ, значение данных необходимо подтвердить на пациентах, подвергавшихся лечению ВААРТ и/или находящихся в бедных ресурсами ареалах. В данном исследовании использованы произвольным образом выбранные значения конечных точек и статистические методы, не требующие определения конкретных значений конечных точек. Прежде чем можно будет ввести общеупотребимое использование уровня suPAR, необходимо иметь нормальные значения уровня suPAR, полученные с использованием стандартных методов анализа образцов. Ранее было установлено, что антигенsuPAR может быть легко определен количественно в моче и что уровни suPAR в моче в высокой степени коррелируют с его уровнем в сыворотке [14]. Поэтому возможно, что для основанного на уровне suPAR прогноза развития инфекции ВИЧ-1 вместо образцов сыворотки можно использовать мочу. Это может повысить безопасность и удобство как для пациентов, так и для медицинского персонала. Внедрение в западных странах ВААРТ значительно повысило ожидаемую продолжительность жизни инфицированных ВИЧ-1 индивидуумов. Однако вследствие высокой стоимости этих лекарств только небольшая часть инфицированных ВИЧ-1 людей в мире имеет доступ к эффективной терапии ВИЧ-1. Измерение уровня suPAR проводится с помощью простого и недорогого метода ELISA. После подтверждения представленных здесь результатов на других группах пациентов определение уровняsuPAR в сыворотке (или даже лучше в моче) инфицированных ВИЧ-1 людей может дать недорогое дополнение или альтернативу к используемым повсеместно способствующим приня 31 тию решения способам, основанным на числе СD4-клеток и вирусной нагрузке. Пример 10. Определение suPAR методомELISA (R2/Pab). Ниже приведен пример специфического метода ELISA, пригодного для использования в способе по настоящему изобретению. Принцип анализа показан на фиг. 15, где цифрами 1, 2 и 3 обозначены три фрагментаsuPAR - D1, D2 и D3. Сокращения. АР: щелочная фосфатаза,Маb: моноклональные антитела,Pab: поликлональные антитела. Протокол анализа. 1. Покрытие. Ячейки Nunc Maxisorp покрывают раствором из расчета 100 мкл на ячейку улавливающего антитела (R2: 3,0 мкг/мл). Инкубация в течение ночи при 4 С без встряхивания. Блокирование 50% Superblock (Pierce Chemicals) (250 мкл на ячейку). Промывка 3 раза. 2. Улавливание. Добавляют (100 мкл на ячейку) стандарты и образцы, разбавленные в гепариновом буфере. Стандарты: 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,313,0,156 нг/мл плюс пустой контроль. Образцы: разбавленные 1/10. Инкубация со встряхиванием в течение 2 ч при 30 С. Промывка 6 раз. 3. Детектирование. Добавляют 100 мкл на ячейку Pab кролика к suPAR, разбавленных в гепариновом буфере(1 мкг/мл). Инкубация в течение ночи при 4 С без встряхивания. Промывка 6 раз. 4. Вторичные антитела. Добавляют 100 мкл на ячейку конъюгированных с АР Mab к IgG кролика (фирма Sigma, по каталогу 2556) (разбавление 1/2000). Инкубация со встряхиванием в течение 1 ч при 30 С. Промывка 6 раз, затем 3 раза MilliQ-H2O. 5. Субстрат. Добавляют 100 мкл на ячейку свежеприготовленного раствора субстрата(пнитрофенилфосфат, фирма Sigma,по каталогу 2765). 6. Измерения. Постоянный мониторинг (измерение кинетики) при 405 нм с отсчетами через каждые 10 мин вплоть до 60 мин. Модифицированный анализ в сравнении с приведенной выше прописью содержал следующие модификации: 1. более низкая концентрация раствора покрывающих антител R2: 1 мкг/мл вместо 3 мкг/мл; 2. длительность инкубации при улавливании (образец/стандарт): 1 ч вместо 2 ч; 3. длительность инкубации при детектировании (Pab к suPAR): 1 ч при 30 С вместо инкубации в течение ночи при 4 С. Пример 11. Определение suPAR методом 32 Ниже приведен пример специфического метода ELISA, пригодного для использования в способе по настоящему изобретению. Принцип анализа показан на фиг. 16, где цифрами 1, 2 и 3 обозначены три фрагментаTR: с разрешением во времени (определение длительности флуоресценции),FIA: флуоресцентный иммуноанализ,Еu: европий,Mab: моноклональные антитела,Pab: поликлональные антитела. Протокол анализа. 1. Покрытие. Ячейки Nunc Maxisorp покрывают раствором из расчета 100 мкл на ячейку улавливающего антитела (R2: 3,0 мкг/мл). Инкубация в течение ночи при 4 С без встряхивания. Блокирование 50% Superblock (Pierce Chemicals) (250 мкл на ячейку). Промывка 3 раза. 2. Улавливание. Добавляют (100 мкл на ячейку) стандарты и образцы, разбавленные в гепариновом буфере. Стандарты: 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,313,0,156 нг/мл плюс пустой контроль. Образцы: разбавленные 1/10. Инкубация со встряхиванием в течение 2 ч при 30 С. Промывка 6 раз. 3. Детектирование. Добавляют 100 мкл на ячейку меченных Еu Pab кролика к suPAR, разбавленных в буфере для анализа (1 мкг/мл). Инкубация в течение ночи при 4 С без встряхивания. Промывка 6 раз,затем 3 раза MilliQ-H2O. 4. Усиление. Добавляют 100 мкл на ячейку усиливающего раствора. Инкубация со встряхиванием в течение 5 мин при комнатной температуре. 5. Измерение. Измеряют длительность флуоресценции Еu. Пример 12: Определение suPAR с помощью инвертированного метода ELISA. Ниже приведен пример специфического метода ELISA, пригодного для использования в способе по настоящему изобретению. Сокращения.Mab: моноклональные антитела,Pab: поликлональные антитела. Протокол анализа. 1. Покрывают иммунологические планшеты MaxiSorp Immunoplates (Nunc 4-39454) улавливающими антителами. Добавляют 100 мкл раствора поликлональных антител к uPAR (2 мкг/мл), разбавленных в покрывающем буфере. Инкубация в течение ночи при 4 С. Моноклональные антитела: 1 мг/мл. 2. Промывают 200 мкл промывающего буфера (3 раза). 3. Добавляют 200 мкл блокирующего буфера. Инкубация в течение 30 мин при 37 С со встряхиванием. 33 4. Добавляют 200 мкл промывающего буфера (3 раза). 5. Стандарт suPAR: 100 мкл с концентрацией 1, 0,5, 0,25, 0,12, 0,06, 0,03, 0,15 нг/мл в буфере для разбавления. 6. Разбавление образцов. Сыворотки разбавляют 1:10 буфером для разбавления, а экстракты ткани 1:20 в зависимости от ткани. Инкубация в течение 1 ч при 37 С со встряхиванием. 7. Добавляют 200 мкл промывающего буфера (5 раз). 8. Добавляют 100 мкл на ячейку детектирующих поликлональных антител (поликлональные антитела кролика к suPAR человека,1 мкл/мл). Инкубация в течение 1 ч при 37 С со встряхиванием. 9. Добавляют 200 мкл промывающего буфера (5 раз). 10. Добавляют конъюгат мышиных антител к антителам кролика со щелочной фосфатазой (Sigma) (разбавление 1:2000, 100 мкл на ячейку). Инкубация в течение 1 ч при 37 С со встряхиванием. 11. Добавляют 200 мкл промывающего буфера (5 раз). 12. Добавляют 200 мкл воды MilliQ (3 раза). 13. Добавляют субстрат (п-нитрофенилфосфат, фирма Sigma,по каталогу 2765),100 мкл на ячейку, инкубация в течение 30 мин при комнатной температуре. Остановка реакции 2 М NaOH. 14. Измеряют поглощение при 405-412 нм. Пример 13. Измерение количества фрагмента D1 suPAR. Были собраны образцы мочи от 20 ВИЧпозитивных пациентов, подвергавшихся ВААРТ,и от 10 контрольных лиц. В образцах определяли содержание suPAR по отношению к креатинину, количество фрагмента D1 suPAR, числоCD4 Т-клеток и количество мРНК ВИЧ. Были применены ELISA и вестерн-блотирование. Анализ ELISA проводили, как в примере 1. Вестерн-блотирование проводили, используя следующую процедуру: 100 мкл образцов сыворотки и культуральной жидкости разбавляли до 1 мл с помощью буфера RIPA (0,1% додецилсульфат натрия (SDS), 1% тритон Х-100, 1% дезоксихолат, 0,15 М NaCl и 0,05 М трис-НСl рН 7,6), содержащего коктейль ингибиторов протеаз (Complete, Boehringer, Mannheim). Иммунопреципитацию образцов проводили в течение 16 ч при 4 С с помощью биотинилированных моноклональных антител R2, R3 или обоих,иммобилизованных на покрытых стрептавидином гранулах (Boehringer, Mannheim). После промывки буфером RIPA абсорбированный материал элюировали кипячением в невосстанавливающем буфере для образцов и разделяли белки электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с SDS. Белки переносили на мембраныPVDF (Immobilon-P, Millipore) и тестировали с помощью поликлональных антител кролика кuPAR. Иммунокомплексы визуализовали путем инкубации с антителами осла к антителам кролика, конъюгированными с пероксидазой(SuperSignal Ultra, Pierce Chemicals). Результаты представлены на фиг. 17-20. Из фиг. 17 можно заключить, что уровень(р 0,003). Фиг. 18 и 19 показывают, что наличие D1 не зависит от числа CD4 Т-клеток и от уровняsuPAR, соответственно. Фиг. 20 показывает, что наличие D1 достоверно коррелирует с уровнем мРНК ВИЧ. Наличие D1 также достоверно чаще обнаруживается у пациентов, имеющих определяемые количества РНК ВИЧ. Только у одного человека из контрольной группы имелся заметный уровень D1. Пример 14. Экспрессия uPAR на клетках РВМС коррелирует с уровнем suPAR в сыворотке. Предпосылки. Цель этого примера состоит в том, чтобы определить, имеется ли существенная связь между экспрессией suPAR на поверхности клеток и уровнем suPAR в сыворотке. Методы. Пробы крови брали у 10 здоровых доноров крови, посещающих донорскую клинику вHvidovre Hospital. Концентрацию suPAR в образцах сыворотки измеряли методом ELISA. Одноядерные клетки периферической крови(РВМС) собирали с помощью центрифугирования в градиенте Histopaq, экспрессию CD87 измеряли с помощью антител R2 и вторичных антител к мышиным антителам, конъюгированных с FITC. Для контроля специфичности применяли идиотипические антитела, служившие негативным контролем. Результаты. Результаты представлены на фиг. 21. По оси Y слева указан уровень suPAR в сыворотке(нг/мл). По оси Y справа указан процент клеток,экспрессирующих рецептор uPAR (СD87-позитивные клетки). Все доноры крови имели измеримый уровень рецептора uPAR на клетках РВМС и измеримый уровень suPAR в сыворотке. У 8 из 10 пациентов уровень suPAR достоверно коррелировал с поверхностной экспрессией uPAR (р 0,05). Вывод. Результаты показывают достоверную связь между экспрессией uPAR (CD87) на поверхности РВМС и уровнем suPAR в сыворотке(нг/мл). Поэтому резонно предположить, что поверхностная экспрессия uPAR является надежным прогностическим показателем при ВИЧ-инфекции. Использование uPAR в качест 35 ве маркера имеет то удобство, что количествоuPAR можно измерять вместе с подсчетом числа CD4 Т-клеток, например методом FACS, при обычных обследованиях ВИЧ-инфицированных индивидуумов. Следовательно, оно дает ценную дополнительную информацию о состоянии развития заболевания у пациентов. Таблица 1 КР - коэффициент риска; ДИ - доверительный интервал; нд - различие недостоверно. Таблица 2 Регрессионный однопараметрический и многопараметрический анализ по Коксу времени развития СПИДa или продолжительности жизни 36 Пациенты, получающие лечение антиретровирусным лекарством на момент регистрации.+ 6 пациентов были инфицированы при внутривенном применении наркотиков, 7 - при переливаниях крови, 6 - пациенты с гемофилией, путь инфицирования у 8 неизвестен.lоg10 числа молекул РНК ВИЧ-1 на 1 мл плазмы. 9 пациентов с отсутствием данных по числу CD4-клеток, 64 пациента с отсутствием данных по вирусной нагрузке и 19 пациентов с отсутствием данных по 2-микроглобулину.U-тест Mann-Whitney.Тест хи-квадрат. НП - неприменимо. Таблица 5 Регрессионный анализ по Коксу 95% доверительный интервал для коэффициента риска. Пациенты, у которых отсутствовали данные для одного или нескольких серологических параметров (N=83), были исключены из анализаCancer Res. 1985. Т. 44. С. 139-266. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ диагностики или прогнозирования ВИЧ-инфекции у индивидуума, содержащий этапы(a) проведения in vitro измерения в образце биологической жидкости индивидуума уровня содержания одного или более маркеров в форме(i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR) и/или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR), и/или одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и(b) использования полученного измеренного значения для оценки состояния индивидуума. 2. Способ диагностики или прогнозирования ВИЧ-инфекции у индивидуума, содержащий этапы(a) проведения in vitro измерения в образце биологической жидкости индивидуума уровня содержания маркера в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR),(ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR) или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и(b) использования полученного измеренного значения для оценки состояния индивидуума. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем,что образцом биологической жидкости является образец мочи, причем измерение маркера нормируется к общему концентрационному уровню образца. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что этап (а) осуществляют с помощью щупа-индикатора. 5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что этап (а) осуществляют с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа ELISA. 6. Способ оценки развития состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией, содержащий этапы(а) проведения in vitro измерения в каждом из нескольких образцов биологической жидкости индивидуума уровня содержания одного или более маркеров в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR),и/или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR),и/или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), причем образцы отбирают в различные моменты времени, и(b) использования полученных измеренных значений для оценки развития состояния индивидуума. 7. Способ оценки развития состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией, содержащий этапы(a) проведения in vitro измерения в каждом из нескольких образцов биологической жидкости индивидуума уровня содержания маркера в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR) или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), причем образцы отбирают в различные моменты времени, и(b) использования полученных измеренных значений для оценки развития состояния индивидуума. 8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем,что индивидуум, состояние которого оценивается, находится в стадии лечения. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что пациент подвергается высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ). 10. Применение набора ELISA, содержащего(a) планшет с несколькими ячейками,(b) один или несколько улавливающих агентов, иммобилизованных на поверхности ячеек и способных улавливать один или несколько маркеров в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR),и/или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR),и/или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и(c) связывающийся компонент, способный связываться с указанным маркером, причем связывающийся компонент содержит(d) систему метки,в качестве набора для оценки физического состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией. 11. Применение набора ELISA, содержащего(a) планшет с несколькими ячейками,(b) улавливающий агент, иммобилизованный на поверхности ячеек и способный улавливать маркер в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена (uPAR), (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR) или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и(c) связывающийся компонент, способный связываться с указанным маркером, причем связывающийся компонент содержит(d) систему метки,в качестве набора для оценки физического состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией. 12. Набор щупа-индикатора для оценки физического состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией, содержащий(a) щуп-индикатор, приспособленный для приведения в контакт с образцом биологической жидкости и содержащий устройства для визуального представления результата оценки,(b) один или несколько улавливающих агентов, иммобилизованных на поверхности щупа-индикатора и способных улавливать один или несколько маркеров в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена(uPAR), и/или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR),и/или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и(c) связывающийся компонент, способный связываться с указанным маркером, причем связывающийся компонент содержит(d) систему метки. 13. Набор щупа-индикатора для оценки физического состояния индивидуума, страдающего заболеванием, вызванным ВИЧ-инфекцией, содержащий(a) щуп-индикатор, приспособленный для приведения в контакт с образцом биологической жидкости и содержащий устройства для визуального представления результата оценки,(b) улавливающий агент, иммобилизованный на поверхности щупа-индикатора и способных улавливать маркер в форме (i) рецептора для урокиназного активатора плазминогена(uPAR), или (ii) растворимого рецептора для урокиназного активатора плазминогена (suPAR),или (iii) одного или более продуктов расщепления (i) или (ii), и(c) связывающийся компонент, способный связываться с указанным маркером, причем связывающийся компонент содержит(d) систему метки. 14. Набор по п.12 или 13 или применение по п.10 или 11, отличающиеся тем, что улавливающий агент является антителом к маркеру. 15. Набор по любому из пп.12-14 или применение по любому из пп. 10, 11 или 14, отличающиеся тем, что связывающийся компонент является антителом к маркеру.

МПК / Метки

МПК: G01N 33/53

Метки: прогнозирования, человека, вич, способ, диагностики, инфекции

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/25-5290-sposob-diagnostiki-i-prognozirovaniya-vich-infekcii-u-cheloveka.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ диагностики и прогнозирования вич инфекции у человека</a>

Похожие патенты