Номер патента: 25180

Опубликовано: 30.11.2016

Авторы: Ларссон Рольф, Линдер Стиг, Фрикнес Мортен

Есть еще 12 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Применение хелатора железа, способного проникать в клетку, для лечения солидной раковой опухоли у субъекта, где хелатор железа, способный проникать в клетку, представляет собой N-(1-пиридин-2-илметилиден)-N-(9H-1,3,4,9-тетраазафлуорен-2-ил)гидразин или его фармацевтически приемлемую соль общей формулы I

Рисунок 1

где R представляет собой H или метил;

R1 представляет собой H или С14алкил;

R2 представляет собой H или С14алкил.

2. Применение по п.1, где R представляет собой метил.

3. Применение по п.1 или 2, где R и R1, оба, представляют собой метил.

4. Применение по любому из пп.1-3, где

Рисунок 2

5. Применение по любому из пп.1-3, где R1 представляет собой 6-метил или 8-метил и R2 представляет собой H.

6. Применение по п.5, где R представляет собой метил, R1 представляет собой 8-метил и R2 представляет собой H.

7. Фармацевтическая композиция для лечения солидной раковой опухоли, содержащая хелатор железа, способный проникать в клетку, определенный в любом из пп.1-6, в количестве, эффективном для лечения рака, и фармацевтически приемлемый носитель.

8. Применение фармацевтической композиции по п.7 для лечения солидной раковой опухоли.

Текст

Смотреть все

В изобретении хелатор железа, способный проникать в клетку, применяют для лечения солидной раковой опухоли у субъекта. Предпочтительный хелатор представляет собой замещенный алкиломN-(1-пиридин-2-илметилиден)-N-(9H-1,3,4,9-тетраазафлуорен-2-ил)гидразин. Также раскрыты фармацевтическая композиция, включающая хелатор железа и фармацевтически приемлемый носитель, и ее применение для лечения солидной раковой опухоли. Область изобретения Данное изобретение относится к лечению солидной опухоли, в частности диссеминированной солидной опухоли, у субъекта, страдающего раком, и к средствам для такого лечения. Уровень техники Существует необходимость в разработке новых и эффективных противораковых лекарственных средств для пациентов, страдающих от диссеминированного рака. Разработка лекарственных средств против солидных опухолей связана с особыми трудностями вследствие сложных биофизических и метаболических условий в трехмерной опухолевой ткани, которые может быть сложно имитировать в экспериментальных системах in vitro. Известно, что гипоксия и ограниченная диффузия питательных веществ ведет к состоянию покоя и устойчивости к традиционным противораковым средствам и лучевой терапии. Более того, противораковые лекарственные средства должны обладать способностью проникать в паренхиму опухоли, чтобы достичь раковых клеток в токсичных концентрациях. Некоторые лекарственные средства, находящиеся в клиническом применении для лечения солидных опухолей, демонстрируют низкую степень проникновения в трехмерные опухолевые образования, что может служить одной из причин их ограниченной эффективности (1). Многоклеточные сфероиды (MCS) имитируют солидные опухоли человека лучше, чем двумерные монослойные культуры (2-4), и многие клинически используемые лекарственные средства проявляют ограниченную эффективность в отношении раковых клеток, выращенных в форме MCS (5, 6). Поэтому MCS лучше подходят для скрининга лекарственных средств,активных в отношении солидных опухолей, чем монослойные культуры. Гибель клеток часто подразделяют на три типа гибели клеток: апоптоз (тип I), аутофагическая смерть клетки (тип II) и некроз (тип III). Апоптоз опосредован активацией каспаз. Аутофагия представляет собой эволюционно консервативный механизм для деградации долгоживущих клеточных белков и поврежденных клеточных органелл. Образование аутофагосом является главной характерной чертой аутофагии. Образование аутофагосомы требует активации фосфатидилинозитол-3-киназы класса III, а также зависит от двух убиквитин-подобных систем конъюгации (Atg-Atg12 и Atg8) (7). Аутофагия защищает клетки во время пребывания в условиях недостатка питательных веществ, а когда аутофагия ингибирована, клетка подвергается апоптозу (8-10). Морфологические признаки аутофагии также наблюдали во время гибели клеток в условиях ингибирования каспаз (11). Сущность изобретения Согласно изобретению раскрыто применение хелатора железа, способного проникать в клетку, для лечения солидной раковой опухоли у субъекта, где хелатор железа, способный проникать в клетку, представляет собой N-(1-пиридин-2-илметилиден)-N-(9H-1,3,4,9-тетраазафлуорен-2-ил)гидразин или его фармацевтически приемлемую соль общей формулы IR2 представляет собой H или С 1-С 4 алкил. Предпочтительно R представляет собой метил. Предпочтительно когда R и R1, оба, представляют собой метил. В предпочтительных соединениях по изобретению N-(1-пиридин-2-илметилиден)-N-(9H-1,3,4,9 тетраазафлуорен-2-ил)гидразин замещен следующим образом: Предпочтительно R1 представляет собой 6-метил или 8-метил и R2 представляет собой H. Предпочтительно R представляет собой метил, R1 представляет собой 8-метил и R2 представляет собой H. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения солидной раковой опухоли, содержащей хелатор железа, способный проникать в клетку, определенный выше, в количестве, эффективном для лечения рака, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по изобретению может быть введена любым подходящим способом, таким как пероральный или парентеральный. Подходящие носители включают диметилсульфоксид и водную среду,как, например, смеси, включающие диметилсульфоксид и воду. Предпочтительными жидкими носителями являются жидкие носители, способные растворить соединение по изобретению. Другими предпочтительными жидкими носителями, в частности водными носителями, являются таковые, включающие соединение по изобретению в мелкодисперсной форме, как, например, в форме микрочастиц размером 10 мкм или менее. Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции для лечения солидной раковой опухоли. Соединение по изобретению представляет собой хелатор железа, способный проникать в клетку. Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения полагают, что противораковое действие соединения по изобретению основано на его железохелатирующих свойствах. Далее изобретение будет описано более подробно путем отсылки на несколько предпочтительных воплощений, проиллюстрированных в графических материалах, включающих несколько чертежей. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 иллюстрирует активность CB21 in vivo на ксенотрансплантатах карциномы головы и шеи линии FaDu. SCID (тяжелый комбинированный иммунодефицит) мышей, несущих опухоли линии FaDu,лечили введением мг/кг CB21 и вычисляли объем опухоли. Фиг. 2 а-2 з иллюстрируют цитотоксичность N-(1-пиридин-2-илэтилиден)-N-(9H-1,3,4,9-тетрааза-8 метилфлуорен-2-ил)гидразина (далее обозначенного как "CB21") в отношении HCT116 MCS и терапевтическое окно цитотоксического действия. Фиг. 2 а: морфология и индукция каспазы-3 в MCS, обработанных CB21. HCT116 MCS обрабатывали в течение 6 ч 6 мкМ CB21, после чего среду заменяли на среду, не содержащую лекарственного средства, и инкубировали далее. Изготавливали срезы MCS и окрашивали на активную каспазу-3. Фиг. 2 б: клоногенное разрастание клеток, обработанных указанными соединениями. Фиг. 2 в: пролиферация монослоя клеток HCT116 в присутствии или в отсутствие CB21. Клетки высевали в 96-луночные планшеты по 7000 клеток/лунка и обрабатывали 3, 6 и 12,5 мкМ CB21. Фиг. 2 г: встраивание EdU (5-этинил-2'-дезоксиуридин) в монослой клеток HCT116 через 24 ч после добавления 6 мкМ CB21. Клетки инкубировали 30 мин с EdU, фиксировали и анализировали с помощьюArrayScan. Фиг. 2 д: количественный анализ сигнала EdU в эксперименте, представленном на фиг. 2 г. Фиг. 2 е: пролиферация монослоя клеток hTERT-RPE1 в присутствии или в отсутствие CB21. Клетки высевали в 96-луночные планшеты по 7000 клеток/лунка и обрабатывали 3, 6 и 12,5 мкМ CB21. Фиг. 2 ж:CB21 не влияет на жизнеспособность клеток hTERT-RPE1 в сплошном слое. Клетки высевали в количестве 7000 или 70000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в присутствии или в отсутствие CB21. Фиг. 2 з: морфология клеток HCT116 и hTERT-RPE1 после воздействия 6 мкМ CB21. Фиг. 3 а-3 д иллюстрируют то, что CB21 представляет собой мощный хелатор железа. Фиг. 3 а: коэффициенты согласно базе данных "Connectivity Map" (Стар). Фиг. 3 б: жизнеспособность клеток, обработанных 6 мкМ CB21 в присутствии или в отсутствие хлорида железа. Слева: клетки HCT116; справа: клетки HCT116 р 53-/-. Фиг. 3 в: жизнеспособность клеток HCT116, обработанных различными хелаторами железа. Фиг. 3 г: жизнеспособность клеток HCT116, обработанных 7 соединениями, родственнымиCB21 по структуре. Фиг. 3 д: CB21 является самым эффективным из серии родственных соединений в отношении уменьшения жизнеспособности MCS. Фиг. 4 а-4 е иллюстрируют индукцию аутофагии CB21 и другими хелаторами железа. Фиг. 4 а: морфология монослоя клеток HCT116, после воздействия 6 мкМ CB21 в течение 6 ч и дополнительно 42 ч или 90 ч в среде без лекарственных средств. Фиг. 4 б: окрашивание клеток, обработанных CB21, антителами к LC3 (легкой цепи 3 белка, ассоциированного с микротрубочками). Фиг. 4 в: индукция белка LC3-I и LC3-II CB21 в монослое и MCS HCT116. Клетки обрабатывали в течение 6 ч (6 мкМ) и затем инкубировали далее. Белки экстрагировали и подвергали вестерн-блот анализу. Фиг. 4 г: индукция белка LC3-I и(200 мкМ), циклопироксоламином (15 мкМ), CB21 (5 мкМ), рапамицином (0,1 мкМ), NVP-BEZ235 (0,2 мкМ). Фиг. 4 е: морфология периферических и коровых клеток, визуализированных с помощью электронной микроскопии. MCS обрабатывали 6 мкМ CB21 в течение 6 ч и инкубировали далее в среде без лекарственных средств в течение указанных промежутков времени и изготавливали срезы. Обратите внимание на появление раздутых митохондрий через 24 ч после обработки CB21. Фиг. 5 а-5 е иллюстрируют то, что ингибирование аутофагии, индуцированной CB21, увеличивает цитотоксичность CB21. Фиг. 5 а: монослой клеток HCT116 обрабатывали 6 мкМ CB21 и/или 10 мкМ 3 МА (3-метиладенин) и определяли жизнеспособность клеток через 48 ч. Фиг. 5 б: монослой клетокHCT116 трансфицировали siRNA к Beclin/Atg6 или контрольной siRNA. Через 24 ч клетки обрабатывали 6 мкМ CB21 как указано. Фиг. 5 в: бафиломицин А (10 мкМ) ингибирует образование LC3 положительных везикул в клетках, обработанных CB21. Клетки фиксировали и окрашивали на LC3 после обработки лекарственным средством через указанные промежутки времени. Фиг. 5 г: бафиломицин А увеличивает цитотоксичность CB21. Клетки обрабатывали 6 мкМ CB21 и/или 10 мкМ бафиломицина А и клетки фотографировали через указанные промежутки времени. Фиг. 5 д: хлорохин увеличивает цитотоксичность CB21 в монослойной культуре. Клетки HCT116 обрабатывали 6 мкМ CB21 и/или 10 мкМ хлорохина. Пролиферацию клеток контролировали путем подсчета плотности культуры. Фиг. 5 е: хлорохин увеличивает цитотоксичность CB21 в культуре MCS. Жизнеспособность клеток определяли, применяя тест на кислую фосфатазу. Обратите внимание, что фоновые уровни активности кислой фосфатазы наблюдали в культурах HCT116 MCS, не содержащих жизнеспособных клеток (обычно около 30%), вероятно вследствие захвата фермента. Фиг. 6 а-6 д иллюстрируют то, что CB21 индуцирует ответы р 53 и гипоксии. Фиг. 6 а: профиль экспрессии генов, индуцированных CB21, анализировали на микрочипах Affymetrix, и показана картина генов, ассоциированных с гипоксией, сигнальными путями р 53 и митозом. Фиг. 6 б: вестерн-блот анализ р 53 и HIF-1a. Клетки HCT116 обрабатывали 6 мкМ CB21 в течение указанных промежутков времени. Фиг. 6 в: индукция HIF-1a-промотора, управляющего репортером GFP посредством CB21. Фиг. 6 г: индукция BNIP3 CB21 в клетках HCT116 и hTERT-RPE1. Фиг. 6 д: нокдаун BNIP3 не влияет на индуцированную CB21 гибель клеток. Клетки HCT116 трансфицировали siRNA к BNIP3 или контрольной siRNA и обрабатывали 6,25 мкМ CB21 через 24 ч. Жизнеспособность определяли через 48 ч с помощью анализа кислой фосфатазы. Фиг. 7 а-7 г иллюстрируют то, что CB21 уменьшает дыхание и ингибирует mTOR. Фиг. 7 а: влияние на транспорт глюкозы. Фиг. 7 б: CB21 уменьшает потребление кислорода. Фиг. 7 в: CB21 уменьшает гипоксию в HCT116 MCS. HCT116 MCS обрабатывали как указано и подвергали иммуногистохимическому анализу с пимонидазолом. Обратите внимание, что CB21 уменьшает площадь, которая окрашивается положительно на аддукты пимонидазола (10 мм Hg O2). Фиг. 7 г: CB21 ингибирует фосфорилирование 4 ЕВР 1. Клетки HCT116 обрабатывали CB21 в течение указанных промежутков времени и белковые экстракты подвергали вестерн-блоттингу. Следует отметить уменьшение фосфорилирования 4 ЕВР 1 и индукцию фосфорилирования AKT. Фиг. 8 а-8 в иллюстрируют то, что глюкозное голодание усиливает цитотоксичность CB21. Фиг. 8 а: морфология HCT116 MCS после инкубации в присутствии или в отсутствие глюкозы в течение 24 ч. Фиг. 8 б: монослой клеток HCT116 обрабатывали CB21 в различных концентрациях в среде, содержащей глюкозу или не содержащей глюкозу. Уровни K18 (кератина 18), расщепленного каспазами, определяли с помощью М 30CytoDeath ELISA (ферментативный иммуносорбентный анализ). Фиг. 8 в: монослой клеток HCT116 обрабатывали как на фиг. 8 б. Жизнеспособность определяли с помощью анализа кислой фосфатазы. Описание предпочтительных воплощений Материалы и методы. Соединения по изобретению были получены из библиотек соединений. Они могут быть получены согласно способам, описанным в литературе, как, например, в WO 02/089809, или путем их модификаций неизобретательского характера. Соединения растворяли в DMSO (диметилсульфоксиде). Конечная концентрация DMSO в клеточных культурах достигала 0,5%. Клеточная культура, получение MCS и скрининг. Клетки карциномы ободочной кишки HCT116 инкубировали в модифицированной среде МакКоя 5 А/10% эмбриональной телячьей сыворотке при 37 С в 5% СО 2. MCS получали, используя модификацию нашего ранее описанного способа (12). Суспензию клеток, содержащую 10000 клеток (200 мкл),добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов, покрытых poly-HEMA (полигидроксиэтилметакрилат). Затем лунки переполняли путем добавления дополнительных 170 мкл среды для достижения выпуклой кривизны поверхности. Пластилиновые разделители (3 мм) помещали в углы каждого планшета для предотвращения касания среды крышкой планшета. Затем планшеты переворачивали для того, чтобы дать возможность клеткам осесть на границе раздела жидкость/воздух и инкубировали при слабом покачивании. Через 24 ч инкубации планшеты возвращали в нормальное положение. Сначала удаляли избыток среды путем аспирации, а затем пластилиновые разделители. Планшеты инкубировали в течение 4 суток до обработки лекарственным средством. Через 24 ч обработки лекарственным средством в культуральную среду добавляли NP40 до концентрации 0,1% для экстрагирования из MCS расщепленного каспазами K18 и для включения материала, высвобожденного в среду из мертвых клеток. Расщепленный каспазами кератин-18 (K18-Asp396) определяли с использованием 25 мл среды/экстракта, с помощью анализа М 30 CytoDeath ELISA (вариант M30-ApoptosenseELISA (13), разработанный для применения invitro (Peviva AB, Bromma, Sweden. Оценку жизнеспособности проводили методом определения кислой фосфатазы (АРН), описаннымFriedrich et al. (14). Фоновую активность вычитали. Клетки hTERT-RPE1 были получены из Clontech Laboratories, Mountain View, CA. hTERT-RPE1 представляет собой линию иммортализованных клеток эпителия сетчатки человека, которая стабильно экспрессирует обратную транскриптазу теломеразы человека (hTERT). Оценка синтеза ДНК. Систему флуоресцентного микроскопа ArrayScan V HCS (Cellomics Inc., Pittsburgh, PA, USA) применяли для определения включения EdU. Перед добавлением тестируемых соединений клетки HCT116 высевали в 96-луночные планшеты (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA, USA) и оставляли на ночь для прикрепления. В течение 24 ч клетки обрабатывали CB21 или контрольным носителем. Клетки окрашивали с использованием метода Click-iT EdU HCS (C10354, Invitrogen, Molecular Probes Inc, OR, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Обработанные планшеты загружали в ArrayScan и анализировали. Изображения были получены для каждого канала флуоресценции с использованием подходящих фильтров с 10-кратным объективом, и в каждой лунке было проанализировано по меньшей мере 1000 клеток. Измеряли среднюю общую интенсивность по каналу BdU. Результаты показаны как среднее по двум независимым экспериментам, каждый из которых выполнен в двух лунках, и представлены как среднееSD. Иммунологические исследования.MCS, полученные методом висячей капли в 96-луночных планшетах, фиксировали в параформальдегиде, обезвоживали, заливали парафином и изготавливали срезы. Каждый образец содержал 32 MCS(MCS из каждого 96-луночного планшета объединяли в 3 группы). Срезы депарафинировали ксиленом,регидратировали и подвергали действию микроволнового излучения, а затем инкубировали в течение ночи с первичными моноклональными антителами, растворенными в 1% (вес./об.) бычьем сывороточном альбумине и визуализировали стандартным методом авидин-биотин-пероксидазного комплекса (VectorLaboratories, Burlingame, CA, USA). Контрастное окрашивание выполняли с гематоксилином Майера. Антитела MIB-1 (против ядерного антигена Ki67, ассоциированного с пролиферацией) были получены отImmunotech SA, Marseille, France и применялись в разведении 1:150; антитела против активной каспазы-3 были получены от Pharmingen и применялись в разведении 1:50. Вестерн-блоттинг. Белки клеточного экстракта разделяли с помощью электрофореза в трис-ацетатных полиакриламидных гелях (Invitrogen, Carlsbad, СА) и переносили на мембрану из поливинилиден дифторида (PVDF). Мембраны инкубировали с антителами в течение ночи, промывали и инкубировали с HRPконьюгированными антителами против Ig кролика (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK) в течение 1 ч. Пероксидазную активность выявляли с помощью SuperSignal West Pico (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) в соответствии с инструкциями изготовителя."Connectivity map" (CMAP) (www.broad.mit.edu/cmap) версия 02 содержит данные экспрессии всего генома для 1300 соединений (6100 примеров, включая повторы, различные дозы и клеточные линии). Следовали оригинальному протоколу с использованием клеток рака молочной железы MCF-7 как описано Lamb et al. (15). Клетки высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 0,4106 клеток на лунку и оставляли на 24 ч для прикрепления, после чего обрабатывали NSC76022, NSC620358 или NSC647889 в конечной концентрации 10 мкМ или контрольным носителем (DMSO). После 6-часовой обработки клетки промывали PBS (фосфатно-солевой буферный раствор). Тотальную РНК получали с помощью RNeasyminiprep kit (Qiagen, Chatsworth, CA). Начиная с двух микрограммов тотальной РНК, анализ экспрессии генов выполняли с использованием Genome U133 Plus 2.0 Arrays в соответствии с GeneChip ExpressionAnalysis Technical Manual (Rev. 5, Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Необработанные данные нормализовали MAS5 (Affymetrix) и вычисляли коэффициенты экспрессии генов клеток, обработанных лекарственными средствами, относительно обработанных контрольным носителем, чтобы составить перечни регулируемых генов. Критериями отбора были наличие сигнала для всех генов в обработанной клеточной линии и пороговый уровень экспрессии по меньшей мере 100 условных единиц экспрессии. Из соображений совместимости СМАР использовали только зонды, присутствующие на HG U133A. Чтобы получить ранжированный перечень соединений, для каждого соединения 40 генов (то есть зондов), экспрессия которых наиболее сильно повышалась и понижалась, загружали в СМАР и сравнивали с 6100 примерами в базе данных СМАР. Потребление кислорода. Измерение дыхания проводили, как описано (16). Сукцинат (5 мМ) в присутствии ротенона (2 мМ),малат+пируват (по 5 мМ каждого) и TMPD (N,N,N',N'-тетраметил-п-фенилендиамин) (0,5 мМ) + аскорбат (1 мМ) использовали в качестве митохондриальных субстратов. За изменениями в концентрации кислорода следили с помощью кислородного электрода (Hansatech Instruments, Norfolk, UK) и анализировали с помощью программного обеспечения OxygraphPlus (Hansatech Instruments, Norfolk, UK). Базальное V4 дыхание в клетках оценивали в присутствии 1 М атрактилозида, который блокирует вход АДФ в митохондрии. Обработка мышиных ксенотрансплантатов. Когда опухоли HCT116 в мышах SCID вырастали до размера 200 мм 3, мышам внутрибрюшинно инъецировали лекарственные средства и ежедневно измеряли размер опухоли. Пример 1. Соединение по изобретению индуцирует апоптоз и уменьшает жизнеспособность MCS. Обработка MCS CB21 в течение 6 ч с последующей инкубацией в течение 96 ч в среде, не содержащей лекарственные средства, приводила к MCS меньшего размера с центральными зонами некроза(фиг. 2 а). Индукция каспазы-3 была умеренной по сравнению с NSC647889. Важно то, что обработкаMCS CB21 в течение 6 ч уменьшала клоногенность до 5% (фиг. 2 б). Уменьшение клоногенности было сильнее, чем такое, наблюдаемое для цисплатина, иринотекана и доксорубицина (несмотря на применение концентраций 5-10 мкМ; более чем 10-кратных IC50 этих соединений в монослойных культурах). Обработка монослоя клеток HCT116 CB21 приводила к незначительному увеличению числа клеток между 0 и 24 ч с последующей гибелью клеток (фиг. 2 в). Исследование встраивания 5-этинил-2'дезоксиуридина (EdU) в клетки, обработанные CB21, показало, что синтез ДНК был почти полностью прекращен через 24 ч (фиг. 2 г, 2 д). CB21 был одинаково эффективен в отношении клеток с поврежденным геном супрессора опухоли р 53 и в отношении клеток, экспрессирующих р 53 дикого типа (фиг. 2 б). Ответ иммортализованных эпителиальных клеток человека (клетки hTERT-RPE1) отличался от ответа клеток HCT116. Рост этих клеток был остановлен, но число клеток не уменьшалось (фиг. 2 е). Когда клетки hTERT-RPE1 высевали с высокой плотностью (70000 клеток/лунка), по существу, никакой потери клеток не наблюдалось после обработки CB21 (фиг. 2 ж). Это различие в ответе на CB21 между клеткамиHCT116 и hTERT-RPE1 показано на фиг. 2 з. Пример 2. Соединение по изобретению представляет собой хелатор железа, способный проникать в клетку. Чтобы выдвинуть гипотезы в отношении механизма действия CB21, был использован сборник сигнатур экспрессии генов "Connectivity map" (CMap) (15) из клеток, обработанных лекарственными средствами. Изменения экспрессии генов, вызванные CB21, были наиболее близки к таковым, вызванным циклопироксоламином (СРХ), противогрибковым агентом, обладающим способностью хелатировать железо(17) (фиг. 3 а). Чтобы протестировать, зависит ли цитотоксическая активность CB21 от истощения железа, к клеткам HCT116 добавляли хлорид железа перед добавлением CB21. Было обнаружено, что хлорид железа полностью устраняет эффект CB21 (фиг. 3 б) как в клетках HCT116, экспрессирующих р 53 дикого типа, так и в клетках HCT116, где ген р 53 поврежден. Было проведено сравнение антипролиферативной активности CB21 и других известных хелаторов железа. Было обнаружено, что CB21 является более мощным, чем VLX50, деферазирокс, циклопироксоламин, дефероксамин (фиг. 3 в). Взаимосвязи структура-активность были исследованы путем использования нескольких структурно родственных соединений (фиг. 3 г, 3 д). Эти исследования показали, чтоCB21 был наиболее эффективным соединением как в монослойных культурах, так и в культурах MCS. Пример 3. Соединение по изобретению индуцирует обширный аутофагический ответ. Противоопухолевая активность хелаторов железа обычно объясняется ингибированием рибонуклеотидредуктазы, приводящим к ингибированию клеточной пролиферации (18). MCS содержат в основном непролиферирующие клетки. Соответственно обнаружение индукции цитотоксических эффектов в отношении MCS хелатором железа CB21 было неожиданным. Механизм(-ы) действия были исследованы более подробно. Визуальное обследование клеток, обработанных CB21, выявило то, что клетки содержали множественные крупные цитоплазматические везикулы (фиг. 4 а). Эти везикулы положительно окрашивались антителами к легкой цепи 3 белка 1 (LC3), ассоциированного с микротрубочками, что позволяет предположить, что они были ассоциированы с аутофагией. Окрашивание LC3 наблюдалось через 24 ч и было сильнее через 42 ч (фиг. 4 б). Вестерн-блот анализ показал, что обработка монослоя клетокHCT116 CB21 индуцировала сильное повышение уровней как LC3-I, так и LC3-II (фиг. 4 в). LC3-II (РЕконъюгированная форма LC3) представляет собой белковый маркер, который считают наиболее достоверно связанным с аутофагосомами (19). Также в HCT116 MCS уровни LC3-II были сильно индуцированы CB21 (фиг. 4 в). Также CB21 индуцировал LC3-II в клетках hTERT-RPE1, но уровень индукции был намного слабее по сравнению с уровнем индукции в клетках HCT116 (фиг. 4 г). Этот результат показывает, что степень аутофагии, индуцированной CB21, коррелирует с цитотоксическим эффектом соединения в этих двух типах клеток. Клетки HCT116 обрабатывали различными хелаторами железа в цитотоксических концентрациях в течение 24 ч. Индукцию LC3-I и LC3-II наблюдали во всех случаях, что показывает то, что индукция LC3 была общим эффектом хелаторов железа (фиг. 4 д). Индукция LC3-I и LC3-II хелаторами железа была более сильной по сравнению с таковой, наблюдаемой после обработки рапамицином или NVP-BEZ235(индукции не наблюдалось через 24 ч, слабая индукция - через 6 ч). Для исследования того, способен ли CB21 индуцировать клеточные изменения в клетках внутреннего кора MCS, HCT116 MCS обрабатывали CB21 в течение 6 ч, промывали и инкубировали в течение различных периодов времени, фиксировали, изготавливали срезы и исследовали путем электронной микроскопии. Крупные везикулы наблюдали в клетках, начиная с 24 ч после обработки (фиг. 4 е). Примечательно, что общим свойством MCS, обработанных CB21, было раннее появление увеличенных и раздутых митохондрий (фиг. 4 е). Наиболее важно то, что массивная вакуолизация происходила зависимым от времени образом не только в клетках на периферии MCS, но также и в центре MCS (фиг. 4 е). Было сделано заключение о том, что CB21 индуцирует образование везикул в клетках центрального кора MCS,-5 025180 которые, как было обнаружено, устойчивы к апоптозу, и что этот ответ связан с потерей жизнеспособности этими клетками. Пример 4. Блокирование аутофагии или слияния аутофагосомы и лизосомы усиливает гибель клеток, вызванную соединением по изобретению. Обычно аутофагию рассматривают как ответ на стрессовые условия, направленный на выживание,но также она может быть механизмом программируемой гибели клеток (20, 21). Для изучения действия различных ингибиторов аутофагии на гибель клеток, индуцированную CB21, цитотоксическое действиеCB21 усиливали с помощью 3-МА (фиг. 5 а), ингибитора PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназы), обычно применяемого как ингибитор аутофагии. Затем выполняли нокдаун Beclin/Atg6 с использованием siRNA. В результате получали почти полный нокдаун экспрессии этого белка. Нокдаун Beclin/Atg6 уменьшал жизнеспособность клеток HCT116 примерно на 50%; токсичность CB21 еще больше уменьшала жизнеспособность (фиг. 5 б). Изучение действия бафиломицина А, антибиотика, который предотвращает слияние аутофагосом и лизосом, показало, что бафиломицин А супрессирует появление больших цитоплазматических везикул, положительных по LC3-II, в клетках HCT116 (фиг. 5 в). В то время как бафиломицин А индуцировал цитотоксичность примерно через 72 ч, цитотоксичность комбинации бафиломицина А иCB21 проявлялась раньше (примерно через 48 ч) (фиг. 5 г). Эти открытия показали, что ингибирование аутофагии усиливает цитотоксическое действие соединения по изобретению, и что крупные везикулы,наблюдаемые в клетках, обработанных CB21, вызваны слиянием аутофагосом и лизосом. Хлорохин (CQ) представляет собой лизосомотропный агент, широко используемый для ингибирования созревания аутофагосом в деструктивные аутолизосомы (22). Сам по себе CQ не оказывает действия на пролиферацию клеток HCT116. Комбинация CQ и CB21 приводила к сильному увеличению гибели клеток в монослое клеток HCT116 (фиг. 5 д). Изучение цитотоксичности комбинации CQ и CB21 в отношении MCS выявило усиленный эффект по сравнению с эффектом или CQ, или CB21 на MCS (фиг. 5 е). Пример 5. Индукция LC3 не опосредована BNIP3.CB21 индуцировал несколько генов ответа на гипоксию и также несколько генов, известных как регулируемые р 53 (фиг. 6 а). Вестерн-блоттингом была подтверждена индукция уровней белков HIF-1a и р 53 (фиг. 6 б). Также значительную индукцию наблюдали с использованием репортерной клеточной линии, где GFP регулируется промотором HIF-1 а (фиг. 6 в). Среди различных генов, сильно индуцируемых CB21, обратил на себя внимание ген, кодирующийBH3-only белок BNIP3. BNIP3 является известной мишенью HIF-1a (23). Сообщалось, что экспрессияBNIP3 индуцирует обширную цитоплазматическую вакуолизацию и аутофагию (24). Было обнаружено,что CB21 индуцирует экспрессию белка BNIP3 в клетках HCT116 (фиг. 6 г). Однако экспрессия BNIP3 была также сильно индуцирована CB21 в клетках hTERT-RPE1 (фиг. 6 г). Это открытие не согласуется с тем, что BNIP3 представляет собой предположительный механизм аутофагии, индуцированной CB21. Нокдаун BNIP3 с помощью siRNA не уменьшал индукцию LC3-II и гибель клеток, вызванных CB21(фиг. 6 д). Пример 6. Соединение по изобретению ингибирует потребление кислорода и уменьшает активностьmTOR. Результаты, описанные выше, позволяют предположить, что индукция аутофагии происходит как попытка спасти клетки от токсических повреждений, вызванных CB21. Поскольку несколько ключевых белков, вовлеченных в энергетический метаболизм клетки, содержат комплексы Fe-S (25), авторы данного изобретения выдвинули гипотезу о том, что хелатирование железа CB21 может приводить к нарушениям в метаболизме клеток, что запустит аутофагию. Для оценки этой гипотезы исследовали действиеCB21 на внутриклеточные уровни АТФ. Однако не удалось обнаружить уменьшения внутриклеточных уровней АТФ в концентрациях, которые индуцируют аутофагию, также не удалось выявить индукцию фосфорилирования АМРК (протеинкиназа, активируемая АМФ) (не показано). Затем, за возможным воздействием CB21 на транспорт глюкозы следили с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентного аналога d-глюкозы 2-[N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино]-2-дезокси-dглюкозы (2-NBDG). Как показано на фиг. 7 а, наблюдали примерно 25% увеличение потребления 2NBDG в клетках, обработанных CB21. Исследование действия CB21 на потребление кислорода клетками выявило, что в монослойных культурах HCT116 дыхание V3 (состояние 3) и Vu (неспаренное) значительно уменьшалось (р 0,05) через 6 ч обработки CB21 (фиг. 7 б). Для исследования того, оказывает ли CB21 действие на дыхание опухолевых клеток в MCS, был применен непрямой метод. Известно, что ингибирование митохондриального дыхания приводит к повышению кислородного напряжения в ткани, что можно визуализировать как уменьшение степени окрашивания пимонидазолом (26). Действительно, было обнаружено, что на срезах MCS область, положительно окрашивающаяся пимонидазолом, составила 50% от контрольной вMSC, обработанных CB21 (фиг. 6 в; таблица). Эффект наблюдался через 3 ч инкубирования с лекарственным средством и сохранялся в течение 24 ч (фиг. 7 в). В качестве контроля монослойные культурыHCT116 обрабатывали митохондриальным разобщающим агентом карбонилцианид-3 хлорфенилгидразоном (СССР), о котором известно то, что он увеличивает потребление кислорода. Как ожидалось, MCS, обработанные СССР, демонстрировали более обширную площадь окрашивания пимонидазолом (фиг. 7 в; таблица). Количественное определение степени окрашивания сфероидов пимонидазолом Мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR) представляет собой серин/треонин киназу, регулирующую рост клеток в ответ на пищевые условия. Достоверно установлено, что метаболический стресс влияет на активность сигнального пути mTOR (27). Сигнальный путь mTOR регулирует потребление кислорода митохондриями и окислительную емкость (28, 29). Для того чтобы определить, связано ли пониженное потребление кислорода, наблюдаемое после обработки CB21, с ингибированием mTOR, было изучено фосфорилирование mTOR субстрата 4 ЕВР 1. Как показано на фиг. 7 г, фосфорилирование 4 ЕВР 1 ингибируется CB21. Уменьшение фосфорилирования ассоциировано с увеличенным фосфорилированием AKT. Известно, что ингибирование mTORC1 разблокирует вовлечение петли отрицательной обратной связи, что приводит к сильной активации Akt (30). Чтобы проверить, будет ли ингибированиеmTOR уменьшать потребление кислорода, MCS HCT116 обрабатывали рапамицином (специфическим фармакологическим ингибитором формирования комплекса mTOR-raptor) и срезы окрашивали пимонидазолом. Наблюдали уменьшение степени окрашивания пимонидазолом, хотя не такое сильное, как сCB21 (фиг. 7 в; табл. 1). Эти открытия побудили исследовать, действительно ли прямое ингибирование mTOR приводит эффектам, похожим на эффекты CB21. Для этих экспериментов применяли двойной PI3K/mTOR ингибитор NVP-BEZ235, соединение в клинических испытаниях. Важным открытием было то, что NVP-BEZ235 уменьшает фосфорилирование 4 ЕВР 1 в клетках HCT116, выращенных как в состоянии монослоя, так и в состоянии MCS (фиг. 7 г). В отличие от CB21, NVP-BEZ235 не влияет на жизнеспособность этих клеток в коре MCS. Пример 7. Глюкозное голодание усиливает гибель клеток, индуцированную соединением по изобретению. Приблизительно 50% продукции клеточного АТФ в раковых клетках происходит путем окислительного фосфорилирования (31). Сообщалось, что потребление кислорода уменьшается во внутренних областях опухолевых MCS, возможно как следствие пониженной пролиферативной активности (32, 33). Другие исследователи обнаружили, что потребление кислорода скорее одинаково в жизнеспособных областях MCS (34); сообщалось, что клоны фибробластов на одной и той же стадии трансформации могут иметь сильно различающуюся метаболическую активность в культуре MCS (33). Даже в случае низкого клеточного потребления кислорода в клетках центрального кора, дальнейшее уменьшение, индуцированное CB21, как ожидается, приведет к повышенной зависимости от глюкозы. В то время как клетки в монослое могут компенсировать повышенную глюкозную зависимость путем увеличенного потребления(как показано на фиг. 8 а), глюкоза будет ограничивающим фактором в MCS. Как показано на фиг. 8 а,выживание клеток кора HCT116 MCS зависит от глюкозы: истощение глюкозы приводит к некрозу центральных областей, эффект, напоминающий эффект CB21 (фиг. 2). На основании этих рассуждений, было исследовано, увеличивает ли глюкозное голодание чувствительность монослоя клеток HCT116 кCB21. Это оказалось действительно так: глюкозное голодание уменьшало жизнеспособность клеток и усиливало апоптоз, вызванный CB21. Вероятно, что эти открытия, по меньшей мере частично, объясняют чувствительность клеток центрального кора к CB21. Пример 8. Противоопухолевая активность соединения по изобретению. Противоопухолевая активность CB21 in vivo исследовали на модели HCT116. Опухоли позволяли расти до размера приблизительно 0,2 мл и затем обрабатывали CB21. Наблюдали очевидный противоопухолевый эффект соединения CB21 (фиг. 1). Было разработано несколько хелаторов железа, которые проявляют противоопухолевую активность, включая Триапин (Triapine) (35), Тачпир (Tachpyr) (36) и Тренсокс (Trensox) (37). Железо важно для многих метаболических реакций, включая образование дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеотидов под действием рибонуклеотидредуктазы (38). В отсутствие Fe клетки не могут перейти от фазы G1 к фазе S клеточного цикла, что объясняет наблюдаемое антипролиферативное действие CB21 как на клеткиHCT116, так и на клетки hTERT-RPE1. Поскольку хелаторы железа в принципе рассматриваются как специфические в отношении пролиферирующих клеток, не ожидалось выявить хелатор железа в скрининге агентов, проявляющих цитотоксичность в отношении MCS. Дальнейшие исследования выявили возможные механизмы действий CB21 на непролиферирующие клетки в корах MCS. Более того, было обнаружено, что CB21 уменьшал потребление кислорода клетками HCT116 и hTERT-RPE1, что наблюдали как путем прямых измерений, так и путем применения окрашивания MCS пимонидазолом. Известно, что потребление кислорода митохондриями и их окислительная способность регулируются сигнальным путем mTOR (28, 29). Также сообщали, что хелатор железа деферазирокс ингибирует передачу сигналов mTOR (39). Действительно, было обнаружено, что CB21 ингибирует фосфорилирование 4 ЕВР 1 и ведет к повышенному фосфорилированию AKT. Ингибирование передачи сигналов mTOR деферазироксом было приписано индукции REDD1 (также известен как RTP801), гена, индуцируемого гипоксией,который, в свою очередь, активирует белок TSC2 (40). Возможно, что действие CB21 на потребление кислорода, по меньшей мере частично, опосредовано этим механизмом. Другая возможность состоит в том, что метаболический стресс, индуцированный истощением железа, воздействует на активность сигнального пути mTOR с помощью некоторых других механизмов. Другое действие CB21, общее с другими хелаторами железа (41), представляет собой индукциюLC3-положительных цитоплазматических везикул и белка LC3-II. Было обнаружено, что индукция LC3 гораздо менее выражена в клетках hTERT-RPE1. Индукция LC3-II хелаторами железа была значительно сильнее, чем таковая, наблюдаемая с ингибиторами mTOR, что позволяет предположить, что индукцияLC3-II не была опосредована исключительно ингибированием mTOR. Было обнаружено, что ингибиторPI3K/mTOR NVP-BEZ235 не вызывает определяемых цитотоксических эффектов на клетки в корахHCT116 (Hernlund et al., не опубликовано), что опять позволяет предположить, что ингибированиеmTOR, вызванное CB21, не является единственным фактором, ответственным за индукцию аутофагии и гибель клеток. Пониженное потребление кислорода, наблюдаемое после обработки CB21, должно привести к повышенной зависимости от глюкозы для продукции АТФ, подобно тому, что сообщалось для рапамицина (42). Кажется, что это предположение подтверждается тем наблюдением, что популяция клеток, присутствующих в коре MCS, демонстрировала признаки значительного стресса ЭПР (Grp78 положительного), состояния, возможно индуцированного гипоксией и ограниченным поступлением глюкозы. Глюкозное голодание MCS индуцировало гибель клеток кора, что согласуется с концепцией того, что выживание этой популяции клеток зависит от глюкозы. Повышенная зависимость от глюкозы,наблюдаемая после обработки CB21, по всей вероятности способствует гибели клеток в популяции клеток кора. По-видимому, апоптоз не является главным механизмом гибели клеток от CB21, о чем свидетельствует слабая индукция каспазы-3 по сравнению с сильной индукцией каспазы-3 в периферических клетках (не показано). Условия низкого энергетического статуса клеток могут привести к устойчивости к апоптозу (также объясняя устойчивость клеток кора к апоптозу, индуцированному NSC647889 (не показано. По-видимому, CB21 индуцирует повышенную зависимость от глюкозы клеток HCT116, и это ведет к пониженной жизнеспособности гипоксических клеток в корах MCS. Аутофагия представляет собой катаболический дегенеративный ответ на метаболический стресс,который стремится сохранить гомеостаз путем разрушения белков и органелл. PI3K-Akt-mTOR, LKB1AMPK-mTOR и р 53 представляют собой основные регуляторы аутофагического пути. Аутофагия, как полагают, вовлечена в передачу раковым клеткам устойчивости к противораковой терапии и представляет собой привлекательную терапевтическую мишень в противораковой лекарственной устойчивости (20,43). CB21 индуцировал значительный аутофагический ответ, характеризуемый сильной индукцией LC3-I и -II. Данное изобретение раскрывает то, что ингибирование аутофагии усиливает цитотоксичность ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение хелатора железа, способного проникать в клетку, для лечения солидной раковой опухоли у субъекта, где хелатор железа, способный проникать в клетку, представляет собой N-(1 пиридин-2-илметилиден)-N-(9H-1,3,4,9-тетраазафлуорен-2-ил)гидразин или его фармацевтически приемлемую соль общей формулы IR2 представляет собой H или С 1-С 4 алкил. 2. Применение по п.1, где R представляет собой метил. 3. Применение по п.1 или 2, где R и R1, оба, представляют собой метил. 4. Применение по любому из пп.1-3, где 5. Применение по любому из пп.1-3, где R1 представляет собой 6-метил или 8-метил и R2 представляет собой H. 6. Применение по п.5, где R представляет собой метил, R1 представляет собой 8-метил и R2 представляет собой H. 7. Фармацевтическая композиция для лечения солидной раковой опухоли, содержащая хелатор железа, способный проникать в клетку, определенный в любом из пп.1-6, в количестве, эффективном для лечения рака, и фармацевтически приемлемый носитель. 8. Применение фармацевтической композиции по п.7 для лечения солидной раковой опухоли.

МПК / Метки

МПК: A61K 31/4706, A61P 35/00, A61K 31/53, A61K 31/16, A61K 31/4196, A61K 31/4412

Метки: опухолей, солидных, лечение

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/20-25180-lechenie-solidnyh-opuholejj.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Лечение солидных опухолей</a>

Похожие патенты