Способ подготовки полинуклеотидов для анализа

Номер патента: 12525

Опубликовано: 30.10.2009

Автор: Лексоу Пребен

Есть еще 12 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ анализа целевого полинуклеотида (полинуклеотида-мишени), содержащего различающиеся элементы (единицы) нуклеотидной последовательности, включающий:

(i) формирование первичного полинуклеотида, представляющего собой конкатемер, имеющий несколько повторяющихся последовательностей целевого полинуклеотида;

(ii) гибридизацию части первичного полинуклеотида со вторичным полинуклеотидом, так что гибридизованная часть или негибридизованная часть соответствует, по меньшей мере, элементу последовательности на мишени, и определение последовательно по одному элементу из каждого целевого полинуклеотида на конкатемере, чтобы таким образом идентифицировать последовательность исходного целевого полинуклеотида.

2. Способ преобразования целевого полинуклеотида, содержащего различающиеся элементы (единицы) нуклеотидной последовательности, в полинуклеотид, содержащий нуклеотидные последовательности, отделяющие один или более из различающихся элементов нуклеотидной последовательности, включающий:

(i) формирование вторичного полинуклеотида, содержащего первый и второй элементы последовательности в предварительно установленной очередности;

(ii) формирование на вторичном полинуклеотиде первичного полинуклеотида, составленного из набора целевых полинуклеотидов, причём очередность первого и второго элементов последовательности обеспечивает характерное взаимодействие между первичным и вторичным полинуклеотидами, так что различающиеся элементы нуклеотидной последовательности на вторичном полинуклеотиде можно отличить от других различающихся элементов по степени взаимодействия; и, возможно,

(iii) определение последовательности и/или очередности различающихся элементов последовательности на основе взаимодействия, чтобы посредством этого установить один или более чем один специфический элемент последовательности на целевом полинуклеотиде.

3. Способ по п.1, где конкатемер образуется путём циркуляризации целевого полинуклеотида и проведения полимеразной реакции с использованием кольцевого целевого полинуклеотида в качестве матрицы.

4. Способ по п.3, где кольцевой целевой полинуклеотид содержит дополнительную нуклеотидную последовательность.

5. Способ по п.3 или 4, где целевой полинуклеотид циркуляризуют путём гибридизации целевого полинуклеотида со вторичным полинуклеотидом, причём 5'- и 3'-области целевого полинуклеотида гибридизуются со вторичным полинуклеотидом, так что 5'- и 3'-концы сближены, и сшивки лигазой 5'- и 3'-концов.

6. Способ по п.3 или 4, где целевой полинуклеотид циркуляризуют путём гибридизации олигонуклеотида с целевым полинуклеотидом (полинуклеотидом-мишенью), причём олигонуклеотид комплементарен и 5'-, и 3'-областям мишени, так что 5'- и 3'-концы сближены, и сшивки лигазой 5'- и 3'-концов.

7. Способ по п.6, где олигонуклеотид перед проведением полимеразной реакции удаляют с помощью экзонуклеазы.

8. Способ по п.2, где этап (ii) осуществляют путём гибридизации между первичным и вторичным полинуклеотидами, причём первичный полинуклеотид содержит элементы последовательности, которые взаимодействуют с первыми элементами последовательности вторичного полинуклеотида, но не со вторыми элементами последовательности, и очередность первого и второго элементов последовательности такова, что очерёдность негибридизованных элементов последовательности на первичном полинуклеотиде отражает определённую очередность элементов последовательности в полинуклеотиде-мишени.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где элементы нуклеотидной последовательности в целевом полинуклеотиде состоят либо из первой определённой последовательности, либо из второй определённой последовательности.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где каждый элемент целевого полинуклеотида содержит по меньшей мере 4 нуклеотида, предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов, и при этом первая последовательность отличается от второй последовательности двумя нуклеотидами.

11. Способ по п.2, где вторичный полинуклеотид получают с помощью полимеразной реакции по механизму вращающегося кольца.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где целевой полинуклеотид содержит по меньшей мере 40, предпочтительно по меньшей мере 50 элементов нуклеотидной последовательности.

13. Способ по любому из пп.1-9, где элементы последовательности в мишени однозначно определены положением этого элемента.

14. Способ по п.13, где вторичный полинуклеотидсконструирован так, чтобы гибридизоваться с каждым целевым полинуклеотидом в первичном полинуклеотиде, но не гибридизоваться с предварительно определённым элементом последовательности на каждой мишени, так что после гибридизации в пределах одного или более из целевых полинуклеотидов имеется один элемент последовательности, который не гибридизуется.

15. Способ по п.1, где определяется элемент последовательности в одном или более из целевых полинуклеотидов, который не гибридизован.

Рисунок 1

 

Текст

Смотреть все

012525 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способам модификации полинуклеотидов для облегчения проведения анализа полинуклеотидов. Предшествующий уровень техники Успехи в изучении молекул были в значительной степени обусловлены усовершенствованием технологий, применяемых для исследования характеристик молекул или их биологических реакций. В частности, в изучении нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) успехи были достигнуты вследствие создания технологий, используемых при определении нуклеотидных последовательностей (секвенировании) и изучении процессов гибридизации. Патентный документ WO-A-00/39333 описывает способ секвенирования полинуклеотидов с помощью преобразования последовательности целевого полинуклеотида во второй полинуклеотид, имеющий определнную последовательность и содержащуюся в нм информацию о расположении. Говорят, что информация о последовательности в целевом полинуклеотиде умножена во втором полинуклеотиде,что дат возможность легче отличать индивидуальные основания в целевой молекуле. Это достигается использованием умножающих ярлычков (magnifying tags), которые являются предварительно определнными элементами последовательности нуклеиновой кислоты. Каждое из оснований (аденин, цитозин,гуанин и тимин) в целевой молекуле представлено индивидуальным умножающим ярлычком, переводящим исходную целевую последовательность в умноженную последовательность. Далее можно применить существующую обычную методику для определения порядка умножающих ярлычков и таким путм определить конкретную последовательность в целевом полинуклеотиде. В предпочтительном способе секвенирования каждый умножающий ярлычок содержит метку, например флуоресцентную метку, которую затем можно идентифицировать и использовать для охарактеризования умножающего ярлычка. Патентный документ WO-A-04/094664 описывает приспособление способа преобразования, раскрытого в публикации WO-A-00/39333. В обоих способах предпочтительно, чтобы каждый умножающий ярлычок содержал две единицы различающейся последовательности, которые могут быть использованы как бинарная система, причм одна единица представляет 0, а другая представляет 1. Каждое основание в мишени характеризуется комбинацией двух единиц, например аденин может быть представлен как 0+0, цитозин как 0+1, гуанин как 1+0, а тимин как 1+1. Единственная трудность в существующих способах состоит в том, что окончательный этап прочтения затруднн необходимостью распознавать различные умножающие ярлычки или единицы. Поэтому задачей изобретения является найти решения, которые позволят усовершенствовать процесс распознавания. Сущность изобретения Настоящее изобретение предлагает способ анализирования полинуклеотидов, предпочтительно таких полинуклеотидов, которые были сформированы различающимися элементами (единицами) нуклеотидной последовательности, каждый из которых представляет конкретную характеристику. Способ использует конкатемер целевого полинуклеотида, то есть повторение последовательности целевого полинуклеотида, и затем формирование на нм следующего полинуклеотида, причм следующий полинуклеотид гибридизуется со специфическими участками мишени, так что гибридизованные и негибридизованные последовательности можно идентифицировать, и очередность (порядок следования) участков гибридизации (или отсутствия гибридизации) показывает идентичность и/или очередность элементов в целевом полинуклеотиде. Предпочтительно цель состоит в том, чтобы последовательно идентифицировать на конкатемере по одному элементу из каждого целевого полинуклеотида. Таким путм подлежащие идентификации элементы в большей степени разделены, чем если бы пришлось секвенировать элементы исходного целевого полинуклеотида. Повышение степени разделения позволяет применить технологию окончательного считывания для отличения одного элемента от другого, вследствие чего повышается эффективность окончательного этапа секвенирования/идентификации. В качестве альтернативы,способ может быть осуществлн так, что повторяемые целевые полинуклеотиды разделяются с помощью дополнительных нуклеотидных последовательностей, действие которых заключается в разделении мишеней друг от друга, так что может быть осуществлн анализ. Согласно первому аспекту настоящего изобретения, способ анализа целевого полинуклеотида,имеющего различающиеся элементы нуклеотидной последовательности, включает:(i) формирование первичного полинуклеотида, представляющего собой конкатемер, имеющий несколько повторяющихся последовательностей целевого полинуклеотида;(ii) гибридизацию части первичного полинуклеотида со вторичным полинуклеотидом, так что гибридизованная часть или негибридизованная часть соответствует, по меньшей мере, элементу последовательности мишени, и определение на мишени элемента последовательности. Во втором аспекте изобретения конкатемер формируется прямо на вторичном полинуклеотиде,имеющем предварительно установленную очередность определнных первого и второго элементов нуклеотидной последовательности. Вторичный полинуклеотид сконструирован таким образом, чтобы гибридизоваться со специфическими элементами последовательности на мишени. Между конкатемером и-1 012525 вторичным полинуклеотидом происходит взаимодействие, так что получаются гибридизованные участки, к которым можно обратиться (запросить), чтобы установить идентичность элемента последовательности. Согласно второму аспекту изобретения способ преобразования целевого полинуклеотида, имеющего различающиеся элементы последовательности нуклеотидов, в полинуклеотид, имеющий нуклеотидные последовательности, отделяющие один или более из различающихся элементов нуклеотидной последовательности, включает:(i) формирование вторичного полинуклеотида, содержащего первый и второй элементы нуклеотидной последовательности в предварительно установленном порядке;(ii) формирование на вторичном полинуклеотиде первичного полинуклеотида, составленного из набора целевых полинуклеотидов, причм очередность первого и второго элементов нуклеотидной последовательности обеспечивает характерное взаимодействие между первичным и вторичным полинуклеотидами, так что различающиеся элементы нуклеотидной последовательности на первичном полинуклеотиде можно отличить от других различающихся элементов по степени взаимодействия; и, возможно,(iii) определение последовательности и/или порядка различающихся элементов нуклеотидной последовательности на основе взаимодействия, чтобы посредством этого установить один или более из специфических элементов нуклеотидной последовательности на целевом полинуклеотиде. Согласно третьему аспекту настоящего изобретения способ формирования двунитевого полинуклеотида включает:(ii) проведение реакции амплификации по механизму вращающегося кольца с праймерной (затравочной) молекулы, присоединнной к первичному полинуклеотиду, причм реакция амплификации использует кольцевую полинуклеотидную молекулу, имеющую последовательность нуклеотидов, комплементарную повторяющимся элементам первичного полинуклеотида. Краткое описание чертежей Описание изобретения сопровождается графическими материалами, где фиг. 1(а) иллюстрирует, как использовать различные нуклеотидные последовательности для представления характеристики 0 или 1, и нуклеотидную последовательность вторичного полинуклеотида, которая будет или не будет гибридизоваться с этой последовательностью; фиг. 1(б) - графическая иллюстрация полимеразной цепной реакции по механизму вращающегося в обратную сторону кольца; фиг. 2 - маскирование или отсутствие маскирования целевого полинуклеотида; фиг. 3 - использование зондов типа висячего замка для обращения к нуклеотидным последовательностям, которые не маскированы; фиг. 4 - конструкция целевого полинуклеотида и вторичного полинуклеотида; фиг. 5 - формирование целевого полинуклеотида, содержащего определнные элементы нуклеотидной последовательности; фиг. 6 - конкатемеризация мишени с дополнительными вставленными нуклеотидными последовательностями; фиг. 7(а) - использование матрицы со вторичными полинуклеотидами, используемыми для захвата и охарактеризования целевого полинуклеотида; фиг. 7(б) - использование зондов типа висячего замка для обращения к целевому полинуклеотиду; фиг. 8 - гибридизация между конкатемеризованными целевыми полинуклеотидами и вторичным полинуклеотидом и наличие неспаренной (немаскированной) последовательности; фиг. 9 - использование зондов типа висячего замка для гибридизации с немаскированными участками конкатемеризованного целевого полинуклеотида; фиг. 10-12 - использование субстратных нуклеотидных последовательностей для ферментов рестрикции (рестриктаз) для обращения к целевому полинуклеотиду и фиг. 13 - фотография электрофорезного геля, показывающая продукты расщепления рестриктазами гибридов, показанных на фиг. 10-12. Описание изобретения Термин полинуклеотид хорошо известен в данной области и здесь использован для обозначения группы связанных в цепочку молекул нуклеиновых кислот, например ДНК или РНК. Имитации нуклеиновых кислот, например пептидонуклеиновые кислоты (ПНК), сплетнные нуклеиновые кислоты (LNA) и 2'-О-метил-РНК, также попадают в круг охвата настоящего изобретения. Упоминание здесь оснований А, Т(У), Г и Ц относится к нуклеотидным основаниям аденину, тимину (урацилу), гуанину и цитозину, как принято в данной области. Если полинуклеотидом является РНК,тимин заменн урацилом, или же урацил может быть введн в ДНК с помощью дезоксиуридинтрифосфата (дУТФ), что опять же понятно специалистам в данной области. Термин первичный полинуклеотид использован здесь для обозначения конкатемеризованного целевого полинуклеотида, то есть первичный полинуклеотид содержит повторяющиеся последователь-2 012525 ности целевого полинуклеотида. Целевые полинуклеотиды могут быть последовательно соединены друг за другом или же могут иметься дополнительные нуклеотидные последовательности, разделяющие целевые полинуклеотиды. Термин вторичный полинуклеотид использован здесь для обозначения полинуклеотида, предназначенного для гибридизации с участками первичного полинуклеотида. Вторичный полинуклеотид может также упоминаться как маскирующий полинуклеотид, поскольку он действует так, чтобы предотвратить обращение к тем участкам первичного полинуклеотида, с которыми он гибридизуется. Участки первичного полинуклеотида, которые не гибридизованы, называются немаскированными. Способ согласно настоящему изобретению применяется для преобразования целевого полинуклеотида, имеющего различающиеся элементы нуклеотидной последовательности, в полинуклеотид, в котором различающиеся элементы нуклеотидной последовательности, к которым следует обращаться, разделены более протяжнными интервалами, чем в мишени. Это дат преимущество разделения элементов,обеспечивая проведение конечных этапов считывания с большей точностью и большим разрешением. Изобретение основано на формировании конкатемера целевого полинуклеотида, что обеспечивает выполнение последующего обращения (запроса) к выбранным элементам; подвергшиеся запросу элементы являются представителями различающихся элементов в исходном целевом полинуклеотиде. Образуя конкатемер, различающиеся элементы целевого полинуклеотида могут быть запрошены различными способами, чтобы установить идентичность одного или более из элементов или чтобы идентифицировать наличие конкретной последовательности, имеющейся на мишени. Предпочтительный путь запрашивания конкатемера - это гибридизация конкатемера с одним или более чем одним вторичным полинуклеотидом определнной последовательности, так что этот вторичный полинуклеотид действует так, чтобы замаскировать части конкатемера, оставляя немаскированные части (элементы последовательности) доступными для запроса, например, меченым полинуклеотидом,специфичным для данной части. Идентификация меченого полинуклеотида показывает идентичность элементов последовательности. Таким путм можно идентифицировать различные элементы последовательности в каждом из целевых полинуклеотидов, входящих в состав конкатемеров. Способ согласно настоящему изобретению основан на использовании целевого полинуклеотида,который состоит из определнных элементов (единиц) нуклеотидной последовательности, где каждый элемент представляет конкретную характеристику более ранней молекулы. Например, каждый элемент может представлять конкретное основание на молекуле исходного полинуклеотида неизвестной последовательности. Каждый элемент предпочтительно содержит 2 или более нуклеотидных оснований,предпочтительно от 2 до 50 оснований, более предпочтительно от 5 до 20 оснований и наиболее предпочтительно от 5 до 10 оснований, например 6 оснований. Предпочтительно в каждом элементе содержится по меньшей мере два различных нуклеотида. Элементы конструируют так, чтобы было возможно в ходе этапа считывания различить различающиеся элементы, например, путм введения различимо меченых нуклеотидов в реакцию полимеризации или проведения гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами. Методы, которыми молекула преобразуется в целевой полинуклеотид, хорошо известны в данной области. Например, они описаны в патентных документах WO-A-00/39333 и WO-A04/094664, содержание которых включено сюда ссылкой. Однако при необходимости элемент может состоять из одного основания. В предпочтительном варианте осуществления изобретения целевой полинуклеотид содержит набор различающихся элементов, комбинация которых сообщает информацию о последовательности или иную информацию. Например, два элемента могут быть использованы в качестве бинарной системы, где один элемент представляет 0, а другой элемент представляет 1. Комбинация различных элементов может отражать основания в исходном полинуклеотиде, подлежащем секвенированию. Это раскрыто в патентном документе WO-A-04/094664. Таким образом, конкатемер содержит повторяющиеся элементы нуклеотидной последовательности. Целевой полинуклеотид (полинуклеотид-мишень) можно сконструировать таким образом, что часть каждого элемента (каждой единицы) представляет характеристику подлежащей изучению исходной молекулы, но каждый элемент содержит также известную нуклеотидную последовательность. Известная последовательность может быть различной для каждого элемента, так что до анализа известна, по меньшей мере, частичная последовательность мишени. Это позволяет сконструировать вторичный полинуклеотид для гибридизации с мишенью. Более детально это показано на фиг. 4 и 5, где для положения каждого элемента на мишени имеются две возможные последовательности элемента; каждый элемент может представлять 0 или 1, в зависимости от последовательности двух нуклеотидов. Однако для каждого положения оставшиеся 8 нуклеотидов одинаковы для 0 или 1, но другие при другом положении элемента. Этим путм можно организовать окончательный запрос, так что может быть осуществлена гибридизация с конкретными элементами, а элементы в конкретных положениях оставлены негибридизованными, что позволяет произвести обращение к негибридизованным элементам. В одном из вариантов осуществления изобретения предполагается обращение к различным положениям элемента на каждом целевом полинуклеотиде в конкатемере, что обеспечивает дополнительное разделение элементов и повышение способности этапа окончательного считывания в различении элементов последовательности.-3 012525 В качестве альтернативы, если последовательность мишени неизвестна, целевой полинуклеотид перед конкатемеризацией может быть пришит к известной последовательности, так что конкатемер содержит и последовательности целевого полинуклеотида, и известные последовательности, вследствие чего гибридизация может осуществиться между конкатемером и вторичным полинуклеотидом. В этом варианте осуществления известные последовательности должны иметь достаточную длину, чтобы сделать возможной гибридизацию со вторичным полинуклеотидом. Например, известные последовательности могут быть длиной более 100 нуклеотидов, предпочтительно более 500 нуклеотидов. Это обеспечивает разделение между гибридизованными последовательностями и негибридизованными (целевыми) последовательностями, к которым можно затем обратиться с запросом. Необходимые для осуществления способа согласно настоящему изобретению условия, в том числе температура, рН, состав буферов и т.д., очевидны для специалистов в данной области. Способ согласно настоящему изобретению содержит три необходимых этапа:(ii) гибридизацию конкатемера со следующим (вторичным) полинуклеотидом с определнной известной последовательностью;(iii) идентификацию элементов (единиц) на конкатемере, которые гибридизованы или предпочтительно не гибридизованы. Конкатемер может быть сформирован любым подходящим путм. В предпочтительном варианте осуществления изобретения циркуляризуют целевой полинуклеотид и проводят полимеразную реакцию,чтобы получить конкатемер. Циркуляризация. Мишень можно циркуляризовать любым удобным способом. В одном из вариантов осуществления изобретения однонитевую мишень гибридизуют с 3'-концом вторичного полинуклеотида. И 5'-, и 3'концы целевой молекулы будут гибридизоваться со вторичным полинуклеотидом и будут сшиты лигазой вместе, образуя однонитевое кольцо. Эффективность сшивок кольца намного возрастает с повышением степени комплементарности. Предпочтительно для этого нужно по меньшей мере 6 комплементарных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 9 комплементарных нуклеотидов для гибридизации со вторичным полинуклеотидом. Лигазой может быть любая доступная лигаза, но предпочтительно это Т 4 ДНК-лигаза, ДНК-лигаза Е. coli или ДНК-лигаза Taq. В альтернативном способе для гибридизации с мишенью и сшивки со вторичным полинуклеотидом может быть использован поддерживающий олигонуклеотид. В одном из вариантов осуществления этого способа гибрид образует частично двунитевую молекулу с избыточным участком, комплементарным к 3'-концу вторичного полинуклеотида. Затем ко вторичному полинуклеотиду на 3'-конце может быть пришит поддерживающий олигонуклеотид. 5'-Конец мишени также комплементарен вторичному полинуклеотиду и поэтому мишень будет гибридизоваться со вторичным полинуклеотидом, приводя два конца мишени в удобное положение для соединения лигазой двух концов мишени и образования кольца. Поддерживающий олигонуклеотид помогает удерживать циркуляризованную теперь мишень на вторичном полинуклеотиде в готовности к конкатемеризации. В альтерантивном варианте осуществления поддерживающий олигонуклеотид используется как скрепляющий олигонуклеотид. Скрепляющий олигонуклеотид комплементарен к участкам 3'- и 5'концов мишени и сближает эти концы, позволяя произойти сшивке лигазой. Гибрид циркуляризованной теперь мишени и поддерживающего олигонуклеотида затем приводят в контакт со вторичным полинуклеотидом, и мишень гибридизуется на конце вторичного полинуклеотида таким образом, чтобы привести поддерживающий олигонуклеотид в сближение со вторичным полинуклеотидом. Затем может произойти сшивка лигазой скрепляющего олигонуклеотида ко вторичному полинуклеотиду, что способствует дальнейшей полимеразной амплификации, предоставляя достаточное количество оснований, с которыми может гибридизоваться кольцевая мишень перед дальнейшим циклом амплификации. Поддерживающий олигонуклеотид должен иметь достаточный размер, чтобы способствовать гибридизации и циркуляризации мишени. В третьем альтернативном способе используется скрепляющий олигонуклеотид. Скрепляющим олигонуклеотидом является короткая однонитевая молекула, комплементарная 3'- и 5'-концам мишени. Следовательно, скрепляющий олигонуклеотид будет сближать концы мишени в положение для соединения двух концов лигазой с образованием кольца. Затем поддерживающий олигонуклеотид можно удалить с помощью расщепления экзонуклеазами, например экзонуклеазой I и экзонуклеазой III. Конкатемеризация. Целевой полинуклеотид можно конкатемеризовать с помощью полимеразной реакции. В одном из вариантов осуществления изобретения сделанный кольцевым (циркуляризованный) целевой полинуклеотид используется как матрица для полимеразной реакции. Поскольку матрицей является кольцевая молекула, используемый метод общеизвестен как амплификация по механизму вращающегося кольца(Rolling Circle Amplification, RCA). Существует несколько вариантов этого метода, обзор которых приведн в работе Richardson и др.//Genetic Engineering. т. 25, с. 51-63. В линейной RCA используется один праймер, что дат с каждой матрицы один конкатемер. В экспоненциальной RCA используются два-4 012525 праймера, причм один праймер комплементарен подлежащей амплификации мишени, тогда как другой комплементарен продукту, получаемому с первым праймером. Следовательно, второй праймер инициирует синтез множественных конкатемеризованных копий по одному целевому полинуклеотиду. В RCA с множественной затравкой (мультипраймерной) в качестве праймеров используется набор случайных(статистических) гексамеров. Эти праймеры инициируют синтез многих конкатемеризованных копий по одному целевому полинуклеотиду. На нитях снятого продукта после первоначального этапа RCA могут последовательно происходить события неспецифичного прикрепления праймера. Полимеразная активность может быть инициирована на 3'-конце вторичного полинуклеотида. Могут быть использованы различные полимеразы, в том числе Sequenase, ДНК-полимераза Bst (большой фрагмент), ДНКэкзополимераза Клнова, которые все работают при 37 С и проявляют важную способность к замещению цепей, необходимую для получения конкатемеров. Может быть использована также термостабильная ДНК-экзополимераза Vent. Однако в литературе в качестве фермента, наиболее эффективного в работе на кольцевых матрицах, указана полимераза 29, и она предпочтительна. В качестве альтернативы, конкатемеризацию осуществляют, сшивая несколько копий целевой молекулы, чтобы получить одну непрерывную однонитевую молекулу. В этом случае нет необходимости в получении циркуляризованного целевого полинуклеотида. Как показано на фиг. 6, могут также наличествовать внедрнные нуклеотидные последовательности. Это часто необходимо, поскольку внедрнная нуклеиновая кислота может иметь известную нуклеотидную последовательность, которая будет способствовать гибридизации со вторичным полинуклеотидом. Гибридизация с маскирующим (вторичным) полинуклеотидом. Гибридизацию со вторичным полинуклеотидом можно осуществить непосредственно, как только получен конкатемер, или можно использовать однонитевую блокирующую молекулу и удалить е обработкой экзонуклеазой после завершения конкатемеризации. В соответствии с этим, в ходе образования конкатемера может присутствовать вторичный полинуклеотид. Это объясняется ниже. Гибридизация конкатемера со вторичным полинуклеотидом может происходить одновременно с тем, как проходит на конкатемере полимеразная реакция. В этом варианте осуществления изобретения кольцевая мишень может быть прикреплена (пришита лигазой) ко вторичному полинуклеотиду, как описано выше, так что продукт полимеразной реакции образуется вблизи вторичного полинуклеотида, что способствует гибридизации. В альтернативном способе гибридизацию можно также отделить от реакции конкатемеризации путм блокирования вторичного полинуклеотида с помощью комплементарной молекулы. Блокирующую молекулу можно синтезировать в отдельной реакции и затем отжечь со вторичным полинуклеотидом перед реакцией конкатемеризации. Альтернативно, блокирующую молекулу можно синтезировать полимеразой прямо на вторичном полинуклеотиде с использованием короткого праймера. После проведения реакции конкатемеризации блокирующую молекулу можно удалить с помощью экзонуклеазы, и тогда вторичный полинуклеотид становится доступным для гибридизации с конкатемеризованной целевой молекулой и е полимеризованным продуктом. Вторичный полинуклеотид должен иметь по меньшей мере частичную комплементарность по отношению к конкатемеру. Это достигается либо на основании знания частичной последовательности элементов нуклеотидной последовательности на мишени, либо введением комплементарных последовательностей в формируемый конкатемер. Цель состоит в гибридизации мишени со вторичным полинуклеотидом, так что остаются негибридизованные участки, к которым можно обратиться. В качестве альтернативы, способ может быть осуществлн путм анализа гибридизованной части. Например, способ может быть спланирован таким образом, что в случае наличия совершенной гибридизации в выбранных местах вторичного полинуклеотида образуются сайты субстрата для рестриктазы, и тогда дуплекс обрабатывают рестриктазой. Мониторинг любого продукта расщепления покажет, присутствует ли в мишени комплементарная последовательность, и таким путм обнаружит характеристику исходной молекулы. Это показано на фиг. с 10 по 13. Говорят, что вторичный полинуклеотид предпочтительно содержит первый и второй элементы последовательности в предварительно определнной очердности. Цель состоит в том, чтобы использовать какой-либо или оба из первого и второго элементов последовательности для маскировки последовательностей в первичном полинуклеотиде для обеспечения выборочного (селективного) запроса первичного полинуклеотида. В одном из вариантов осуществления вторичный полинуклеотид используется для маскировки выбранных элементов на первичном полинуклеотиде, чтобы таким путм разделить элементы на первичном полинуклеотиде и облегчить проведение запроса. Немаскированные элементы первичного полинуклеотида могут быть расположены в такой очередности (порядке), которая отражает очередность элементов в исходном целевом полинуклеотиде, или же они могут быть использованы для создания новой очередности элементов, которая отражает конкретные последовательности в целевом полинуклеотиде. Например, как показано на фиг. 2, взаимодействие между первичным и вторичным полинуклеотидами осуществляется так, чтобы между в высокой степени комплементарными последовательностями пер-5 012525 вичного и вторичного полинуклеотидов появились сайты для рестрикционных ферментов. Хотя гибридизация и происходит между некомплементарными участками (см. последовательности, выделенные жирным шрифтом), расщепление рестриктазами там не происходит. Если происходит совершенная гибридизация, тогда субстратные сайты рестриктаз могут быть расщеплены. Если имеются один или более из участков неполного спаривания (mismatches), тогда расщепление не происходит. Некоторые рестриктазы способны расщеплять субстрат, если имеются один или два участка неполного спаривания. Если такие ферменты используются для получения характеристик целевого полинуклеотида, тогда предпочтительно, чтобы вторичный полинуклеотид был сконструирован таким образом, чтобы присутствовали два или более участков неполного спаривания. В качестве альтернативы, как показано на фиг. 3, взаимодействие между первичным и вторичным полинуклеотидами приводит к появлению негибридизованных элементов, запрос которых может быть осуществлн путм гибридизации с последующим олигонуклеотидом. Более детально это объяснено далее. Можно также использовать несколько вторичных полинуклеотидов в матрицах с адресованным запросом, где конкатемер гибридизуется с несколькими вторичными полинуклеотидами с последующим запросом, позволяющим идентифицировать гибридизационные события. Это показано на фиг. 7 и более детально объяснено далее. Анализ целевого полинуклеотида Как объяснено выше, целевой полинуклеотид содержит элементы (единицы) нуклеотидной последовательности, которые представляют конкретные характеристики (например, информацию о последовательности) исходной молекулы. Способ согласно настоящему изобретению используется для идентификации этих элементов, чтобы посредством этого определить характеристики исходной молекулы. Конкатамер используется, чтобы идентифицировать элементы, разделнные более протяжнными интервалами, чем они могли бы быть, если бы анализ производился на одиночном целевом полинуклеотиде. Чтобы это осуществить, предпочтительно селективно маскировать элементы в каждой копии целевого полинуклеотида в конкатемере, а немаскированные элементы опрашивать и идентифицировать. Маскирование осуществляется с помощью вторичного полинуклеотида, который будет маскировать(гибридизоваться с нею) большую часть каждого целевого полинуклеотида (адрес) на первичном полинуклеотиде и затем даст возможность каждому адресу демаскировать одно конкретное положение бита(единицы информации о последовательности). Это показано на фиг. 8. В адресе 1 будет демаскировано положение 1 бита и так далее. Процедура установления содержания каждого положения бита может затем состоять в сшивании бита с зондом типа висячего замка, например с сигнальной частью молекулы и проведении полимеразной реакции заполнения (fill-in) с меченым нуклеотидом, доступным для детектирования. Когда все положения битов должным образом помечены, может быть осуществлн этап считывания для охарактеризования каждого бита. Эта процедура более детально описана далее. Этап 1. В этом примере целевой полинуклеотид содержит по меньшей мере 40 битов нуклеотидной последовательности, кодирующих подлежащую анализу последовательность нативной (исходной) ДНК. Каждое положение бита может иметь любое из двух значений: 0 или 1. Два бита, возможных для каждого положения, составляют в длину по меньшей мере 10 пар нуклеотидов (п.н.), где два нуклеотида уникальны. Эти два нуклеотида могут располагаться в любом месте кодирующей бит последовательности и определяют величину бита. Оставшиеся нуклеотиды (по меньшей мере 8) предпочтительно идентичны для значений двух битов в каждом положении, но различны в различных положениях битов, как иллюстрировано на фиг. 4. Маскирующая молекула (вторичный полинуклеотид) - это одноцепочечная молекула, содержащая по меньшей мере 40 копий целевого полинуклеотида или комплементарной последовательности. Поскольку каждый целевой полинуклеотид отличается по последовательности значений битов, маска (вторичный полинуклеотид) содержит не последовательности битов 0 или 1, а универсальные биты, отличающиеся от кодирующих значения битов одной парой нуклеотидов, как показано на фиг. 4. После того как целевой полинуклеотид конкатемеризован, проводится полимеразная реакция. Этап 2. Полученный гибрид маски и конкатемера состоит из двунитевой ДНК с одним участком неполного спаривания в каждой последовательности бита. Однако благодаря конструкции маски, положение 1 бита в 1-й копии целевого полинуклеотида не будет гибридизоваться, а оставит последовательность бита доступной. Более того, положение 2 бита во 2-й копии целевого полинуклеотида также не будет гибридизоваться, оставляя доступной последовательность бита в положении 2. Этот механизм используется для установления последовательностей всех битов в исходном целевом полинуклеотиде, как показано на фиг. 8. Кроме того, установленные значения битов физически отделены одной длиной целевого полинуклеотида, что умножает сигнальную цепь по меньшей мере в 40 раз. Вторичный полинуклеотид может быть сконструирован так, что в положениях битов (элементов, единиц), подлежащих запросу,гибридизация не происходит. Таким образом, например, в положении 1 бита в мишени 1 нуклеотидная последовательность во вторичном полинуклеотиде может не иметь никаких комплементарных уча-6 012525 стков. Подобным же образом, в положении 2 бита в мишени 2 может не быть комплементарных последовательностей. Это позволяет разделить подлежащие запросу положения битов. Этап 3. Запрос полученного гибрида может быть осуществлн с помощью любой удобной техники считывания. В одном из вариантов осуществления изобретения предпочтительно использовать технологию зондов типа висячего замка (Nilsson и др.//Science. 1994, т. 265,5181, с. 2085-2088; Baner и др.//Curr.Opin. Biotechnol. 2001, т. 12,1, с. 11-15). Зонд типа висячего замка - это олигонуклеотид, который циркуляризуется путм сшивания ДНК в присутствии подходящей полинуклеотидной последовательности. В реакции необходима гибридизация двух концов олигонуклеотида с прилегающими нуклеотидами на мишени, чтобы произошла сшивка лигазой, поэтому этот процесс высоко специфичен. Поскольку значение каждого бита кодировано двумя прилегающими парами нуклеотидов, эти две пары нуклеотидов могут быть использованы для осуществления специфической к нуклеотидной последовательности сшивки лигазой зондов типа висячего замка с немаскированными битами, как показано на фиг. 9. Если положение 1 бита кодирует величину 1, только специфичный к 1 зонд сможет гибридизовать свои два концевых нуклеотида и будет доступен для реакции сшивки. Если специфичный к 0 зонд гибридизован с битом 1, зонд типа висячего замка не будет доступен для реакции сшивки и, следовательно, будет отмыт. Если все положения битов были соединены со своими соответствующими зондами типа висячего замка,полученную молекулу можно считывать с помощью стандартных визуализующих систем, при условии,что 0-специфичные и 1-специфичные зонды типа висячего замка помечены 0-специфичными или 1 специфичными флуорофорами. После того, как был осуществлн способ преобразования, можно осуществить этап считывания,чтобы получить закодированную информацию о нуклеотидной последовательности. Этап считывания может быть осуществлн с помощью любой пригодной техники, например, такой как описанная в патентных документах WO-A-00/39333 и WO-A-04/094663. Одна из стратегий считывания состоит в использовании коротких олигонуклеотидов, несущих распознаваемую метку, для гибридизации с элементами на преобразованном полинуклеотиде (первичном или вторичном полинуклеотиде) и в детектировании события гибридизации. Короткие олигонуклеотиды имеют нуклеотидную последовательность, комплементарную специфическим элементам преобразованного полинуклеотида. Это показано на фиг. 7(а). Следующий далее пример иллюстрирует изобретение. Пример. Чтобы продемонстрировать принцип репликации по типу вращающегося в обратную сторону кольца, использовали однонитевую молекулу длиной 114 нуклеотидов в качестве субстрата - вторичного полинуклеотида и кольцевую молекулу-мишень длиной 38 пар нуклеотидов. Субстратную молекулу иммобилизовали на покрытых 1 мкМ стрептавидином парамагнитных гранулах, используя биотин для заякоривания вторичного полинуклеотида. Молекулу-мишень гибридизовали со вторичным полинуклеотидом и добавляли ДНК-полимеразу 29. Полимераза производила удлинение, используя молекулу-мишень как матрицу. Удлиннная нить комплементарна вторичному полинуклеотиду и согласно теории полимеризации по механизму вращающегося в обратную сторону кольца будет гибридизоваться со вторичным полинуклеотидом, образуя двунитевую молекулу длиной 114 п.н. В зависимости от последовательности мишени, двунитевая молекула содержит сайты распознавания для определнных рестриктаз (фиг. 10, 11 и 12). Как показано на фиг. 10, мишень с последовательностью единиц 0100 образует сайт распознавания для рестриктазы BamH1 во 2 положении бита во 2-й копии полинуклеотида-мишени. Положения 2 бита в копиях 1 и 3 инактивированы гибридизациями с неполным спариванием в двух одиночных парах нуклеотидов в сайте распознавания. При условии, что репликация по механизму вращающегося в обратном направлении кольца действительно имела место, расщепление рестриктазой BamH1 даст молекулу длиной 64 п.н., которую можно увидеть при электрофорезе в геле. Как показано на фиг. 11, мишень с последовательностью элементов 0010 образует сайт распознавания для рестриктазы HindIII в положении 3 бита в 3-й копии мишени. Положения 3 бита в копиях 1 и 2 инактивированы неполным спариванием одной пары нуклеотидов в сайте распознавания. При условии, что репликация по механизму вращающегося в обратном направлении кольца действительно имела место, расщепление рестриктазой HindIII даст молекулу длиной 64 п.н., которую можно увидеть при электрофорезе в геле. Как показано на фиг. 12, мишень с последовательностью элементов 0110 образует сайты распознавания для рестриктаз BamH1 и HindIII соответственно во 2 положении во 2-й копии мишени и в 3 положении в 3-й копии мишени. Другие возможные сайты рестрикции в конкатемере инактивированы, как описано для мишеней 0100 и 0010. Результаты. Мишень 0100 во всех опытах при электрофорезе давала в геле зону вблизи маркера с 60 п.н. (см. полосу 3 на фиг. 13). Для мишени 0010 во всех опытах зона в геле видна в положении вблизи маркера с 100 п.н. после расщепления рестриктазой HindIII. Однако в дополнение к ожидаемой зоне с 96 п.н. в геле появляются-7 012525 две другие зоны с положениями вблизи 50 и 40 п.н. (см. полосу 4 на фиг. 13). Эти результаты позволяют предположить, что расщепление рестриктазой HindIII не подавляется полностью наличием одной неспаренной пары нуклеотидов. Если во 2-й копии мишени происходит частичное расщепление, ожидаемые молекулы должны быть длиной 96, 54 и 38 п.н. Расщепление 1-й копии мишени должно дать зоны в положениях 38 и 16 п.н. Тот факт, что эти зоны не видны в геле, может указывать на то, что сайт рестрикции расположен слишком близко к концу молекулы, чтобы расщепление происходило в заметной степени. Однако факт обнаружения зон в положениях, соответствующих 54 и 38 п.н., указывает на формирование двунитевой ДНК в процессе репликации по механизму вращающегося в обратную сторону кольца. Для мишени 0110 во всех опытах при расщеплении рестриктазами BamH1 и HindIII виден такой же профиль рестрикции, как и соответственно для мишеней 0100 и 0010 (см. полосы 5 и 6 на фиг. 13). Содержание всех публикаций, на которые производилась ссылка, включено сюда ссылкой. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ анализа целевого полинуклеотида (полинуклеотида-мишени), содержащего различающиеся элементы (единицы) нуклеотидной последовательности, включающий:(i) формирование первичного полинуклеотида, представляющего собой конкатемер, имеющий несколько повторяющихся последовательностей целевого полинуклеотида;(ii) гибридизацию части первичного полинуклеотида со вторичным полинуклеотидом, так что гибридизованная часть или негибридизованная часть соответствует, по меньшей мере, элементу последовательности на мишени, и определение последовательно по одному элементу из каждого целевого полинуклеотида на конкатемере, чтобы таким образом идентифицировать последовательность исходного целевого полинуклеотида. 2. Способ преобразования целевого полинуклеотида, содержащего различающиеся элементы (единицы) нуклеотидной последовательности, в полинуклеотид, содержащий нуклеотидные последовательности, отделяющие один или более из различающихся элементов нуклеотидной последовательности,включающий:(i) формирование вторичного полинуклеотида, содержащего первый и второй элементы последовательности в предварительно установленной очередности;(ii) формирование на вторичном полинуклеотиде первичного полинуклеотида, составленного из набора целевых полинуклеотидов, причм очередность первого и второго элементов последовательности обеспечивает характерное взаимодействие между первичным и вторичным полинуклеотидами, так что различающиеся элементы нуклеотидной последовательности на вторичном полинуклеотиде можно отличить от других различающихся элементов по степени взаимодействия; и, возможно,(iii) определение последовательности и/или очередности различающихся элементов последовательности на основе взаимодействия, чтобы посредством этого установить один или более чем один специфический элемент последовательности на целевом полинуклеотиде. 3. Способ по п.1, где конкатемер образуется путм циркуляризации целевого полинуклеотида и проведения полимеразной реакции с использованием кольцевого целевого полинуклеотида в качестве матрицы. 4. Способ по п.3, где кольцевой целевой полинуклеотид содержит дополнительную нуклеотидную последовательность. 5. Способ по п.3 или 4, где целевой полинуклеотид циркуляризуют путм гибридизации целевого полинуклеотида со вторичным полинуклеотидом, причм 5'- и 3'-области целевого полинуклеотида гибридизуются со вторичным полинуклеотидом, так что 5'- и 3'-концы сближены, и сшивки лигазой 5'- и 3'концов. 6. Способ по п.3 или 4, где целевой полинуклеотид циркуляризуют путм гибридизации олигонуклеотида с целевым полинуклеотидом (полинуклеотидом-мишенью), причм олигонуклеотид комплементарен и 5'-, и 3'-областям мишени, так что 5'- и 3'-концы сближены, и сшивки лигазой 5'- и 3'-концов. 7. Способ по п.6, где олигонуклеотид перед проведением полимеразной реакции удаляют с помощью экзонуклеазы. 8. Способ по п.2, где этап (ii) осуществляют путм гибридизации между первичным и вторичным полинуклеотидами, причм первичный полинуклеотид содержит элементы последовательности, которые взаимодействуют с первыми элементами последовательности вторичного полинуклеотида, но не со вторыми элементами последовательности, и очередность первого и второго элементов последовательности такова, что очердность негибридизованных элементов последовательности на первичном полинуклеотиде отражает определнную очередность элементов последовательности в полинуклеотиде-мишени. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где элементы нуклеотидной последовательности в целевом полинуклеотиде состоят либо из первой определнной последовательности, либо из второй определнной последовательности. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где каждый элемент целевого полинуклеотида содержит по меньшей мере 4 нуклеотида, предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов, и при этом-8 012525 первая последовательность отличается от второй последовательности двумя нуклеотидами. 11. Способ по п.2, где вторичный полинуклеотид получают с помощью полимеразной реакции по механизму вращающегося кольца. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где целевой полинуклеотид содержит по меньшей мере 40, предпочтительно по меньшей мере 50 элементов нуклеотидной последовательности. 13. Способ по любому из пп.1-9, где элементы последовательности в мишени однозначно определены положением этого элемента. 14. Способ по п.13, где вторичный полинуклеотид сконструирован так, чтобы гибридизоваться с каждым целевым полинуклеотидом в первичном полинуклеотиде, но не гибридизоваться с предварительно определнным элементом последовательности на каждой мишени, так что после гибридизации в пределах одного или более из целевых полинуклеотидов имеется один элемент последовательности, который не гибридизуется. 15. Способ по п.1, где определяется элемент последовательности в одном или более из целевых полинуклеотидов, который не гибридизован.

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/68

Метки: полинуклеотидов, анализа, подготовки, способ

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/20-12525-sposob-podgotovki-polinukleotidov-dlya-analiza.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ подготовки полинуклеотидов для анализа</a>

Похожие патенты