Гетероциклические трипептиды в качестве ингибиторов вируса гепатита с

Номер патента: 7739

Опубликовано: 29.12.2006

Авторы: Ллина-Брюне Монсе, Бейли Марри Д., Гиро Элиза

Есть еще 13 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Соединение формулы (I)

Рисунок 1

в котором R1 обозначает гидрокси или NHSO2R1A, где R1A обозначает C18алкил, С37циклоалкил или С16алкил-С37циклоалкил, которые все необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, OC16алкил, амидо, амино или фенил, или R1A обозначает C6- или С10арил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, С16алкил, OC16алкил, амидо, амино или фенил; R2 обозначает трет-бутил, -СН2-С(СН3)3 или -СН2-циклопентил; R3 обозначает трет-бутил или циклогексил и R4 обозначает циклобутил, циклопентил или циклогексил; или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, NHSO2Me, NHSО2-циклопропил или NHSO2Ph.

3. Соединение формулы (I) по п.2, в котором R1 обозначает NHSO2Me или гидрокси.

4. Соединение формулы (I) по п.3, в котором R1 обозначает гидрокси.

5. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-4, в котором R2 обозначает трет-бутил или СН2-С(СН3)3.

6. Соединение формулы (I) по п.5, в котором R2 обозначает СН2-С(СН3)3.

7. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-6, в котором R3 обозначает трет-бутил.

8. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-7, в котором R4 обозначает циклопентил или циклогексил.

9. Соединение формулы (I) по п.8, в котором R4 обозначает циклопентил.

10. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН2-С(СН3)3, R3 обозначает трет-бутил и R4 обозначает циклопентил.

11. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, R2 и R3, каждый, обозначает трет-бутил и R4 обозначает циклопентил.

12. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН2-С(СН3)3, R3 обозначает циклогексил и R4 обозначает циклопентил.

13. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН2-С(СН3)3 и R3 и R4, каждый обозначает циклогексил.

14. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает циклопентилметил, R3 обозначает трет-бутил и R4 обозначает циклобутил.

15. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН2-С(СН3)3, R3 обозначает трет-бутил и R4 обозначает циклобутил.

16. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает NHSO2Me, R2 обозначает СН2-С(СН3)3, R3 обозначает тpeт-бутил и R4 обозначает циклопентил.

17. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает NHSO2Ph, R2 обозначает СН2-С(СН3)3, R3 обозначает тpeт-бутил и R4 обозначает циклопентил.

18. Применение соединения формулы (I) по одному из пп.1-17 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С.

 

Текст

Смотреть все

007739 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к соединениям, способам их синтеза, композициям и способам лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С (HCV). В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидным аналогам, фармацевтическим композициям, содержащим такие аналоги, и к способам применения этих аналогов для лечения вызываемой HCV инфекции. Предпосылки создания изобретения Вирус гепатита С (HCV) является основным возбудителем гепатита, относящегося к не-А, не-Б гепатиту, который передается при переливании крови и который поражает людей во всем мире. Установлено, что свыше 200 миллионов людей в мире заражено вирусом. Большой процент носителей становится хронически инфицированным, и у многих пациентов это приводит к хроническому заболеванию печени, так называемому хроническому гепатиту С. В свою очередь, эта группа больных имеет высокий риск заболевания такой серьезной болезнью печени, как цирроз печени, печеночно-клеточный рак и последняя стадия болезни печени, приводящая к смерти. Механизм, с помощью которого происходит сохранение вируса HCV в организме и обеспечивается высокий коэффициент заболеваемости хронической болезнью печени, пока недостаточно изучен. Неизвестно, как HCV взаимодействует с иммунной системой хозяина и преодолевает ее действие. Кроме того,также еще не выявлены роли клеточных и гуморальных иммунных ответов в защите от HCV-инфекции и при заболевании гепатитом. Имеются данные о том, что для профилактики связанного с переливанием крови вирусного гепатита можно применять иммуноглобулины, однако, Центр по контролю заболеваемости в настоящее время не рекомендует для этой цели применять лечение с использованием иммуноглобулинов. Отсутствие эффективного защитного иммунного ответа затрудняет разработку вакцины или адекватных профилактических мер после контакта, поэтому в ближайшее время надежды, в основном,возлагаются на антивирусные средства. С целью выявления фармацевтических агентов, обладающих эффективностью в отношении леченияHCV-инфекции, были проведены различные клинические исследования с участием пациентов, страдающих хроническим гепатитом С. В этих исследованиях применяли интерферон-альфа индивидуально или в сочетании с другими антивирусными агентами. Эти исследования позволили установить, что у основного большинства участников эксперимента не было обнаружено реакции на такие схемы лечения, а из тех участников, которые оказались чувствительными к лечению, у большей части после окончания лечения происходил рецидив. Таким образом, до последнего времени терапия с использованием интерферона (IFN) оставалась единственным доступным методом лечения пациентов, страдающих хроническим гепатитом С, которая обладала доказанной в клинических условиях эффективностью. Однако эффективность такого лечения сохраняется в течение непродолжительного периода времени, и, кроме того, лечение интерфероном вызывает серьезные побочные действия (т.е. ретинопатию, тиреоидит, острый панкреатит, депрессию), что снижает качество жизни пациентов, подвергающихся лечению. В настоящее время интерферон в сочетании с рибавирином предложен для лечения пациентов, не чувствительных к IFN при его индивидуальном применении. Однако побочные действия, вызываемые IFN, не уменьшаются при такой совместной терапии. Установлено, что пэгилированные формы интерферонов, такие как PEG-Intron и Pegasys, могут частично снижать указанные вредные побочные действия, однако, антивирусные лекарственные препараты все еще остаются основным средством для орального лечения HCV. Таким образом, существует необходимость в разработке эффективных антивирусных агентов для лечения HCV-инфекции, которые были бы лишены недостатков существующих методов лечения, основанных на применении фармацевтических средств.HCV представляет собой заключенную в оболочку положительную цепь РНК-ового вируса семейства Flaviviridae. Геном HCV, представленный одноцепочечной РНК, состоит приблизительно из 9500 нуклеотидов и имеет одну открытую рамку считывания (ОРС), которая кодирует один большой полипротеин, состоящий примерно из 3000 аминокислот. В зараженных клетках этот полипротеин расщепляется во многих сайтах клеточными и вирусными протеазами с образованием структурных и неструктурных (NS) протеинов. В случае HCV под действием двух вирусных протеаз образуются зрелые неструктурные протеины (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B). Первая из указанных протеаз, которая пока еще недостаточно охарактеризована, расщепляет связь NS2-NS3 (далее в контексте настоящего описания обозначена как NS2/3-пpoтeaзa); вторая представляет собой сериновую протеазу, содержащуюся в Nконцевой области NS3 (далее обозначена как NS3-пpoтeaзa), и она опосредует все последующие расщепления, происходящие по ходу транскрипции NS3, как в цис-ориентации в сайте расщепления NS3-NS4A,так и в транс-ориентации в остальных сайтах NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B. Протеин NS4A,вероятно, обладает множественными функциями, действуя в качестве кофактора для NS3-пpoтeaзы и возможно способствуя мембранной локализации NS3 и других компонентов вирусных репликаз. Образование комплекса протеазы NS3 с NS4A, вероятно, необходимо для процессирования, усиления протеолитической эффективности во всех сайтах. Протеин NS3 обладает также нуклеозидтрифосфатазной активностью и РНК-геликазной активностью. NS5B представляет собой РНК-зависимую РНК-полимеразу,-1 007739 принимающую участие в репликации HCV. Общая стратегия разработки антивирусных агентов предусматривает инактивацию кодируемых вирусом ферментов, которые играют основную роль в репликации вируса. Ниже приведен перечень заявок на патенты, опубликованных в течение последних нескольких лет,в которых описаны пептидные аналоги, являющиеся ингибиторами NS3-пpoтeaзы HCV, которые по строению отличаются от соединений, предлагаемых в настоящем изобретении: GB 2337262; JP 10298151;WO 02/18369; WO 02/60926 и WO 02/79234. Одним из преимуществ настоящего изобретения является то, что в нем заявлены трипептидные производные, которые обладают ингибирующей активностью в отношении NS3-пpoтeaзы, фермента,который играет важную роль в репликации вируса гепатита С. Еще одним преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что эти соединения специфически ингибируют NS3-пpoтeaзy и не проявляют заметной ингибирующей активности в отношении других сериновых протеаз, таких как эластаза лейкоцитов человека (HLE), эластаза панкреатической железы свиньи (РРЕ) или бычий химотрипсин поджелудочной железы, или в отношении цистеиновых протеаз, таких как катепсин В печени человека (Cat В). Кроме того, соединения проявляют активность в опытах на культуре клеток и обладают хорошим фармакокинетическим профилем in vivo. Еще одним преимуществом настоящего изобретения является то, что заявлемые соединения обладают биологической доступностью для млекопитающих при оральном введении. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к соединению формулы (I) в котором R1 обозначает гидрокси или NHSO2R1A, где R1A обозначает C1-С 8 алкил, С 3-С 7 циклоалкил или С 1-С 6 алкил-С 3-С 7 циклоалкил, которые все необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, OC1-С 6 алкил, амидо, амино или фенил, или R1A обозначает С 6- или С 10 арил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, С 1-С 6 алкил, ОС 1-С 6 алкил, амидо, амино или фенил; R2 обозначает трет-бутил, -СН 2 С(СН 3)3 или -СН 2-циклопентил; R3 обозначает тpeт-бутил или циклогексил и R4 обозначает циклобутил,циклопентил или циклогексил; или его фармацевтически приемлемой соли. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в смеси с фармацевтически приемлемой средой носителя или вспомогательным веществом. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, дополнительно содержит интерферон (пэгилированный или непэгилированный), или рибавирин, или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении HCV, или их любую комбинацию. Еще одним важным объектом изобретения является способ лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффективное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы I, или его фармацевтически приемлемой соли, или описанной выше композиции, индивидуально или в сочетании с одним или несколькими следующими компонентами: интерферон (пэгилированный или непэгилированный), или рибавирин, или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении HCV, которые в каждом случае вводят совместно или раздельно. Следующим важным объектом изобретения является способ предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С у млекопитающего, заключающийся в том, что млекопитающему вводят эффек-2 007739 тивное в отношении вируса гепатита С количество соединения формулы I, или его терапевтически приемлемой соли, или описанной выше композиции, индивидуально или в сочетании с одним или несколькими следующими компонентами: интерферон (пэгилированный или непэгилированный), или рибавирин, или один или несколько других агентов, обладающих активностью в отношении HCV, которые вводят совместно или раздельно. Настоящее изобретение относится также к применению описанного выше соединения формулы I для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С. Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения Определения Если не указано иное, то в контексте настоящего описания используемые понятия имеют следующие значения. В тех случаях, когда для обозначения абсолютной конфигурации заместителя или асимметричного центра соединения формулы (I) используют дескрипторы (R) или (S), то обозначение относится ко всему соединению, а не только к заместителю или асимметричному центру. Обозначение P1, P2 и Р 3 в контексте настоящего описания относится к положению аминокислотных остатков, начиная с С-конца пептидных аналогов и простираясь к N-концу (т.е. Р 1 обозначает положение 1 относительно С-конца, Р 2 обозначает положение 2 относительно С-конца и т.д. (см. Berger А. иSchechter I., Transactions of the Royal Society London series, B257, 1970, с 249-264. В контексте настоящего описания понятие (1R,2S)-винил-АЦКК относится к соединению формулы т.е. (1R,2S)-1-амино-2-этенилциклопропилкарбоновой кислоте. Понятие С 1-С 6 алкил в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает ациклические алкильные заместители с прямой или разветвленной цепью, содержащие от 1 до 6 атомов углерода, и включает, например, метил, этил, пропил, бутил, 1-метилэтил, 1 метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил и гексил. Аналогично этому понятие С 1-С 8 алкил обозначает ациклический алкил с прямой или разветвленной цепью, содержащий 1-8 атомов углерода, например октил. Понятие С 3-С 7 циклоалкил в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим заместителем, обозначает циклоалкильный заместитель, содержащий от 3 до 7 атомов углерода,и включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил. Понятие С 1-С 6 алкил-С 3-С 7 циклоалкил в контексте настоящего описания обозначает циклоалкильный радикал, содержащий от 3 до 7 атомов углерода, который непосредственно связан с алкиленовым радикалом, содержащим от 1 до 6 атомов углерода, например циклопропилметил, циклопентилэтил,циклогексилметил, циклогексилэтил и циклогептилпропил. Например, когда R4 А обозначает C1-С 6 алкилС 3-С 6 циклоалкил, то эта группа связана с SO2-группой через С 1-С 6 алкил (т.е. алкиленовый фрагмент). Понятие С 6- или С 10 арил в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим радикалом, обозначает либо ароматическую моноциклическую группу, содержащую 6 атомов углерода, либо ароматическую бициклическую группу, содержащую 10 атомов углерода. Например, арил представляет собой фенил, 1-нафтил или 2-нафтил. Понятие OC1-С 6 алкил в контексте настоящего описания, индивидуально или в сочетании с другим радикалом, обозначает радикал -OC1-С 6 алкил, в котором алкил, как указано выше, содержит вплоть до 6 атомов углерода, и включает метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси, бутокси и 1,1-диметилэтокси. Последний радикал обычно обозначают как трет-бутокси. Понятие гало в контексте настоящего описания обозначает галогеновый заместитель, выбранный из группы, включающей бром, хлор, фтор или йод. Понятие фармацевтически приемлемая соль обозначает соль соединения формулы (I), которую, с медицинской точки зрения, можно использовать в контакте с тканями человека и низших животных без признаков повышенной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., которая соответствует приемлемому соотношению польза/риск и, как правило, может растворяться или диспергироваться в воде или масле и обладает эффективностью при целевом использовании. Понятие включает фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли и фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований. Перечень приемлемых солей приведен, например, у S.M. Birge и др., J. Pharm. Sci., 66, 1977, с. 119, публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Понятие фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль обозначает соли, которые сохраняют свою биологическую эффективность и свойства свободных оснований и которые не являются нежелательными с позиций биологии или по другим причинам, образованные с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, сульфаминовая кисло-3 007739 та, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п., и с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, адипиновая кислота, аскорбиновая кислота, аспарагиновая кислота, бензолсульфоновая кислота, бензойная кислота, масляная кислота, камфорная кислота, камфорсульфоновая кислота, коричная кислота, лимонная кислота, диглюконовая кислота, этансульфоновая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, глицерофосфорная кислота, полусерная кислота, капроновая кислота, муравьиная кислота, фумаровая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота (изэтионовая кислота), молочная кислота, гидроксималеиновая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, миндальная кислота, мезитиленсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, нафталинсульфоновая кислота, никотиновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, щавелевая кислота, памовая кислота, пектиновая кислота, фенилуксусная кислота, 3-фенилпропионовая кислота, пивалиновая кислота, пропионовая кислота, пировиноградная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, янтарная кислота, сульфаниловая кислота, винная кислота, паратолуолсульфоновая кислота, ундекановая кислота и т.п. Понятие фармацевтически приемлемая соль присоединения основания обозначает соли, которые сохраняют свою биологическую эффективность и свойства свободных кислот и которые не являются нежелательными с позиций биологии или по другим причинам, образованные с неорганическими основаниями, такими как аммиак или гидроксид, карбонат или бикарбонат аммония, или катионами металла,такого как натрий, калий, литий, кальций, магний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий и т.п. Наиболее предпочтительными являются соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксических оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, четвертичных аминовых соединений, замещенных аминов, включая встречающиеся в естественных условиях замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, такие как метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, изопропиламин, трипропиламин, трибутиламин, этаноламин, диэтаноламин, 2-диметиламиноэтанол, 2-диэтиламиноэтанол, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, N-этилпиперидин,производные тетраметиламмония, производные тетраэтиламмония, пиридин, N,N-диметиланилин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, дициклогексиламин, дибензиламин, N,N-дибензилфенэтиламин, 1-эфенамин,N,N'-дибензилэтилендиамин, полиаминовые смолы и т.п. Наиболее предпочтительными органическими нетоксическими основаниями являются изопропиламин, диэтиламин, этаноламин, триметиламин, дициклогексиламин, холин и кофеин. Понятие антивирусный агент в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации вируса в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации вируса в организме млекопитающего. Антивирусные агенты включают, например, рибавирин, амантадин, VX-497 (меримеподиб, фирма Vertex Pharmaceuticals), VX-498 (фирмаBiopharmaceuticals). Понятие другой агент, обладающий активностью в отношении HCV в контексте настоящего описания обозначает агенты, эффективные в отношении снижения или предупреждения развития связанных с гепатитом С симптомов болезни. Такие агенты выбирают из антивирусных агентов, иммуномодуляторов, ингибиторов NS3-пpoтeaзы HCV, ингибиторов полимеразы HCV или ингибиторов другой мишени в жизненном цикле HCV. Понятие иммуномодулятор в контексте настоящего описания обозначает агенты (химические соединения или биологические агенты), которые обладают эффективностью в отношении повышения или потенциирования реакции иммунной системы у млекопитающего. Иммуномодуляторы включают, например,интерфероны класса I (такие как -, -, - и -интерфероны, -интерфероны, консенсусные интерфероны и азиало-интерфероны), интерфероны класса II (такие как -интерфероны) и пэгилированные интерфероны. Понятие ингибитор NS3-протеазы HCV в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования функции NS3-пpoтeaзы HCV у млекопитающего. Ингибиторы NS3-протеазы HCV включают,например, соединения, описанные в WO 99/07733, WO 99/07734, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 00/59929 или WO 02/060926, перспективное соединение, разработанное фирмой Boehringer Ingelheim, обозначенное как BILN 2061, которое изучено в клиническом исследовании, и перспективные соединения, разработанные фирмой Vertex/Eli Lilly, обозначенные как VX-950 или LY-570310, которые еще не окончательно исследованы. В частности, соединения 2, 3, 5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103,104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 125, 126 и 127, представленные в таблице на cc. 224-226WO 02/060926, можно применять в сочетании с соединениями, предлагаемыми в настоящем изобретении. Понятие ингибитор полимеразы HCV в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования функции полимеразы HCV у млекопитающего. Оно относится, например, к ингибиторам NS5B-4 007739 полимеразы HCV. Ингибиторы полимеразы HCV включают не относящиеся к нуклеозидам соединения,например, описанные в: заявке на патент США 10/198680, которая соответствует РСТ/СА 02/01127, оба документа поданы 18 июля 2002 г. (фирма Boehringer Ingelheim),заявке на патент США 10/198384, которая соответствует РСТ/СА 02/01128, оба документа поданы 18 июля 2002 г. (фирма Boehringer Ingelheim),заявке на патент США 10/198259, которая соответствует РСТ/СА 02/01129, оба документа поданы 18 июля 2002 г. (фирма Boehringer Ingelheim),WO 02/100846 А 1 и WO 02/100851 A2 (обе на имя фирмы Shire),WO 01/85172 А 1 и WO 02/098424 А 1 (обе на имя фирмы GSK),WO 00/06529 и WO 02/06246 А 1 (обе на имя фирмы Merck),WO 01/47883 и WO 03/000254 (обе на имя фирмы Japan Tobacco) и ЕР 1 256 628 А 2 (на имя фирмы Agouron). Кроме того, другие ингибиторы полимеразы HCV включают также нуклеозидные аналоги, например соединения, описанные в:WO 02/057287 A2 и WO 02/057425 A2 (обе на имя фирмы Merck/Isis). Конкретными примерами ингибиторов полимеразы HCV являются JTK-002, JTK-003 и JTK-109(фирма Japan Tobacco). Понятие ингибитор другой мишени в жизненном цикле HCV в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации HCV у млекопитающего, отличной от ингибирования функции NS3-пpoтeaзы HCV. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом HCV механизмы, необходимые для образования и/или репликации HCV в организме млекопитающего. Ингибиторы другой мишени в жизненном цикле HCV включают, например, агенты, которые ингибируют мишень, выбранную из ряда, включающего геликазу, NS2/3 пpoтeaзy HCV и внутренний сайт входа в рибосому (IRES). Конкретным примером ингибиторов другой мишени в жизненном цикле HCV является ISIS-14803 (ISIS Pharmaceuticals). Понятие ингибитор ВИЧ в контексте настоящего описания обозначает агент (химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации ВИЧ в организме млекопитающего. Оно включает агенты, которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации ВИЧ в организме млекопитающего. Ингибиторы ВИЧ включают, например, нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы протеаз, ингибиторы слияния и ингибиторы интегразы. Понятие ингибитор HAV (вирус гепатита А) в контексте настоящего описания обозначает агент(химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации HAV в организме млекопитающего. Оно включает агенты,которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации HAV в организме млекопитающего. Ингибиторы HAV включают вакцины, содержащие вирус гепатита А, например Havrix (фирма GlaxoSmithKline), VAQTA (фирмаMerck) и Avaxim (фирма Aventis Pasteur). Понятие ингибитор HBV (вирус гепатита В) в контексте настоящего описания обозначает агент(химическое соединение или биологический агент), который обладает эффективностью в отношении ингибирования образования и/или репликации HBV в организме млекопитающего. Оно включает агенты,которые оказывают воздействие на связанные либо с хозяином, либо с вирусом механизмы, необходимые для образования и/или репликации HBV в организме млекопитающего. Ингибиторы HBV включают, например, агенты, которые ингибируют ДНК-полимеразу вируса HBV или вакцины на основе HBV. Конкретными примерами ингибиторов HBV являются ламивудин (Epivir-HBV), адефовирдипивоксил,энтекавир, FTC (Coviracil), DAPD (DXG), L-FMAU (Clevudine), АМ 365 (амрад), Ldt (телбивудин), моновалентный-LdC (валторцитабин), АСН-126,443 (L-Fd4C) (ахиллион), МСС 478 (фирма Eli Lilly), рацивир (RCV), фтор-L- и -D-нуклеозиды, робустафлавон, ICN 2001-3 (ICN), Ваm 205 (Novelos), XTL-001(XTL), иминосахара (Nonyl-DNJ) (фирма Synergy), HepBzyme; иммуномодуляторы, такие как интерферон альфа 2b, HE2000 (фирма Hollis-Eden), Theradigm (эпиммун), ЕНТ 899 (фирма Enzo Biochem), тимозин альфа-1 (Zadaxin), вакцина на основе ДНК HBV (фирма PowderJect), вакцина на основе ДНК HBV(фирма Jefferon Center), антиген HBV (фирма OraGen), BayHep В (фирма Bayer), Nabi-HB (фирма Nabi) и антитела к вирусу гепатита В (фирма Cangene); и вакцины на основе HBV, такие, например, как Engerix В, Recombivax HB, GenHevac В, Нерасаrе, Bio-Hep В, TwinRix, Comvax, Hexavac. Понятие интерферон класса I в контексте настоящего описания обозначает интерферон, выбранный из группы интерферонов, которые все связываются с рецептором типа I. Оно включает как встречающиеся в естественных условиях, таких и полученные синтетическим путем интерфероны класса I. Примеры интерферонов класса I включают -, -, -интерфероны, -интерфероны, консенсусные интер-5 007739 фероны, азиало-интерфероны. Понятие интерферон класса II в контексте настоящего описания обозначает интерферон, выбранный из группы интерферонов, которые все связываются с рецептором типа II. Примеры интерферонов класса II включают -интерфероны. Ниже представлены конкретные предпочтительные примеры некоторых таких агентов: антивирусные агенты: рибавирин и амантадин; иммуномодуляторы: интерфероны класса I, интерфероны класса II и пэгилированные интерфероны; ингибитор другой мишени в жизненном цикле HCV, мишенью такого ингибитора являются NS3 геликаза, NS2/3-пpoтeaзa HCV или внутренний сайт входа в рибосому (IRES); ингибиторы ВИЧ: нуклеозидные ингибиторы, ненуклеозидные ингибиторы, ингибиторы протеаз,ингибиторы слияния и ингибиторы интеграз; или ингибиторы HBV: агенты, которые ингибируют вирусную ДНК-полимеразу HBV, или вакцина на основе HBV. Как указано выше, совместная терапия предусматривает совместное введение соединения формулы(I) или его фармацевтически приемлемой соли по меньшей мере с одним дополнительным агентом, выбранным из следующего ряда: антивирусный агент, иммуномодулятор, другой ингибитор NS3-пpoтeaзыHCV, ингибитор полимеразы HCV, ингибитор другой мишени в жизненном цикле HCV, ингибитор ВИЧ,ингибитор HAV и ингибитор HBV. Примеры таких агентов приведены выше в разделе Определения. Указанные дополнительные агенты можно объединять с соединениями, предлагаемыми в изобретении,получая лекарственное средство, которое содержит однократную фармацевтическую дозу. В другом варианте указанные дополнительные агенты можно вводить пациенту индивидуально в виде составной части многокомпонентного лекарственного средства, например, используя набор. Указанные дополнительные агенты можно вводить пациенту до, одновременно или после введения соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. В контексте настоящего описания понятие лечение обозначает введение соединения или композиции, предлагаемых в настоящем изобретении, для облегчения или устранения симптомов гепатита С и/или снижения вирусного титра у пациента. В контексте настоящего описания понятие предупреждение обозначает введение соединения или композиции, предлагаемых в настоящем изобретении, после контакта индивидуума с вирусом, но до проявления симптомов болезни и/или до обнаружения вируса в крови. Предпочтительные варианты осуществления изобретения Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых R1 обозначает гидрокси, NHSO2Me, NHSО 2-циклопропил или NHSO2Ph. Более предпочтительно R1 обозначает NHSO2Me или гидрокси. Наиболее предпочтительно R1 обозначает гидрокси. Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых R2 обозначает трет-бутил или СН 2-С(СН 3)3. Более предпочтительно R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3. Предпочтительно R3 обозначает тpeт-бутил. Предпочтительными являются соединения формулы (I), как они определены выше, в которых R4 обозначает циклопентил или циклогексил. Более предпочтительно R4 обозначает циклопентил. Более предпочтительным является соединение формулы (I), как оно определено выше, в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3, R3 обозначает трет-бутил и R4 обозначает циклопентил. Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором R1 обозначает гидрокси, R2 и 3R , каждый обозначает тpeт-бутил и R4 обозначает циклопентил. Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3, R3 обозначает циклогексил и R4 обозначает циклопентил. Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3 и R3 и R4, каждый обозначает циклогексил. Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает циклопентилметил, R3 обозначает тpeт-бутил и R4 обозначает циклобутил. Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3, R3 обозначает трет-бутил и R4 обозначает циклобутил. Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором R1 обозначает NHSO2Me, R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3, R3 обозначает трет-бутил и R4 обозначает циклопентил. Более предпочтительным является соединение формулы (I), в котором R1 обозначает NHSO2Ph, R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3, R3 обозначает трет-бутил и R4 обозначает циклопентил. Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать другой агент, обладающий активностью в отношении HCV. Примеры других агентов, обладающих активностью в отношении HCV, включают (альфа), - (бета), - (дельта), - (гамма), - (тау) или - (омега) интерферон, рибавирин и амантадин. Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать другой ингибитор NS3-пpoтeaзы HCV.-6 007739 Согласно еще одному варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать ингибитор полимеразы HCV. Согласно следующему варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать ингибитор других мишеней жизненного цикла HCV, включая (но не ограничиваясь ими) геликазу, NS2/3-пpoтeaзy или внутренний сайт входа в рибосому (IRES). Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить орально,парентерально или с помощью устройства для имплантации. Предпочтительным является оральное введение или введение с помощью инъекции. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать любые общепринятые нетоксические фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или наполнители. В некоторых случаях значение рН композиции можно регулировать с помощью фармацевтически приемлемых кислот, оснований или буферов с целью повышения стабильности соединения, включенного в композицию или в форму для его введения. В контексте настоящего описания понятие парентеральный включает подкожный, внутрикожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставной, интрасиновиальный, интрастернальный, интратекальный путь введения, введение с помощью инъекции или инфузии, а также введение в область повреждения. Фармацевтическая композиция может иметь форму стерильного препарата для инъекции, например, стерильной инъецируемой водной или жирорастворимой суспензии. Эту суспензию можно получать с помощью хорошо известных методов с использованием диспергирующих или смачивающих агентов(таких, например, как Твин 80) и суспендирующих агентов. Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить орально в виде любой приемлемой формы лекарственного средства, предназначенной для орального введения,включая (но не ограничиваясь ими) капсулы, таблетки и водные суспензии и растворы. В случае таблеток для орального введения обычно применяемые носители представляют собой лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, добавляют также замасливатели, такие как стеарат магния. Для орального введения в форме капсул приемлемые разбавители представляют собой лактозу и безводный кукурузный крахмал. Когда оральным путем вводят водные суспензии, действующее вещество объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При необходимости можно добавлять определенные подслащивающие вещества, и/или корригенты, и/или красители. Другие пригодные наполнители или носители для указанных выше препаративных форм и композиций приведены в обычных фармацевтических справочниках, например в Remington's PharmaceuticalSciences, The Science and Practice of Pharmacy, 19-е изд. Mack Publishing Company, Easton, Penn., (1995). Для монотерапии с целью предупреждения и лечения опосредованной HCV болезни можно применять дозы в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 100 мг/кг веса тела в день, предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 50 мг/кг веса тела в день предлагаемого соединения, которое является ингибитором протеазы. Как правило, фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить от примерно 1 до примерно 5 раз в день или в другом варианте путем непрерывной инфузии. Такое введение можно применять как для длительного, так и для экстренного лечения. Количество действующего вещества, которое можно объединять с носителями для получения однократной дозы лекарственного средства, должно варьироваться в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, и конкретного пути введения. Обычная композиция может содержать от примерно 5 до примерно 95% действующего вещества (мас.%). Предпочтительно такие композиции содержат от примерно 20 до примерно 80% действующего вещества. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, можно применять и более низкие или более высокие дозы по сравнению с указанными выше. Конкретные дозы и схемы лечения любого конкретного пациента могут зависеть от различных факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, время введения, скорость выведения, сочетание лекарственных средств, серьезность и особенности развития болезни, предрасположенность пациента к инфекции, и их определяет лечащий врач. Как правило, лечение начинают с небольших доз, существенно более низких, чем оптимальная доза пептида. Затем дозу повышают небольшими порциями до достижения оптимального действия в конкретных условиях. Как правило, наиболее предпочтительно вводить соединение в таком диапазоне концентраций, которые, в целом, обеспечивают антивирусную активность, но не обладают какими-либо вредными или опасными побочными действиями. Когда композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, включают в комбинацию, содержащую соединение формулы (I) и один или несколько дополнительных терапевтических или профилактических агентов, то соединение и дополнительный агент должны присутствовать в дозе, составляющей примерно от 10 до 100% и более предпочтительно примерно от 10 до 80% от дозы, обычно применяемой в режиме монотерапии. Когда эти соединения или их фармацевтически приемлемые соли объединяют в препаративной форме с фармацевтически приемлемым носителем, то полученную композицию можно вводить in vivo млекопитающему, такому как человек, для ингибирования NS3-пpoтeaзы HCV или для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом HCV. Такое лечение можно осуществлять также при использовании соединения, предлагаемого в изобретении, в сочетании с агентами, включающими (но не-7 007739 ограничиваясь ими): -, -, -, -, - или -интерферон, рибавирин, амантадин; другие ингибиторы NS3 пpoтeaзы HCV; ингибиторы полимеразы HCV; ингибиторы других мишеней жизненного цикла HCV,которые включает (но не ограничиваясь ими) геликазу, NS2/3-пpoтeaзy или внутренний сайт входа в рибосому (IRES); или их комбинации. С соединениями, предлагаемыми в настоящем изобретении, можно объединять другие агенты, получая однократную дозу лекарственного средства. В другом варианте эти дополнительные агенты можно вводить млекопитающему по отдельности в виде составной части многокомпонентного лекарственного средства. Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является способ ингибирования NS3 пpoтeaзной активности HCV у млекопитающего, заключающийся во введении соединения формулы (I). Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения этот способ предназначен для снижения NS3-протеазной активности у зараженного вирусом гепатита С млекопитающего. Если фармацевтическая композиция содержит в качестве действующего вещества только соединение,предлагаемое в настоящем изобретении, то такой способ может дополнительно предусматривать введение указанному млекопитающему агента, выбранного из ряда, включающего иммуномодулятор, антивирусный агент, ингибитор NS3-пpoтeaзы HCV, ингибитор полимеразы HCV или ингибитор других мишеней жизненного цикла HCV, таких как геликаза, NS2/3-пpoтeaзa или IRES. Такой дополнительный агент можно вводить млекопитающему до, одновременно или после введения композиции, предлагаемой в настоящем изобретении. Соединение формулы (I), предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также в качестве лабораторного реагента. Соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также для устранения или предупреждения вирусного загрязнения материалов, снижая тем самым риск заражения вирусом персонала лабораторий или медицинских учреждений или пациентов, которые имеют контакт с такими материалами (например, кровью, тканями, хирургическими инструментами и предметами одежды, лабораторными инструментами и предметами одежды, приборами и материалами для сбора крови). Соединение формулы (I), предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять также в качестве реагента для исследований. Соединение формулы (I) можно использовать в качестве позитивного контроля для обоснования модельных анализов на клетках или анализов in vitro или in vivo репликации вирусов. Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем, заявляемый в приведенной ниже формуле изобретения. Примеры Температуры даны в градусах Цельсия. Проценты для растворов представляют собой % (мас./об.), а соотношения в растворах представляют собой соотношения объемов, если не указано иное. Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) регистрировали с помощью спектрометра фирмы Brucker при частоте 400 МГц, химические сдвигивыражены в ч./млн. Экспресс-хроматографию проводили на силикагеле(SiO2) согласно методу экспресс-хроматографии Стилла (W.C. Still и др., J. Org. Chem., 43, 1978, с. 2923). В примерах использовали следующие сокращения: ДБУ: 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен; ДХМ: дихлорметан; ДИЭА: диизопропилэтиламин; ДИПЭА: диизопропилэтиламин; ДМФ: N,N-диметилформамид; ДМАП: 4-(диметиламино)пиридин; EtOAc: этилацетат; ГАТУ: [гексафторфосфат O-(7 азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония]; ЖХВР: жидкостная хроматография высокого разрешения; МС: масс-спектрометрия; MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Disorption Ionization-Time of Flight;FAB: бомбардировка быстрыми атомами; Me: метил; МеОН: метанол; Ph: фенил; К.Т.: комнатная температура (18-22); трет-бутил или m-бутил: 1,1-диметилэтил; Tbg: трет-бутилглицин:трет-лейцин; ТФК: трифторуксусная кислота; и ТГФ: тетрагидрофуран. Синтез соединений формулы (I). В целом, соединения формулы (I) и их промежуточные продукты получают известными методами с использованием реакционных условий, для которых известно, что они являются приемлемыми для реактантов. Некоторые такие методы описаны в WO 00/09543, WO 00/09558 и US 6323180, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Получение тиомочевин. Получение тиомочевины 2 а.(8,88 г, 66 ммолей). Смесь выдерживали при температуре дефлегмации в течение 14 ч, получая раствор желтого цвета. Смесь концентрировали досуха и остаток распределяли между ЕtOАс и насыщеннымNaHCO3. Органическую фазу желтого цвета сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали, получая твердое вещество желтого цвета. Твердое вещество растворяли в минимальном количестве ЕtOАс и растирали с гексаном, получая соединение 2 а в виде твердого вещества белого цвета (8,52 г; 75%). МС (электроспрей): 173 (М-Н)- 175 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой С помощью описанного выше процесса и используя поступающий в продажу циклопентилацетилхлорид вместо трет-бутилацетилхлорила, получали тиомочевину 2b. Синтез промежуточных продуктов 3. Получение карбамата 3 а. Тетрагидрофуран (350 мл) добавляли в колбу, содержащую 2,5-диоксопирролидин-1-иловый эфир циклопентилового эфира угольной кислоты (9,00 г, 39,6 ммоля) и трет-лейцин (6,24 г, 47,5 ммоля), получая суспензию. При интенсивном перемешивании добавляли дистиллированную воду (100 мл). Небольшое количество твердого вещества оставалось нерастворенным. Затем добавляли триэтиламин (16,6 мл,119 ммолей), получая гомогенный раствор, который перемешивали при К.Т. Через 2,5 ч ТГФ выпаривали, и водный остаток разбавляли водой (100 мл), и реакционную смесь подщелачивали, добавляя 1 н.NaOH (25 мл - конечное значение рН 10). Раствор промывали ЕtOАс (2 х 200 мл) и затем водную фазу подкисляли с помощью 1 н. НСl (примерно 70 мл - конечное значение рН 2). Мутный раствор экстрагировали ЕtOАс (200+150 мл). Экстракт сушили (MgSO4) и упаривали, получая соединение 3 а в виде твердого вещества белого цвета (8,68 г). Получение карбаматов 3b, 3 с и 3d. С помощью описанного выше процесса и используя соответствующие комбинации трет-бутилглицина или циклогексилглицина и 2,5-диоксопирролидин-1-иловый эфир циклобутилового, циклопентилового или циклогексилового эфира угольной кислоты, получали следующие карбаматы: Получение промежуточного продукта 5. Получение промежуточного продукта 5 а.-Бромкетон 4 (3,61 г, 5,71 ммоля) объединяли с тиомочевиной 2 а (1,09 г, 6,28 ммоля) в изопропаноле (140 мл) и раствор желтого цвета помещали в предварительно нагретую масляную баню с температурой 70 С и выдерживали в течение 1,5 ч. Раствор охлаждали до К.Т. и упаривали досуха. Остаток растворяли в EtOAc. EtOАс-раствор промывали насыщенным NaHCO3 (2x), водой (2 х) и соляным раствором(1x), сушили (MgSO4) и упаривали, получая продукт в виде пены оранжево-коричневого цвета. С помощью колоночной экспресс-хроматографии с использованием гексана:ЕtOАс, 7:3, удаляли менее полярные примеси, а с использованием гексана:ЕtOАс, 6:4, получали чистый продукт в виде твердого вещества светло-желтого цвета (3,05 г, 76%). МС (электроспрей): 706,3 (М-Н)- 708,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; CH3CN:Н 2O): 99%. Получение промежуточного продукта 5b. С помощью описанного выше процесса и используя тиомочевину 2b вместо тиомочевины 2 а, полу-9 007739 чали соответствующий промежуточный продукт 5b. Получение промежуточного продукта 5 с. С помощью описанного выше процесса и используя поступающую в продажу тиомочевину вместо тиомочевины 2 а, получали соответствующий промежуточный продукт 5 с. Стадия 1. Получение промежуточного продукта 6 а. Защищенный с помощью Воc дипептид 5 а (3,05 г, 4,31 ммоля) растворяли в смеси 4 н. НСl/диоксан(22 мл). После перемешивания при К.Т. в течение 30 мин осаждался гидрохлорид. Для растворения осадка добавляли МеОН (2 мл). Через 2 ч реакционную смесь упаривали досуха. Образовавшийся гидрохлорид растворяли в ДХМ (22 мл) и ДИЭА (3,0 мл, 17,24 ммоля); добавляли карбамат 3 а (1,15 г, 4,47 ммоля) и ГАТУ (1,72 г, 4,516 ммоля). Раствор перемешивали при К.Т. в течение 6 ч. Затем смесь разбавлялиEtOAc и раствор промывали насыщенным NaHCO3 (2x), водой (2x) и соляным раствором (1 х), сушили(MgSO4), фильтровали и упаривали, получая соединение 6 а в виде твердого вещества желтого цвета. С помощью колоночной экспресс-хроматографии, осуществляя сначала элюирование гексаном:ЕtOАс, 7:3,а затем этой же смесью в соотношении 6:4, получали чистый метиловый эфир 6 а в пены белого цвета (3,25 г, 90%). МС (электроспрей): 831,4 (М-Н)- 833,4 (М+Н)+ 855,4 (M+Na)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; CH3CN:Н 2O): 98%. Стадия 2. Гидролиз сложного эфира. Сложный метиловый эфир 6 а (3,24 мг, 3,89 ммоля) растворяли в ТГФ (40 мл) и МеОН (20 мл) и добавляли водный раствор LiOH (1,63 мг, 38,9 ммоля в 25 мл). Реакционную смесь желтого цвета перемешивали в течение 5,5 ч и затем концентрировали, получая беловатую суспензию. Суспензию растворяли в ЕtOАс и соляном растворе, приготовленном на деионизированной воде. Значение рН полученного рас- 10007739 твора доводили до 6, добавляя 1 н. НСl. Слои разделяли и водный слой дополнительно экстрагировали ЕtOАс (2 х). Объединенные ЕtOАс-экстракты промывали деионизированной водой (2 х), приготовленным на деионизированной воде соляным раствором (1 х), сушили (MgSO4), фильтровали и упаривали, получая соединение 100 в виде твердого вещества желто-белого цвета (3,02 г, выход 95%). Превращение в Na-соль. Нейтральное соединение 100 (1,22 г, 1,49 ммоля) растворяли в МеОН (30 мл) и добавляли 1 экв. 0,01 н. NaOH (14,85 мл) - при этом не происходило осаждение продукта. Прозрачный раствор желтого цвета концентрировали, разбавляли деионизированный водой, замораживали и лиофилизировали, получая продукт (Na-соль) в виде аморфного твердого вещества желто-белого цвета (1,24 г, выход 99%).MC (электроспрей) : 817,3 (M-H)- 819,4 (M+H)+ 841,4 (M+Na)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; CH3CN:H2O): 98%. 1 Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): смесь ротамеров, соотношение примерно 6:1;8,11-7,65 (m, 4 Н),7,33 (bs, 1 Н), 7,18-6,97 (m, 2 Н), 6,36-6,08 (m, 1 Н), 5,55-5,33 (m, 1 Н), 4,98 (d, J=18,0 Гц, 1H), 4,85 (bs, 1 Н),4,80 (d, J=10,4 Гц, 1H), 4,50-4,41 (m, 1 Н), 4,22-4,02 (m, 2 Н), 3,92 (s, 3 Н), 2,72-2,45 (m, 1 Н), 2,50 (при регистрации в ДМСО, s, 2 Н), 2,40-2,26 (m, 1H), 1,89-1,43 (m, 9 Н), 1,37-1,30 (m, 1H), 1,30-1,12 (m, 1 Н), 1,03 и 0,90 (2 x s, 9H), 0,98 и 0,94 (2 x s, 9H). Пример 2. Синтез соединения 101. С помощью процесса, описанного на первой стадии примера 1, и используя Вос-дипептид 5 с вместо 5 а, получали соединение 6b. Соединение 6b (70 мг, 0,095 ммоля) растворяли в 2 мл ДХМ и последовательно обрабатывали ДИЭА(0,045 мл, 0,26 ммоля) и пивалоилхлоридом (0,015 мл, 0,12 ммоля). После перемешивания в течение 1 ч при 40 вносили дополнительную порцию пивалоилхлорида (0,015 мл, 0,12 ммоля) и перемешивание продолжали в течение еще 2 ч. После концентрирования раствора остаток растворяли в ЕtOАс. Раствор промывали насыщенным раствором NaHCO3 и соляным раствором, сушили (MgSO4) и концентрировали,получая 8 мг неочищенного соединения 6 с, которое использовали без дополнительной очистки. Представляющее собой сложный метиловый эфир производное 6 с гидролизовали согласно процессу, описанному на стадии 2 примера 1, и очищали с помощью препаративной ЖХВР, используя колонку YMCCombi-Prep. ODS-AQ, 50 х 20 мм, ID, S - 5 мкм, 120 и программу линейного градиента от 2 до 100%AcCN/вода (0,06% ТФК). Фракции анализировали с помощью аналитической ЖХВР и чистые фракции объединяли, концентрировали, замораживали и лиофилизировали, получая соединение 101 в виде трифторацетата. Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): смесь ротамеров, соотношение примерно 85:15, описание основного изомера;8,56 (s, 1H), 8,40-8,22 (m, 1H), 8,17 (d, J=8,9 Гц, 1 Н), 7,67 (bs, 1 Н), 7,52 (bs, 1 Н), 7,24-7,15 (m,1H), 7,03 (d, J=8,3 Гц, 1 Н), 5,78-5,67 (m, 1 Н), 5,61-5,53 (m, 1 Н), 5,19 (dd, J=17,2, 1,6 Гц, 1 Н), 5,09-5,03 (m,1 Н), 4,63-4,55 (m, 1 Н), 4,49-4,39 (m, 2 Н), 4,11-3,92 (m, 2 Н), 3,95 (s, 3H), 2,62-2,53 (m, 1 Н), 2,33-2,25 (m,1 Н), 2,06-1,98 (m, 1 Н), 1,72-1,25 (m, 10 Н), 1,30 (s, 9H), 0,97 (s, 9H). МС (электроспрей): 803,3 (М-Н)- 805,3 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; CH3CN:Н 2O): 97%.- 11007739 Пример 3. Получение соединения 102. С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя карбамат 3d вместо 3 а и описанную в примере 2 препаративную ЖХВР для очистки конечного соединения, получали соединение 102 в виде трифторацетата.MC (электроспрей): 843,5 (M-H)- 845,4 (M+H)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; CH3CN:H2O): 99%. Пример 4. Получение соединения 103. С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя карбамат 3 с вместо 3 а и описанную в примере 2 препаративную ЖХВР для очистки конечного соединения, получали соединение 103 в виде трифторацетата. 1 Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): смесь ротамеров, соотношение примерно 85:15, описание основного изомера;12,35 (s, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,43-8,06 (m, 2 Н), 7,67-7,41 (m, 2 Н), 7,26 (d, J=7,8 Гц, 1 Н), 7,24-7,11(m, 1 Н), 5,77-5,65 (m, 1H), 5,62-5,48 (m, 1 Н), 5,23-5,15 (m, 1H), 5,10-5,03 (m, 1 Н), 4,52-4,38 (m, 2 Н), 4,154,05 (m, 1 Н), 4,03-3,89 (m, 2 Н), 3,94 (s, 3 Н), 2,63-2,52 (m, 1H), 2,41 (s, 2H), 2,35-2,23 (m, 1H), 2,05-1,96 (m,1 Н), 1,81-1,41 (m, 11 Н), 1,38-0,86 (m, 12 Н), 1,04 (s, 9H). МС (электроспрей): 857,5 (М-Н)- 859,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; CH3CN: Н 2O): 99%. Пример 5. Получение соединения 104. С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя карбамат 3b вместо 3 а и Вос-дипептид 5b вместо 5 а и описанную в примере 2 препаративную ЖХВР для очистки конечного соединения, получали соединение 104 в виде трифторацетата. 1 Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): смесь ротамеров, соотношение примерно 3:1;8,02 (s, 1 Н), 7,90 (s,1 Н), 7,84 (d, J=7,0 Гц, 1 Н), 7,70 (s, 1H), 7,33 (d, J=2,2 Гц, 1 Н), 7,14 (dd, J=2,5, 8,2 Гц, 1 Н), 7,09 (dd, J=2,2,9,2 Гц, 1H), 6,29-6,08 (m, 1H), 5,54-5,32 (m, 1 Н), 4,99 (d, J=15,9 Гц, 1 Н), 4,80 (d, J=10,0 Гц, 1 Н), 4,76-4,64- 12007739 МС (электроспрей): 815,3 (М-Н)- 817,3 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; CH3CN:Н 2O): 98%. Пример 6. Получение соединения 105. С помощью процесса, описанного в примере 1, и используя карбамат 3b вместо 3 а и описанную в примере 2 препаративную ЖХВР для очистки конечного соединения, получали соединение 105 в виде трифторацетата. 1 Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): смесь ротамеров, соотношение примерно 7:1;8,58 (s, 1H), 8,19 (d,J=8,0 Гц, 1 Н), 7,76-7,50 (m, 2 Н), 7,35-7,20 (m, 1 Н), 7,19 (d, J=8,0 Гц, 1 Н), 5,78-5,67 (m, 1H), 5,65-5,50 (m,1 Н), 5,19 (d, J=17,0 Гц, 1H), 5,07 (d, J=10,2 Гц, 1H), 4,51-4,42 (m, 2 Н), 4,42-4,31 (m, 1 Н), 4,02 (d, J=7,4 Гц,1H), 4,02-3,93 (m, 1 Н), 3,97 (s, 3 Н), 2,63-2,52 (m, 1 Н), 2,42 (s, 2H), 2,35-2,25 (m, 1 Н), 2,07-1,95 (m, 3 Н),1,90-1,76 (m, 1 Н), 1,70-1,41 (m, 3 Н), 1,30-1,23 (m, 1H), 1,04 (s, 9H), 0,96 и 0,87 (2 x s, 9H). МС (электроспрей): 803,4 (М-Н)- 805,4 (М+Н)+. Гомогенность по данным ЖХВР с обращенной фазой (0,06% ТФК; CH3CN:Н 2O): 98%. Пример 7. Получение соединения 106. Соединение 100, описанное в примере 1 (29,8 мг, 0,036 ммоля), объединяли с ГАТУ (1,2 экв., 19,7 мг,0,052 ммоля) и растворяли в безводном ДМФ (4 мл). Раствор перемешивали при К.Т. и по каплям в течение примерно 1 мин добавляли ДИПЭА (5 экв., 31,4 мкл, 0,18 ммоля). Смесь перемешивали в течение 20 мин при К.Т. и анализировали с помощью аналитической ЖХВР, оценивая образование активированного сложного эфира. Добавляли раствор метансульфонамида (5,8 экв., 19,7 мг, 0,207 ммоля), ДМАП (5,4 экв.,23,5 мг, 0,193 ммоля) и ДБУ (4,8 экв., 25,8 мкл, 0,172 ммоля) в ДМФ (1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при К.Т., затем концентрировали в вакууме. Остаток восстанавливали в ДМСО и очищали с помощью препаративной ЖХВР. После лиофилизации получали конечный продукт (23 мг,71,3%) в виде аморфного твердого вещества беловатого цвета. 1 Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6),12,35 (s, 1H), 10,53 (s, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,40-8,20 (m, 1 Н), 8,17 (d,J=8,8 Гц, 1 Н), 7,61 (bs, 1H), 7,51 (bs, 1H), 5,67-5,55 (m, 2 Н), 5,23-5,18 (m, 1 Н), 5,10 (d, J=12 Гц, 1 Н), 4,684,57 (m, 1 Н), 4,50 (bd, J=12 Гц, 1 Н), 4,46-4,37 (m, 1 Н), 4,07 (d, J=8,0 Гц, 1H), 3,95 (s, 3 Н), 3,17 (s, 3 Н), 2,782,58 (m, 1H), 2,42 (s, 2 Н), 2,29-2,19 (m, 1H), 2,19-2,09 (m, 1 Н), 1,71 (dd, J=7,8, 7,6 Гц, 1 Н), 1,67-1,55 (m,4 Н), 1,55-1,37 (m, 4 Н), 1,04 (s, 9H), 0,98 (s, 9H), 0,97-0,87 (m, 2 Н). МС (электроспрей): 896,5 (М+Н)+ и 894,5 (М-Н)-. ОФ-ЖХВР: Rt=6,7 мин (гомогенность=100%). Пример 8. Получение соединения 107.- 13007739 С помощью процесса, описанного в примере 7, и используя бензолсульфонамид вместо метилсульфонамида, получали соединение 107 в виде аморфного твердого вещества светло-желтого цвета, выход 54%. 1 Н-ЯМР (ДМСO-d6),12,39 (s, 1 Н), 10,89 (s, 1H), 8,83 (s, 1H), 8,40-8,22 (m, 1H), 8,18 (d, J=8,4 Гц,1H), 7,90 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 7,67-7,63 (m, 1H), 7,63-7,54 (m, 3H), 7,54-7,45 (m, 1H), 7,30-7,15 (m, 1H),7,10 (d, J=7,8 Гц, 1 Н), 5,62-5,51 (m, 1H), 5,38-5,26 (m, 1H), 5,16-5,08 (m, 1H), 4,93 (d, J=10,4 Гц, 1 Н), 4,704,58 (m, 1H), 4,57-4,49 (m, 1H), 4,48-4,39 (m, 1H), 4,09 (d, J=7,8 Гц, 1H), 3,95 (s, 3H), 2,69-2,59 (m, 1H),2,41 (s, 2H), 2,28-2,16 (m, 1H), 2,14-2,04 (m, 1H), 1,72-1,52 (m, 4H), 1,51-1,37 (m, 4H), 1,29-1,22 (m, 1H),1,03 (s, 9H), 1,00 (s, 9H), 0,99-0,92 (m, 1H). МС (электроспрей); 958,5 (M+H)+ и 956,5 (M-H)-. ОФ-ЖХВР: Rt=7,2 мин (гомогенность=95%). Пример 9. Анализ NS3-NS4A-пpoтeaзы. Ферментативный анализ, который применяли для оценки соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, описан в WO 00/09543 и WO 00/59929. Пример 10. Анализ репликации РНК HCV на культуре клеток. Культура клеток. Клетки линии Huh7, стабильно поддерживающие субгеномный репликон HCV, создавали согласно описанному ранее методу (Lohman и др., Science 285, 1999, сс. 110-113) и обозначали их как клеточная линия S22.3 (WO 02/052015). Клетки линии S22.3 поддерживали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% ФБС и 1 мг/мл неомицина (стандартная среда). В процессе анализа использовали среду DMEM, дополненную 10% ФБС, содержащую 0,5% ДМСО и не содержащую неомицин (среда для анализа). За 16 ч до внесения соединения клетки линии S22.3 обрабатывали трипсином и разбавляли до 50000 клеток/мл стандартной средой. По 200 мкл (10000 клеток) вносили в каждую лунку 96-луночного планшета. Затем планшет инкубировали при 37 в атмосфере с 5% СО 2 до следующего дня. Реагенты и материалы. Подготовка тестируемого соединения к анализу. 10 мкл тестируемого соединения (в 100% ДМСО) добавляли к 2 мл среды для анализа до конечной концентрации ДМСО 0,5% и раствор обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин и фильтровали через фильтр типа Millipore с размером отверстий 0,22 мкм. 900 мкл вносили в ряд А титрационного планшета из полипропилена с глубокими лунками. Ряды Б-З содержали аликвоты по 400 мкм среды для анализа(содержащей 0,5% ДМСО), и их применяли для приготовления серийных разведений (1/2) путем переноса по 400 мкл из ряда в ряд (в ряд З не вносили никакого соединения). Внесение тестируемого соединения в культуру клеток. Среду для культуры клеток аспирировали из 96-луночного планшета, содержащего клетки линииS22.3. По 175 мкл среды для анализа с соответствующим образом разбавленным тестируемым соединением переносили из каждой лунки планшета, содержащего соединения, в соответствующую лунку планшета, содержащего культуру клеток (ряд З применяли в качестве контроля без ингибитора). Планшет с культурой клеток инкубировали при 37 в атмосфере с 5% СО 2 в течение 72 ч. Экстракция общей клеточной РНК. После 72-часового периода инкубации экстрагировали общую клеточную РНК из клеток линии S22.3,находящихся в 96-луночном планшете, используя набор типа RNeasy 96 (Qiagen, RNeasy Handbook,1999). В целом, метод состоит в следующем: среду для анализа полностью удаляли из клеток и в каждую лунку 96-луночного планшета с культурой клеток добавляли по 100 мкл RLT-буфера (Qiagen), содер- 14007739 жащего 143 мМ -меркаптоэтанол. Микропланшет осторожно встряхивали в течение 20 с. Затем в каждую лунку микропланшета добавляли по 100 мкл 70%-ного этанола и перемешивали пипетированием. Лизат удаляли и вносили в лунки планшета, содержащего RNeasy 96 (Qiagen), который помещали в верхнюю часть блока с квадратными лунками (Qiagen Square-Well Block). Планшет с RNeasy 96 запечатывали скотчем и устройство Square-Well Block с содержащим RNeasy 96 планшетом помещали в держатель и вносили в роторный резервуар центрифуги 4 К 15 С. Образец центрифугировали при 6000 об./мин(5600 х g) в течение 4 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли с планшета и в каждую лунку планшета с RNeasy 96 вносили по 0,8 мл RW1-буфера (Qiagen набор RNeasy 96). Содержащий RNeasy 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Содержащий RNeasy 96 планшет помещали в верхнюю часть другого чистого блока с квадратными лунками (типа Square-Well Block), скотч удаляли и в каждую лунку содержащего RNeasy 96 планшета вносили по 0,8 мл RPE-буфера (Qiagen набор RNeasy 96). СодержащийRNeasy 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли и в каждую лунку содержащего RNeasy 96 планшета вносили еще по 0,8 мл RPE-буфера (Qiagen набор RNeasy). Содержащий RNeasy 96 планшет запечатывали новым куском скотча и центрифугировали при 6000 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Скотч удаляли, содержащий RNeasy 96 планшет помещали в верхнюю часть адаптора, содержащего предназначенные для сбора образцов микроцентрифужные пробирки объемом 1,2 мл. РНК элюировали, добавляя в каждую лунку по 50 мкл свободной от РНКазы воды, запечатывая планшет новым куском скотча и инкубируя в течение 1 мин при комнатной температуре. Планшет затем центрифугировали при 6000 об./мин в течение 4 мин при комнатной температуре. Стадию элюирования повторяли, используя второй объем, равный 50 мкл свободной от РНКазы воды. Микроцентрифужные пробирки с общей клеточной РНК хранили при -70. Количественная оценка общей клеточной РНК. РНК оценивали количественно с помощью системы STORM (Molecular Dynamics), используя набор для количественной оценки РНК типа RiboGreen (Molecular Probes). В целом, метод состоит в следующем: реагент RiboGreen разбавляли в 200 раз ТЭ (10 мМ Трис-HCl рН=7,5, 1 мМ ЭДТК). Как правило, 50 мкл реагента разбавляли 10 мл ТЭ. Образцы рибосомной РНК для построения стандартной кривой разбавляли в ТЭ до 2 мкл/мл и затем предварительно определенные количества (100, 50, 40, 20, 10, 5, 2 и 0 мкл) раствора рибосомной РНК переносили в новый 96-луночный планшет (COSTAR3997) и объем доводили до 100 мкл с помощью ТЭ. Как правило, колонку 1 96-луночного планшета использовали для построения стандартной кривой, а другие лунки использовали для количественной оценки образцов РНК. По 10 мкл каждого образца РНК, подлежащего количественной оценке, переносили в соответствующую лунку 96-луночного планшета и добавляли по 90 мкл ТЭ. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили по одному объему (100 мкл) разбавленного реагента RiboGreen и инкубировали в течение 2-5 мин при комнатной температуре, защищая от света (10 мкл образца РНК в 200 мкл конечного объема,т.е. 20-кратное разбавление). Интенсивность флуоресценции каждой лунки оценивали с помощью системы STORM (Molecular Dynamics). Стандартные кривые получали на основе известных количеств рибосомной РНК и соответствующей им интенсивности флуоресценции. Концентрацию РНК в экспериментальных образцах определяли, исходя из стандартной кривой, и корректировали с учетом 20-кратного разбавления. Реагенты и материалы. ОТ-ПЦР, проводимая в реальном времени. ОТ-ПЦР в реальном времени осуществляли с помощью системы для анализа последовательностиBiosystems). ОТ-ПЦР оптимизировали для количественной оценки 5'-IRES РНК HCV с помощью технологии Taqman (фирма Roche Molecular Diagnostics Systems), которая аналогична методу, описанному ранее у Martell и др. J. Clin. Microbiol. 37, 1999, cc. 327-332. Система основана на 5'3' нуклеолитической- 15007739 активности ДНК-полимеразы AmpliTaq. В целом, метод состоит в следующем: для его осуществления использовали фторогенный гибридизующийся зонд с двойной меткой (PUTR-зонд), который специфично ренатурирует матрицу между ПЦР-праймерами (праймеры 8125 и 7028). 5'-Конец зонда содержит флуоресцентный репортер (6-карбоксифлуоресцин [FAM]), а 3'-конец содержит гаситель флуоресценции (6 карбокситетраметилродамин [TAMRA]). Спектр испускания репортера FAM подавляли гасителем на неповрежденном гибридизующемся зонде. Расщепление гибридизующегося зонда высвобождало репортер, что приводило к повышению испускания флуоресценции. С помощью анализатора последовательности типа ABI Prism 7700 непрерывно осуществляли определение повышения испускания флуоресценции в процессе ПЦР-амплификации, при этом количество амплифицированного продукта прямо пропорционально сигналу. Зависимость амплификации от времени анализировали на ранней стадии реакции, в момент времени, соответствующий логарифмической фазе накопления продукта. Точку, представляющую собой определенный порог обнаружения повышения сигнала флуоресценции, связанного с экспоненциальным увеличением количества ПЦР-продукта для анализатора последовательности, обозначали как порог цикла (СT). Значения СT обратно пропорциональны количеству введенной РНК HCV; т.е. при одинаковых условиях ПЦР чем больше исходная концентрация РНК HCV, тем ниже значение СT. Стандартную кривую строили автоматически с помощью системы обнаружения ABI Prism 7700 путем построения графика зависимости СT от каждого стандартного разведения с известной концентрацией РНК HCV. В каждый планшет для осуществления ОТ-ПЦР вносили эталонные образцы для стандартной кривой. РНК репликона HCV синтезировали (посредством транскрипции Т 7) in vitro, очищали и количественно оценивали по величине ОП 260. С учетом того, что в 1 мкг этой РНК содержится 2,15x1011 копий РНК, осуществляли такие разведения, чтобы получать 108,107,106,105,104,103 или 102 копий геномной РНК/5 мкл. В каждое разведение включали также общую клеточную РНК линии Huh-7 (50 нг/5 мкл). 5 мкл каждого эталонного образца (РНК репликона + РНК Huh-7) объединяли с 45 мкл реагента Mix и применяли в проводимой в реальном времени ОТ-ПЦР. Проводимую в реальном времени ОТ-ПЦР осуществляли также с использованием экспериментальных образцов, которые очищали в содержащих RNeasy 96 лунках планшета, объединяя 5 мкл каждого образца общей клеточной РНК с 45 мкл реагента Mix. Реагенты и материалы. Состав для приготовления реагента Mix.- 16007739 Последовательность прямого праймера (SEQ ID NO. 1): 5' - ACG CAG AAA GCG ТСТ AGC CAT GGC GTT AGT - 3' Последовательность обратного праймера (SEQ ID NO. 2): 5' - TCC CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCT АТС AGG - 3' Примечание: эти праймеры обеспечивают амплификацию области, состоящей из 256 нуклеотидов,которая присутствует в 5'-нетранслируемой области HCV. Последовательность PUTR-зонда (SEQ ID NO. 3): Несодержащие матрицы контроля (НМК): на каждом планшете по 4 лунки использовали в качестве НМК. Для получения таких контролей в каждую лунку вместо РНК вносили 5 мкл воды. Условия проведения реакции в термоячейке: После завершения ОТ-ПЦР для анализа данных необходимо определять порог обнаружения сигнала флуоресценции для ПЦР-планшета, и для этого получали стандартную кривую путем построения графика зависимости значения Ct от количества копий РНК, применяемых в каждой эталонной реакции. Значения Ct, полученные для анализируемых образцов, использовали для определения путем интерполяции количества копий РНК на основе стандартной кривой. И, наконец, количество копий РНК стандартизовали (на основе количественной оценки РНК, экстрагируемой из лунки с клеточной культурой, с помощью набора RiboGreen RNA) и выражали в виде геномных эквивалентов/мкг общей РНК [г.э./мкг]. Количество копий РНК [г.э./мкг] для каждой лунки планшета с культурой клеток принимали за меру количества реплицирующейся РНК HCV в присутствии различных концентраций ингибитора. Ингибирование в % рассчитывали с помощью следующего уравнения: 100-[(г.э./мкг инг.)/(г.э./мкг контр.)х 100] Для обработки данных зависимости ингибирования от концентрации применяли основанную на модели Хилла аппроксимацию нелинейной кривой и значения концентрации, обеспечивающей 50%-ную эффективность (50%-ное ингибирование) (EC50), рассчитывали с помощью программного обеспеченияSAS (Statistical Software System; SAS Institute, Inc. Кэри, шт. Северная Каролина). При оценке соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, с помощью описанных выше ферментативных анализов и анализов на клеточных культурах выявлена их высокая активность. Более конкретно, установлено, что значения IC50 соединений составляли менее 0,1 мкМ при анализе NS3-NS4A-протеазы, а значения ЕС 50 составляли менее 0,5 мкМ при анализе репликации РНК HCV на культуре клеток. Пример 11. Анализы специфичности. Анализы специфичности, применяемые для оценки избирательности действия указанного соединения, соответствуют описанным в WO 00/09543. Когда соединения оценивали в опытах по определению специфичности, то было установлено, что соединения формулы (I) обладали селективностью, т.е. они не вызывали существенного ингибирования эластазы лейкоцитов человека и катепсина В. Пример 12. Фармакокинетические свойства. Соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают также удовлетворительными фармакокинетическими свойствами, такими как значительные уровни в плазме крыс через 1 и 2 ч после орального введения дозы 4 или 5 мг/кг. Более конкретно, для оценки уровней в плазме крыс тестируемых соединений после орального введения применяли следующий анализ, основанный на оценке in vivo абсорбции после орального введения. Материалы и методы. 1. Метод, применяемый для группировки соединений (отбор с помощью кассет). Отбор соединений, предназначенных для объединения в кассету, был основан на их структурном сходстве и физикохимических свойствах. Был разработан метод твердофазной экстракции, применимый для всех отобранных соединений. Данные начального тестирования, при котором каждое соединение вводили в плазму крыс и с помощью ЖХВР или ЖХВР-МС анализировали каждое соединение, взятое в концентрации 0,5 мкМ, с определением времени удерживания, ионной массы и возможности разделения соединений с помощью ЖХВР и/или ЖХВР/МС, использовали для объединения 3-4 соединений в одну- 17007739 кассету. 2. Подготовка носителя и соединения для орального введения. Каждая кассета содержала 3-4 соединения, каждое в концентрации 5 или 4 мг/кг. Кассету приготавливали в виде суспензии для орального введения, содержащей 0,5% водной метилцеллюлозы и 0,3% полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеата (Твин-80). Объем вводимой дозы составлял 10 мл/кг, и ее вводили через оральный желудочный зонд. 3. Применяемые дозы и отбор образцов плазмы. Самцов крыс Sprague Dawley содержали в индивидуальных клетках в течение ночи, и животные имели доступ к водной 10%-ной декстрозе. Каждую кассету вводили 2 крысам. Образцы плазмы (1 мл) получали через 1 и 2 ч после обработки у каждой из 2 крыс и объединяли для экстракции и анализа. 4. Экстракция и анализ соединений. Для каждой кассеты образцы плазмы, полученные через 1 и 2 ч, образцы контрольной плазмы,образцы контрольной плазмы, в которую вводили все соединения, каждое в концентрации 0,5 мкМ, экстрагировали с помощью метода твердофазной экстракции. Для сравнения образцы анализировали с помощью ЖХВР и ЖХВР/МС. Концентрации в плазме определяли на основе одной концентрации стандарта, составляющей 0,5 мкМ. Результаты. При оценке предлагаемых в настоящем изобретении соединений, описанных в примерах 1-8, с помощью указанного выше метода отбора выявлены их высокие уровни в плазме через 1 и 2 ч после орального введения, при этом усредненные уровни в плазме крови составляли 0,83 и 0,75 мкМ соответственно. Эти результаты демонстрируют, что предлагаемые в настоящем изобретении трипептидные соединения обладают представлящим интерес уровнем абсорбции in vivo после орального введения в сравнении с низким уровнем абсорбции после орального введения, характерным в целом для этого класса пептидов. Способность к абсорбции после орального введения делает указанные соединения перспективными для лечения инфекции, вызываемой HCV. Перечень последовательностей в котором R1 обозначает гидрокси или NHSO2R1A , где R1A обозначает C1-С 8 алкил, С 3-С 7 циклоалкил или С 1-С 6 алкил-С 3-С 7 циклоалкил, которые все необязательно замещены 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, OC1-С 6 алкил, амидо, амино или фенил, или R1A обозначаетC6- или С 10 арил, необязательно замещенный 1-3 заместителями, выбранными из ряда, включающего галоген, циано, нитро, С 1-С 6 алкил, OC1-С 6 алкил, амидо, амино или фенил; R2 обозначает трет-бутил, -СН 2 С(СН 3)3 или -СН 2-циклопентил; R3 обозначает трет-бутил или циклогексил и R4 обозначает циклобутил,циклопентил или циклогексил; или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, NHSO2Me, NHSО 2 циклопропил или NHSO2Ph. 3. Соединение формулы (I) по п.2, в котором R1 обозначает NHSO2Me или гидрокси. 4. Соединение формулы (I) по п.3, в котором R1 обозначает гидрокси. 5. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-4, в котором R2 обозначает трет-бутил или СН 2 С(СН 3)3. 6. Соединение формулы (I) по п.5, в котором R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3. 7. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-6, в котором R3 обозначает трет-бутил. 8. Соединение формулы (I) по одному из пп.1-7, в котором R4 обозначает циклопентил или циклогексил. 9. Соединение формулы (I) по п.8, в котором R4 обозначает циклопентил. 10. Соединение формулы (I) по п.1, в котором R1 обозначает гидрокси, R2 обозначает СН 2-С(СН 3)3,3R обозначает тpeт-бутил и R4 обозначает циклопентил. 18. Применение соединения формулы (I) по одному из пп.1-17 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гепатита С. 3

МПК / Метки

МПК: A61P 31/00, C07K 4/00, C07D 417/14, A61K 31/47

Метки: гетероциклические, гепатита, трипептиды, ингибиторов, качестве, вируса

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/21-7739-geterociklicheskie-tripeptidy-v-kachestve-ingibitorov-virusa-gepatita-s.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Гетероциклические трипептиды в качестве ингибиторов вируса гепатита с</a>

Похожие патенты