Устройство для термозависимой цепной амплификации последовательностей – мишеней нуклеиновых кислот

Номер патента: 4719

Опубликовано: 26.08.2004

Автор: Фесток Габриель

Есть еще 11 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Реакционный планшет, содержащий несколько реакционных камер (13) и по меньшей мере один резервуар (11), при этом каждая реакционная камера соединена с резервуаром при помощи канала (12) с поперечным сечением в виде круга диаметром меньше 3 мм; емкость резервуара меньше 10 мкл, а расположение реакционных камер и каналов по отношению к резервуару обеспечивает равномерное распределение текучей среды по реакционным камерам из резервуара, причем планшет имеет геометрическую форму тела вращения, при которой резервуар расположен практически в центре указанного планшета, реакционные камеры (13) распределены по кругу вокруг указанного резервуара, а каналы (12), соединяющие указанный резервуар с указанными камерами, выполнены, в основном, в радиальном направлении.

2. Планшет по п.1, в котором диаметр каналов меньше или равен 0,2 мм.

3. Планшет по п.1 или 2, в котором емкость резервуара составляет от 0,1 до 1 мл.

4. Планшет по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что содержит от 20 до 500 реакционных камер.

5. Планшет по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что объем реакционных камер составляет от 0,2 до 50 мкл, предпочтительно от 1 до 10 мкл.

6. Планшет по одному из пп.1-5, в котором соединение между каналами (12) и резервуаром (11) выполнено по периферии резервуара, а дно указанного резервуара выполнено наклонным и/или выпуклым, с возможностью обеспечения распределения содержащейся в резервуаре текучей среды на уровне входа каналов.

7. Планшет по одному из пп.1-6, в котором дно резервуара (11) выполнено коническим.

8. Планшет по одному из пп.1-7, в котором реакционные камеры (13) размещены на периферии планшета.

9. Планшет по одному из пп.1-8, имеющий диаметр от 1 до 10 см.

10. Планшет по одному из пп.1-9, в котором резервуар (11) поделен на 2-8 субрезервуаров (111-118) и каждая из реакционных камер соединена только с одним из этих субрезервуаров при помощи канала (12).

11. Планшет по одному из пп.1-10, в котором реакционные камеры имеют глубину от 0,5 до 1,5 мм.

12. Планшет по одному из пп.1-11, отличающийся тем, что выполнен из пластика, предпочтительно из поликарбоната.

13. Планшет по одному из пп.1-12, имеющий толщину от 0,5 до 5 мм.

14. Планшет по одному из пп.1-13, в котором пол реакционных камер (13) имеет толщину от 0,05 до 0,5 мм, предпочтительно примерно 0,25 мм.

15. Планшет по одному из пп.1-14, в котором реакционные камеры (13) закрыты прозрачной верхней стенкой (17).

16. Планшет по одному из пп.1-15, в котором реакционные камеры (13) оснащены вентиляционными трубками (14).

17. Планшет по одному из пп.1-16, в котором реакционные камеры (13) выполнены замкнутыми.

18. Планшет по одному из пп.1-7, в котором резервуар (11) содержит отверстие, выполненное соответственно средствам (4) изменения давления в указанном резервуаре.

19. Планшет по одному из пп.1-18, в котором каждый канал (12) состоит по меньшей мере из двух частей разного диаметра (121 и 122), при этом диаметр второй части (122) меньше диаметра первой части (121), для обеспечения сброса нагрузки в канале (12).

20. Планшет по одному из пп.1-19, отличающийся тем, что каждый канал (12) оснащен полостью (123) отсечки на уровне его соединения с резервуаром (11), при этом указанная полость отсечки образована практически вертикальным участком канала, имеющим диаметр, превышающий или равный диаметру канала (12).

21. Планшет по одному из пп.1-20, в котором по меньшей мере часть реакционных камер (13) содержит олигонуклеотиды.

22. Планшет по одному из пп.1-21, в котором каждая из реакционных камер (13) содержит два специфических праймера анализируемой последовательности нуклеиновой кислоты и, факультативно, специфический меченый зонд указанной последовательности.

23. Планшет по одному из пп.1-22, в котором по меньшей мере часть реакционных камер (13) содержит реактивы, помещенные в них в виде жидкости с последующей их сушкой, для восстановления раствора этих реактивов при подаче в указанные реакционные камеры текучей среды.

24. Устройство для осуществления энзиматических и/или молекулярно-биологических реакций, требующих по меньшей мере две разные температуры инкубации, отличающееся тем, что содержит по меньшей мере один планшет (1), по пп.1-23; по меньшей мере один нагревательный столик (2), содержащий по меньшей мере две отдельные зоны, которые могут нагреваться по меньшей мере до двух разных температур; средства (3) относительного перемещения между указанным планшетом и указанным нагревательным столиком, обеспечивающие циклическое изменение температуры реакционных камер.

25. Устройство по п.24, в котором энзиматическая реакция является термозависимой цепной амплификацией последовательностей нуклеиновых кислот и в котором зоны нагревательного столика (2) выполнены с возможностью нагрева по меньшей мере до двух разных температур, соответствующих фазам циклов амплификации указанных нуклеиновых кислот.

26. Устройство по п.25, отличающееся тем, что специфические праймеры амплифицируемых последовательностей-мишеней заранее распределены по реакционным камерам; резервуар (11) предназначен для заполнения текучей средой, содержащей, в частности, анализируемую пробу нуклеиновых кислот и реактивы, необходимые для осуществления реакции полимеразной цепной амплификации, за исключением праймеров, а нагревательный столик (2) содержит три отдельные зоны, которые могут нагреваться до трех разных температур, соответствующих трем фазам циклов полимеразной цепной амплификации.

27. Устройство по п.25 или 26 для термозависимой цепной амплификации последовательностей нуклеиновых кислот, измеряемой в режиме реального масштаба времени, отличающееся тем, что содержит оптические средства (5) возбуждения/измерения флуоресценции, установленные с возможностью возбуждения/измерения флуоресценции содержимого реакционных камер в каждом цикле.

28. Устройство по одному из пп.24-27, в котором отдельные зоны нагрева нагревательного столика (2) распределены по меньшей мере по двум или трем участкам диска.

29. Устройство по одному из пп.24-28, в котором указанный нагревательный столик (2) выполнен неподвижным, а указанный планшет (1) выполнен с возможностью перемещения при помощи указанных средств (3) перемещения.

30. Устройство по одному из пп.24-29, в котором указанный планшет (1) выполнен неподвижным, а указанный нагревательный столик (2) выполнен с возможностью перемещения при помощи указанных средств (3) перемещения.

31. Устройство по одному из пп.24-30, в котором указанный планшет (1) и/или указанный нагревательный столик (2) выполнены с возможностью вращения под воздействием средства (3) перемещения.

32. Устройство по одному из пп.24-31, в котором планшет (1) непосредственно соприкасается с нагревательным столиком (2).

33. Устройство по одному из пп.24-32, в котором нагревательный столик (2) имеет покрытие, способствующее относительному перемещению между указанным планшетом (1) и указанным нагревательным столиком (2).

34. Устройство по одному из пп.24-33, в котором нагревательный столик (2) содержит два или три отдельных термоблока (21, 22 и, в случае необходимости, 23), соединенных со средствами программирования их температуры нагрева.

35. Устройство по одному из пп.24-34, в котором планшет (1) содержит на своей нижней стороне центральную выступающую часть (181), содержащую вырез (182), и средства (3) перемещения содержат по меньшей мере один поводок (32), взаимодействующий с указанным вырезом (182) для сообщения указанному планшету (1) вращательного движения.

36. Устройство по одному из пп.24-35, содержащее оптические средства (5) возбуждения/измерения флуоресценции, расположенные над планшетом или на его стороне.

37. Устройство по одному из пп.24-36, содержащее дополнительно средства (4), обеспечивающие подачу содержащейся в резервуаре (1) текучей среды в реакционные камеры (13).

38. Устройство по п.37, в котором указанные средства подачи (4) содержат поршневое устройство (41) и текучая среда подается в реакционные камеры путхь увеличения давления.

39. Устройство по п.38, в котором средства подачи (4) содержат насос (41) и текучая среда подается в реакционные камеры путем восстановления давления после создания разрежения.

40. Устройство по п.39, в котором реакционные камеры (13) планшета (1) выполнены замкнутыми.

41. Способ амплификации нуклеиновой кислоты при помощи устройства по одному из пп.24-40, согласно которому производят по меньшей мере частичное заполнение резервуара (11) текучей средой, содержащей анализируемую пробу нуклеиновых кислот, а также все необходимые ингредиенты для реакции амплификации, за исключением праймеров, и, в случае необходимости, флуоресцентный интеркалятор нуклеиновых кислот; производят распределение указанной текучей среды по реакционным камерам (13) планшета (1), в которые заранее помещают праймеры и, в случае необходимости, один или несколько меченых зондов; приводят в действие средства (3) относительного перемещения между планшетом и нагревательным столиком для последовательного нагревания необходимое количество раз содержимого каждой реакционной камеры до двух, трех и более температур, определенных двумя, тремя и более зонами указанного нагревательного столика (2).

42. Способ амплификации по п.41, согласно которому на этапе распределения текучей среды по реакционным камерам (13) создают разрежение внутри планшета с последующим восстановлением давления.

43. Способ заполнения в режиме закрытой системы реакционных камер (13) планшета (1) по п.21, согласно которому по меньшей мере частично заполняют резервуар (11) текучей средой, соединяют планшет (1) со средствами (4) изменения давления и создают разрежение внутри планшета и восстанавливают давление.

Рисунок 1

 

Текст

Смотреть все

1 Настоящее изобретение относится к области генетики. Более конкретно настоящее изобретение касается устройства для амплификации нуклеиновых последовательностей-мишеней, реакционных планшетов, используемых в этом устройстве, и способов применения этого устройства. Задачей настоящего изобретения является,в частности, обнаружение и, в случае необходимости, количественная оценка в режиме реального масштаба времени последовательностей-мишеней нуклеиновых кислот в одной или нескольких пробах. Технология обнаружения нуклеиновых последовательностей-мишеней все чаще применяется во многих областях, и спектр применения этой технологии будет расширяться по мере того, как она будет становиться все более надежной, более экономичной и более быстрой. Так, в здравоохранении обнаружение некоторых последовательностей нуклеиновых кислот в некоторых случаях позволяет поставить надежный и быстрый диагноз вирусных или бактериальных инфекций. Точно так же, обнаружение некоторых генетических особенностей может позволить идентифицировать предрасположенность к некоторым болезням или поставить своевременный диагноз генетических или неоплазических заболеваний. Обнаружение нуклеиновых последовательностей-мишеней используют также в агропищевой промышленности, в частности для отслеживания происхождения продуктов, обнаружения присутствия генетически измененных организмов и их идентификации или для санитарного контроля пищевых продуктов. В способах обнаружения, основанных на нуклеиновых кислотах, практически постоянно применяется реакция молекулярной гибридизации между нуклеиновой последовательностьюмишенью и одной или несколькими комплементарными последовательностями указанной нуклеиновой последовательности-мишени. Эти способы имеют многочисленные варианты в виде известных специалистам методик под названием методики переноса (blot, dot blot,Southern blot, Restriction Fragment Length Polymorphism и т.д.) или в виде миниатюризированных систем, на которых предварительно закрепляют последовательности, комплементарные последовательностям-мишеням (биочипы). В рамках этих методик комплементарные нуклеиновые последовательности называют зондами. Другой вариант, который сам по себе может быть основой способа диагностирования или только дополнительным этапом в одной из вышеупомянутых методик (в частности, для повышения концентрации последовательностимишени и, как следствие, для повышения точности диагноза), состоит в амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Ранее были описаны многие методики, 004719 2 обеспечивающие специфическую амплификацию последовательности нуклеиновой кислоты,и самой распространенной из них является полимеразовая цепная реакция амплификации(ПЦР) или Polymerase Chain Reaction (PCR). В рамках этой последней методики нуклеиновые последовательности, комплементарные последовательностям-мишеням и называемые праймерами, используются для амплификации указанных последовательностей-мишеней. Реакции ПЦР подразумевают повторяемость циклов, число которых, в основном, колеблется от 20 до 50 и каждый из которых состоит из трех последовательных фаз, а именно: денатурация, гибридизация и удлинение. При этом первая фаза соответствует преобразованию двунитевых нуклеиновых кислот в однонитевые нуклеиновые кислоты, вторая фаза - молекулярной гибридизации между последовательностьюмишенью и комплементарными праймерами указанной последовательности и третья фаза удлинению комплементарных праймеров, гибридизированных с последовательностью-мишенью,при помощи ДНК-полимеразы. Эти фазы осуществляют при соответствующей температуре: как правило, при 95 С для денатурации, 72 С для удлинения и от 30 до 65 С для гибридизации, соответственно температуре гибридизации(Тm) используемых праймеров. Этапы гибридизации и удлинения можно также осуществлять при одинаковой температуре (как правило,60 С). Таким образом, ПЦР-реакция заключается в последовательном осуществлении повторяющихся термических циклов, при котором число молекул ДНК-мишени, выполняющей роль матрицы, теоретически удваивается на каждом цикле. В действительности, коэффициент полезного действия ПЦР меньше 100%, поэтому количество продукта Xn, полученное после n циклов, составляетXn=Xn-1(1+rn),где Xn-1 - количество продукта, полученного на предыдущем цикле, а rn - коэффициент полезного действия ПЦР на цикле n (0rn1). Если принять коэффициент полезного действия за постоянную величину, то есть одинаковым для каждого цикла, то в этом случае количество продукта Xn, полученного после n циклов из стартового количества Х 0, составляет(А) В действительности, коэффициент полезного действия r во время ПЦР-реакции уменьшается по причине нескольких факторов, таких как ограниченное количество по меньшей мере одного из реактивов, необходимых для амплификации, инактивация полимеразы при ее повторяющемся доведении до температуры 95 С или ее ингибирование образующимися при реакции пирофосфатами. По причине снижения КПД кинетика ПЦРреакции представляет собой сначала экспонен 3 циальную фазу (пока r остается постоянным),которая затем переходит в фазу плато, когда r уменьшается. Во время экспоненциальной фазы применимо вышеуказанное уравнение (А), которое может быть также записано в видеlog(Xn)=log(X0)+n log(1+r) Таким образом, в экспоненциальной фазе ПЦР кривая на логарифмической шкале соответствует количеству продукта и зависит от числа циклов, а пересечение наклонной прямой (1+r) с осью ординат соответствует значению, равному логарифму первоначальной концентрации. Следовательно, измерение в режиме реального времени количества полученного продукта может позволить узнать первоначальную концентрацию матрицы, что может найти широкое применение, например, для измерения вирусной нагрузки больного или для определения изменяемости транскриптомы. Как правило, проведение ПЦР-реакций требует реакционных объемов от 2 до 50 мкл и осуществляется в пробирках, микропробирках,капиллярах или в системах, известных из уровня техники под названием микропланшеты(блоки жестко соединенных между собой микропробирок). Каждый комплект пробирок или эквивалентных емкостей необходимо нагревать до трех температур, соответствующих различным фазам ПЦР, причем столько раз, сколько осуществляется циклов. Использование пробирок или подобных им систем требует от пользователя многократного манипулирования, чтобы приготовить столько пробирок и растворов (известных специалистам под названием mix PCR), сколько последовательностей-мишеней он собирается амплифицировать, даже на основе только одной пробы нуклеиновых кислот, за исключением способов мультиплексорной амплификации, позволяющих осуществлять амплификацию нескольких последовательностей одновременно в нескольких емкостях либо путем применения так называемых малоспецифических праймеров, которые могут гибридизироваться с несколькими последовательностями-мишенями, как, например, в методике RAPD - Random AmplifiedPolymorphism DNA, либо путем применения специфических праймеров, но в большем количестве, причем каждая используемая пара праймеров обеспечивает амплификацию одной последовательности-мишени. Такие мультиплексорные амплификации соответствуют частным случаям и не являются нормой. Более того, они не гарантируют отсутствия взаимодействия одной реакции амплификации с другой и, в частности, по причине возможной гибридизации между праймерами весьма ограничены числом последовательностей-мишеней, амплифицируемых в одной емкости. Необходимость таких манипуляций является причиной многих недостатков. 4 Во-первых, они являются трудоемкими. Во-вторых, они могут стать причиной контаминации одной пробирки от другой или от внешней окружающей среды (пыль, бактерии, аэрозоль или любой другой контаминирующий агент, который может содержать молекулы нуклеиновых кислот или молекулы, способные повлиять на эффективность реакции амплификации). Кроме того, они не обеспечивают однородности по объему и по концентрации реактивов от одной пробирки к другой. И, наконец,они требуют ручного манипулирования объемами, как правило, превышающими 1 мкл, что сказывается на стоимости реализации ПЦРреакций, поскольку реактивы являются дорогостоящими. Применение устройств, разработанных для частичной автоматизации таких манипуляций,позволяет устранить некоторые из этих недостатков. Однако такие автоматы являются относительно дорогими, и их применение оправдано экономически только в случае осуществления ПЦР-реакций в широком масштабе, например для сиквенирования геномов. Существуют также автоматы для реализации кинетических ПЦР-реакций. Как уже отмечалось выше, осуществление кинетической ПЦР требует специфического количественного анализа амплифицируемой последовательностимишени в режиме реального времени. Использование интеркалирующего флуоресцентного зонда в реакционной смеси позволяет измерить увеличение общего количества двунитевой ДНК в указанной смеси. Однако этот метод не позволяет дифференцировать амплификацию последовательности-мишени от фонового шума или от возможной неспецифической амплификации. В последнее время описано несколько зондовых систем, позволяющих производить специфическое измерение амплификации определенной последовательности-мишени. Они основаны на комплементарных олигонуклеотидах указанной последовательности и связаны с парами групп флуорофоров или групп флуорофоров/гасителей таким образом, чтобы гибридизация зонда со своей мишенью и последовательные амплификационные циклы приводили, в зависимости от варианта, к увеличению или уменьшению общей флуоресценции смеси пропорционально амплификации последовательности-мишени. В качестве примеров используемых зондов для реализации кинетических ПЦР можно указать систему TaqMan (ABI), систему AmpliSensor (InGen) и систему Sunrise (Oncor,Appligene). В настоящее время наибольшее распространение получила система TaqMan. Этот способ объединяет активности ДНКполимеразы и 5'3'-нуклеазы Taq-полимеразы во время ПЦР. Принцип способа заключается в следующем: дополнительно к двум праймерам последовательности, комплементарной подвер 5 гаемой количественному анализу мишени, в реакционную среду добавляют зонд, называемый репортерным зондом. Он обладает способностью гибридизации с мишенью в теле амплифицируемой последовательности, но сам не может амплифицироваться. Действительно, добавленная к концу 3' зонда фосфорильная группа препятствует его расширению Taq-полимеразой. В зонд вводят производное флуоресцина и производное родамина, соответственно к концам 5' и 3'. Зонд имеет небольшие размеры, поэтому производное родамина, находящееся вблизи флуоресцина, поглощает энергию, излучаемую флуоресцином, на который действует источник возбуждения (феномен гашения). После гибридизации праймеров с мишенью во время реакции расширения Taq-ДНКполимераза атакует зонд своей активностью 5'нуклеазы, высвобождая группу-гаситель и восстанавливая, таким образом, излучение флуоресценции. Интенсивность излучаемой флуоресценции пропорциональна в этом случае количеству образованных при ПЦР продуктов, что позволяет получить количественный результат. Излучаемая флуоресценция пропорциональна числу исходных молекул-мишеней. Кинетику развития флуоресценции можно наблюдать в режиме реального времени во время реакции амплификации. Преимуществом данной технологии является возможность ее автоматизации. КомпаниейPerkin-Elmer выпускается прибор ABI Prism 7700, позволяющий осуществлять данный способ. Этот прибор сочетает в себе термоциклер и флуориметр. Он может обнаруживать увеличение флуоресценции во время количественного теста по способу TaqMan благодаря оптическим волокнам, находящимся над каждой пробиркой и соединенным с камерой CCD, которая улавливает в реальном времени сигнал,излучаемый флуоресцентными группами, высвобождаемыми во время ПЦР. Количественные данные выводятся на основе определения цикла,на котором сигнал продукта акмплификации достигает некоторого порога, определяемого пользователем. Действительно, многочисленные исследования показали, что число циклов пропорционально количеству исходного материала(Gibson, Heid et al. 1996; Heid, Stevens et al. 1996; Williams, Giles et al. 1998). Сфера возможного применения такого прибора является достаточно широкой как в области здравоохранения, так и в агропищевой промышленности и в контроле качества. К сожалению, прибор ABI Prism 7700TM и несколько других приборов, выпускаемых в настоящее время конкурентами, являются чрезвычайно дорогими. Кроме того, они могут применяться только квалифицированным оператором. На практике такие приборы могут использоваться только в некоторых специализированных структурах. 6 Поэтому сегодня возникает насущная необходимость в системе амплификации нуклеиновых кислот, измеряемой, в случае необходимости, в режиме реального масштаба времени и не имеющей вышеуказанных недостатков, характерных для приборов предшествующего уровня техники. Объектом настоящего изобретения является система, позволяющая значительно сократить число манипуляций, необходимых для реализации методики амплификации множества последовательностей-мишеней, и, следовательно, сократить продолжительность такой операции. Другая задача настоящего изобретения заключается в разработке системы, сводящей к минимуму опасность контаминации одной емкости от другой. Еще одной задачей настоящего изобретения является разработка системы, позволяющей сократить объемы используемых реактивов и,следовательно, снизить себестоимость операции. Другая задача настоящего изобретения состоит в разработке системы, позволяющей оптимизировать равномерное по объему и концентрации распределение в емкостях реактивов,необходимых для реализации ПЦР. Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении всех потенциальных пользователей, в частности медицинских центров, медицинских лабораторий, лабораторий агропищевого комплекса и лабораторий санитарного контроля, простым в применении и обслуживании прибором для повседневного осуществления реакций амплификации нуклеиновых кислот с количественным анализом в режиме реального масштаба времени. В настоящей заявке используются несколько терминов, имеющих следующее значение: Реакция амплификации нуклеиновых кислот относится к любому известному специалистам методу амплификации нуклеиновых кислот. В качестве неограничительного примера можно указать полимеразовую цепную амплификацию (ПЦР), чаще обозначаемую специалистами английским акронимом PCR (Polymerasereplication), амплификация со сдвигом цепи или(ligase chain reaction). Исходной матрицей для амплификации может быть любой тип нуклеиновой кислоты: ДНК или РНК, геномная, плазмидная, рекомбинантная, с-ДНК, m-РНК, рибосомальная РНК,вирусная РНК или другие. Если исходной матрицей является РНК, то первый этап обратной транскрипции, как правило, осуществляют для получения ДНК-матрицы. Этот этап в данном тексте не описывается, так как специалистам хорошо известно, когда и как его осуществлять. Разумеется, что устройства в соответствии с 7 настоящим изобретением могут применяться для амплификации и, возможно, для специфической количественной оценки последовательностей как РНК, так и ДНК. Поэтому в дальнейшем в тексте термин ПЦР будет использоваться для обозначения собственно ПЦР, а также ОТ-ПЦР (Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction - обратная транскрипция - ПЦР). Среди вышеназванных реакций амплификации некоторые являются изотермическими. Другие, в частности ПЦР и ЛЦР, подразумевают циклическое доведение реакционной среды до различных температур. Такие реакции в данном тексте называются термозависимыми реакциями амплификации нуклеиновых кислот. Далее в тексте устройство в соответствии с настоящим изобретением будет, в основном, описано в рамках применения для ПЦР. Тем не менее, само собой разумеется, что это устройство не ограничивается применением в данной технологии и может быть использовано в любой реакции амплификации нуклеиновых кислот и даже для других энзиматических реакций и/или реакций в области молекулярной биологии. Это устройство, в частности, адаптировано для реакций, требующих небольших объемов реакционной среды и ее циклического перехода в различные температурные режимы, как это будет пояснено в дальнейшем. Одним из объектов настоящего изобретения является новое устройство для осуществления так называемых количественных реакций амплификации, то есть позволяющее определить концентрацию последовательности-мишени, первоначально присутствующей в реакционной среде. Ранее были описаны многие типы количественных реакций амплификации. Различают количественные амплификации, основанные на применении внешнего шаблона, конкурентные амплификации с использованием внутреннего шаблона и, наконец, кинетические амплификации, принцип которых упомянут выше и которые основаны на измерении в режиме реального масштаба времени увеличения количества последовательности-мишени. Этот тип амплификации будет обозначаться в данном тексте равнозначными терминами кинетическая амплификация (нуклеиновых кислот),кинетическая ПЦР, количественная амплификация (нуклеиновых кислот) в режиме реального масштаба времени или ПЦР в режиме реального масштаба времени. Термины в скобках иногда опускаются. В настоящей заявке термин реактив должен пониматься в широком смысле, как обозначающий любой элемент, необходимый либо для собственно реакции амплификации, либо для ее обнаружения. Согласно этому определению необходимыми для проведения ПЦР реактивами являются соли, dNTR, праймеры или полимераза. Точно так же флуоресцентный интеркалятор или зонд рассматриваются в данном 8 случае как реактивы, участвующие в обнаружения амплифицированных продуктов, хотя и не реагируют в буквальном смысле этого слова. Другие термины, обозначающие некоторые элементы устройства в соответствии с настоящим изобретением, будут определены ниже в подробном описания изобретения. Некоторые элементы устройства имеют цифровые ссылки на фигуры чертежей, иллюстрирующих несколько способов и вариантов, не ограничивающих рамки настоящего изобретения, где фиг. 1 представляет упрощенное изображение варианта выполнения устройства в соответствии с настоящим изобретением, вид сбоку; фиг. 2 - изображение, вид сверху, нагревательного столика, в случае, когда блоки (21-23) являются дисковыми секторами (фиг. 2 А), и в случае, когда они образованы зубчатыми секторами (фиг. 2 В); фиг. 3 - изображение в перспективе первого примера выполнения планшета (1), оснащенного реакционными камерами и частично средствами перемещения; фиг. 4 - изображение этого планшета в разрезе по линии АА; фиг. 5 - изображение, вид сверху, второго примера выполнения нижней части (цоколя) планшета в соответствии с настоящим изобретением. Размеры даны исключительно в качестве информации и не носят ограничительного характера; фиг. 6 - изображение нижней части планшета в разрезе по линии АА фиг. 5; фиг. 7 - вид сверху верхней части (крышки) планшета, показанного на фиг. 5 и 6; фиг. 8 - изображение этого планшета в разрезе по линии ВВ фиг. 7; фиг. 9 - изображение планшета в сборе,содержащего цоколь, показанный на фиг. 5 и 6(сплошная линия), и крышку, показанную на фиг. 7 (пунктирная линия); фиг. 10 - изображение трех образцов планшета, показанного на фиг. 9, над которым находятся средства возбуждения/измерения флуоресценции (5); фиг. 11 - изображение прямоугольного планшета и двух вариантов применения такого планшета. На фиг. 11 А показан планшет (1),содержащий 8 субрезервуаров (111-118) и 40 реакционных камер. На фигуре показаны только 5 каналов, сообщающихся с субрезервуаром 111, а также соответствующие реакционные камеры (13). На фиг. 11 В показано устройство в соответствии с настоящим изобретением, содержащее прямоугольный планшет (1) и нагревательный столик (2), состоящий из трех параллельных элементов (21-23). На фиг. 11 С элемент(22) смещен относительно других элементов; планшет должен, таким образом, перемещаться по треугольнику для осуществления циклов ПЦР; 9 фиг. 12 - схематическое изображение в разрезе канала (12) с устройством сброса нагрузки. В первую очередь, настоящее изобретение касается любого устройства для осуществления энзиматических и/или молекулярно-биологических реакций, для которых необходимы две разные температуры инкубации, отличающегося тем, что оно содержит по меньшей мере одну пластину или планшет (1), содержащий множество реакционных камер (13) и резервуар (11), при этом указанные реакционные камеры соединены с резервуаром каналами (12); по меньшей мере один нагревательный столик (2), содержащий по меньшей мере две отдельные зоны, которые могут нагреваться по меньшей мере до двух разных температур; средства (3) относительного перемещения между указанным планшетом и указанным столиком, обеспечивающие циклическое изменение температуры в реакционных камерах. Температура каждой зоны нагревательного столика может быть однородной или, в случае необходимости, варьироваться по градиенту. Многие типы молекулярно-биологических реакций требуют доведения реакционной смеси до различных значений температуры в зависимости от времени. Это происходит, например,когда требуется инактивировать энзим после его использования (например, рестрикционную нуклеазу), или для тестирования стабильности комплекса. В последнем случае комплекс (например, комплекс антиген/антитело или рецептор/лиганд), один из элементов которого связан с флуорофором, а другой - с гасителем флуоресценции, можно помещать в одну из реакционных камер устройства. В этом случае нагревательный столик программируют на несколько значений температуры в возрастающем порядке,в случае необходимости, в виде градиента. При этом стабильность комплекса тестируют, перемещая планшет по нагревательному столику таким образом, чтобы температура реакционной камеры повышалась постепенно, и наблюдая за увеличением флуросценции при помощи средств возбуждения/измерения флуоресценции, установленных напротив реакционной камеры. Увеличение флуоресценции в данном случае свидетельствует о распаде комплекса. Устройство в соответствии с настоящим изобретением предназначено, в частности, для осуществления реакций, требующих циклического изменения температуры реакционных камер, как в случае некоторых реакций амплификации нуклеиновых кислот, например для полимеразной цепной амплификации (ПЦР) или для лигазной цепной реакции (ЛЦР). Таким образом, настоящее изобретение касается, в частности, устройства для термозависимой цепной амплификации последовательно 004719 10 стей-мишеней нуклеиновых кислот, отличающегося тем, что оно содержит по меньшей мере один планшет (1), содержащий множество реакционных камер (13) и резервуар (11), при этом указанные реакционные камеры соединены с резервуаром каналами (12); по меньшей мере один нагревательный столик (2), содержащий по меньшей мере две отдельные зоны, которые могут быть доведены по меньшей мере до двух разных значений температур, соответствующих фазам циклов амплификации указанных нуклеиновых кислотмишеней; средства (3) относительного перемещения между указанным планшетом и указанным нагревательным столиком, обеспечивающие циклическое изменение температуры реакционных камер. Такая система в соответствии с настоящим изобретением является менее сложной по сравнению с системами из предшествующего уровня техники, поскольку температуры, необходимые для циклов цепной амплификации, обеспечиваются двумя отдельными зонами постоянных температур, а не нагревательным столиком,температуру которого необходимо изменять. Очень важно отметить, что осуществление термозависимых цепных реакций амплификации требует прохождения проб по меньшей мере через два температурных режима. Например,при ЛЦР на каждом цикле необходима фаза примерно при 95 С для денатурации ДНКмишени, затем фаза от 55 до 65 С (в зависимости от Тm зондов) для осуществления гибридизации/связывания. Что же касается ПЦР, то здесь для каждого цикла, как правило, предусмотрено три фазы, а именно: денатурация примерно при 95 С, гибридизация, температура которой зависит от Тm зондов, и удлинение,обычно осуществляемое при 72 С. Вместе с тем,возможно осуществление ПЦР с упрощенными циклами, в которых гибридизация и удлинение осуществляются при одной и той же температуре, поэтому для каждого цикла необходимы только две разные температуры. Возможно выполнение различных вариантов описанного выше устройства. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения система характеризуется следующими признаками: специфические праймеры амплифицируемых последовательностей-мишеней заранее распределены в реакционных камерах (13); резервуар (11) предназначен для наполнения текучей средой, содержащей, в частности,анализируемую пробу нуклеиновых кислот и реактивы, необходимые для полимеразной цепной амплификации, за исключением праймеров; нагревательный столик (2) содержит три отдельные зоны, которые могут доводиться до трех разных температур, соответствующих трем 11 фазам циклов полимеразной цепной амплификации. Согласно этому предпочтительному варианту текучую среду из резервуара, содержащую анализируемую пробу нуклеиновых кислот и необходимые для ПЦР реактивы, можно распределять в множество реакционных камер,содержащих специфические праймеры амплифицируемых последовательностей-мишеней нуклеиновых кислот, и осуществлять процесс амплификации, последовательно и многократно доводя содержимое реакционных камер до различных температур (то есть температур, необходимых для денатурации, гибридизации и удлинения), благодаря относительному движению между планшетом, содержащим указанные реакционные камеры, и указанным нагревательным столиком, содержащим две или три отдельные зоны, которые могут доводиться до разных температур. В случае необходимости реакционные камеры (13) могут содержать необходимые для ПЦР в режиме реального масштаба времени реактивы, отличные от вышеупомянутых праймеров. В предпочтительном варианте выполнения устройства в соответствии с настоящим изобретением реакционные камеры содержат дополнительно, кроме праймеров, один или несколько специфических зондов амплифицируемой последовательности. Распределение зондов в реакционных камерах может быть осуществлено таким образом, что некоторые камеры содержат специфические зонды амплифицируемых последовательностей, а другие камеры контрольные зонды, а priori не опознающие амплифицируемые последовательности. Эти зонды могут быть помеченными, и если в одной и той же реакционной камере присутствует несколько зондов (например, специфический зонд амплифицируемой последовательности и контрольный зонд), то эти зонды предпочтительно метят разными флуорофорами. В другом варианте устройства дополнительные реактивы, такие как dNTR или соли,изначально помещают в реакционные камеры. В этом случае эти реактивы отсутствуют или присутствуют в минимальном количестве в текучей среде, помещаемой в резервуар (11). В крайнем случае, все необходимые для ПЦР-реакции реактивы, за исключением матрицы, помещают в реакционные камеры (13), а помещаемая в резервуар (11) текучая среда содержит только пробу амплифицируемой ДНК (или РНК). Описанные варианты предполагают, что параллельно на одной пробе осуществляют несколько реакций с различными праймерами и/или зондами. В данном случае речь идет о характеризации одной пробы (или нескольких проб, если резервуар разделен на несколько субрезервуаров) по нескольким критериям. В некоторых случаях применения ставится задача характеризации множества проб по единствен 004719 12 ному критерию или по ограниченному числу критериев. Это происходит при исследованиях,когда требуется проверить банк фагов или бактерий на наличие данного гена. В этом случае необходимо провести ПЦР на большом количестве проб на основе данной пары праймеров. Устройство в соответствии с настоящим изобретением применимо и для такого типа манипуляций. Для этого пробы помещают в реакционные камеры (13). Праймеры могут вводиться в помещаемую в резервуар (11) текучую среду вместе с другими необходимыми для ПЦР реактивами. Разумеется, такая конфигурация не исключает предварительного помещения в реакционные камеры (13) некоторых реактивов, отличных от анализируемой пробы. Независимо от выбранного варианта устройства и от помещаемых в реакционные камеры (13) реактивов, они могут вводиться туда предпочтительно в виде жидкости с последующей сушкой. Подача текучей среды из резервуара (11) обеспечивает восстановление раствора этих реактивов. Помещаемое количество каждого реактива рассчитывают в зависимости от объема текучей среды, проникающего в каждую реакционную камеру (13), таким образом, чтобы восстановление раствора реактивов привело к требуемой конечной концентрации каждого из них. Вышеописанные планшеты, в которых по меньшей мере часть реакционных камер (13) содержит помещенные в них в виде жидкости реактивы с последующей сушкой таким образом, чтобы эти реактивы были восстановлены в виде раствора путем подачи в эти реакционные камеры текучей среды, также являются неотъемлемой частью настоящего изобретения. Преимуществом вышеописанного устройства является то, что оно позволяет одновременно заполнять все реакционные камеры, тем самым сокращается время на подготовку и уменьшается опасность контаминации одной камеры от другой. Преимуществом этого устройства является также то, что его можно миниатюризировать и что оно позволяет обойтись гораздо меньшими объемами реактивов, чем в предшествующем уровне техники. Наконец, следует также отметить, что благодаря предложенному в изобретении нагревательному столику обеспечивается возможность ускорения циклов ПЦР, так как для осуществления различных фаз (денатурации, гибридизации, удлинения) не требуется изменять температуру нагревательного столика или атмосферы,как в предшествующем уровне техники, поскольку относительное движение между планшетом и нагревательным столиком обеспечивает быстрое и последовательное доведение содержимого каждой из реакционных камер до трех разных температур, необходимых для каждой из этих фаз. Использование незначительных реакционных объемов, а также небольшая толщина пола планшета (1) позволяют ограничить 13 термическую инерцию на уровне реакционных камер и способствуют, таким образом, повышению скорости реакции. Настоящее изобретение касается также устройства для термозависимой цепной амплификации последовательностей-мишеней нуклеиновых кислот, измеряемой в режиме реального масштаба времени, отличающегося тем,что оно содержит те же элементы, что и любое из вышеописанных устройств, и дополнительно содержит оптические средства (5) возбуждения/измерения флуоресценции, установленные с возможностью возбуждения и измерения на каждом цикле флуресценции содержимого реакционных камер. Одним из оригинальных элементов вышеописанных устройств является элемент, называемый как реакционной пластиной, так и реакционным планшетом (1). Этот элемент может использоваться многократно или, что предпочтительнее, применяться в качестве расходного элемента и сам по себе является одним из аспектов настоящего изобретения. Таким образом,настоящее изобретение касается также реакционного планшета, содержащего несколько реакционных камер (13) и по меньшей мере один резервуар (11) и характеризующегося следующими признаками: каждая реакционная камера соединена с резервуаром каналом (12) с поперечным сечением в виде круга диаметром, меньшим 3 мм; емкость резервуара меньше 10 мл; расположение реакционных камер и каналов по отношению к резервуару позволяет распределять однородную текучую среду в реакционные камеры из резервуара. Диаметр каналов предпочтительно выбирают достаточно малым, чтобы воспрепятствовать перетеканию в реакционные камеры содержащейся в резервуаре текучей среды под действием ее тяжести, то есть избегать нерепродуктивного заполнения этих камер. Этот диаметр предпочтительно меньше или равен 0,2 мм. По поводу этого диаметра необходимо заметить, что сечение каналов предпочтительно выполняют круглым, но оно может иметь любую другую форму, в частности многоугольную, при этом диаметр каналов будет соответствовать их наибольшей ширине по сечению. Резервуар для пробы нуклеиновых кислот и необходимых для ПЦР реактивов может иметь различную емкость, например, составляющую примерно от 0,1 до 1 мл. Планшет предпочтительно содержит примерно от 20 до 500 реакционных камер и еще предпочтительнее от 60 до 100 реакционных камер. Объем этих камер может также меняться в зависимости от варианта выполнения. В предпочтительном варианте выполнения камеры имеют объем примерно от 0,2 до 50 мкл и еще предпочтительнее от 1 до 10 мкл. 14 В планшетах в соответствии с настоящим изобретением соединение между каналами (12) и резервуаром (11) предпочтительно выполнять по периферии резервуара, а дно указанного резервуара выполняют наклонным и/или выпуклым, чтобы обеспечивать распределение содержащейся в резервуаре текучей среды на уровне входа в каналы. Необходимо отметить, что планшет в соответствии с настоящим изобретением может иметь различные формы. Тем не менее, согласно предпочтительному варианту выполнения настоящего изобретения планшет имеет форму круга, при этом резервуар выполняют практически в центре планшета, реакционные камеры распределяют по кругу вокруг резервуара, а каналы, соединяющие резервуар с камерами,выполняют, в основном, врадиальном направлении. Такая архитектура обеспечивает оптимизацию заполнения реакционных камер из центрального резервуара. В частном варианте выполнения круговых планшетов в соответствии с настоящим изобретением дно резервуара (11) имеет коническую форму. Предпочтительно, чтобы указанные реакционные камеры были выполнены по периферии указанного планшета. Благодаря этому становится возможным оптимизировать число реакционных камер, которые могут быть выполнены на планшете и заполняться из центрального резервуара. Одним из преимуществ настоящего изобретения является возможность миниатюризации предлагаемого устройства. Так, в предпочтительном варианте выполнения планшет,имеющий геометрическую форму, образованную от вращения тела, имеет диаметр, составляющий примерно от 1 до 10 см. В качестве альтернативного варианта планшет в соответствии с настоящим изобретением может иметь форму, образованную от поступательного движения тела, при которой резервуар (11) выполнен на одной стороне указанного планшета, а реакционные камеры (13) выполнены в ряд на другой стороне планшета, при этом соединяющие резервуар с камерами каналы (12), в основном, параллельны друг другу. В этом случае такой планшет имеет, в основном,прямоугольную форму, за исключением некоторых выступов и/или впадин, предназначенных для соединения планшета со средствами, предназначенными для его приведения в движение. Пример такого планшета показан на фиг. 11 А. В таком варианте выполнения планшета дно резервуара (11) предпочтительно выполнять в виде наклонной плоскости, что позволяет направлять реакционную текучую среду к входу в каналы (12). В вышеописанных вариантах выполнения планшетов в соответствии с настоящим изобретением, независимо от их геометрической фор 15 мы, резервуар (11) делится на 2-20, предпочтительно на 2-8 субрезервуаров, что позволяет одновременно производить анализ нескольких проб на одном планшете. В этом случае каждая из реакционных камер (13) соединяется каналом(12) только с одним из этих субрезервуаров. Пример этого варианта выполнения показан на фиг. 11 А. Показанный на этой фигуре планшет содержит восемь субрезервуаров, обозначенных позициями 111-118, при этом каждый из этих субрезервуаров соединен с пятью реакционными камерами (13) через пять каналов (12). На этой фигуре показаны только каналы, соединенные с субрезервуаром 111. В связи с этим очень важно отметить, что в предшествующем тексте, а также в дальнейшем под резервуаром(11) следует понимать как весь резервуар (11),так и субрезервуар. Глубина реакционных камер (относительно каналов) может также меняться в зависимости от вариантов выполнения настоящего изобретения. Согласно предпочтительному варианту эти камеры имеют глубину, составляющую примерно от 0,5 до 1,5 мм. Кроме того, следует заметить, что толщина планшета зависит от нескольких факторов, и в частности от материала, из которого он изготовлен. На практике, этот планшет предпочтительно выполняют из пластмассы, предпочтительно из поликарбоната, физические, оптические и термические свойства которого соответствуют условиям осуществления настоящего изобретения. Толщина планшетов в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно должна составлять от 0,5 до 5 мм. Для улучшения теплообмена между содержимым реакционных камер и нагревательного столика толщина его крышки предпочтительно должна быть минимальной. Эта толщина зависит от материала планшета. В предпочтительном варианте выполнения она составляет от 0,05 до 0,5 мм, например приблизительно 0,25 мм. Предпочтительно, чтобы реакционные камеры планшетов в соответствии с настоящим изобретением были закрыты прозрачной верхней стенкой (17), например из прозрачного пластика, для обеспечения нормальных условий для возбуждения и измерения флуоресценции реакционной среды. В частном варианте выполнения изобретения камеры оснащены вентиляционной трубкой(открытая система), обеспечивающей удаление содержащегося в них воздуха во время заполнения текучей средой из резервуара. В случае, если камеры (13) оснащены вентиляционными трубками (14), то каналы (12) предпочтительно должны состоять по меньшей мере из двух частей разного диаметра (121 и 122), при этом диаметр второй части (122) меньше диаметра первой части (121) для создания сброса нагрузки в канале (12). Так, если один канал заполняется быстрее другого под 16 действием давления, явление сброса нагрузки позволяет остановить распространение текучей среды в канале или каналах, первая часть (121) которых уже заполнена, до момента, когда все каналы будут заполнены одинаково. Тем самым обеспечивается предварительное калибрование объемов для каждого канала, чтобы обеспечить равномерное заполнение разных реакционных камер. Эта вторая часть (122) канала может быть выполнена, например, в виде стеклянного капилляра гораздо меньшего диаметра, чем первая часть (121), при этом указанный капилляр включен в пластиковый планшет. Можно также предусмотреть полости (15),с которыми сообщаются вентиляционные трубки (14) реакционных камер. Эти полости имеют отверстие (16), выходящее наружу планшета(открытая система), которое, с одной стороны,позволяет рекуперировать без загрязнения возможные излишки текучей среды, которые могут выходить из реакционных камер через вентиляционные трубки (14), и, с другой стороны, может закрываться после заполнения реакционных камер. Такое закрытие можно выполнить, например, при помощи адгезивной ленты, и оно позволяет перейти к закрытой системе для осуществления собственно амплификации. Это позволяет избежать или по меньшей мере ограничить испарение содержащейся в планшете (1) текучей среды. Данный вариант выполнения настоящего изобретения подробно описан в примере 3 и показан на фиг. 11 А и 12. В качестве альтернативы можно работать в закрытой системе сразу же после заполнения реакционных камер, создавая в планшете разрежение с последующим восстановлением давления, как будет подробно пояснено ниже. Планшеты, в которых реакционные камеры не содержат никакого другого отверстия, кроме впускного канала (12) (так называемые закрытые реакционные камеры), также являются частью настоящего изобретения. Вышеописанные планшеты, предназначенные для применения либо в режиме открытой системы, либо в режиме закрытой системы,предпочтительно должны содержать отверстие,выполненное соответственно средствам (4) изменения давления в резервуаре (11), обеспечивающим перемещение содержащейся в резервуаре текучей среды к реакционным камерам. Настоящее изобретение касается способа заполнения в режиме закрытой системы реакционных камер (13) планшета (1), описанного в предыдущих параграфах, в варианте, когда реакционные камеры являются закрытыми, при этом указанный способ содержит следующие этапы: по меньшей мере, частичное заполнение резервуара (11) текучей средой; соединение планшета (1) со средствами (4) изменения давления; 17 создание разрежения внутри планшета с последующим восстановлением давления. В одном из вариантов выполнения планшетов в соответствии с настоящим изобретением каждый канал (12) оснащен полостью отсечки на уровне его соединения с резервуаром (11),при этом указанная полость отсечки образована практически вертикальным участком канала,имеющим диаметр, равный диаметру канала(12) или превышающий его. Такой вариант имеет два преимущества. Во-первых, эти полости отсечки позволяют предотвратить встречную контаминацию в случае непредвиденного возврата текучей среды в сторону резервуара (11) или в случае, когда не вся текучая среда попала в каналы. Во-вторых, наличие этих полостей позволяет предусмотреть для устройств в соответствии с настоящим изобретением пробку,зубцы которой заходят в эти вертикальные отверстия, чтобы закрыть каналы после направления реакционной среды, но до проведения реакции амплификации. Это позволяет работать в режиме абсолютно закрытой системы и предотвратить любую опасность контаминации или испарения. Тем не менее, необходимо отметить,что полости отсечки и пробка на уровне резервуара для закупоривания входных отверстий канала со стороны резервуара могут применяться также и в случае вышеописанных открытых систем, в которых реакционные камеры оснащены вентиляционными трубками. В предпочтительном варианте выполнения планшетов в соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере часть реакционных камер (13) содержит олигонуклеотиды. В еще более предпочтительном варианте каждая из реакционных камер (13) содержит два специфических праймера амплифицируемой последовательности нуклеиновой кислоты и, факультативно, один или несколько специфических меченых зондов указанной последовательности. Такой зонд может быть помечен таким образом,чтобы его сигнал усиливался при его гибридизации с его последовательностью (система Sunrise), или таким образом, чтобы удлинение от одной нити, с которой он гибридизируется, приводило к ослаблению или усилению сигналаTaqMan). Наличие таких зондов в реакционных камерах позволяет осуществлять количественно определяемые в реальном масштабе времени амплификации при помощи вышеописанного устройства в соответствии с настоящим изобретением, содержащего средства (5) возбуждения/измерения флуоресценции. Можно также использовать неспецифические контрольные зонды амплифицируемой последовательности,помеченные иначе, чем специфические зонды,для выявления возможной контаминации. В вышеописанном варианте выполнения настоящего изобретения, в котором реакционные камеры содержат праймеры и, факульта 004719 18 тивно, один или несколько зондов, эти различные праймеры и зонды предпочтительно выбирают с близкими по значению соответственными температурами плавления (Тm). В частности,Тm различных праймеров предпочтительно должна находиться в одном интервале, составляющем примерно 5 С. Точно так же, различные зонды должны иметь Тm, находящуюся в таком же интервале 5 С, который может отличаться от интервала Тm праймеров. В этом случае зонды выбирают таким образом, чтобы их Тm превышала Тm праймеров, при этом разница между Тm различных категорий олигонуклеотидов предпочтительно составляет порядка 5 С. Выбранная для амплификации температура гибридизации соответствует в этом случае самой низкой из температур плавления праймеров. Реакционные камеры (13) планшетов в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать, кроме возможных праймеров и зондов, один или несколько реактивов, необходимых для проведения ПЦР-реакции или для измерения амплификации. Речь может идти,например, о солях, dNTR или о флуросцентном интеркаляторе двунитевой ДНК, типа SybrGreen(зарегистрированный товарный знак). Как было упомянуто выше, все эти реактивы предпочтительно вводятся на уровне реакционных камер(13) в виде жидкого раствора, а затем подвергаются сушке. Согласно альтернативному варианту выполнения планшетов в соответствии с настоящим изобретением планшеты предусмотрены для тщательной проверки большого количества проб по ограниченному числу критериев. Это значит, что пользователь может легко вводить эти пробы в каждую из реакционных камер (13). Для этого планшет может содержать, например, съемную крышку, при снятии которой можно получить доступ непосредственно к реакционным камерам. Такие планшеты могут быть заранее заполнены на уровне реакционных камер (13) одним или несколькими реактивами, необходимыми для амплификации и/или их выявления. Разумеется, вышеупомянутые устройства в соответствии с настоящим изобретением могут содержать один или несколько планшетов, соответствующих вышеописанным планшетам. В частном варианте выполнения устройства в соответствии с настоящим изобретением, в котором планшеты выполняют круглыми, отдельные нагревательные зоны нагревательного столика (2) предпочтительно распределены по участкам диска (фиг. 2 А) или венца (фиг. 2 В). Каждый участок может нагреваться до определенной температуры, чтобы последовательно доводить до разных требуемых температур содержимое реакционных камер, благодаря средствам (3) относительного перемещения между планшетом (1) и нагревательным столиком (2). Для того чтобы ограничить проблемы испарения и конденсации в планшете (1), термоблоки 19 предпочтительно должны быть выполнены достаточно широкими, чтобы нагревать также часть каналов, как показано, например, на фиг. 11, в рамках варианта прямоугольного планшета. Необходимо отметить, что число отдельных нагревательных зон может быть равным двум, трем и более. Например, в случае двухтемпературной ПЦР нагревательный столик может иметь зону нагрева до 95 С для денатурации двунитевых нуклеиновых кислот и зону нагрева до 60 С для гибридизации праймеров и удлинения. В случае трехтемпературной ПЦР нагревательный столик содержит зону нагрева до 95 С (денатурация), зону нагрева до 40-70 С(гибридизация праймеров) и зону нагрева до 72 С (удлинение). Наконец, нагревательный столик может иметь более трех зон, например,для временного блокирования реакции в заданный момент каждого цикла. Нагревательный столик может также содержать число зон, кратное двум или трем, чтобы один оборот планшета соответствовал нескольким ПЦР-циклам. Наконец, необходимо отметить, что относительный размер различных нагревательных зон выбирают пропорционально продолжительности инкубации, необходимой для реакционной среды, при температуре нагрева указанной зоны. Так, в показанном на фиг. 2 В планшете термоблок 21, предназначенный для осуществления этапа денатурации, имеет поверхность, в 2 раза меньшую поверхности термоблоков, предназначенных для этапов гибридизации и удлинения (соответственно блоки 22 и 23) . Выбирая относительную скорость вращения планшета на нагревательном столике таким образом, чтобы оборот в 360 осуществлялся за 150 с, получают циклы, в которых денатурация длится 30 с, гибридизация - 1 мин и удлинение - 1 мин. Говоря о средствах перемещения, необходимо отметить, что в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения настоящего изобретения нагревательный столик (2) выполняют неподвижным, а планшет (1) перемещается при помощи средств перемещения (3). Тем не менее, в других вариантах выполнения можно выполнять планшет неподвижным, а нагревательный столик подвижным под действием указанных средств перемещения. Согласно предпочтительному варианту выполнения настоящего изобретения, в котором планшет выполняют круглым, средства перемещения (3) обеспечивают вращение указанного планшета и/или указанного нагревательного столика. Между планшетом и нагревательным столиком можно предусмотреть направляющий промежуточный элемент. Однако согласно предпочтительному варианту выполнения указанный планшет находится в непосредственном контакте с указанным нагревательным столиком. В этом случае указанный нагревательный столик предпочтительно должен содержать по 004719 20 крытие, способствующее перемещению между указанным планшетом и указанным нагревательным столиком. Такое покрытие может быть выполнено, например, из материала типа Teflon(зарегистрированный товарный знак). Как уже отмечалось, нагревательный столик системы может содержать по меньшей мере две зоны, которые могут нагреваться до разных температур. Предпочтительно, чтобы нагревательный столик состоял из двух или трех независимых отдельных термоблоков (термоблоки), соединенных со средствами программирования их температуры. В случае, когда нагревательный столик содержит три термоблока (2123), первый из этих термоблоков (21) нагревают до температуры денатурации, второй (22) - до температуры гибридизации, третий (23) - до температуры удлинения. Использование таких термоблоков постоянной температуры упрощает выполнение нагревательного столика. Форма выполнения средств относительного перемещения планшета по отношению к нагревательному столику может быть самой различной. Согласно предпочтительному варианту выполнения, показанному на фиг. 10, планшет(1) содержит на своей нижней части центральную выступающую часть (181), содержащую вырез (182), при этом выступающая часть (181) заходит в нагревательный столик (2) и соединяет планшет (1) со средствами перемещения (3) на уровне поводка или пальца (32), приводимого в движение микродвигателем (31). Благодаря этому выступающая часть (181) обеспечивает, с одной стороны, позиционирование планшета по отношению к нагревательному столику (2), как показано на фиг. 2 В, и, с другой стороны, обеспечивает его соединение с приводными средствами (3). Согласно альтернативному варианту выполнения, показанному на фиг. 1 и 3, планшет содержит по меньшей мере одну проушину(183), а средства перемещения (3) содержат по меньшей мере один палец (32), взаимодействующий с указанной проушиной для придания указанному планшету вращательного движения. Вариант относительного перемещения между планшетом и нагревательным столиком может меняться в зависимости от вариантов выполнения. Речь может идти о непрерывном перемещении с постоянной скоростью или о прерывистом движении. Скорость перемещения может быть постоянной или изменяться со временем. В случае прямоугольного планшета предпочтительно, чтобы перемещение планшета относительно нагревательного столика (2) было поступательным, как описано на примере 3 и показано на фиг. 11. Предпочтительно, чтобы система в соответствии с настоящим изобретением содержала также оптические средства возбуждения/измерения флуоресценции, выполненные, например, 21 над указанным планшетом или на одной из его сторон. Согласно предпочтительному варианту выполнения настоящего изобретения эти средства образуют единую неподвижную систему. Преимуществом предпочтительного варианта выполнения изобретения, согласно которому планшет выполняют круглым и приводят во вращательное движение, является то, что можно последовательно подводить каждую реакционную камеру под указанную оптическую систему, что значительно упрощает выполнение. Система определения местонахождения, установленная, например, на планшете (1), позволяет в любой момент определить, какая из реакционных камер находится напротив оптической системы. Средства подачи находящейся в резервуаре текучей среды к указанным реакционным камерам могут быть выполнены различной формы. Как было описано выше, средства направления текучей среды к реакционным камерам могут различаться по двум категориям: направление в режиме открытой системы, предполагающем увеличение давления на уровне резервуара и наличие вентиляционных трубок (14) на уровне реакционных камер, и направление в режиме закрытой системы, начинающемся с установления разрежения в планшете (1) с последующим восстановлением давления. Средства (4) подачи текучей среды в реакционные камеры различаются в зависимости от выбранного варианта выполнения. Так, в открытой системе содержащаяся в резервуаре текучая среда распределяется под давлением по реакционным камерам таким образом, чтобы обеспечить равномерное заполнение этих камер. В этом случае средства (4) подачи предпочтительно содержат поршневое устройство (41), при этом скорость проникновения поршня в резервуар рассчитывают таким образом, чтобы обеспечить нормальное заполнение реакционных камер. В альтернативном варианте эти средства подачи содержат насос, подключенный с возможностью увеличения давления в резервуаре (11). Как уже указывалось, другой предпочтительный вариант выполнения изобретения предполагает работу в режиме закрытой системы. В этом случае содержащаяся в резервуаре текучая среда распределяется по реакционным камерам следующим образом: на первом этапе создают разрежение внутри планшета при помощи поршневого устройства или насоса (42),подключенного в данном случае с возможностью понижения давления в планшете (1). После этого давление восстанавливают, что позволяет текучей среде попадать в каналы и заполнять периферические реакционные камеры. Настоящее изобретение касается также любого способа амплификации нуклеиновой кислоты при помощи вышеописанной системы,отличающегося тем, что он содержит следующие этапы: 22 по меньшей мере, частичное заполнение резервуара (11) текучей средой, содержащей анализируемую пробу нуклеиновых кислот, а также все необходимые ингредиенты для осуществления реакции амплификации, за исключением праймеров, и, факультативно, флуоресцентный интеркалятор нуклеиновых кислот; распределение указанной текучей среды по реакционных камерам, выполненным в планшете (1), в которые заранее помещены праймеры и,факультативно, один или несколько специфических меченых зондов нуклеиновой последовательности-мишени; приведение в действие средств относительного перемещения между планшетом и нагревательным столиком для последовательного приведения требуемое количество раз содержимого каждой камеры до определенных температур при помощи двух, трех и более зон указанного нагревательного столика. В варианте упомянутого способа реактивы,необходимые для реакции амплификации и/или для обнаружения продуктов амплификации и отличающиеся от праймеров и зондов, заранее распределяются в реакционных камерах (13) планшета (1). В этом случае помещаемая в резервуар (11) текучая среда не содержит этих реактивов. Этап распределения текучей среды по реакционным камерам (13) осуществляют либо путем создания разрежения внутри планшета с последующим восстановлением давления (закрытая система), либо путем повышения давления на уровне резервуара (11), при условии, что реакционные камеры оснащены вентиляционными трубками (открытая система). Сущность настоящего изобретения, а также его преимущества будут более понятны из нижеследующего описания нескольких неограничительных вариантов его выполнения и прилагаемых фигур. Пример 1. Упрощенный способ реализации устройства в соответствии с настоящим изобретением. Показанная на фиг. 1 система обнаружения и количественной оценки нуклеиновых последовательностей-мишеней содержит круглый пластиковый планшет, имеющий толщину 2 мм и диаметр 5 мм. Этот планшет (1) оснащен резервуаром (11) и будет подробно описан ниже со ссылками на фиг. 3 и 4. В рамках настоящего варианта выполнения емкость резервуара составляет 400 мкл. Его пол выполнен плоским,но при этом следует отметить, что в других вариантах выполнения он может быть выпуклым для обеспечения перетекания текучей среды к реакционным камерам без образования воздушных пузырьков, в частности, в конце подачи,когда резервуар оказывается почти пустым. Кроме того, система содержит нагревательный столик (2), непосредственно соприкасающийся с нижней стороной планшета (1), и 23 средства перемещения (3) планшета по отношению к нагревательному столику (2). Эти средства перемещения содержат микродвигатель (31),соединенный с двумя пальцами (32), взаимодействующими с двумя проушинами (183) планшета (1), для придания последнему вращательного движения на нагревательном столике (2), который остается неподвижным. Описанная система содержит также поршень (41), предназначенный для взаимодействия с указанным резервуаром (11), а также оптическое устройство (5) для возбуждения/измерения флуоресценции (источник излучения,обеспечивающий возбуждение на данной программируемой длине волны, и приемник излучаемой флуоресценции), выполненное неподвижным и установленное над планшетом (1) и нагревательным столиком (2). Как показано на фиг. 2 А, нагревательный столик (2) состоит из трех металлических блоков (21, 22 и 23) (в дальнейшем называемых термоблоками) в виде участков диска. Необходимо отметить, что в данном варианте выполнения эти термоблоки имеют практически одинаковые размеры, но в других вариантах выполнения они могут иметь разные размеры, при этом под размером понимается занимаемая угловая поверхность в верхней проекции. Каждый термоблок (21, 22 и 23) выполнен с возможностью нагрева до постоянной и программируемой температуры, соответствующей одной из фаз (денатурации, гибридизации или удлинения) амплификационных циклов (ПЦР), то есть соответственно 94 С для денатурации, 72 С для удлинения и от 30-40 до 65-70 С для гибридизации в соответствии с Тm (температурой гибридизации) используемых праймеров. Температура термоблоков может контролироваться любыми известными специалистам средствами. Как показано на фиг. 3, планшет (1) оснащен центральным резервуаром (11) емкостью 400 мкл, соединенным с 36 реакционными камерами (13) таким же количеством каналов (12),равномерно распределенных по всей периферии планшета (на фиг. 3 показаны не все каналы и камеры, а только некоторые из них). Эти реакционные камеры (13) содержат, кроме того, вентиляционные трубки (14), выходящие на край планшета (1). В данном варианте выполнения каналы имеют диаметр 0,2 мм, а объем реакционных камер составляет 2,5 мкл. В других вариантах выполнения эти диаметр и объем могут быть другими. Как уже уточнялось, данный планшет (1) оснащен также двумя проушинами (183), в каждой из которых выполнено отверстие для пальца(32), соединенного с микродвигателем (31). На фиг. 4 реакционные камеры имеют глубину 1 мм. Их пол имеет толщину порядка 0,2 мм. Эта толщина достаточно мала, чтобы способствовать нормальному теплообмену между камерами (13) и термоблоками (21, 22 и 23). Эти ре 004719 24 акционные камеры (13) закрыты в верхней части прозрачной стенкой (17), образующей также стенку резервуара (11). Показанное устройство применяется следующим образом. Центральный резервуар (11) предназначен для размещения анализируемой пробы нуклеиновых кислот, а также всех необходимых ингредиентов для реакции амплификации и, факультативно, флуоресцентного интеркалятора нуклеиновых кислот (весь комплекс в дальнейшем называется текучей средой), за исключением заранее помещенных в каждую периферическую реакционную камеру 10 праймеров. В рамках данного варианта выполнения пользователь помещает в центральный резервуар 90 мкл (то есть 36 раз по 2,5 мкл) текучей среды, в том числе 75 нг нуклеиновых кислот. Концентрация реактивов в указанной текучей среде составляет:SybrGreen (зарегистрированный товарный знак): 1 х Н 2 О: специфическое количество Каждая реакционная камера 10, за исключением нескольких камер для отрицательных контрольных образцов, содержит два специфических праймера амплифицируемой последовательности-мишени и, факультативно, один или несколько меченых зондов, обеспечивающих дальнейшее специфическое измерение флуоресценции. В данном варианте выполнения в каждую камеру распределено по 10 нг каждого праймера, за исключением камер для отрицательных контрольных образцов. После частичного заполнения резервуара(11) текучей средой, объем которой равен сумме объемов камер (объем камеры определяют как произведение площади пола на ее глубину),приводят в действие поршень (41) для распределения этой текучей среды по всем реакционным камерам (13). Этот поршень обеспечивает увеличение давления внутри резервуара (11) и подачу текучей среды через каналы к камерам. Скорость перемещения поршня в резервуаре составляет примерно 1 мм/с, и это перемещение прекращается на уровне, зависящем от объема направляемой в камеры текучей среды. Малый диаметр каналов (12) препятствует распространению текучей среды из резервуара(11) к каналам (12) и камерам (13) под действием силы тяжести (в таком масштабе обычно не принимаемые в расчет процессы, такие как силы капиллярности, становятся ощутимыми и в данном случае могут удерживать текучую среду в резервуаре). Благодаря наличию вентиляционных трубок (14) присутствующий в камерах (13) воздух удаляется, и тем самым обеспечивается их заполнение. 25 Термоблоки (21, 22, 23) нагревают до трех температур, соответствующих трем температурам фаз ПЦР (или чуть более высоким температурам с учетом возможных тепловых потерь между нагревательным столиком (2) и планшетом (1, и приводят в действие средства (3) перемещения для приведения планшета (1) во вращательное движение, чтобы каждая реакционная камера прошла необходимое количество раз над тремя термоблоками. В частности, блок (21) доводят до температуры, соответствующей фазе денатурации(94 С), термоблок (22) доводят до температуры,соответствующей фазе гибридизации (36 С), а термоблок (23) доводят до температуры, соответствующей фазе удлинения (72 С). В настоящем варианте выполнения микродвигатель (31) средств (3) перемещения выполнен с возможностью обеспечения поворота планшета (1) на 10 каждые 2,5 с (то есть один ПЦР-цикл за 1,5 мин). Однако в других вариантах выполнения движение может осуществляться с другой скоростью и быть не прерывистым,а непрерывным. Следует заметить, что над соответствующим блоком 23, нагреваемым до температуры,соответствующей температуре удлинения, установлено оптическое устройство (5), в частности в месте, соответствующем концу фазы удлинения. Разумеется, оптическое устройство (5) может быть установлено и в другом месте, выбираемом, в частности, в зависимости от применяемого химического процесса. Например, при использовании химической технологии TaqMan или неспецифической флуоресценции логично производить измерение в конце фазы удлинения,как было описано выше. Применение же химической технологии типа Molecular Beacons предполагает, что измерение производится в момент гибридизации. Представленная система обеспечивает быстрое и воспроизводимое заполнение большого числа реакционных камер и позволяет проводить на их содержимом ПЦР-реакции и измерения флуоресценции на каждом ПЦР-цикле. Описанный вариант выполнения ни в коем случае не ограничивает объема изобретения. Не выходя за рамки изобретения, в него можно вносить любые модификации. Пример 2. Усовершенствованный круглый планшет. На фиг. 5-10 представлен пример круглого планшета с некоторыми изменениями по сравнению с планшетом, представленным в примере 1. Этот планшет предусмотрен для работы в режиме закрытой системы, то есть единственным отверстием реакционных камер (13) является только вход каналов (12). Планшет состоит из двух соединенных друг с другом в паз элементов: нижней части или цоколя, показанного на фиг. 5 и 6, и верхней части или крышки, по 004719 26 казанной на фиг. 7 и 8. Соединение двух элементов показано на фиг. 9 и 10. Загрузка этого планшета производится следующим образом. Пользователь помещает в центральный резервуар анализируемую пробу нуклеиновых кислот. Расходную часть он помещает в автомат. Последний создает внутри планшета разрежение (Р 0,05 бар), например, при помощи насоса (42). После этого давление восстанавливается, что позволяет текучей среде проходить по каналам и заполнять периферические реакционные камеры. Таким образом, если сравнивать этот вариант с представленным в примере 1 устройством, текучая среда направляется не давлением, а разрежением, поэтому в данном случае не требуется наличия вентиляционных трубок и можно работать в режиме закрытой системы. В случае необходимости можно предусмотреть наличие нескольких субрезервуаров вместо одного резервуара, что позволяет одновременно обрабатывать несколько проб. Дно резервуара имеет коническую форму,что позволяет текучей среде распределяться по периферии, то есть вблизи входа в каналы. На соединении между каналами и резервуаром выполнена система отсечки, образованная вертикальным участком (123) канала, что, с одной стороны, препятствует встречной контаминации в случае непредвиденного возврата текучей среды в центральную часть или в случае, когда в канал попадает не вся текучая среда, и, с другой стороны, сразу после подачи текучей среды, но до проведения ПЦР позволяет закупорить каналы при помощи пробки, зубцы которой входят в эти вертикальные входы, для работы в режиме закрытой системы (одновременно устраняется опасность контаминации и испарения). Планшет выполнен из пластика, предпочтительно из поликарбоната, так как этот полимер обладает оптимальными физическими, оптическими и термическими свойствами. В сечении каналы имеют, например, размер 0,4 х 0,2 мм (полумесяц). Размер расходной части равен, например,100 мм (диаметр), число камер равно 80, а число субрезервуаров - от 1 до 8. Как показано на фиг. 10, на нижней стороне планшет (1) содержит выступающую центральную часть (181), содержащую вырез (182),при этом выступающая часть (181) входит в нагревательный столик (2) и соединяет планшет(1) со средствами перемещения (3) на уровне поводка или пальца (32), приводимого в движение от микродвигателя (31). Таким образом, выступающая часть (181), с одной стороны, обеспечивает позиционирование планшета по отношению к нагревательному столику (2), показанному на фиг. 2 В, и, с другой стороны, обеспечивает его соединение с приводными средствами (3). 27 В реакционные камеры помещают специфические праймеры последовательностеймишеней и, в случае необходимости, зонды типа TaqMan или другие специфические зонды указанных мишеней. В зависимости от вариантов применения, мишени могут быть вирусными или бактериальными генами, соединениями между геном-мутантом и геномой растения для определения некоторых OGM. Вышеописанный вариант планшета, содержащий 38 реакционных камер объемом 8 мкл и каналы диаметром 0,3 мм, применяют для осуществления теста определения бактерийSalmonella. В центральный резервуар помещают 288 мкл (38 раз по 8 мкл) следующего раствора:SybrGreen (зарегистрированный товарный знак): 0,1 х Геномная ДНК Salmonella enteritidis: 1 нг Н 2O: специфическое количество 1,6 пикомоль праймеров FinA1 и FinA2,описанных в Cohen, Mechanda et al. 1996, помещают в реакционные камеры. Этот опыт, как и ожидалось, дал положительные результаты. Пример 3. Прямоугольный планшет. В этом примере, иллюстрируемом фиг. 11,резервуар не является центральным, а боковым, и движение планшета не обязательно является вращательным, а может быть поступательным. Способ направления и закрытия может быть идентичным варианту с круглым планшетом, описанному в примере 2. В альтернативном варианте выполнения текучая среда может направляться путем увеличения давления. Она входит в первую часть канала (121), сумма объемов которого должна быть несколько меньше объема анализируемой пробы (пробы нуклеиновых кислот). Вторая часть канала (122) образована стеклянным капилляром гораздо меньшего диаметра, включенным в пластиковую систему, как показано на фиг. 12. Она должна создавать явление, называемое сбросом нагрузки, обеспечивая равномерное заполнение первой части каналов (если один канал заполняется быстрее, чем другой, во время увеличения давления, при этом данное явление позволяет прекратить дальнейшее продвижение текучей среды в заполненном канале или каналах, пока не будут заполнены другие каналы). Это обеспечивает предварительное калибрование объемов для каждого канала и,следовательно, равномерное заполнение различных камер (13), расположенных ниже по потоку. На конце камер выполнены вентиляци 004719 28 онные трубки, сообщающиеся, в свою очередь,с полостями (15), выполненными в верхней части, которые, с одной стороны, позволяют извлечь, не опасаясь загрязнения, возможные излишки текучей среды, которая может выходить через указанные вентиляционные трубки, и, с другой стороны, могут быть закрыты адгезивной лентой для предотвращения испарения. Объем (и форма) камер идентичны объему и форме первой части каналов. Каналы имеют диаметр 0,4 мм, то есть их число составляет один канал на миллиметр, если расстояние между двумя каналами равно 0,6 мм. Так, планшет длиной 8 см содержит 80 камер. Для закрытия канала на уровне резервуара существуют две возможности. Первая состоит в применении, как показано в примере 2, зубчатой пробки. В этом случае указанная пробка и увеличивающий давление поршень являются одной и той же деталью. Поэтому необходимо предусмотреть открывание поршня (полого) между этапом направления текучей среды под давлением и этапом закрытия, чтобы закрытие не вызвало нового увеличения давления, которое может привести к распространению текучей среды за пределы реакционных камер. Вторая возможность состоит в размещении масла (сверх штатного объема) над текучей средой. Поэтому после заполнения камер каналы 1210, по меньшей мере, частично заполняются маслом, препятствующим контаминации и испарению. БиблиографияPCR, In F; Ferre (Ed.), Gene Quantification, Birkhauser, Boston. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Реакционный планшет, содержащий несколько реакционных камер (13) и по меньшей мере один резервуар (11), при этом каждая реакционная камера соединена с резервуаром при помощи канала (12) с поперечным сечением в виде круга диаметром меньше 3 мм; емкость резервуара меньше 10 мкл, а расположение реакционных камер и каналов по отношению к резервуару обеспечивает равномерное распре 29 деление текучей среды по реакционным камерам из резервуара, причем планшет имеет геометрическую форму тела вращения, при которой резервуар расположен практически в центре указанного планшета, реакционные камеры (13) распределены по кругу вокруг указанного резервуара, а каналы (12), соединяющие указанный резервуар с указанными камерами, выполнены, в основном, в радиальном направлении. 2. Планшет по п.1, в котором диаметр каналов меньше или равен 0,2 мм. 3. Планшет по п.1 или 2, в котором емкость резервуара составляет от 0,1 до 1 мл. 4. Планшет по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что содержит от 20 до 500 реакционных камер. 5. Планшет по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что объем реакционных камер составляет от 0,2 до 50 мкл, предпочтительно от 1 до 10 мкл. 6. Планшет по одному из пп.1-5, в котором соединение между каналами (12) и резервуаром(11) выполнено по периферии резервуара, а дно указанного резервуара выполнено наклонным и/или выпуклым, с возможностью обеспечения распределения содержащейся в резервуаре текучей среды на уровне входа каналов. 7. Планшет по одному из пп.1-6, в котором дно резервуара (11) выполнено коническим. 8. Планшет по одному из пп.1-7, в котором реакционные камеры (13) размещены на периферии планшета. 9. Планшет по одному из пп.1-8, имеющий диаметр от 1 до 10 см. 10. Планшет по одному из пп.1-9, в котором резервуар (11) поделен на 2-8 субрезервуаров (111-118) и каждая из реакционных камер соединена только с одним из этих субрезервуаров при помощи канала (12). 11. Планшет по одному из пп.1-10, в котором реакционные камеры имеют глубину от 0,5 до 1,5 мм. 12. Планшет по одному из пп.1-11, отличающийся тем, что выполнен из пластика, предпочтительно из поликарбоната. 13. Планшет по одному из пп.1-12, имеющий толщину от 0,5 до 5 мм. 14. Планшет по одному из пп. 1-13, в котором пол реакционных камер (13) имеет толщину от 0,05 до 0,5 мм, предпочтительно примерно 0,25 мм. 15. Планшет по одному из пп.1-14, в котором реакционные камеры (13) закрыты прозрачной верхней стенкой (17). 16. Планшет по одному из пп.1-15, в котором реакционные камеры (13) оснащены вентиляционными трубками (14). 17. Планшет по одному из пп.1-16, в котором реакционные камеры (13) выполнены замкнутыми. 18. Планшет по одному из пп.1-7, в котором резервуар (11) содержит отверстие, выпол 004719 30 ненное соответственно средствам (4) изменения давления в указанном резервуаре. 19. Планшет по одному из пп.1-18, в котором каждый канал (12) состоит по меньшей мере из двух частей разного диаметра (121 и 122),при этом диаметр второй части (122) меньше диаметра первой части (121), для обеспечения сброса нагрузки в канале (12). 20. Планшет по одному из пп.1-19, отличающийся тем, что каждый канал (12) оснащен полостью (123) отсечки на уровне его соединения с резервуаром (11), при этом указанная полость отсечки образована практически вертикальным участком канала, имеющим диаметр,превышающий или равный диаметру канала(12). 21. Планшет по одному из пп.1-20, в котором по меньшей мере часть реакционных камер(13) содержит олигонуклеотиды. 22. Планшет по одному из пп.1-21, в котором каждая из реакционных камер (13) содержит два специфических праймера анализируемой последовательности нуклеиновой кислоты и, факультативно, специфический меченый зонд указанной последовательности. 23. Планшет по одному из пп.1-22, в котором по меньшей мере часть реакционных камер(13) содержит реактивы, помещенные в них в виде жидкости с последующей их сушкой, для восстановления раствора этих реактивов при подаче в указанные реакционные камеры текучей среды. 24. Устройство для осуществления энзиматических и/или молекулярно-биологических реакций, требующих по меньшей мере две разные температуры инкубации, отличающееся тем, что содержит по меньшей мере один планшет (1), по пп.1-23; по меньшей мере один нагревательный столик (2), содержащий по меньшей мере две отдельные зоны, которые могут нагреваться по меньшей мере до двух разных температур; средства (3) относительного перемещения между указанным планшетом и указанным нагревательным столиком, обеспечивающие циклическое изменение температуры реакционных камер. 25. Устройство по п.24, в котором энзиматическая реакция является термозависимой цепной амплификацией последовательностей нуклеиновых кислот и в котором зоны нагревательного столика (2) выполнены с возможностью нагрева по меньшей мере до двух разных температур, соответствующих фазам циклов амплификации указанных нуклеиновых кислот. 26. Устройство по п.25, отличающееся тем,что специфические праймеры амплифицируемых последовательностей-мишеней заранее распределены по реакционным камерам; резервуар (11) предназначен для заполнения текучей средой, содержащей, в частности, анализируемую пробу нуклеиновых кислот и реактивы,необходимые для осуществления реакции по 31 лимеразной цепной амплификации, за исключением праймеров, а нагревательный столик (2) содержит три отдельные зоны, которые могут нагреваться до трех разных температур, соответствующих трем фазам циклов полимеразной цепной амплификации. 27. Устройство по п.25 или 26 для термозависимой цепной амплификации последовательностей нуклеиновых кислот, измеряемой в режиме реального масштаба времени, отличающееся тем, что содержит оптические средства (5) возбуждения/измерения флуоресценции, установленные с возможностью возбуждения/измерения флуоресценции содержимого реакционных камер в каждом цикле. 28. Устройство по одному из пп.24-27, в котором отдельные зоны нагрева нагревательного столика (2) распределены по меньшей мере по двум или трем участкам диска. 29. Устройство по одному из пп.24-28, в котором указанный нагревательный столик (2) выполнен неподвижным, а указанный планшет(1) выполнен с возможностью перемещения при помощи указанных средств (3) перемещения. 30. Устройство по одному из пп.24-29, в котором указанный планшет (1) выполнен неподвижным, а указанный нагревательный столик (2) выполнен с возможностью перемещения при помощи указанных средств (3) перемещения. 31. Устройство по одному из пп.24-30, в котором указанный планшет (1) и/или указанный нагревательный столик (2) выполнены с возможностью вращения под воздействием средства (3) перемещения. 32. Устройство по одному из пп.24-31, в котором планшет (1) непосредственно соприкасается с нагревательным столиком (2). 33. Устройство по одному из пп.24-32, в котором нагревательный столик (2) имеет покрытие, способствующее относительному перемещению между указанным планшетом (1) и указанным нагревательным столиком (2). 34. Устройство по одному из пп.24-33, в котором нагревательный столик (2) содержит два или три отдельных термоблока (21, 22 и, в случае необходимости, 23), соединенных со средствами программирования их температуры нагрева. 35. Устройство по одному из пп.24-34, в котором планшет (1) содержит на своей нижней стороне центральную выступающую часть(181), содержащую вырез (182), и средства (3) перемещения содержат по меньшей мере один поводок (32), взаимодействующий с указанным вырезом (182) для сообщения указанному планшету (1) вращательного движения. 36. Устройство по одному из пп.24-35, содержащее оптические средства (5) возбуждения/измерения флуоресценции, расположенные над планшетом или на его стороне. 32 37. Устройство по одному из пп.24-36, содержащее дополнительно средства (4), обеспечивающие подачу содержащейся в резервуаре(1) текучей среды в реакционные камеры (13). 38. Устройство по п.37, в котором указанные средства подачи (4) содержат поршневое устройство (41) и текучая среда подается в реакционные камеры путем увеличения давления. 39. Устройство по п.38, в котором средства подачи (4) содержат насос (41) и текучая среда подается в реакционные камеры путем восстановления давления после создания разрежения. 40. Устройство по п.39, в котором реакционные камеры (13) планшета (1) выполнены замкнутыми. 41. Способ амплификации нуклеиновой кислоты при помощи устройства по одному из пп.24-40, согласно которому производят, по меньшей мере, частичное заполнение резервуара (11) текучей средой, содержащей анализируемую пробу нуклеиновых кислот, а также все необходимые ингредиенты для реакции амплификации, за исключением праймеров, и, в случае необходимости, флуоресцентный интеркалятор нуклеиновых кислот; производят распределение указанной текучей среды по реакционным камерам (13) планшета (1), в которые заранее помещают праймеры и, в случае необходимости, один или несколько меченых зондов; приводят в действие средства (3) относительного перемещения между планшетом и нагревательным столиком для последовательного нагревания необходимое количество раз содержимого каждой реакционной камеры до двух, трех и более температур, определенных двумя, тремя и более зонами указанного нагревательного столика (2). 42. Способ амплификации по п.41, согласно которому на этапе распределения текучей среды по реакционным камерам (13) создают разрежение внутри планшета с последующим восстановлением давления. 43. Способ заполнения в режиме закрытой системы реакционных камер (13) планшета (1) по п.21, согласно которому, по меньшей мере,частично заполняют резервуар (11) текучей средой, соединяют планшет (1) со средствами (4) изменения давления и создают разрежение внутри планшета и восстанавливают давление.

МПК / Метки

МПК: B01L 7/00

Метки: нуклеиновых, мишеней, устройство, кислот, последовательностей, цепной, термозависимой, амплификации

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/19-4719-ustrojjstvo-dlya-termozavisimojj-cepnojj-amplifikacii-posledovatelnostejj-mishenejj-nukleinovyh-kislot.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Устройство для термозависимой цепной амплификации последовательностей – мишеней нуклеиновых кислот</a>

Похожие патенты