Ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, отличающуюся увеличенной стабильностью, и его применение для контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена

Номер патента: 24878

Опубликовано: 31.10.2016

Автор: Хуан Хайдун

Есть еще 14 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Мутантный ген, при экспрессии которого наблюдается увеличенная стабильность кодируемой им глюкокиназы, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или идентичную ей последовательность, за исключением открытой рамки считывания (ORF) в положении 487-1884 нуклеотидов, которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и ORF нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2.

2. Рекомбинантный вектор, содержащий ген по п.1.

3. Рекомбинантный вектор по п.2, отличающийся тем, что указанный вектор выбран из группы, включающей клонирующий вектор, эукариотический вектор экспрессии, прокариотический вектор экспрессии и челночный вектор.

4. Рекомбинантный вектор по п.2, отличающийся тем, что указанный вектор выбран из группы, включающей pIRES2-EGFP, pCMVp-NEO.BAN, pEGFT-Actin и аденовирусный вектор.

5. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.2.

6. Клетка-хозяин по п.5, которая выбрана из группы, включающей клетки Escherichia coli, клетки 239, клетки min-6 и островковые бета-клетки человека.

7. Фармацевтическая композиция для контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена, содержащая ген по п.1, и/или вектор по п.2, и/или клетку-хозяин по п.5, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, предназначенная для инъекций, содержащая ген по п.1 и/или вектор по п.2, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, содержащая в 1 мл 102-1010 копий гена по п.1 или копий вектора по п.2 и содержащая в качестве фармацевтически приемлемого наполнителя фосфатный буфер со значением pH 4,0-9,0.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, дополнительно содержащая вещество-протектор и/или осмотический регулятор в концентрации 0,01-30,00 вес.%, где вещество-протектор представляет собой инозит, и/или сорбит, и/или сахарозу, а осмотический регулятор, обеспечивающий осмотическое давление 200-700 мосмоль/кг, представляет собой хлорид натрия и/или хлорид калия.

11. Способ контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в этом, вводят средство, выбранное из группы, включающей ген по п.1, вектор по п.2, клетку-хозяин по п.5 и композицию по п.7.

12. Способ по п.11, где нарушением углеводного обмена является сахарный диабет.

Текст

Смотреть все

ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ МУТАНТНУЮ ГЛЮКОКИНАЗУ ЧЕЛОВЕКА,ОТЛИЧАЮЩУЮСЯ УВЕЛИЧЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА Настоящее изобретение относится к гену, кодирующему мутантную глюкокиназу человека,отличающуюся увеличенной стабильностью, а также к содержащему указанный ген вектору,а также к содержащей указанный вектор клетке-хозяин, к содержащей указанный ген, вектор или клетку-хозяин композиции для контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена и соответствующему способу, включающему введение указанного гена, вектора, клетки-хозяин или композиции. Область изобретения Данное изобретение направлено на ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, мутантную глюкокиназу человека, экспрессируемую геном, рекомбинантный вектор, несущий ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, хозяина, содержащего рекомбинантный вектор, фармацевтическую композицию, содержащую один или более, выбранные из гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, мутантной глюкокиназы человека, рекомбинантного вектора и хозяина, применение гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, мутантной глюкокиназы человека, рекомбинантного вектора и хозяина при изготовлении лекарственного препарата для контроля глюкозы в крови или лекарственного препарата для предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена, применение гена,кодирующего мутантную глюкокиназу человека, мутантной глюкокиназы человека, рекомбинантного вектора и хозяина при изготовлении лекарственного препарата для предупреждения и лечения сахарного диабета, способ контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена путем их применения и способ предупреждения и лечения сахарного диабета путем их применения. Предпосылки изобретения Глюкокиназа (GK) является важным членом гексокиназного семейства, основная биологический активность которого заключается в катализе фосфорилирования глюкозы. Ген, кодирующий глюкокиназу человека, расположен на коротком плече хромосомы 7 и содержит десять экзонов. GK состоит из 465 аминокислот, присутствует, как правило, в зрелых гепатоцитах и островковых бета-клетках и вовлечена во многие ключевые этапы в углеводном метаболизме и секреции инсулина. К настоящему времени было показано, что интенсивность инсулинового секреторного ответа in vivo пропорциональна скорости метаболизма для глюкозы в инсулиновых бета-клетках. Таким образом,фермент, который контролирует скорость притока глюкозы в клетки, рассматривается как глюкозный сенсор, регулирующий высвобождение инсулина, a GK является глюкозным сенсором у островковых бета-клеток. При переносе в бета-клетку посредством транспортера 2 глюкоза фосфорилируется под действием глюкокиназы и вводится в гликолитический путь с получением АТФ, количество которого пропорционально количеству глюкозы, введенной в бета-клетку; АТФ может выключать калиевый ионный канал на плазматической мембране бета-клетки, приводя к деполяризации, которая, в свою очередь, приводит в результате к притоку ионов кальция и, в конечном итоге, секреции инсулина. ПосколькуGK-активность контролируется напрямую или опосредованно концентрацией глюкозы в крови, то изменение скорости метаболизма для глюкозы в бета-клетке может регулировать секрецию инсулина. Более того, поскольку фермент также может контролировать концентрацию глюкозы в крови, содействуя синтезу гликогена печени и катализу превращения глюкозы в глюкоза-6-фосфат, нарушение GK-активности играет ключевую роль при возникновении и развитии нарушений углеводного обмена. В некоторых исследованиях было обнаружено, что у пациентов и некоторых животных моделей(например, голодающие крысы), страдающих от сахарного диабета 2 типа, GK-активность в гепатоцитах от крыс с сахарным диабетом 2 типа, индуцированных диетой с высоким содержанием жира, значительно снижена по сравнению с нормальным контролем. Кроме того, было продемонстрировано результатами других исследований, что повышение GK-активности может значительно снизить уровень глюкозы в крови. В данном исследовании подтверждено, что изменчивость в гене GK тесно связана с проявлением подтипа сахарного диабета 2 типа, т.е. юношеского диабета взрослого типа (MODY), при котором генная мутация играет ведущую роль в проявлении MODY. Раскрытие изобретения Техническая задача, решаемая данным изобретением, заключается в обеспечении гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, с которого экспрессируется мутантная глюкокиназа человека сGK-активностью, выше таковой дикого типа, с тем чтобы обеспечить новый способ контроля глюкозы в крови, лечения нарушений углеводного обмена, а также сахарного диабета, особенно сахарного диабета 2 типа. Данное изобретение представляет ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, где ген имеет:(2) нуклеотидную последовательность, которая идентична нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, за исключением открытой рамки считывания (ORF), располагающейся от положения 487 до 1884 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и ORF которой кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и кодируемая посредством ORF нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2. Обычно в известном уровне техники считается, что поскольку миссенс-мутация, нонсенс-мутация и мутация со сдвигом рамки в основаниях в ORF кодирующего белок гена могут изменять первичную структуру аминокислотной последовательности белкового продукта, кодируемого геном, то только мутация, происходящая в экзоне кодирующего белок гена, может обычно давать в результате относительно заметные изменения в работе белкового продукта. В настоящее время функция интрона кодирующего белок гена все еще неясна, и, в общем, изменение в интроне вряд ли может иметь существенное влияние на работу белкового продукта. В данном изобретении неожиданно обнаружено, что мутантный ген глю-1 024878 кокиназы человека, который имеет мутацию, находящуюся в интронном участке гена дикого типа глюкокиназы человека, может экспрессировать мутантную глюкокиназу человека, проявляющую значительно повышенную GK-активность по сравнению с таковой дикого типа. Данное изобретение также представляет мутантную глюкокиназу человека, где ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, является геном, кодирующим мутантную глюкокиназу человека, изложенным в данном изобретении. Данное изобретение также представляет рекомбинантный вектор, включающий вектор и ген интереса, переносимый им, где ген интереса является геном, кодирующим мутантную глюкокиназу человека,изложенным в данном изобретении. Данное изобретение также представляет хозяина, где хозяин содержит рекомбинантный вектор, изложенный в данном изобретении. Данное изобретение также представляет фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемый наполнитель и один или более, выбранные из гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, изложенного в данном изобретении, мутантной глюкокиназы человека, изложенной в данном изобретении, рекомбинантного вектора, изложенного в данном изобретении, и хозяина,изложенного в данном изобретении. Данное изобретение также представляет применение гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, изложенного в данном изобретении, мутантной глюкокиназы человека, изложенной в данном изобретении, рекомбинантного вектора, изложенного в данном изобретении, и хозяина, изложенного в данном изобретении, при изготовлении лекарственного препарата для контроля глюкозы в крови или лекарственного препарата для предупреждения и лечения нарушения углеводного обмена. Данное изобретение также представляет применение гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, изложенного в данном изобретении, мутантной глюкокиназы человека, изложенной в данном изобретении, рекомбинантного вектора, изложенного в данном изобретении, и хозяина, изложенного в данном изобретении, при изготовлении лекарственного препарата для предупреждения и лечения сахарного диабета. Данное изобретение также представляет способ контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена, при котором средство, выбранное из группы, включающей ген,кодирующий мутантную глюкокиназу человека, изложенный в данном изобретении, мутантную глюкокиназу человека, изложенную в данном изобретении, рекомбинантный вектор, изложенный в данном изобретении, и хозяина, изложенного в данном изобретении, вводят пациенту, нуждающемуся в этом. Данное изобретение также представляет способ предупреждения и лечения сахарного диабета, при котором средство, выбранное из группы, включающей ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, изложенный в данном изобретении, мутантную глюкокиназу человека, изложенную в данном изобретении, рекомбинантный вектор, изложенный в данном изобретении, и хозяина, изложенного в данном изобретении, вводят пациенту, нуждающемуся в этом. Мутантная глюкокиназа человека, экспрессируемая геном данного изобретения, проявляет активность, значительно более высокую, чем у глюкозиназы дикого типа, таким образом, обеспечивая новое,эффективное средство для контроля глюкозы в крови или для предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена, в частности сахарного диабета. Описание графических материалов Фиг. 1 представляет собой фотографию электофореза, полученную после лигирования линеаризованной плазмиды pIRES2-EGFP и гена интереса (пример 1), где дорожка 1 представляет результат электрофореза для лигированной общей ДНК примера 1, дорожка 2 представляет маркер молекулярного веса,и бэнд с молекулярным весом больше 5000 у дорожки 1 является бэндом успешно лигированной. Фиг. 2 представляет собой кривую функциональной зависимости между инсулиновой единицей(микроЕдиница/мл) по Х-оси и подсчетом 125I no Y-ocu. Фиг. 3 представляет собой схематическое изображение структуры плазмидного вектора pIRES2EGFP. Фиг. 4 представляет собой фотографию электрофореза для идентификации клеток min6, успешно трансфецированных рекомбинантным плазмидным вектором, где дорожка 0 представляет плазмидуG262, дорожка 1- геном G261min-6, дорожка 2 - геном G261min-6, дорожка 3 - геном G262min-6, дорожка 4 - геном G262min-6, дорожка 5 - плазмида G261, дорожка 6 - плазмида G261, дорожка 7 - геном дикого типа min-6, дорожка 8 - отрицательный контроль (вода), дорожка 9 - отрицательный контроль (вода),дорожка 10 - плазмида G262, дорожка 11 - геном дикого типа min-6, дорожка 12 - геном G261min-6, дорожка 13 - геном G262min-6 и дорожка М - маркер молекулярного веса ДНК. Фиг. 5 представляет собой фотографию микроскопии клеток min6, успешно трансфецированных рекомбинантным плазмидным вектором. Фиг. 6 представляет собой фотографию электрофореза для идентификации рекомбинантной кольцевой челночной плазмиды pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP или рекомбинантной кольцевой челночной плазмиды pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP, где дорожки 1-4 представляют, соответственно, два образца pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP и два образца pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP. Фиг. 7 представляет собой фотографию электрофореза для идентификации рекомбинантного аденовируса pAd-GFP-G261 или рекомбинантного аденовируса pAd-GFP-G262, где дорожки 1-5 представляют,соответственно, два образца рекомбинантной аденовирусной плазмиды pAd-GFP-G261 и три образца рекомбинантной аденовирусной плазмиды pAd-GFP-G262. Детальные варианты осуществления Данное изобретение представляет ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, где ген имеет:(2) нуклеотидную последовательность, которая идентична нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, за исключением открытой рамки считывания (ORF), располагающейся от положения 487 до 1884 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, и ORF которой кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и кодируемая посредством ORF нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2. Предпочтительно ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2. Ген, кодирующий глюкокиназу человека, может быть выделен из лейкоцитов здорового человеческого организма, который имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 из перечня последовательностей, т.е. ген дикого типа, кодирующий глюкокиназу человека (инвентарный номер GenBank BC001890, М 88011, NM033508 и NM033507). Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, по данному изобретению, как показано в SEQ ID NO: 2, имела делению одного С-основания в положении 2643 по сравнению с таковой гена дикого типа. Следует понимать, что специалист в данной области может синтезировать нуклеотидную последовательность, отличную от SEQ ID NO: 2 и в то же время кодирующую мутантную глюкокиназу человека данного изобретения, в соответствии с вырожденностью кодона и смещением частот использования кодонов у различных видов. Т.е. это нуклеотидная последовательность, которая идентична нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, за исключением открытой рамки считывания, располагающейся от положения 487 до 1884 нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, иORF которой кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и кодируемая посредствомORF нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2. Данное изобретение также представляет мутантную глюкокиназу человека, где ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, является геном, кодирующим мутантную глюкокиназу человека, изложенным в данном изобретении. В данном уровне техники хорошо известно, что среди 20 видов различных аминокислот, составляющих белок, все другие 18 видов различных аминокислот кодируются отдельно 2-6 кодонами за исключением Met (ATG) или Trp (TGG), каждая из которых кодируются одним кодоном (см. ПриложениеD в Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 950). Другими словами, поскольку кодон, кодирующий аминокислоту, представляет собой более чем один в большинстве случаев из-за генетической вырожденности кодона, и замещение третьего нуклеотида в триплетном кодоне часто не приводит в результате к изменениям в аминокислотном составе, нуклеотидные последовательности, кодирующие белки с идентичной аминокислотной последовательностью, могут быть различными. По хорошо известной таблице кодонов специалист в данном уровне техники получит вышеупомянутые нуклеотидные последовательности из нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, раскрытой по данному изобретению, посредством биологических процессов (например, подходы, основанные на ПЦР (полимеразная цепная реакция), способы точечной мутации) или химического синтеза, и использует их в рекомбинантных техниках и генных терапиях, таким образом, эта часть нуклеотидных последовательностей должна быть полностью включена в объем данного изобретения. Более того, последовательности ДНК, раскрытые в данном описании, также могут быть использованы способами, хорошо известными в данном уровне техники, например способами, описанными Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989), путем модифицирования последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в данном изобретении. Данное изобретение также представляет рекомбинантный вектор, содержащий вектор и ген интереса, переносимый им, где ген интереса является геном, кодирующим мутантную глюкокиназу человека,изложенным в данном изобретении. Гены интереса могут также включать регуляторную последовательность, например промотор, терминатор и энхансер, для экспрессии одного или более генов интереса. Ген интереса также может включать маркерный ген (например, гены, кодирующие -галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок или другие флуоресцентные белки) или ген, чей продукт регулирует экспрессию других генов. Кроме того, что является ДНК, ген интереса также может быть мРНК, тРНК или рРНК, а также может включать соответствующую транскрипционную регуляторную последовательность, обычно связанную с транскрипцией последовательности, такую как, например, сигнал терминации транскрипции, сайт полиаденилирования и нижний энхансерный элемент. Вектором могут быть различные векторы, способные нести ген интереса, которые обычно используются в данном уровне техники, и различные векторы, способные нести ген интереса, которые доступны и улучшены технологическим прогрессом. Например, вектором являются плазмиды (голая ДНК), липосомы, молекулярные конъюгаты, полимеры и вирусы. Плазмида (голая ДНК) может нести ген интереса, и плазмида, несущая ген интереса может быть введена напрямую или введена техниками генной пушки, электропорации и электрослияния в клетки ткани. Более того, ультразвуковая волна способствует повышению эффективности переноса для плазмиды. Ультразвуковая волна в сочетании со средством эхо-контрастных микропузырьков может увеличить проницаемость плазматической мембраны, таким образом, значительно усиливая эффективность переноса и экспрессии голой ДНК. Поскольку эта техника проницаемости плазматической мембраны может временно проделывать поры на поверхности плазматической мембраны, ДНК имеет шанс быть введенной в клетку. Липосома представляет собой каплю, состоящую из липидных бимолекулярных листков, и может опосредовать введение гена интереса через плазматическую мембрану. Липидом могут быть натуральные фосфолипиды, преобладающие в лецитине (фосфатидилхолин, PC) и получаемые из яичного желтка и сои; также могут быть синтетические фосфолипиды, такие как дипальмитоилфосфатидилхолин(DPPC), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) и т.д.; а также могут включать холестерин. Предпочтительной липосомой является катионная липосома, которая,главным образом, является результатом смешивания положительно заряженных липидов и вспомогательных нейтральных липидов в эквимолярных количествах. Комплекс может быть эффективно сформирован между положительно заряженной липосомой и отрицательно заряженной ДНК и перенесен в клетки посредством эндоцитоза. Полимер является стабильным комплексом полимер/ДНК, сформированным электрической нейтрализацией в результате связывания положительных зарядов на катионном полимере (например, поли-Lлизин) с отрицательными зарядами на ДНК. Полученный в результате комплекс катионного полимера и ДНК по-прежнему загружен положительными зарядами, может связываться с отрицательно заряженным рецептором на поверхности клетки, а затем вводиться в клетку. Молекулярный конъюгат является объектом, в котором экзогенный ДНК-ген интереса ковалентно привязан на лиганд, моноклональное антитело или белок вирусной оболочки против специфичного сенсора на клеточной поверхности, и экзогенный ген вводится в определенный тип клетки благодаря свойству специфичного связывания. Поскольку вирус обычно может входить в определенный клеточный тип с высокой эффективностью, экспрессировать свои собственные белки и образовывать растущие вирионы, то, таким образом,модифицированный вирус служит, прежде всего, вектором для генной терапии. Например, может быть упомянут ретровирусный вектор, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса, вектор на основе вируса простого герпеса и т.п. Среди них, аденоассоциированный вирус является непатогенным членом семейства Parvoviridae, пролиферация которого может зависеть исключительно от вируса-хелпера. Аденоассоциированный вирус имеет очень маленький геном. Например, аденоассоциированный вирус 2 типа имеет геном из одноцепочечной ДНК, состоящий из 4681 нуклеотида, который содержит два гена, т.е. rep-ген (кодирующий белки, отвечающие за регуляцию вирусной репликации,экспрессию структурных генов и встраивание в геном хозяина) и cap-ген (кодирующий структурный капсидный белок) с одним концевым повтором из 145 пар оснований, присутствующим на одном конце генома, деноассоциированный вирус может инфицировать клетки в фазе деления и в стационарной фазе,внедриться в хромосому клетки хозяина или стабильно экспрессироваться в течение длительного времени в форме внехромосомной конкатемерной ДНК. Он может эффективно трансформировать клеточные типы мозга, скелетной мускулатуры, печени и т.д. и обладает характеристиками, такими как антигенность, низкая токсичность, непатогенность и т.п. Предпочтительно вектор выбирают из группы, включающей клонирующий вектор, эукариотический вектор экспрессии, прокариотический вектор экспрессии и челночный вектор (например, челночная плазмида pShuttle2), для осуществления амплификации и экспрессии гена интереса. При использовании в генной терапии предпочтительно применяют индуцибельный вектор экспрессии, например pIRES2EGFP. Более предпочтительно вектор выбирают из группы, включающей pIRES2-EGFP, pCMVpNEO.BAN, pEGFT-Actin и аденовирусный вектор. Наиболее предпочтительным вектором является аденовирусный вектор. Аденовирус является вирусом без оболочки с линейным геномом из двухцепочечной ДНК, широко встречается в природе и классифицирован, по меньшей мере, более чем на 100 серотипов. Аденовирусный геном имеет длину около 36 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) и имеет один обратный концевой повтор, соответственно, на одном из двух концов, при этом сигнал упаковки вируса является внутренним. В аденовирусном геноме существует четыре ранних транскрипционных единицы (Е 1, Е 2, Е 3 и Е 4), отвечающих за регуляцию, и одна поздняя транкрипционная единица, отвечающая за кодирование вирусных структурных белков. В качестве вектора для генной терапии аденовирусный вектор имеет следующие преимущества: 1) имеет относительно большую вмещающую способность для экзогенного гена, таким образом,-4 024878 можно вставить большой фрагмент экзогенного гена, до 35 т.п.н. в длину; 2) имеет высокую инфекционную эффективность, таким образом, можно эффективно трансдуцировать различные типы клеток в ткани человека с эффективностью экспериментальной трансдукции in vitro приблизительно 100%; 3) может трансдуцировать неделящиеся клетки; 4) дает рекомбинантный вирус с высокими титрами в клеточной культуре; 5) входит в клетку-хозяина без встраивания в геном клетки-хозяина и экспрессируется лишь временно, таким образом, проявляя относительно высокую безопасность. В настоящее время в новейшем варианте аденовирусного вектора удалены все (невирусный вектор) или большинство из аденовирусных генов (миниаденовирусный вектор) и оставлены только обратные концевые повторы и сигнальная последовательность упаковки, таким образом, ген до 35 т.п.н. длиной может быть вставлен в вектор, вектором вызывается более слабый клеточный иммунный ответ, участок присоединения к ядерному матриксу, введенный в вектор, может обеспечить экспрессию экзогенного гена в течение длительного времени и увеличить стабильность вектора. Данное изобретение также представляет хозяина, где хозяин содержит рекомбинантный вектор, изложенный в данном изобретении. С одной стороны, трансформация хозяина рекомбинантным вектором,содержащим ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, данного изобретения, может быть использована для исследования связи между мутантной глюкокиназой человека и метаболизмом углеводов,а также секрецией инсулина, с другой стороны, может быть использована для получения активной мутантной глюкокиназы. Предпочтительно, чтобы хозяин был выбран из одного или более из Е coli, клеток 239, клеток min-6 и островковых бета-клеток человека. Из них Е. coli, как штамм, созданный генной инженерией, может как содержать рекомбинантный клонирующий вектор данного изобретения для осуществления амплификации гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, данного изобретения, так и содержать рекомбинантный вектор экспрессии данного изобретения для осуществления экспрессии мутантной глюкокиназы человека данного изобретения в большом количестве. Если рекомбинантным вектором является рекомбинантный аденовирусный вектор, то вектор можно амплифицировать в клетках 239. Клетка min-6 представляет собой штамм островковых бета-клеток мышей с относительно сильной способностью секретировать инсулин и может служить хозяином для эукариотического вектора экспрессии данного изобретения для продуцирования мутантной глюкокиназы человека данного изобретения и теста ее GK-активности. Человеческой островковой бета-клеткой может быть коммерчески доступная клеточная линия, а также человеческие островковые бета-клетки субъектов, например от пациентов с сахарным диабетом. Во время курса генной терапии предпочтительно, чтобы человеческие островковые бета-клетки от субъекта per se ретрансплантировались субъекту после трансдукции геном, кодирующим мутантную глюкокиназу человека, данного изобретения, во избежание последующего иммунологического отторжения. Данное изобретение также представляет фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемый наполнитель и один или более, выбранные из гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, изложенного в данном изобретении, мутантной глюкокиназы человека, изложенной в данном изобретении, рекомбинантного вектора, изложенного в данном изобретении, и хозяина,изложенного в данном изобретении. Фармацевтически приемлемый наполнитель означает нетоксические твердые, полутвердые или жидкие наполнители, разбавители, покрывающие материалы или другие вспомогательные средства для составов, например включая в качестве неограничивающих примеров солевой раствор, буферизированный солевой раствор, глюкозу, воду, глицерин, этанол и их смеси. Фармацевтическая композиция подходит для парентерального, подъязычного, интрацистернального, интравагинального, внутриперитониального, интраректального, интрабуккального или трансдермального введения. Перентеральное введение включает внутривенную, внутримышечную, внутриперитониальную, интраторакальную, подкожную, внутрисуставную инъекцию и инфузию. Фармацевтическая композиция,подходящая для парентерального введения, включает водные или неводные стерильные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии и порошки, составленные в инъецируемый стерильный раствор или дисперсию непосредственно перед применением. Соответствующие водные или неводные носители, разбавители, растворители или наполнители включают воду, этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, растительные масла и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Такие композиции также могут содержать консерванты, смачивающие средства,эмульгаторы, вещества-протекторы и диспергирующие добавки, например инозит, сорбит и сахарозу. Предпочтительно добавление осмотических регуляторов, таких как углеводороды, хлорид натрия и хлорид калия. Трансдермальное введение включает применение на коже, слизистой и поверхности легкого и глаза. Такая фармацевтическая композиция включает порошки, мази, капли, трансдермальные пластыри,устройства для ионофореза, ингаляторы и т.п. Композиция для интраректального или интравагинального введения предпочтительна как суппозиторий, который может быть приготовлен смешиванием рекомбинантного вектора данного изобретения с соответствующими не стимулирующими наполнителями, таки-5 024878 ми как масло какао, полиэтиленгликоль или восковая основа для суппозитория, где наполнитель или носитель остается твердым при комнатной температура и становится жидким при температуре организма,таким образом, расплавляясь в прямой кишке или влагалище и высвобождая активное соединение. Предпочтительно фармацевтическая композиция представляет собой инъекцию, которая содержит фармацевтически приемлемый наполнитель и один или более, выбранные из гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, изложенного в данном изобретении, и рекомбинантных векторов, изложенных в данном изобретении. Указанным фармацевтически приемлемым наполнителем является фосфатный буфер со значениемpH 4,0-9,0; и в один мл инъекции включены 102-1010 копии гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, или 102-1010 копии рекомбинантного вектора. Инъекция дополнительно содержит вещество-протектор и/или осмотический регулятор; содержание вещества-протектора составляет 0,01-30,00 вес.% на основе инъекции, веществом-протектором является один или более, выбранные из инозита, сорбита и сахарозы; содержание осмотического регулятора обеспечивает осмотическое давление инъекции 200-700 мосмоль/кг, при этом осмотическим регулятором является хлорид натрия и/или хлорид калия. Если при введении была использована инъекция, то субъекту вводили инъекцию, содержащую 102-1010 копий предпочтительно 105-108 копий и, более предпочтительно 106-108 копий гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека; или содержащую 102-1010 копий, предпочтительно 105-1010 копий и более предпочтительно 106-1010 копий рекомбинантного вектора. Кроме того, предпочтительно, чтобы рекомбинантный вектор представлял собой рекомбинантный аденовирусный вектор, который вводят в количестве, варьирующем от 103 до 1010 бляшкообразующих единиц (pfu), предпочтительно 105-1010 pfu и более предпочтительно 106-1010 pfu. При инъецировании фармацевтической композиции данного изобретения дозировка инъекции может быть обычно используемой в данном уровне техники, чаще всего 500 мкл, типично 1-200 мкл, предпочтительно 1-10 мкл; однако, дозировка до 10 мл также может быть использована в зависимости от места инъекции. Поскольку специалист в данной области сможет без труда определить оптимальный путь введения и дозировки, вышеприведенные пути введения и дозировки являются лишь примером. Доза может быть определена по различным параметрам, в частности возраст, вес тела пациента, подлежащего лечению, тяжесть заболевания, расстройства или состояния, а также и путь введения. Инъекцию фармацевтической композиции, изложенной в данном изобретении, также можно вводить систематически, и инъекцию фармацевтической композиции данного изобретения также можно вводить в локальный участок (например, в скелетную мышцу). Данное изобретение также представляет применение гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, изложенного в данном изобретении, мутантной глюкокиназы человека, изложенной в данном изобретении, рекомбинантного вектора, изложенного в данном изобретении, и хозяина, изложенного в данном изобретении, при изготовлении лекарственного препарата для контроля глюкозы в крови или лекарственного препарата для предупреждения и лечения нарушения углеводного обмена. Данное изобретение также представляет применение гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, изложенного в данном изобретении, мутантной глюкокиназы человека, изложенной в данном изобретении, рекомбинантного вектора, изложенного в данном изобретении, и хозяина, изложенного в данном изобретении, при изготовлении лекарственного препарата для предупреждения и лечения сахарного диабета. Данное изобретение также представляет способ контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена, где средство, выбранное из группы, включающей ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, изложенный в данном изобретении, мутантную глюкокиназу человека, изложенную в данном изобретении, рекомбинантный вектор, изложенный в данном изобретении, и хозяина, изложенного в данном изобретении, вводят пациенту, нуждающемуся в этом. Данное изобретение также представляет способ предупреждения и лечения сахарного диабета, где средство, выбранное из группы, включающей ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, изложенный в данном изобретении, мутантную глюкокиназу человека, изложенную в данном изобретении,рекомбинантный вектор, изложенный в данном изобретении, и хозяина, изложенного в данном изобретении, вводят пациенту, нуждающемуся в этом. Следующие примеры будут дополнительно иллюстрировать раскрытие данного изобретения и не должны рассматриваться как каким-либо образом ограничивающие данное изобретение. Все модификации или замещения, которые могут быть сделаны в способах, этапах или условиях в данном изобретении без отступления от идеи и сути данного изобретения, попадают в объем данного изобретения. Технические средства, используемые в примерах, являются традиционными средствами, хорошо известными специалисту в данной области, если определенно не указано иное. Все реагенты и культуральные среды,используемые в данном изобретении, являются коммерчески доступными продуктами, если определенно не указано иное. Пример 1. Химический синтез гена, кодирующего мутантную глюкокиназу человека, (G262) данного изобретения. Ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, с нуклеотидной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 2, имеет полную длину 2748 п.н. (пар нуклеотдов). После анализа последовательности было показано, что существует три уникальных сайта рестрикции, HindIII, SacI и BamHI, которые расположены в положении 2443, 1327 и 2250 SEQ ID NO: 2, соответственно. Методика синтеза была следующей: синтез частичных фрагментов ДНК, соответственно, с использованием твердофазного подхода на основе сложного триэфира фосфорамидита, лигирование синтезированных фрагментов, секвенирование, и проверка лигированного гена, и коррекция ошибочного лигирования, в которой детальные этапы были следующими: 1. синтезировали фрагмент А, в общей сложности, с 1360 п.н., располагающимися от 5' конца до сайта рестрикции SacI гена; 2. результаты секвенирования и идентификации показали, что на этапе 1 получили целый фрагмент А, целый фрагмент подвергли концевой модификации и затем лигировали между сайтами HindIII/SacI вектора PCR2.1 (Invitrogen, Co.); 3. синтезировали фрагмент В, в общей сложности, с 939 п.н., располагающимися от сайта рестрикции SacI до сайта рестрикции BamHI гена; 4. результаты секвенирования и идентификации показали, что на этапе 3 получили целый фрагмент В, целый фрагмент подвергли концевой модификации, а затем лигировали между сайтами BamHI/Sac I вектора PCR2.1; 5. синтезировали фрагмент С, в общей сложности, с 551 п.н., располагающеюся от BamHI сайта рестрикции до 3' конца гена; 6. результаты секвенирования и идентификации показали, что на этапе 5 получили целый фрагмент С, целый фрагмент лигировали в вектор, содержащий фрагмент В, что дало фрагмент D, в общей сложности, из 1457 пар оснований; 7. результаты секвенирования и идентификации показали, что на этапе 6 получили целый фрагментD. Фрагменты А и D, подлежащие лигированию, расщепили ферментом рестрикции SacI с получением фрагментов ДНК с когезионным концом, провели реакцию лигирования ДНК с участием Т 4 ДНК-полимеразы. В конечном итоге получили ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, с нуклеотидной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 2. Все используемые ферменты и буферы были приобретены у Clontech, Co., и рестрикционное расщепление и лигирование выполнили согласно протоколу, предоставленному Clontech, Co. Поскольку имелись некоторые защитные последовательности на всех концах синтезированных фрагментов для облегчения концевой модификации фрагментов после синтеза, то длина синтезированной последовательности была немного больше фактической длины. Защитная последовательность означает защитную последовательность из 8-20 оснований, которую добавляют искусственно к каждой стороне концевого сайта рестрикции, присутствующего на конце ДНК с целью устранения неспособности фермента рестрикции нормально связываться с ДНК и расщеплять ДНК в сайте рестрикции при наличии стерического несоответствия, при этом защитная последовательность оснований получена от ClontechCo. производителя ферментов рестрикции. Для цепочек ДНК, которые будут распадаться, начиная от ее конца, присутствие защитных оснований может защитить сайт рестрикции от повреждения во время манипуляции. Модификация означает процесс, в котором фрагмент ДНК ферментативно расщепляется ферментом рестрикции с удалением защитных оснований. Использованные фермент рестрикции и Т 4 лигаза, а также использованные реакционные буферы и экспериментальные системы - все были от Clontech Co, которая предоставила инструкцию для соответствующих продуктов и их стандартные протоколы работы на своем веб-сайте (http://www.clontech.com/). Генную последовательность, корректно лигированную на этапе 7, амплифицировали с помощью ПЦР, и результат секвенирования гена соответствовал SEQ ID NO: 2. Полученный в результате ген хранили при -20 С для лигирования в вектор экспрессии. Сравнительный пример 1. Получение гена, кодирующего глюкокиназу дикого типа человека (G261) Ген, кодирующий глюкокиназу дикого типа человека, получили в соответствии с нуклеотидной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 1 со ссылкой на протокол в примере 1. Пример 2. Построение вектора экспрессии. 1-1) Линеаризация плазмидного вектора pIRES2-EGFP. Плазмида pIRES2-EGFP представляет собой кольцевую структуру (см. на фиг. 3) и нуждается в линеаризации перед трансфецированием в клетки. Фермент рестрикции BstBI (TTCGAA) (New EnglandBiolabs, NEB Co.) выбрали в связи с тем, что этот фермент способен к единственно возможной рестрикции в плазмиде и, таким образом, рестрикционное расщепление не влияет на экспрессию белка. IRSE означает внутренний сайт посадки рибосомы, отличающийся тем, что, при наличии IRSE после ORF возможна трансляция другой кодирующей последовательности, следующей за IRSE, после того, как будет закончена трансляция ORF. Таким образом, гены, кодирующие два белка, при этом каждый имел независимую ORF, экспрессировались как гибридный белок. инкубировали при 37 С в течение 3 ч, подвергли экстракции фенолом/хлороформом для получения общей ДНК, осадили безводным этанолом с выходом осадка ДНК. Осадок ДНК промыли 70% этанолом и повторно растворили в деионизированной воде. Электрофорез в 1,2% агарозном геле выполнили для выявления молекулярного веса плазмиды и очистки линеаризованного плазмидного вектора pIRES2EGFP. Очищенную плазмиду хранили при -20 С до использования. 1-2) Лигирование линеаризованной плазмиды pIRES2-EGFP и гена интереса. Выделенного линейного плазмидного инкубировали при 14 С в течение 12 ч, подвергли экстракции фенолом/хлороформом для получения общей ДНК, осадили безводным этанолом с выходом осадка ДНК. Осадок ДНК промыли 70% этанолом и повторно растворили в деионизированной воде. Молекулярный вес плазмиды идентифицировали электрофорезом (см. фиг. 1 для результата электрофореза примера 1, где дорожка 1 представляет результат электрофореза для лигированной общей ДНК примера 1, дорожка 2 представляет маркер молекулярного веса, и бэнд с молекулярным весом больше 5000 у дорожки 1 является бэндом успешно лигированной) и плазмидные векторы pIRES2-EGFP, несущие гены интереса, (в примере 1 или в сравнительном примере) индивидуально очистили и выделили. Очищенную плазмиду хранили при -20 С до использования. Использованные фермент рестрикции и Т 4 лигаза, а также использованные реакционные буферы и экспериментальные системы - были от NEB Co., и с ними обращаются согласно инструкции соответствующих продуктов и их технологических протоколов. 2) Построение аденовирусного вектора экспрессии. 2-1) Серотип 5 аденовируса человека и Е 1/Е 3-делетированный аденовирус выбрали в примере для построения рекомбинантного челночного плазмидного вектора в следующих этапах: а) обеспечили челночную плазмиду pShuttle2-CMV (BD Co.) (CMV означает цитомегаловирус);b) плазмиду этапа а) дважды расщепили ферментами рестрикции EcoRV + Notl;c) концевое дефосфорилирование выполнили телячьей кишечной щелочной фосфатазой (CIP);d) выделили фрагмент вектора 3,4 т.п.н.;e) плазмидный вектор pIRES2-EGFP, полученный на этапах 1-2, выше, дважды расщепили ферментами рестрикции EcoRV+Notl, и G262-IRES2-EGFP или G261-IRES2-EGFP, полученные в результате рестрикционного расщепления, соответственно лигировали в фрагмент челночного плазмидного вектора,полученный на этапе d) в присутствии Т 4 лигазы, таким образом, создав рекомбинантную кольцевую челночную плазмиду pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP или рекомбинантную кольцевую челночную плазмиду pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP;f) челночные плазмиды, полученные на этапе е), расщепили ферментом рестрикции NheI;g) ферментативно разрезанные концы на этапе f), дополнили фрагментом Кленова ДНК-полимеразыh) выделили фрагмент 4,1 т.п.н. (фрагмент является фрагментом ДНК, в который вставили экзогенный ген, и частичные последовательности которого из вектора расположены на обоих концах). 2-2) Идентификация полученной кольцевой челночной плазмиды pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP или кольцевой челночной плазмиды pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP Кольцевую челночную плазмиду pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP или pShuttle2-CMV-G261IRES2-EGFP ферментативно разрезали с помощью EcoRI. Полученный в результате рестрикционного расщепления продукт идентифицировали по электрофорезу в 1,2% агарозном геле. Положительный клон даст два бэнда с молекулярным весом 4,7 т.п.н. и 2,8 т.п.н. соответственно тогда как отрицательный клон даст только один бэнд 3,4 т.п.н. Результат идентификации показали на фиг. 6, где М является маркером молекулярного веса (бэнды в 1 т.п.н. ДНК лестнице сверху вниз были 8 т.п.н., 7 т.п.н., 6 т.п.н., 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1,6 т.п.н., 1 т.п.н., 517 п.о. (пар оснований), 396 п.н. и 230 п.н., соответственно), все дорожки 1-4 (два образца pShuttle2-CMVG261-IRES2-EGFP и два образца pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP) представляли положительные клоны. 2-3) CMV-GFP-IRES-GFP перенесли из pShuttleGFP-CMV-TrkC на аденовирусный вектор pAd, образовав рекомбинантную аденовирусную плазмиду pAd-GFP-G261 или pAd-GFP-G262. Все пустые плазмиды, используемые выше, были коммерческими векторами, приобретенными у Clontech Co.(http://www.clontech.com/), а экспериментальные условия и использованные наборы были коммерческими наборами. При переносе использовали набор Adeno-X Expression System 1 от Clontech (Clontech 631513),и перенос выполнили согласно экспериментальному протоколу, предоставленному Clontech Co. 2-4) Идентификация рекомбинантных аденовирусных плазмид pAd-GFP-G261 и pAd-GFP-G262. Рестрикционное расщепление с помощью Xhol выполнили на рекомбинантных аденовирусных плазмидах pAd-GFP-G261 и pAd-GFP-G262, соответственно. Полученный в результате рестрикционного расщепления продукт идентифицировали по электрофорезу в 1,2% агарозном геле; положительный клон даст бэнды со следующим молекулярным весом 14 т.п.н., 11,8 т.п.н., 4,9 т.п.н., 2,6 т.п.н., 2,47 т.п.н.,1,45 т.п.н. и 0,6 т.п.н., соответственно, тогда как отрицательный клон даст бэнды со следующим молекулярным весом 14 т.п.н., 11,8 т.п.н., 4 т.п.н., 2,47 т.п.н., 1,45 т.п.н. и 0,6 т.п.н., соответственно. Результат идентификации показали на фиг. 7, где М является маркером молекулярного веса (бэнды в 1 т.п.н. ДНК лестнице сверху вниз были 8 т.п.н., 7 т.п.н., 6 т.п.н., 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1,6 т.п.н., 1 т.п.н.,517 п.н., 396 п.н. и 230 п.н., соответственно), все дорожки 1-5 (два образца рекомбинантной аденовирусной плазмиды pAd-GFP-G261 и три образца рекомбинантной аденовирусной плазмиды pAd-GFP-G262) представляли положительные клоны. 2-5) Упаковка, амплификация, сбор и очистка рекомбинантного аденовируса. Рекомбинантную аденовирусную ДНК, корректно идентифицированную на этапе 2-4), трансфицировали в клетки 239 для упаковки, а затем сохранили вирусный материал. Упакованный аденовирус амплифицировали и затем сохранили вирусный материал (вторичный вирусный материал). Кроме того,амплифицированный вторичный вирусный материал подвергли двум циклам крупномасштабной амплификации. После завершения амплификации вирус собрали и подвергли центрифугированию в градиенте плотности CsCl для очистки, а остаточный CsCl в вирусном растворе удалили диализом. Подробные действия были следующими:a) клетки 293 (Е 1-трансформированные клетки почки эмбриона человека) высеяли в одну или две чашки для культивирования клеток (60 мм) за 24 ч до трансфекции и выращивали до степени слияния 50-70% при трансфекции;b) перед трансфекцией плазмиду интереса ферментативно разрезали с помощью Рас I (6 мкг ДНК на 60 мм чашку для культивирования клеток). Ферментативно разрезанную плазмиду осадили этанолом и повторно растворили в 20 мкл стерильной воды;c) клетки трансфецировали посредством 6 мкг Pad-обработанной плазмиды с использованием PEI(полиэтиленимин) или другого средства трансфекции;d) после 8 ч трансфекции трансфекционную смешанную жидкость удалили и добавили 4 мл полной культуральной среды DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) (содержащей 10%e) через 7-10 дней трансфекции клетки соскоблили с культуральной чашки и перенесли в 50 мл коническую пробирку. После центрифугирования клетки ресуспендировали в 2,0 мл PBS (физиологический раствор с фосфатным буфером) или полной культуральной среды. Суспензию заморозили в жидком азоте и растопили в 37 С водяной бане с резким встряхиванием. Этап повторили четыре раза. После центрифугирования полученный в результате супернатант хранили при -20 С;f) клетки 293 высеяли в 60 мм чашку для культивирования клеток, культивировали до степени слияния 50-70% и инокулировали содержащим вирус супернатантом в объемном проценте 30-50%. Явный клеточный лизис и цитопатический эффект (СРЕ) наблюдали спустя 3 дня после инфицирования;g) когда от 1/3 до 1/2 клеток отделилось и всплыло, что происходит обычно на 3-5 дни после инфицирования, вирус собрали. Присутствие рекомбинантного аденовируса можно дополнительно подтвердить вестерн-блоттингом или ПЦР (5 мкл содержащего вирус супернатанта добавили в 10 мкл протеазы К с ПЦР-степенью чистоты и инкубировали при 55 С в течение 1 ч; затем смешанный образец кипятили в течение 5 мин и центрифугировали; 1-2 мкл полученного в результате супернатанта использовали в реакции ПЦР);h) содержащий вирус супернатант собрали по протоколу этапа f). В данном случае, как правило,можно собрать вирусный материал с вирусным титром по меньшей мере 10 вирионов/мл (инфекционных частиц/мл). Каждый цикл амплификации должен был повышать вирусный титр на один порядок.i) Для дальнейшей амплификации содержащий вирус супернатант, полученный на этапе h), далее инокупировали в клетки в 100 мм чашке для культивирования клеток, полученный в результате вирус собрали по протоколу на этапе f) и инокулировали в клетки 293 в 150 мм чашке для культивирования клеток с получением достаточного количества потомства вируса;k) обогащенный в результате вирионами супернатант, содержащий вирусы, добавили по каплям вCsCl-градиентный раствор; 1) ультрацентрифугирование проводили на 30000 оборотов в минуту при 4 С в течение 16 ч;m) после центрифугирования было две зоны. Верхняя зона бледного цвета содержала, главным образом, пустые аденовирусные капсиды без инфекционности; тогда как нижняя зона более яркого цвета содержала живые вирионы, подлежащие сбору. Нижнюю зону собрали иглой 16 калибра;n) сбор диализировали против TBS (10 мМ Tris, 0,9% NaCl, pH 8,1) в течение 1 ч, а затем противTBS, содержащего 10% глицерина, два раза (один час на каждый раз) для удаления CsCl; о) очищенный аденовирус разделили в ЕР пробирки; р) количество общего белка в диализате определили на спектрофотометре Эппендорфа (Eppendorfq) долговременное хранение осуществляли при -70 С, кратковременное хранение при 4 С; количество резервного материала составляло не менее 1 Е+11 единиц VP/аликвотную емкость после разделения на аликвоты; вышеописанная крупномасштабная амплификация означает увеличение количества вируса свыше 1 Е+12 единиц VP/аликвотную емкость;r) поскольку существует различие в эффективности инфицирования аденовируса для различных клеточных линий и учитывается питотоксический эффект вириона, необходимую вирусную дозировку обычно определяют способом серийного градиентного разведения. Целевые клетки инфицировали вирионом в относительном количестве к числу клеток 1:1, 10:1, 100:1 и 1000:1; добавили Polybrene(1,5-диметил-1,5-диазаундекаметиленполиметобромид) в относительном объеме к среде 1:1000. Планшет центрифугировали при 37 С в течение 30 мин;s) среду заменили через 8-12 ч после инфицирования и собрали вирус. 2-6) Качественный контроль упаковки рекомбинантного аденовируса. Общее количество инфекционного вируса 1,051012 PFU/3 мл. 2-7) Хранение рекомбинантного аденовируса. Буфер хранения: 4% сахарозы, 2 мМ MgCl2, 10 мМ Tris, pH 8,0. Температура хранения: -80 С. Пример 3. Трансфекция клеток min-6. 1. Основная среда для клеток min-6.-меркаптоэтанол: 10 мкл. Поверхность чашек Петри не была обработана для культивирования клеток, и во всех случаях использовался Фиколл. Условия инкубации: 37 С; 5% СО 2; 95% относительная влажность. Плазмидные векторы pIRES2-EGFP, полученные в примере 2, несущие ген интереса (Пример 1 или Сравнительный пример 1), трансфецировали в клеточную линию amin6 согласно протоколу Lipofectmine 2000 (Invitrogen). Детальные этапы описаны далее. День 1. Замороженные в жидком азоте клетки восстановили и высеяли в 25 см 2 культуральную колбу. День 2. Культуральную среду заменили. День 3. Клетки расщепили 0,2% трипсиновым раствором (Gibco), как только они выросли до степени слияния 90%, и высеяли в 6-лунковый планшет с плотностью 2105 клеток/мл (с извлеченным на данном этапе антибиотиком). День 4. 4 мкг линеаризованных векторов, 10 мкл Lipofectmine и Opti-M до 100 мкл смешали и оставили отдельно при комнатной температуре на 10 мин. Всю смесь добавили в питательную среду для клеток min6 и осторожно перемешали до однородности. Полученную в результате смесь оставили отдельно при 37 С в 5% СО 2 при относительной влажности 95% на 24 ч. В это время приготовили отрицательный контроль. День 5. Заменяют культуральную среду. (Альтернативно можно использовать питательную среду,содержащую антибиотик). День 6. Культуральную среду заменяют и дополняют антибиотиком G418 (400 мкг/мл) для отбора стабильно трансфецированных клеточных линий (см. фиг. 5, в темном поле наблюдали, что экспрессировался зеленый флуоресцентный белок) в течение 8 следующих дней. После отбора клеточной линии, стабильно экспрессирующей экзогенный GCK-белок, ее идентифицировали на геномном уровне с помощью ПЦР. Для этой цели в данном изобретении сконструирована пара праймеров, специфичных к векторной последовательности (прямой праймер: обратный праймер: и подтверждено экспериментами и выравниванием последовательностей, что праймеры были не способны инициировать амплификацию с генома клеточной линии min-6, но способны продуцировать ампликон размером 653 п.н. с введенного вектора. В данном изобретении также сконструирована пара праймеров, специфичных к геному min-6 (прямой праймер: Обратный праймер: и подтверждено экспериментами и выравниванием последовательностей, что праймеры были неспособны амплифицировать какой-либо специфический продукт с введенного вектора и способны продуцировать продукт размером 956 п.н. с генома клеточной линии min-6. Следовательно, можно наблюдать два амплифицированных продукта с различным размером после амплификации генома min-6, несущего экзогенную ДНК (см. фиг. 4). Экстракция геномной ДНК клеток min-6. Состав из необходимых реагентов. Буфер для лизиса с протеиназой К (буфер с протеиназой К SNET). 20 ммоль/л Tris-Cl (pH 8,0). 5 ммоль/л EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (рН 8,0). 400 ммоль/л NaCl. 1% (масса/объем) SDS (додецилсульфат натрия). 400 мкг/мл протеиназы К. Клетки расщепили панкреатическими протеиназами перед экстракцией геномной ДНК согласно следующим этапам: А. протеиназу добавили и инкубировали при 56 С в течение ночи; В. добавили безводный этанол двумя объемами и постоянно перемешивали до однородности; С. полученную в результате смесь оставили отдельно при -80 С в холодильнике;D. выполнили центрифугирование при 12000 g в течение 15 мин; Е. супернатант отбросили;F. осадок ДНК промыли 75% этанолом;G. выполнили центрифугирование при 12000 g в течение 10 мин; Н. осадок ДНК промыли 75% этанолом;I. выполнили центрифугирование при 12000 g в течение 10 мин;J. осадок ДНК высушили; К. осадок ДНК растворили в очищенной воде. Определили количество ДНК с помощью УФ-спектрофотометра и разбавили очищенной водой согласно концентрации ДНК с получением окончательной концентрации ДНК 50 нг/мкл для рабочего раствора. Исходный раствор хранили при -20 С в холодильнике до готовности к применению, а его разведение хранили при 4 С в холодильнике и использовали как ПЦР матрицу в реакции ПЦР.+1 с на цикл; 8 = 72 С длительность 45 с; 9 = вернуться к 6, 30 циклов; 10 = 72 С длительность 60 мин; 11 = 4 С сохранение длительности (постоянной). Амплифицированный с помощью ПЦР продукт идентифицировали электрофорезом в 1,2% агарозном геле. Результат идентификации показан на фиг. 4, в которой дорожка 0 представляет плазмиду G262,дорожка 1: геном G261min-6, дорожка 2: геном G261min-6, дорожка 3: геном G262min-6, дорожка 4: геном G262min-6, дорожка 5: плазмида G261, дорожка 6: плазмида G261, дорожка 7: геном дикого типаmin-6, дорожка 8: отрицательный контроль (вода), дорожка 9: отрицательный контроль (вода), дорожка 10: плазмида G262, дорожка 11: геном дикого типа min-6, дорожка 12: геном G261min-6, дорожка 13: геном G262min-6 и дорожка М: маркер молекулярного веса ДНК. 2. Клетки min-6 равномерно высеяли в 12-лунковый планшет с повтором по четыре лунки на образец Клетки синхронизировали сывороточным голоданием: культуральный супернатант отсосали пипеткой, клетки промыли два раза бикарбонатным буфером Кребса-Рингера без сахара (KRBB) и предварительно обработали KRBB без сахара + 0,1% BSA в течение 2 ч. Состав среды KRBB без сахара + 0,1% 3. Культуральный супернатант отсосали пипеткой, а затем клетки обработали KRBB G2.8+0,1%BSA или KRBB G25 + 0,01% BSA в течение 1 ч, в котором G2.8 указывало на концентрацию глюкозы 504,448 мг/л, a G25 указывало на концентрацию глюкозы 4,504 г/л. 4. Супернатант собрали из 3 лунок и хранили при -20 С до испытания. 5. Клетки в четвертой лунке расщепили и подсчитали на гемоцитометре для статистического вычисления числа клеток в каждом образце. 6. Интенсивности секреции инсулина от клеток min-6 при условии высоких концентраций глюкозы определили радиоиммуноанализом. В радиоиммуноанализе существует функциональная зависимость между содержанием инсулина в образце и подсчетом импульсов в минуту I в образце. Следовательно, в каждом эксперименте должна быть построена стандартная кривая для расчета функциональной зависимости между содержанием инсулина и подсчетом импульсов в минуту I. Получение стандартной кривой и измерение образцов. Таблица 1 Содержание инсулина и подсчет импульсов в минуту I в стандартах Как показано на фиг. 2, на основе содержания инсулина и подсчета импульсов в минуту 125I в стандартах установили следующую функциональную зависимость между единицей инсулина (микроЕдиница/мл) X и подсчетом 125I Y: у = -1649,8 Ln (x) + 10590 (формула 1),таким образом,х = ехр[(10590 - у)/1649,8] (формула 2). Подсчеты импульсов в минуту 125I в супернатантах от культуры wt (дикого типа), G261min-6 иG262min-6 определили фактически, а затем перевели в количества секретированного инсулина путем расчета по формуле 2. Таблица 2 Количество секретированного инсулина Из табл. 2 можно видеть, что G262 проявляет эффект значительного содействия секреции инсулина,что означает, что глюкокиназная активность G262 значительно выше, чем у дикого типа. Пример 4. Экспериментальное исследование in vivo рекомбинантного аденовируса на животных. 1. Выращивание экспериментального животного (крыса GK). Крысы GK в качестве экспериментальных животных были приобретены у National Rodent Laboratory Animal Resources, Шанхайский филиал, Китай. В качестве экспериментальных животных крысы GK,крысы SLAC/GK, страдающие диабетом 2 типа, были выведены в 1975 г. в Университете Тохоку. Они были созданы при помощи скрининга гипергликемических особей из ауткроссовых крыс WISTAR. Самка достигает половой зрелости в возрасте 8-10 недель, а самец в возрасте 10-12 недель. Период беременности длится от 21 до 23 дней, в помете 7-9 крысят, степень оплодотворения составляет 60%, а лактация длится 28 дней. Крысы GK широко используются в исследовании инсулиннезависимого сахарного диабета (NIDDM, диабет II типа). После появления диабетической мочи гипергликемия, ослабленная секреция инсулина и т.п. быстро наступают у крыс GK, имеющих осложнение в виде ретинопатии, микроангиопатии, нейропатии, нефропатии на поздних стадиях. В отличие от другой животной модели диабета II типа на грызунах крыса GK является моделью, не страдающей ожирением. В примере выбрали 20 крысGK возрастом 10 недель и обеспечили свободный доступ к корму и воде в течение одной недели. 2. Введение рекомбинантного аденовируса из примера 2.(1) Состав инъекции. Серию фосфатных буферов составили, соответственно, согласно дозам, показанным в табл. 3, а затем стерилизовали при 121 С в течение 60 мин. В стерильном условии рекомбинантный аденовирусный материал из этапов 2-6 в примере 2 отфильтровали на ультратонкой фильтрационной мембране 0,45 мкм. Клеточные обломки удалили. Фильтрат собрали в стерильную центрифужную пробирку и центрифугировали на 8000 оборотов в минуту в течение 1 ч. Супернатант отбросили. Полученный в результате вирусный осадок диспергировали в автоклавированных фосфатных буферах, описанных выше, на основе титров, показанных в табл. 3, получив инъекции данного изобретения. Таблица 3 Рекомбинантный аденовирус pAd-GFP-G261 или pAd-GFP-G262 из примера 2 соответственно вводили инъекцией ежедневно при дозировке 1010 pfu/кг веса тела через хвостовую вену в течение 3 последовательных дней. Каждый состав вводили инъекцией двум крысам.(2) Способ анализа глюкозы в крови. Анализ глюкозы в крови выполнили на 0,5 мл образце крови, взятом из угловой вены глаза, с использованием средства контроля глюкозы в крови НЕА-214 от OMRON по инструкции изготовителя.(3) Результаты определения глюкозы в крови у крыс. Животных, инъецированных рекомбинантным вирусным вектором, экспрессирующим глюкокиназу дикого типа (G261), пронумеровали 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. Животных, инъецированных рекомбинантным вирусным вектором, экспрессирующим мутантную глюкокиназу (G262), пронумеровали 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20. "Пустые" образцы крови собрали у всех крыс и проанализировали на уровень глюкозы в крови перед инъекцией. Послеинъекционные образцы крови собрали 8 раз на различных стадиях и проанализировали на уровень глюкозы в крови. Временные точки для отбора образцов и опреде- 13024878 ленные результаты показали в табл. 4 и 5. Таблица 4 Описательная таблица для глюкозы в крови (G261) (GLU ммоль/л) Таблица 5 Описательная таблица для глюкозы в крови (G262) (GLU ммоль/л) Из данных, записанных в табл. 4 и 5, можно видеть, что in vivo активность мутантной глюкокиназы человека данного изобретения по снижению уровня глюкозы в крови и ее стабильность намного лучше,чем у глюкокиназы дикого типа человека. Уровень глюкозы в крови в модели сахарного диабета II типа на крысах можно эффективно контролировать инъекцией в организм животного рекомбинантного аденовируса, который содержит ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека данного изобретения,таким образом, делая возможным лечение сахарного диабета путем эффективного увеличения секреции инсулина. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Мутантный ген, при экспрессии которого наблюдается увеличенная стабильность кодируемой им глюкокиназы, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или идентичную ей последовательность, за исключением открытой рамки считывания (ORF) в положении 487-1884 нуклеотидов,которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и ORF нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2. 2. Рекомбинантный вектор, содержащий ген по п.1. 3. Рекомбинантный вектор по п.2, отличающийся тем, что указанный вектор выбран из группы,включающей клонирующий вектор, эукариотический вектор экспрессии, прокариотический вектор экспрессии и челночный вектор. 4. Рекомбинантный вектор по п.2, отличающийся тем, что указанный вектор выбран из группы,включающей pIRES2-EGFP, pCMVp-NEO.BAN, pEGFT-Actin и аденовирусный вектор. 5. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.2. 6. Клетка-хозяин по п.5, которая выбрана из группы, включающей клетки Escherichia coli, клетки 239, клетки min-6 и островковые бета-клетки человека. 7. Фармацевтическая композиция для контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена, содержащая ген по п.1, и/или вектор по п.2, и/или клетку-хозяин по п.5,и фармацевтически приемлемый наполнитель. 8. Фармацевтическая композиция по п.7, предназначенная для инъекций, содержащая ген по п.1 и/или вектор по п.2, и фармацевтически приемлемый наполнитель. 9. Фармацевтическая композиция по п.8, содержащая в 1 мл 102-1010 копий гена по п.1 или копий вектора по п.2 и содержащая в качестве фармацевтически приемлемого наполнителя фосфатный буфер со значением pH 4,0-9,0. 10. Фармацевтическая композиция по п.9, дополнительно содержащая вещество-протектор и/или осмотический регулятор в концентрации 0,01-30,00 вес.%, где вещество-протектор представляет собой инозит, и/или сорбит, и/или сахарозу, а осмотический регулятор, обеспечивающий осмотическое давление 200-700 мосмоль/кг, представляет собой хлорид натрия и/или хлорид калия. 11. Способ контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена, отличающийся тем, что пациенту, нуждающемуся в этом, вводят средство, выбранное из группы,включающей ген по п.1, вектор по п.2, клетку-хозяин по п.5 и композицию по п.7. 12. Способ по п.11, где нарушением углеводного обмена является сахарный диабет.

МПК / Метки

МПК: C12N 9/12, C12N 15/63, C12N 15/86, A61K 38/45, A61P 3/10, C12N 15/54, A61K 48/00

Метки: углеводного, глюкозы, крови, кодирующий, отличающуюся, применение, нарушений, ген, мутантную, предупреждения, стабильностью, обмена, контроля, глюкокиназу, человека, увеличенной, лечения

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/22-24878-gen-kodiruyushhijj-mutantnuyu-glyukokinazu-cheloveka-otlichayushhuyusya-uvelichennojj-stabilnostyu-i-ego-primenenie-dlya-kontrolya-glyukozy-v-krovi-ili-preduprezhdeniya-i-lecheniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Ген, кодирующий мутантную глюкокиназу человека, отличающуюся увеличенной стабильностью, и его применение для контроля глюкозы в крови или предупреждения и лечения нарушений углеводного обмена</a>

Похожие патенты