Способы и композиция для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, термофильный микроорганизм, способ его получения и частицы, импрегнированные такими микроорганизмами

Номер патента: 17608

Опубликовано: 30.01.2013

Авторы: Хёуген Ярле Андре, Котлар Ханс Кристиан

Есть еще 11 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ обработки углеводородной скважины, при котором внутрь ствола эксплуатационной углеводородной скважины вводят термофильные микроорганизмы, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для обработки указанной скважины, представляющего собой ингибитор образования твердого осадка, ингибитор образования гидратов, ингибитор образования асфальтеновых отложений, ингибитор образования парафиновых отложений или ингибитор коррозии, где химическое соединение является белком или пептидом, спиртом, глицерином, антифризом, биосурфактантом или органической кислотой.

2. Способ по п.1, где указанный термофильный микроорганизм также является галофильным и анаэробным.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный термофильный микроорганизм является характерным для углеводородного месторождения, в котором расположена скважина, подлежащая обработке.

4. Способ по любому из пп.1-3, где по меньшей мере 50% всех аминокислот в указанном белке или пептиде имеют заряженные боковые цепи.

5. Способ по п.4, где указанные заряженные аминокислоты представляют собой аспарагиновую кислоту.

6. Способ по п.4, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

7. Способ по любому из пп.1-6, где указанный микроорганизм представляет собой термофильную архебактерию.

8. Способ по любому из пп.1-7, где указанное химическое соединение секретируется микроорганизмом.

9. Способ по любому из пп.1-8, где указанный микроорганизм вводят в ствол скважины с помощью пористой частицы.

10. Частицы, импрегнированные термофильными микроорганизмами, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, где химическое соединение представляет собой белок или пептид, спирт, глицерин, антифриз, биосурфактант или органическую кислоту.

11. Частицы по п.10, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

12. Композиция для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, включающая в себя жидкость-носитель, содержащую термофильные микроорганизмы, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для указанной обработки, где химическое соединение представляет собой белок или пептид, спирт, глицерин, антифриз, биосурфактант или органическую кислоту.

13. Композиция по п.12, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

14. Термофильный микроорганизм, созданный путем генной инженерии для продуцирования химического соединения для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6.

15. Микроорганизм по п.14, который представляет собой архебактерию.

16. Микроорганизм по п.14 или 15, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

17. Способ трансформации микроорганизма с получением термофильного микроорганизма по любому из пп.14-16, при котором в указанный микроорганизм вводят молекулу нуклеиновой кислоты, экспрессия которой приводит к продуцированию химического соединения, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6.

18. Способ по п.17, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.

19. Способ обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, при котором внутрь ствола скважины вводят химическое соединение, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6, причем указанное химическое соединение было собрано из биореактора, содержащего микроорганизмы по любому из пп.14-16.

20. Способ по п.19, где указанное химическое соединение доставляют в ствол скважины с помощью пористых частиц.

Текст

Смотреть все

СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБРАБОТКИ СТВОЛА ЭКСПЛУАТАЦИОННОЙ УГЛЕВОДОРОДНОЙ СКВАЖИНЫ, ТЕРМОФИЛЬНЫЙ МИКРООРГАНИЗМ,СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ЧАСТИЦЫ, ИМПРЕГНИРОВАННЫЕ ТАКИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ Описан способ, относящийся к обработке углеводородной скважины, при котором внутрь ствола скважины вводят термофильные микроорганизмы, обладающие способностью продуцировать химическое соединение для обработки скважин, в частности, когда ствол скважины представляет собой ствол эксплуатационной скважины и химическое соединение для обработки скважин представляет собой пептид, такой как полиАсп; дополнительные аспекты включают в себя термофильные микроорганизмы, созданные путем генной инженерии для продуцирования химического соединения для обработки скважин, и биореакторы, где микроорганизмы продуцируют химические соединения для обработки скважин для использования в среде ствола скважины. Котлар Ханс Кристиан, Хуген Ярле Андре (NO) Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU) 017608 Данное изобретение относится к способу обработки углеводородной скважины, в частности, путем помещения внутрь скважины бактерий, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин или их предшественники или соединения, образующие их, и к частицам,композициям и структурам, содержащим эти бактерии. В процессе использования углеводородной скважины (то есть газовой или нефтяной скважины) возникают различные проблемы, такие как коррозия металлических деталей, отложение, задерживающее поток углеводородов (например, отложение твердого осадка, газовых клатратов, сульфидов металлов,парафинов, гель-полимеров, микробных останков и так далее), образование токсического сероводорода сульфат-восстанавливающими бактериями, увеличение потока воды в эксплуатационную скважину и так далее. Таким образом, например, когда морскую воду закачивают через ствол нагнетательной скважины в нефтеносный пласт для продвижения нефти через формацию (то есть горную породу) в ствол эксплуатационной скважины, различия растворенных веществ в закачиваемой воде и воде, уже присутствующей в формации, могут вызывать осаждение солей металлов в виде твердого осадка, таким образом, постепенно увеличивая засорение ствола эксплуатационной скважины. Как правило, с этим борются путем применения "закачки под давлением" химических соединенийингибиторов образования твердого осадка, то есть химических соединений, которые разрушают твердый осадок и увеличивают поток нефти или газа. Это, как правило, предполагает остановку потока углеводородов, нагнетание водного раствора ингибитора образования твердого осадка в эксплуатационную скважину под давлением, чтобы доставить раствор ингибитора в формацию, и возобновление добычи. Такая обработка обычно предоставляет возможность для потока углеводородов в течение еще шести месяцев или около шести месяцев перед тем, как потребуется еще одна "закачка под давлением", и каждая "закачка под давлением" вызывает некоторое повреждение формации, окружающей ствол эксплуатационной скважины, и, как результат, увеличение потока фрагментов формации (то есть крупинок горной породы) в скважину. Ствол эксплуатационной скважины в нефтяной скважине с "гравийными фильтрами", представляющими собой содержащие песок фильтрующие элементы, которые служат для того, чтобы захватывать фрагменты формации, как правило, направляется в пласт, несущий углеводороды, и предлагается включать в такие гравийные фильтры керамические частицы, покрытые химическими соединениями для обработки скважин, такими как ингибиторы образования твердого осадка (см. EP-A-656459 и WO 96/27070), или бактериями (см. WO 99/36667), или же эти химические соединения или бактерии импрегнированы в керамические частицы. Подобным образом, была предложена обработка формации, окружающей ствол эксплуатационной скважины, химическими соединениями для обработки скважин перед началом добычи углеводородов, например в GB-A-2290096 и WO 99/54592. Также известны различные полимерные, олигомерные, неорганические и другие имеющие форму частиц носители для химических соединений для обработки скважины, например частицы ионообменной смолы (см. US-A-4787455), полиакриламидные частицы (см. EP-A-193369), желатиновые капсулы (см.US-3676363), олигомерные матрицы и капсулы (см. US-A-4986353 и US-A-4986354), керамические частицы (см. WO 99/54592, WO 96/27070 и EP-A-656459) и частицы самих химических соединений для обработки скважины (см. WO 97/45625). Частицы, покрытые или содержащие химические соединения для обработки скважины, тем не менее, неизбежно будут обеспечивать защиту только в течение ограниченного промежутка времени. Следовательно, существует потребность в средствах для обработки скважин, которые обеспечат продолжительный период защиты, например, против образования твердого осадка или других проблем, таких как коррозия или проблемы ограничения потока углеводородов. В дополнение, один известный ингибитор образования твердого осадка представляет собой полиаспарагиновую кислоту (полиАсп). Тем не менее, общеизвестно, что сложно получать поли(аспарагиновую кислоту) в масштабе, который практически осуществим в производстве. Химический синтез полиАсп осуществляется, например, путем тепловой полимеризации из малеинового ангидрида и катализируется ортофосфорной кислотой. Химический синтез приводит к ,-форме полимера, нежели чем к -форме,обнаруженной в природе. Химический синтез также приводит к образованию побочных продуктов. Согласно настоящему изобретению, таким образом, предложен новый способ создания и использования полиАсп в среде скважины. Авторы изобретения предлагают осуществлять обработку скважины путем введения внутрь скважины термофильных Archea или других термофильных бактерий или микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин.Archea представляют собой одну из трех систем микроорганизмов на земле, другие две представляют собой эубактерии и эукариоты (см. Howland (Ed) "The Surprising Archaea" Oxford University Press,2000). Archea могут быть разделены на три группы: а) анаэробные метанпродуцирующие бактерии; б) анаэробные и аэробные бактерии, усваивающие серу (например, Sulfolobales и Thermoproteales); и-1 017608 в) умеренно термофильные Thermoplasmales. Некоторые представители группы а) и большая часть группы б) являются термофильными, обладают способностью выживать при температурах 90-150C. Подходящее определение и классификацию Archea можно найти в последнем издании Bergey's Manual или Howland (Ed) (см. выше). Как правило, Archea можно идентифицировать по их клеточной стенке, которая лишена пептидогликанового каркаса, и по их цитоплазматической мембране, которая содержит простые эфиры глицерина и C20 (фитанил) и C40(бифитанил) алкильных изопреноидов вместо сложных эфиров глицерина и жирных кислот. В дополнение, ДНК-зависимые РНК-полимеразы у Archea отличаются от таковых у эубактерий тем, что они состоят из более чем четырех субъединиц и устойчивы к антибиотикам рифампицину и стрептоликлигину(streptolycligin). Согласно первому аспекту данного изобретения предложен способ обработки углеводородной скважины, при котором внутрь ствола эксплуатационной скважины вводят термофильных Archea или других термофильных бактерий или микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин. Подходящие микроорганизмы представляют собой галофильные и анаэробные, а также термофильные, например некоторые серувосстанавливающие бактерии,такие как штаммы Desulfovibrio-, Desulfobulbus-, Desulfobacter, Desulfococcus, различные виды Bacillus,виды Clostridium, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobium, Thermobacteroides, Thermodesulfobacterium,некоторые Pseudomonas и так далее. Некоторые серувосстанавливающие бактерии могут также использовать другие метаболические пути через лактат или ацетат. Эти Archea или другие термофильные микроорганизмы могут встречаться в природе, но обычно они генетически модифицированы для продуцирования химических соединений для обработки скважин. Archea, в частности, генетически модифицированные Archea, предпочтительны для использования в способах по данному изобретению. В особенно предпочтительном воплощении химические соединения для обработки скважин представляют собой агенты, которые ингибируют образование твердого осадка. Термофильные бактерии, как правило, рассматриваются как проблема в нефтяных скважинах, поскольку обычно они являются бактериями, усваивающими серу, и продуцируют токсический сероводород. Как было указано выше, в соответствии с настоящим изобретением предложено вводить микроорганизмы внутрь ствола эксплуатационной скважины, и, таким образом, данное изобретение не имеет отношения к введению микроорганизмов в нагнетательную скважину. Условия в этих двух скважинах очень различаются, исходя из понятий физической среды и осложнений при бурении, с которыми сталкиваются. Таким образом, эффективный способ обработки одной скважины вполне вероятно окажется неподходящим для другой скважины. Подобным образом, микроорганизмы, которые могут бурно размножаться в среде одной скважины, не обязательно выживут в другой. Используемые микроорганизмы предпочтительно представляют собой микроорганизмы, характерные для углеводородного месторождения, в котором расположена скважина, подлежащая обработке. Описанные здесь способы сбора и идентификации подходящих характерных микроорганизмов могут использоваться в способах по данному изобретению. Тем не менее, могут использоваться другие Archea,такие как Archea, депонированные в Американской коллекции типовых культур (ATCC), Немецкой коллекции микроорганизмов (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) (DSM и Британской коллекции промышленных и морских бактерий (British Collection of Industrial and Marine Bacteria (CIMB. Примеры подходящих видов включают в себя: Desulfotomaculum, Archaeoglobus (например, A. fulgidis), Thermodesulforabdus, Petrofaga (например, P. mobilis), Methanococous (например, M. thermolithotrophus), Thermodesulfotobacteria, Sulfolobales, Thermoprotealis, Thermoplasmales. Представители всех вышеупомянутых групп Archea могут быть использованы в способах по настоящему изобретению при условии, что они проявляют необходимые термофильные свойства.Archea и другие бактерии или микроорганизмы, которые могут выживать при температурах, превышающих 50C (более предпочтительно, при температурах, превышающих 70C), могут рассматриваться как "термофильные". Особенно предпочтительны такие микроорганизмы, в особенности Archea,которые могут бурно размножаться при температурах, превышающих 90C. Удобно, если Archea и другие бактерии или микроорганизмы могут быть факультативно анаэробными/строго анаэробными и иметь очень простые требования к питательным веществам. Это особенно важно, поскольку может возникнуть необходимость вводить бактерии и питательные вещества для них в ствол скважины, например в пористую материнскую породу. Удобно, если Archea и другие бактерии или микроорганизмы могут использовать углеводороды с короткой цепью или ацетат в своем энергетическом обмене. Желаемые питательные вещества для удобства могут быть введены в пористую материнскую породу или введены вместе с бактериями или другими микроорганизмами в пористые частицы.Archea и другие бактерии или микроорганизмы могут быть генетически модифицированы с использованием стандартных способов для введения рабочих последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки, представляющие собой химические соединения для обработки скважин или участвующие в продуцировании химических соединений, подходящих для использования в качестве химических-2 017608 соединений для обработки скважин. Таким образом, бактерии могут продуцировать химические соединения для обработки скважин непосредственно или могут продуцировать предшественники химических соединений для обработки скважин или соединения, образующие их. Возможно, что, в соответствии с генетической модификацией, эта последовательность представляет собой регуляторную, нежели чем кодирующую последовательность, которую вводят в организм-хозяин и которая ответственна за переключение или усиление экспрессии релевантной кодирующей последовательности. Относительно трансформации Archea можно обратиться к следующим ссылкам на 3-й Международный конгресс по экстремофилам, проходивший 3-7 сентября 2000 года в Техническом университете Гамбурга (Гамбург):Prieur, D. and Erauso, G. from Universit Paris-Sud. Ссылки далее на "Archea" используют все необходимые изменения в отношении других термофильных бактерий или микроорганизмов, которые могут быть введены внутрь скважины в соответствии с настоящим изобретением. Для экспрессии экзогенных генов в Archea в предшествующем уровне техники было описано и использовалось множество векторов. Например, Cannio et al. (1998, J. Bacteriol. 180 (12): 3237-40) описывает вектор, который особенно эффективен в Sulfolobus solfataricus. Кроме того, Cannio et al. в Journal "Extremophiles" 2001 5 (3): 153-9 описывает способы и векторы для трансформации Archae. Также были получены шаттл-векторы, которые подходят для использования в E. coli и Sulfolobus (Cannio et al, firstmeeting on Extremophiles as cell Factories, Athens, 19-21 April 1997). Эти публикации включены сюда посредством ссылки. Модификации этих векторов, которые могут быть желательны для использования с другими видами микроорганизмов, известны в уровне техники и находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Еще один аспект данного изобретения составляет способ трансформации Archea, при котором в указанную Archea вводят молекулу нуклеиновой кислоты, экспрессия которой прямо или косвенно приводит в результате к продукции, обычно самой Archea, химического соединения для обработки скважин.Archea, которые были генетически модифицированы для продукции химических соединений для обработки скважин, составляют еще один аспект настоящего изобретения. Химическое соединение для обработки, продуцируемое Archea, будет использовано в среде ствола эксплуатационной скважины, иArchea обладает способностью выживать в этой среде. Таким образом, гены, кодирующие полезные химические соединения для обработки скважин или ферменты или другие факторы, вовлеченные в продукцию организмом активных химических соединений для обработки скважин, могут быть введены в организм-хозяин Archea с использованием подходящих способов трансформации, хорошо известных из уровня техники. Общее руководство по способам клонирования можно найти, например, в Molecular Cloning laboratory manual под редакцией Maniatis etal., опубликованном в Cold Spring Harbour Laboratory Press. Более конкретно, ссылка L52, например, демонстрирует каким образом можно добиться трансформации в гипертермофильной Archea Pyrococcusabyssi. Подходящие организмы, предоставляющие гены, могут представлять собой другие бактерии или микроорганизмы или высшие эукариоты, включающие в себя растения и млекопитающих. Продукт экспрессии должен быть стабильным в условиях ствола скважины, и, таким образом, он обычно может быть термостабильным. Таким образом, организмы-мишени для получения интересующих генов сами могут существовать в довольно экстремальных условиях окружающей среды. Ген, введенный в Archea, может быть модифицирован для усиления термостабильности экспрессируемого продукта. Кроме того, белки,экспрессируемые организмами, которые сами по себе не могут жить в стволе скважины, могут быть достаточно стабильными для сохранения в активной форме, когда они экспрессируются термофильнымиArchea. Белок, если требуется, может также содержать дополнительную модификацию, такую как добавление меток, например his-меток (his - гистидин) или myc-меток, которые улучшают выделение белка из системы. Для некоторых из более простых химических соединения для обработки скважин, например, полиаминокислот, таких как полиаспартат, нуклеиновая кислота, кодирующая ген, может быть синтезированаde novo (то есть ее не берут из другого организма) и введена в Archea обычным путем. Трансформация, как правило, включает в себя плазмидный вектор, который также содержит ген для того, чтобы сделать возможной идентификацию успешно трансформированной Archea, например, ген-3 017608 устойчивости к антибиотикам, такой как ген хлорамфениколацетилтрансферазы. Когда микроорганизм вводят в ствол скважины, антибиотик также может быть введен, например, микроорганизм, питательные вещества и антибиотик могут быть совместно введены в пористые частицы. Таким образом, эндогенные бактерии могут быть подавлены, что дает конкурентные преимущества для роста модифицированного организма. Другие способы отбора трансформантов известны специалистам и включают в себя использование светочувствительного вектора (light sensitive vector), люкс-гена (lux-gene), который заставляет положительные колонии светиться в темноте. Другие подходящие носители для трансформации бактерий включают в себя космиды и молекулы бактериофагов. Как хорошо понятно из уровня техники, ген, введенный в Archea, должен быть функционально связан с контролирующими последовательностями, которые совместимы с нормальной экспрессией генов в хозяине Archea. Контролирующие последовательности включают в себя промоторы и возможно регуляторные последовательности, которые заставляют ген включаться или выключаться в ответ на химический или физический стимул. Ген может быть введен в хромосому Archea и может регулироваться эндогенными контролирующими последовательностями, или, если вектор не введен, интересующий ген будет трансфицироваться вместе с подходящими регуляторными последовательностями и промоторами. Может быть необходимо обеспечивать Archea аминокислотами, кофакторами и так далее, необходимыми при продуцировании химических соединений для обработки скважин. Примеры простых искусственных химических соединений для обработки скважин, которые могут быть получены таким способом, включают в себя богатые аспарагиновой кислотой или содержащие аспартатные повторы полипептиды, и олигопептиды, и полимеры, и олигомеры аспарагиновой кислоты,которые могут функционировать в качестве ингибиторов образования твердого осадка. Особенно предпочтительная группа ингибиторов образования твердого осадка представляет собой молекулы, богатые аминокислотами, имеющими заряженные боковые цепи, в частности анионными аминокислотами, такими как аспарагиновая или глутаминовая кислота, а также включающими в себя катионные аминокислоты, такие как лизин, аргинин или гистидин. Такие молекулы, включающие в себя некодируемые генетически заряженные аминокислоты, могут быть синтезированы Archea in situ, хотя предпочтительны молекулы, которые могут быть образованы путем трансляции, и, таким образом, включают в себя лишь 20 генетически кодируемых аминокислот. Таким образом, химическое соединение для обработки скважин может представлять собой пептид(здесь не делается различий между "пептидом" и "полипептидом"), имеющий большое количество заряженных, в особенности кислых аминокислот. Такой пептид может состоять полностью из заряженных аминокислот или значительной доли заряженных аминокислот; например, вдоль его длины или его фрагмента от 30, предпочтительно от 50, до 100% всех аминокислот заряжены, например 60, 70, 80 или 90% всех аминокислот заряжены. Если у пептида имеется заряженный фрагмент, он включает в себя по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, предпочтительно 15 или большее количество остатков,имеющих такую долю заряженных, предпочтительно кислых, остатков, как обсуждалось выше. В полных определениях пептид для обработки скважин предпочтительно имеет по меньшей мере 3, предпочтительно 4 или более чем 4, более предпочтительно, 6 или более чем 6, например 8-14 заряженных остатков или от 15 до 25 заряженных остатков, в частности от 20 до 25 заряженных остатков. Заряженные остатки могут быть последовательными или разделены другими незаряженными остатками, но, как правило, должна присутствовать отчетливо заряженная природа пептида или его области/фрагмента. Полимер может представлять собой сополимер, например аспарагиновой кислоты и гистидина,глицина, аланина, пролина, лейцина, серина или тирозина. Показано, что сополимеры аспарагиновой кислоты и пролина или гистидина могут представлять собой более эффективные ингибирующие образование твердого осадка полимеры, чем полимеры одной аспарагиновой кислоты. Незаряженные остатки предпочтительно представляют собой пролин. Хотя на N-конце пептида может также присутствовать метионин. Заряженный полипептид наиболее предпочтительно представляет собой полиАсп. Здесь ссылка на"полиАсп" включает в себя сополимеры, обсуждавшиеся выше, но в каждом случае, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 50%, например по меньшей мере 70%, остатков в конечном пептидном продукте представляют собой аспарагиновую кислоту. Инициация трансляции требует еще одного остатка в первом положении (имеющего происхождение от стартового кодона) исходно экспрессирующегося пептида, как правило, этим остатком является метионин (Мет), хотя бактерии могут также использовать другие остатки в первом положении. Конечный продукт полиАсп, используемый для обработки скважин, может сохранять инициирующий остаток, или он может отщепляться, в особенности,когда ген полиАсп включает в себя сигнал или другую последовательность в 3'-5' направлении. Продукт полиАсп (без какой-либо сигнальной или меченой последовательности), как правило, имеет длину в 1575 аминокислот, например длину в 20-45 аминокислот, и предпочтительно включает в себя 1-8, например 2-4, остатка пролина. Получение полиАсп из природного возобновляемого источника, такого как Archea или бактерии,или in situ в скважине или в биореакторе, представляет собой эффективное средство получения больших количеств полиАсп. Таким образом, использование Archea или бактерий для получения полиАсп также-4 017608 является более экологически приемлемым, чем любой другой используемый в настоящее время способ. Получение полиАсп может осуществляться in situ в соответствии с тем, как описано в данной заявке,путем его экспрессии в генетически модифицированных термофильных Archea, или, в качестве альтернативы, может осуществляться в биореакторе. Химическое соединение для обработки скважин может включать в себя молекулу белка, например экспрессирующийся в норме белок Archea, который модифицирован для увеличения в нем количества заряженных остатков. Или путем увеличения количества заряженных, предпочтительно кислых остатков,обнаруженных по всей длине молекулы, но более предпочтительно путем добавления к молекуле заряженной области. Таким образом, экспрессирующийся белок может для удобства иметь заряженный домен, не обнаруженный в нативной молекуле. Это заряженный домен предпочтительно находится снаружи молекулы белка, так что он доступен и способен проявлять свои свойства ингибирования образования твердого осадка. Белок или полипептид может экскретироваться Archea или может оставаться прикрепленным к бактериальной клеточной поверхности. Более крупные белки могут пересекать клеточную стенку, располагая свои заряженные домены снаружи Archea. Можно модифицировать секрецию пептида путем добавления или удаления сигнальных пептидов, которые направляют пептид, который должен секретироваться. Сигнальные пептиды для секреции или мембранной локализации хорошо известны в уровне техники. Сигнальные пептиды могут быть отщеплены во время или после процесса секреции или могут оставаться присоединенными к молекуле пептида. Когда сигнальная последовательность отщепляется таким образом, можно для удобства удалить инициирующий остаток метионина (Мет). Здесь ссылка на молекулы"полиАсп" включает в себя ссылку на молекулы, которые включают в себя такие сигнальные последовательности как сигнальная последовательность щелочной протеазы (ЩП). Многие подходящие молекулы пептидов, ингибирующие образование твердого осадка, являются новыми и составляют еще один аспект настоящего изобретения. Молекулы нуклеиновых кислот, которые включают в себя нуклеотидную последовательность, которая кодирует эти молекулы пептидов, ингибирующие образование твердого осадка, или комплементарна последовательности, кодирующей эти молекулы пептидов, составляют еще один аспект настоящего изобретения. Генетическая конструкция,включающая в себя такие молекулы нуклеиновых кислот, функционально связанная с последовательностью промотора, составляет еще один аспект настоящего изобретения. Пример нуклеиновой кислоты, кодирующей химическое соединение для обработки скважин, представляет собой 5'-CATGGATGACGATGATGACCCGGATGATGACGACGATGACGATGACGATCCGGDDDPDDDDDDDDDPRHHHHHH, составляют дополнительные аспекты данного изобретения, а также вектор pET11d-Asp в соответствии с тем, как описано в примере 2. Варианты и фрагменты этих последовательностей, которые также содержат большое количество остатков Асп (или триплеты, кодирующие их, как подходит) составляют дополнительные аспекты данного изобретения. Может быть предпочтительно сконструировать ген полиАсп таким образом, чтобы различные триплеты, кодирующие Асп, были включены для предотвращения саморенатурации, хотя эту проблему можно избежать, используя двухцепочечную ДНК (дцДНК). Конкретные вызывающие интерес варианты представляют собой такие варианты, которые лишеныC-концевых остатков His (и связывающего аргинина). Если полиАсп слит с сигнальной последовательностью, он, как правило, лишен своего собственного инициирующего кодона и поэтому не включает в себя четыре основания CATG на 5' конце. Другие полезные химические соединения для обработки скважин, которые могут продуцироватьсяArchea, включают в себя спирты и глицерины, белковые и небелковые молекулы антифризов и биосурфактантов. Данное изобретение также включает в себя применение встречающихся в природе микроорганизмов, то есть микроорганизмов, которые не модифицированы генетически и предпочтительно являются характерными для нефтехранилища или ствола скважины. Такие микроорганизмы размножаются в большом количестве конкретно в условиях, обнаруженных в этих месторождениях, и могут продуцировать продукты, которые полезны в данном изобретении. Такие продукты включают в себя органические кислоты, которые защищают от карбоната, криоглобулин, который действует против гидратов (например, газового гидрата, который представляет собой кристаллическое твердое вещество, состоящее из молекулы газа, окруженной сеткой из молекул воды), и ферменты, которые разрушают S-S мостики для уменьшения вязкости. Примеры таких микроорганизмов включают в себя Archea, которые представляют собой экстремофилов, то есть экстремальных термофилов.Archea могут быть доставлены к месту в стволе скважины, находясь внутри или на поверхности частиц, например пористых неорганических частиц (например, диоксида кремния, оксида алюминия и так далее) или полимерных частиц или в капсулах, например коллоидах, и так далее. Эти частицыносители могут также нести питательные вещества для бактерий.-5 017608 Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложены частицы, импрегнированные термофильными Archea, обладающими способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин, предпочтительно Archea, генетически модифицированными для продуцирования химических соединений для обработки скважин. Согласно еще одному аспекту данного изобретения предложено применение термофильных Archea,обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин, предпочтительно Archea, генетически модифицированных для продуцирования химических соединений для обработки скважин, для производства композиций для обработки углеводородных скважин. Согласно еще одному аспекту, данное изобретение включает в себя композицию для обработки углеводородных скважин, включающую в себя жидкость-носитель, содержащую термофильных Archea,обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин, предпочтительно Archea, генетически модифицированных для продуцирования химических соединений для обработки скважин. Согласно еще одному аспекту, данное изобретение включает в себя трубный фильтр (tubular filter) для размещения внутри ствола скважины, содержащий термофильных Archea, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин, предпочтительно Archea, генетически модифицированных для продуцирования химических соединений для обработки скважин. В способе по данному изобретению бактерии могут быть помещены внутрь ствола скважины перед добычей углеводородов (то есть извлечения нефти или газа из скважины) и/или после нее. Предпочтительно, бактерий помещают внутрь ствола скважины перед началом добычи, в частности, на завершающей стадии строительства скважины. Бактерий можно поместить внутрь ствола скважины (например, в несущие углеводороды пласты или ответвления ствола скважины) или внутрь окружающей формации (например, внутрь трещин или внутрь самой горной породы). В первом случае, бактерий для удобства импрегнируют в частицы, содержащиеся внутри трубного фильтра, например гравийного фильтра или фильтрующей структуры, как описано в EP-A-656459 или WO 96/27070; во втором случае, бактерий (возможно, импрегнированных внутрь частиц) предпочтительно размещают путем вдавливания жидкой композиции, содержащей этих бактерий, внутрь ствола скважины. Предпочтительно, перед началом добычи бактерий помещают как внутри скважины в фильтре, так и внутри окружающей формации. Бактерий, в качестве альтернативы,помещают внутрь частиц. Когда бактерий (как правило, импрегнированные внутрь частиц) помещают внутрь окружающей формации, используемое давление должно быть достаточным для того, чтобы заставить бактерий проникнуть внутрь по меньшей мере на 1 м, более предпочтительно по меньшей мере на 1,5 м, еще более предпочтительно по меньшей мере на 2 м внутрь формации. Если желательно, бактерий можно использовать в сочетании с пористыми частицами для того, чтобы достигнуть проникновения внутрь формации приблизительно на 2 м или более. Композиции, включающие в себя такие небольшие пористые частицы и бактерии, по данному изобретению, которые могут быть введены вместе с питательными веществами,составляют еще один аспект данного изобретения. Преимущественно, частицы, пропитанные или нагруженные (также здесь называемые "импрегнированными") Archea, по данному изобретению, имеют модовый размер (mode particle size) (например,измеренный с использованием анализатора размера частиц Coulter) от 1 мкм до 5 мм, более предпочтительно от 10 мкм до 1000 мкм, в частности от 250 мкм до 800 мкм. Для помещения внутрь формации размер частиц предпочтительно составляет от 1 до 50 мкм, в частности от 1 до 20 мкм, например 1-5 мкм. Для любой конкретной формации, проницаемость формации (которая коррелирует с размером суженной части пор в формации) можно легко определить, используя образцы горной породы, взятые во время бурения, и, таким образом, может быть определен оптимальный размер импрегнированных частиц. Поскольку частицы, полученные в соответствии с тем, как описано в ЕР-В-3905, US-A-4530956 иWO 99/19375, имеют очень низкую дисперсность (то есть разброс размеров), может быть достигнуто высоко очень равномерное нанесение и глубокое проникновение в формацию. По этой причине, частицы предпочтительно имеют коэффициент вариации (KB), составляющий менее 10%, более предпочтительно менее 5%, еще более предпочтительно менее 2%. где "среднее" представляет собой средний диаметр частиц, и "стандартное отклонение" представляет собой стандартное отклонение размера частиц. KB предпочтительно рассчитывается по главной моде,то есть путем подгонки кривой мономодового распределения к обнаруженному распределению размера частиц. Таким образом, некоторые частицы, имеющие размер меньше или больше модового размера,могут быть исключены при расчете, который, например, может основываться на приблизительно 90% от общего числа частиц (то есть обнаруженных частиц). Такое определение KB можно осуществлять на анализаторе размера частиц Coulter LS 130.-6 017608 Для размещения внутри фильтров импрегнированные частицы предпочтительно имеют модовый размер частиц от 50 до 5000 мкм, более конкретно от 50 до 1000 мкм, еще более предпочтительно от 100 до 500 мкм. В таких фильтрах импрегнированные частицы предпочтительно составляют от 1 до 99 мас.%, более предпочтительно от 2 до 30 мас.%, еще более предпочтительно от 5 до 20 мас.% от матрицы фильтра в виде частиц, причем оставшаяся часть матрицы включает в себя не растворимый в нефти и воде неорганический материал в виде частиц, предпочтительно неорганический оксид, такой как диоксид кремния, оксид алюминия или оксид алюминия-диоксид кремния. Особенно предпочтительно, если неорганический оксид имеет модовый размер частиц, аналогичный размеру импрегнированных полимерных частиц, например, в пределах 20%, более предпочтительно в пределах 10%. Что касается расположения внутри формации, импрегнированные частицы предпочтительно имеют низкую дисперсность,например KB составляет менее 10%, более предпочтительно менее 5%, еще более предпочтительно менее 2%. Низкая дисперсность нужна для того, чтобы препятствовать засорению фильтров. Поры частиц должны быть достаточно крупными для того, чтобы дать возможность микроорганизмам проникать без затруднений, например, радиус пор составляет до 2-4 мкм. Импрегнированные частицы предпочтительно представляют собой частицы, имеющие объем пор,составляющий по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, например по меньшей мере до 85%. Импрегнированные бактериями полимерные частицы, используемые по данному изобретению, например MPP или другие ступенчато выращенные полимерные частицы (step-grown polymer particles),предпочтительно представляют собой гомо- и сополимеры винила, более предпочтительно гомо- и сополимеры стирола. Примеры подходящих мономеров включают в себя виниловые алифатические мономеры, такие как эфиры акриловой и метакриловой кислот, акрилонитрил, и виниловые ароматические мономеры, такие как стирол и замещенные стиролы. Предпочтительные полимеры представляют собой стироловые полимеры, возможно и предпочтительно сетчатые полимеры, например с дивинилбензолом,и частицы таких полимеров с диапазоном размеров и объемов пор имеются в продаже от Dyno SpecialtyPolymers AS of Lillestrom, Норвегия. Если желательно, частицы могут быть обработаны (functionalised),например для получения поверхности с кислыми или основными группами (например, функциональными группами карбоксильной или амино), например для того, чтобы захватывать атомы металлов из воды,проникающей в частицы, чтобы уменьшить образование твердого осадка, облегчить адгезию частиц для образования поверхностей, облегчить агрегацию частиц или препятствовать ей и так далее. Обработанные частицы доступны от Dyno Specialty Polymers AS. Предпочтительно, полимерная матрица импрегнированных частиц имеет точку размягчения выше температуры в скважине, например выше 70C, более предпочтительно выше 100C, еще более предпочтительно выше 150C. Как правило, когда частицы импрегнируют бактериями, их также импрегнируют питательными веществами для бактерий, например сахарозой, чтобы способствовать росту бактерий, как только частицы окажутся в воде. В качестве альтернативы, могут использоваться так называемые "ультрамикробактерии", которые "голодают" на стадии введения, что облегчает их проникновение вглубь формации. Последующее введение питательных веществ затем стимулирует рост. Примеры типичных химических соединений для обработки скважин, предшественников и образующих их соединений упоминаются в публикациях патентов, содержание которых включено в данное описание посредством ссылки. Так, например, типичные ингибиторы образования твердого осадка включают в себя неорганические и органические фосфонаты (например, аминотрисметиленфосфонат натрия), полиаминокарбоновые кислоты или их сополимеры, полиакриламины, поликарбоновые кислоты, полисульфоновые кислоты,фосфатные сложные эфиры, неорганические фосфаты, полиакриловые кислоты, инулины (например,натрий-карбоксиметилинулин), фитиновую кислоту и ее производные (в особенности карбоксильные производные), полиаспартаты и так далее. Особенно предпочтительно применение экологически приемлемых ингибиторов образования твердого осадка, например инулинов, фитиновой кислоты и ее производных и полиаспартатов. Когда ингибитор образования твердого осадка представляет собой полимер, он, безусловно, может содержать остатки одного или более чем одного различного сомономера, например сополимер аспарагиновой кислоты и пролина. Другие полезные микробные продукты включают в себя ферменты, которые сами по себе способны синтезировать химические соединения для обработки скважин, такие как ингибиторы образования твердого осадка. Может быть необходимо трансформировать бактерии множеством генов, кодирующих различные ферменты, которые вовлечены в синтетический путь описанного химического соединения для обработки скважин. Таким образом, химическое соединение для обработки скважин может быть прямо продуцировано Archea, то есть представлять собой продукт экспрессии, или получено косвенно в результате метаболизма или катаболизма внутри Archea. Таким образом, химическое соединение для обработки скважин может быть белковым, например полипептидом или гликопротеином, но не обязательно, и мо-7 017608 жет быть полисахаридом или липидом. В особенно предпочтительном воплощении, химическое соединение для обработки скважин может иметь двойную функцию. Этого можно легко достигнуть, например, путем получения слитого белка,который может иметь фрагмент, ингибирующий образование твердого осадка, и фрагмент, который действует, например, как ингибитор коррозии, биосурфактант или антифриз. Полиаспартат особенно полезен, поскольку он может действовать в качестве ингибитора образования твердого осадка и ингибитора коррозии. Примеры предпочтительных химических соединений для обработки скважин включают в себя: ингибитор образования гидратов, ингибиторы образования твердого осадка, ингибиторы образования асфальтеновых отложений, ингибиторы образования парафиновых отложений и ингибиторы коррозии. Такие ингибиторы хорошо известны специалистам в области обработки скважин. В некоторых специальных случаях, например, если сталкиваются с отложением карбонатов или органическим нафтенатным отложением, может быть подходящим введение описанных здесь микроорганизмов в нагнетательную скважину. Таким образом, согласно еще одному аспекту настоящего изобретения также предложен способ обработки углеводородной скважины, при котором внутрь нагнетательной скважины вводят термофильных Archea или других термофильных бактерий или микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать химические соединения для обработки скважин. Предпочтительные признаки данного аспекта включают в себя применение Archea, которые были генетически модифицированы для продуцирования химических соединений для обработки скважин, в соответствии с тем, как обсуждалось выше. Микроорганизмы, вводимые в нагнетательную скважину, преимущественно,могут продуцировать органические кислоты и/или химические соединения, вовлеченные в ингибирование образования гидратов. Когда бактерий вводят внутрь формации, они предпочтительно используются в виде дисперсии в жидком носителе. Для использования до и после завершения жидкий носитель предпочтительно включает в себя неводную органическую жидкость, например углеводород или смесь углеводородов, как правило углеводороды C3-C15 или нефть, например сырая нефть. Для исправляющей обработки (curative treatment), то есть после того, как добыча продолжалась в течение некоторого периода времени, жидкий носитель может быть водным и неводным. Импрегнация бактерий и, если желательно, питательных веществ и/или других химических соединений для обработки скважин в пористые частицы носителя может быть осуществлена с использованием любого обычного способа, например, путем приведения частиц в контакт с водной и неводной дисперсией бактерий и других химических соединений с последующим удалением растворителя, если потребуется, например путем дренирования, сушки или под вакуумом. Тем не менее, особенно предпочтительно импрегнировать частицы бактериями путем смешивания в суспензии, то есть путем добавления количества дисперсии, которое близко к объему пор частиц, например от 0,8 до 1,2 от объема пор, более предпочтительно от 0,9 до 1,1 от объема пор. Еще более предпочтительно импрегнировать частицы с использованием способа пропитывания с помощью вакуума. Этот способ можно удобно осуществлять в роторном испарителе при 0-15 мбар (0-1500 Па) при комнатной температуре и продолжать при 50C до тех пор, пока большая часть водной фазы не будет удалена. Желательно вводить бактерий в систему пор не только на поверхности. Если желательно, нагрузка частиц может быть увеличена путем осуществления более чем одной стадии импрегнации. Для поддержания популяции микроорганизмов in situ могут быть предусмотрены различные способы. Микроорганизм может быть иммобилизован на пористой матрице с комплексом питательных веществ или введен вместе с питательными веществами в небольшие пористые частицы, которые затем могут быть введены глубоко (например, 2-10 м) в формацию. Высококонцентрированные инокуляты термофильных бактерий могут быть введены в пористые частицы. Преимущественно, некоторые виды бактерий, которые могут быть введены, способны к продуцированию жизнеспособных спор в среде скважины. Данное изобретение также относится к биореактору для синтеза химических соединений для обработки скважин. Химические соединения для обработки скважин, таким образом, продуцируются в биореакторе и затем вводятся в углеводородную скважину. В предпочтительном воплощении, частицы описанного здесь типа, то есть пористые импрегнированные частицы, могут быть нагружены продуктами из биореактора. Биореактор, который может располагаться на участке ствола скважины или около него или удален от участка, может функционировать, для того чтобы создать возможность продуцирования любого химического соединения для обработки скважин, такого как было описано выше. Предпочтительно,биореактор может создать возможность для получения пептидных ингибиторов образования твердого осадка, таких как поли(аминокислоты), например полиАсп или другие преимущественно (положительно) заряженные полипептиды, подходящие для использования в качестве химических соединений для обработки скважин. Используемые в биореакторе микроорганизмы могут встречаться в природе, например встречающиеся в природе бактерии или Archea, примеры которых были приведены выше, которые продуцируют химические продукты для обработки скважин, синтезируемые или путем модификации, или путем добавления регуляторных или структурных последовательностей. Не обязательно использовать-8 017608 термофильные виды, если используют биореактор. Могут использоваться любые микроорганизмы, например E. coli. Используемый здесь термин "биореактор" относится к любой системе для роста клеток в культуре,а именно микроорганизмов, таких как бактерии или Archea. Питательные вещества можно подавать в биореактор, а образцы легко удалять из него. Продукт, выделяемый от микроорганизмов, может секретироваться или оставаться в клетке. В том случае, когда продукт секретируется, его можно непрерывно удалять из клеточной культуральной среды путем удаления культуральной среды и заменой ее свежей средой для выращивания. Продукт может затем быть выделен из среды для выращивания с использованием стандартных способов. В качестве альтернативы, микроорганизмы могут быть удалены из биореактора, а продукт выделен после разрушения клеток с использованием способов, известных из уровня техники. Для того чтобы добиться выделения продукта в том случае, когда он представляет собой экзогенный белок, этот белок может быть модифицирован таким образом, чтобы способствовать выделению,например его можно пометить с использованием метки, такой как his-метка или myc-метка. Такие метки и способы выделения хорошо известны из уровня техники. Продукты, полученные в биореакторе, например пептидные ингибиторы образования твердого осадка, такие как полиАсп, или выделяют из лизированных микроорганизмов, или они секретируются и их выделяют из среды для выращивания. Может быть необходимо добавлять последовательности, которые кодируют аминокислотные сигналы, которые направляют секрецию белка при определенных условиях. Независимо от способа получения продукт затем можно смешать с получением общего препарата,необходимого для традиционной обработки путем закачки под давлением. Биореакторы, таким образом, представляют собой экологически приемлемую систему для получения химических соединений для обработки скважин. Еще один аспект настоящего изобретения, следовательно, относится к применению биореактора для получения химических соединений для обработки скважин. Предпочтительно, химические соединения для обработки скважин представляют собой пептидные ингибиторы образования твердого осадка или другие вещества, которые полезны для скважины,включающие в себя заряженные пептиды. Наиболее предпочтительно, заряженный пептид представляет собой полиАсп или сополимер аспарагиновой кислоты и другой аминокислоты, как было определено выше. Данное изобретение далее будет описано со ссылкой на следующие не ограничивающие объем изобретения примеры и графический материал, на которых дано схематическое представление плазмидыpET11d-Aspartate, описанной в примере 2. Эта плазмида кодирует полиАсп и может быть использована для трансформации микроорганизмов, в соответствии с тем как здесь описано. Пример 1. Клонирование гена полиаспартата (ПА). Использовали систему экспрессии pET E. coli. Эта система имеет высокую избирательность РНКполимеразы бактериофага T7 в отношении распознаваемых ею последовательностей промоторов, причем высокий уровень активности полимеразы и высокая эффективность трансляции опосредованы сигналами инициации трансляции T7. Олигонуклеотид для ПА. Кодон, предпочтительный для ПА, исследовали в "Codon usage database" (http://www.kazusa.or.jp/codon/) перед синтезом. Нуклеотид для ПА синтезировали с использованием последовательности GATGATGAT 75 пар оснований (25 аминокислот), в дополнение к стартовому и стоп-кодонам и специфическим последовательностям для встраивания в вектор после расщепления рестриктазами (EuroGenTec). Получение вектора и олигонуклеотидов. Вектор pET 11 а (1 г/мл; Stratagene, La Jolla, Ca, США) расщепляли рестриктазой Ndel (37C в течение ночи). Вектор обрабатывали "кишечной щелочной фосфатазой теленка" (CIAP; Stratagene) в соответствии с указаниями производителя. Вектор затем разделяли посредством электрофореза в агарозном геле(1% агароза), вырезали из геля и очищали с использованием реагентов для экстракции из геля (Qiaquickgel extraction kit, Qiagen, GmbH, Hilden, Tyskland). Олигонуклеотиды (100 пмоль/л) нагревали (95C, 5 мин), температуру затем уменьшали до 65C со скоростью 1C/мин и образец помещали на лед перед лигированием. Использовали соотношение между вектором и вставкой, рекомендуемое производителем. Лигирование и трансформация. Лигирование осуществляли в течение ночи при 18C, используя несколько соотношений между вектором и вставкой. Использовали ДНК-лигазу фага T4 и 10 лигазный буфер (pH 7,6). Лигирующую смесь трансформировали в E. coli DH5 с использованием протокола "тепловой шок": лигирующую смесь добавляли к компетентным клеткам (50 л), инкубировали на льду (30 мин), помещали на нагревающий блок при 42C (45 с) и, наконец, на лед (2 мин). Клетки затем инокулировали в среду Луриа-Бертани (среду LB), инкубировали в инкубаторе с перемешиванием (37C, 3 ч) и распределяли по агару LB с 5-бром-4-хлор-3-индолилD-галактопиранозидом (X-gal), изопропилтиогалактозидом(ИПТГ) и ампициллином для отбора клонов. Чашки с LB инкубировали при 37C в течение ночи. Выделение и секвенирование плазмидной ДНК. Белые пигментированные клоны удаляли с агара LB, инокулировали в среду LB с ампициллином и инкубировали в инкубаторе при перемешивании в течение ночи (37C). Плазмидную ДНК выделяли с использованием системы для очистки ДНК Wizard Plus SV Miniprep (Promega, Madison, WI, США) в соответствии с указаниями производителя. Секвенирование плазмидной ДНК осуществляли с использованием реагентов для секвенирования "Big Dye" (Applied Biosystems, Foster City, CA, США) и праймером промотора T7 в реакции. ДНК осаждали в этаноле и анализировали в секвенаторе ABI Prism DNA377(Applied Biosystems). Пример 2. В этом примере также используется система pET E. coli, описанная в примере 1. Олигонуклеотид для ПА. ОлигонуклеотидыEuroGen Tec. Эквивалентные количества каждого олигонуклеотида отжигали путем их смешивания, нагревания до 95C и охлаждения смеси со скоростью 1C/мин до 65C. Смешанные олигонуклеотиды затем помещали на лед. Эти смешанные олигонуклеотиды образуют двухцепочечную ДНК с липкими концами, совместимыми с сайтами рестриктаз Ncol и BamHI. Таким образом, возможно прямое клонирование дцДНК-вставки. Получение вектора. Вектор pET11d (Stratagene) расщепляли рестриктазами BamHI и Ncol в соответствии с указаниями производителя, для того чтобы добиться полного расщепления. Вектор обрабатывали CIAP в соответствии с указаниями производителя. Расщепленный вектор затем отделяли от отрезанного фрагмента с использованием электрофореза в агарозном геле и очищали путем экстракции из геля. Лигирование. Для лигирования использовали несколько соотношений между вектором и вставкой, в соответствии с рекомендациями производителя. Лигирование осуществляли, используя ДНК-лигазу фага T4 и 10 лигазный буфер (pH 7,6). Реакцию осуществляли в течение ночи при 18C, в соответствии со стандартными способами. Получающийся в результате вектор показан на чертеже. Лигирующую смесь трансформировали в клетки E. coli (DH10B), используя стандартный протокол"тепловой шок". Трансформированные клетки затем инкубировали, наносили на чашки и отбирали. Плазмидную ДНК выделяли из E. coli и секвенировали в соответствии с тем, как описано в примере 1, для того чтобы подтвердить наличие вставки и ее последовательность. Пример 3. Экспрессия и выделение полиаспартата. Очищенную плазмидную ДНК трансформируют в E. coli ER2566, которая экспрессирует ДНКполимеразу T7, под контроль промотора Iac. Трансформированных E. coli выращивают на среде 3XLB,содержащей ампициллин (200 мкг/мл) в течение 7 часов при перемешивании. Экспрессию полиАсп индуцируют в одной культуре через 3 ч путем добавления ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ. Одну культуру оставляют неиндуцированной для сравнения. Культуру можно инкубировать при более низкой температуре с последующей индукцией для увеличения ее эффективности. Клетки собирают и ресуспендируют в одной десятой части объема 10 мМ трис(гидроксиметил)метиламина (Трис) pH 7,5 и обрабатывают ультразвуком. Получающуюся в результате смесь центрифугируют для отделения дебриса и супернатант фильтруют. Аликвоты культуральной среды, обработанных ультразвуком клеток и фильтрат используют в анализе, для того чтобы выяснить, секретируется ли пептид, или остается ли он в клетке, или присутствует в виде растворимого внутриклеточного/периплазматического белка. Белковые образцы отбирают, используя стандартный электрофорез в полиакриламидном геле, используя 15-20% полиакриламидный гель. Наличие полосы приблизительно на уровне 5 кДа указывает на присутствие желаемого продукта. Если необходимо, продукт может быть обнаружен с использованием стандартных способов иммуноблоттинга, таких как вестерн-блоттинг, используя антитела в отношении полиАсп на любой подходящей белковой метке. Пример 4. Идентификация Archea и бактерий, характерных для нефтяных месторождений. Этих микроорганизмов затем можно использовать для обработки углеводородной скважины в немодифицированном виде или предпочтительно генетически модифицированном виде для продуцирования полезного химического соединения для обработки скважин, такого как полиАсп. 1. Материалы и методы. 1.1. Отбор и обработка образца. 1.1.1. Отбор.- 10017608 Стерилизованные стеклянные колбы для образцов на 5 л (Schott) с 5 мл 0,1% (мас./об.) восстановителя резазурина (Sigma Chemical Co., St. Louis, MA, США) на колбу доставляли на находящиеся в открытом море месторождения. Образцы собирали в виде сырого флюида из эксплуатационной скважины(нефть/вода) через эксплуатационный трубопровод перед отделением попутно добываемой воды. Колбы полностью заполняли. Верхний нефтяной слой закрывал воду от атмосферы, предотвращая окисление водных фаз. Образцы посылали на берег в закрытых алюминиевых ящиках (периоды транспортировки 1-2 недели). В процессе транспортировки ящики хранили при температуре окружающей среды. Никаких следов кислорода не было обнаружено в водных фазах по прибытии образцов на берег. 1.1.2. Фильтрация водных образцов. После прибытия в лабораторию нефтяную и водную фазы образцов флюида из эксплуатационной скважины немедленно нагревали (70C; 20 мин) и нагретые фазы разделяли в делительных воронках на 2 л. Биомассу микробов из 1-2 л воды собирали путем фильтрации через 0,22 мкм фильтры Sterivex GV(Millipore Corp., Bedford, Ma, США), соединенные с предфильтрами Millex АР (Millipore). После фильтрации каждый фильтр Sterivex заполняли 2 мкл лизирующего буфера (50 мМ трис-HCl, pH 8,0; 40 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); 750 мМ сахароза) и хранили при -20C до экстракции ДНК. Один из образцов был сильно эмульгирован, что привело в результате к лишь небольшому количеству водной фазы. Эту эмульсионную фазу промывали стерильным буферным раствором, фазы разделяли и фильтровали (приблизительно 1 л фазы буфера), как было описано выше. 1.2. Подсчет клеток. Количество клеток в водных фазах флюида из эксплуатационной скважины подсчитывали немедленно после доставки в лабораторию с использованием эпифлуоресцентной микроскопии. Образцы предварительно фильтровали (Millex AP, Millipore) и 100 мл фильтраты центрифугировали (6000g; 10 мин для удаления крупных частиц и остаточных капель нефти). В супернатанты (10 мл) добавляли флуорохром 4',6-диамино-2-фенилиндол (DAPI; 0,6 мкг/мл) и образцы инкубировали при комнатной температуре (10 мин) с последующей фильтрацией через 0,22 мкм черные поликарбонатные фильтры (Millipore). Фильтры помещали в флуоресцентный микрпоскоп (Leitz Dialux с флуоресцентным блоком Ploemopak и УФ-фильтром А и оборудованный цифровой камерой Leica DC 100) в иммерсионном масле. Флуоресцирующие клетки подсчитывали при увеличении 1250. 1.3. Амплификация образцов из месторождения путем полимеразной цепной реакции (ПЦР). 1.3.1. Экстракция и количественное определение нуклеиновой кислоты. Замороженные фильтры Sterivex с микробными сообществами размораживали и лизировали непосредственно на фильтрах. Лизис осуществляли путем инкубации каждого фильтра с 2 мкг лизоцима(Sigma; из маточного раствора 20 мг/мл; при 37C в течение 30 мин). Смеси затем инкубировали при 55C в течение 2 ч с 1 мкг протеиназы K (Sigma; из маточного раствора 20 мг/мл) и 1 % (масс/об.) додецилсульфата натрия (SDS; BioRad Labs, Richmont, CA, США) из 20% маточного раствора. Лизаты переносили в стерильные пробирки, фильтры Sterivex промывали лизирующим буфером (55C; 10 мин) и лизаты с каждого фильтра объединяли. Лизаты экстрагировали горячей смесью фенол-хлороформизоамиловый спирт (25:24:1) в соответствии со стандартными способами (Sambrook and Russel, 2001). Вкратце, каждый лизат (3 мл) смешивали с 6 мл горячей (60C) смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, забуференной Трис-HCl (pH 8,0), интенсивно перемешивали, поддерживали в горячем состоянии в течение 5 мин, затем охлаждали на льду с последующим разделением фаз путем центрифугирования(4000g; 5 мин при 4C; Jouan Model 1812, Saint Nazaire, Франция). К каждой водной фазе добавляли ацетат натрия (0,2 объема 10 M растворов) и повторно экстрагировали 5 мл смеси фенол-хлороформизоамиловый спирт, забуференной Трис-HCl, с последующим центрифугированием. Водные фазы затем экстрагировали 5 мл горячей (60C) смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали,как описано выше. Экстрагированные водные фазы осаждали 2,5 объемами 96% этанола (-20C; 3 ч),осадки осаждали путем центрифугирования (4000g) и капли осадков промывали 75% этанолом. Капли осадков сушили (N2) после повторного центрифугирования и растворяли в 100 мкл стерильной сверхчистой воды (Biochrom AG, Berlin, Germany). Экстракты нуклеиновой кислоты замораживали (-20C). Экстрагированные нуклеиновые кислоты оценивали с использованием полуколичественного метода анализа, используя бромистый этидий (Sambrook and Russel, 2001). Нуклеиновые кислоты (2 мкл) наносили пятнами на УФ трансиллюминационный столик (BioRad), накрытый пластиковой пленкой ("GladPak") и в каждое пятнышко добавляли 2 мкл бромистого этидия (10 мг/мл в буфере TE, pH 8,0). Пятнышки фотографировали под УФ-освещением и концентрации определяли по интенсивности окрашивания по сравнению со стандартными сериями ДНК лосося (Sigma) в диапазоне 100-500 нг ДНК на пятнышко. 1.3.2. Олигонуклеотиды и реагенты для ПЦР. 1.3.2.1. Олигонуклеотиды для амплификации путем ПЦР. Получали олигонуклеотидные праймеры, специфичные в отношении бактерий и Archea (Teske et al.,1996; DeLong, PNAS USA 89 (1): 5685-9, 1992). БактерииArchea 21fARCH: 5'-TTC-CGG-TTG-ATC-CCG-CCG-GA-3' (прямой праймер) 958rARCH: 5'-CCC-GGC-GTT-GAA-TTC-AAT-T-3' (обратный праймер) Ожидаемый продукт ПЦР: 938 п.о. Праймеры были синтезированы в EuroGentec, Seraing, Бельгия. Праймеры разводили в стерильной воде в концентрации 50 мкМ, распределяли по 50 мкл аликвотам и хранили при -20C. 1.3.2.2. Биотинилированные олигонуклеотиды. Было получено множество биотинилированных олигонуклеотидов ДНК (5'- и 3'-меченных) (Teske etal., 1996; Massana et al., 1997) для анализа продуктов ПЦР методом саузерн-блоттинга:подраздел/грамположительные бактерии (включающие в себя Desulfovibrio и Desulfobulbus) 385 SRB: Биотин-5'-CGG-CGT-CGC-TGC-GTC-AGG-3'-Биотин Температура гибридизации: 50C.Euryarchaeota (Группа II Archea) 554ARCH-II: Биотин-5'-TTA-GGC-CCA-ATA-AAA-KCG-AC-3'-Биотин Температура гибридизации: 40C. Все биотинилированные праймеры были синтезированы в EuroGentec, Seraing, Бельгия. Праймеры разводили в стерильной воде в концентрации 50 мкМ, распределяли по 50 мкл аликвотам и хранили при 20C. 1.3.2.3. Дезоксинуклеотиды. Маточные растворы дезоксинуклеотидов (дНТФ) готовили путем разбавления 100 мМ дНТФ. 2'-дезоксиаденозин 5'-трифосфата (дАТФ),2'-дезокситимидин 5'-трифосфата (дТТФ),2'-дезоксигуанозин 5'-трифосфата (дГТФ) и 2'-дезоксицитидин 5'-трифосфата (дЦТФ) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, США). Каждый дНТФ (100 мкл) разводили в стерильной воде (600 мкл), получая в результате конечную концентрацию 10 мМ каждого дНТФ. Растворы распределяли по 50 мкл аликвотам и хранили при -20C. 1.3.3. Проявительная ПЦР (touchdown PCR). Экстрагированные ДНК (см. выше) или суспензии лизированных микробных клеток использовали в качестве ДНК-матрицы для амплификации путем ПЦР. Когда использовали суспензии лизированных клеток, бульонные культуры разводили в стерильной воде (10-2) или колонии с чашек с агаровой средой суспендировали в стерильной воде с последующим нагреванием (100C) в течение 10 мин. 100 мкл смеси для ПЦР, состоящей из 20 мкл дНТФ (10 мМ), 10 мкл прямого праймера (50 мкМ),10 мкл обратного праймера (50 мкМ), 55 мкл стерильной воды и 5 мкл ДНК-полимеразы AmpliTaq(Perkin Elmer Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, США). ДНК-матрицу (1-10 мкл) разводили в 10 мкл [10] буфера для ПЦР с 15 мкМ MgCl2 (Perkin Elmer Roche) и стерильной водой до конечного объема 90 мкл. Смесь нагревали (95C) в течение 5-10 мин на нагревающем блоке. 10 мкл смеси для ПЦР добавляли в каждый образец, пока они еще находились в нагревающем блоке (95C), и образцы немедленно переносили в ДНК-термоциклер (DNA Thermal Cycler, iCycler, BioRad). ПЦР проводили в виде проявительного способа для уменьшения образования ложных побочных продуктов, используя следующую последовательность циклов: Денатурация: 95C в течение 1 мин. Отжиг праймеров: 65-55C в течение 1 мин. Синтез ДНК (удлинение праймера): 72C в течение 3 мин. Число циклов: 35. В течение первых 10 циклов температуру отжига постепенно уменьшали с 65 до 55C на 1C на каждый цикл в течение первых 10 циклов, с последующими 25 циклами с температурой отжига 55C. Работу ПЦР останавливали посредством использования температуры 72C в течение 15 мин перед охлаждением до 4C.- 12017608 1.3.4. Электрофорез в агарозном геле. 1.3.4.1. Аналитический электрофорез. Продукты ПЦР анализировали путем электрофореза в горизонтальном агарозном геле. Образцы (27 мкл) смешивали с [10] гель-загрузочным (gel-loading) буфером TBE (3 мкл) (0,9 М Трис, 0,9 М борат, 20 мМ ЭДТА, pH 8,3, 50% (об. %) глицерин, 0,25% (мас./об.) бромфеноловый синий). В качестве стандарта использовали лэддер ДНК с низкой массой (Low DNA Mass Ladder, Gibco BRL, Paisley, Великобритания) в количестве 12 мкл стандарта в 3 мкл [10] гель-загрузочного буфера ТВЕ. Гели готовили путем нагревания агарозы (2,0 г; Sigma) в 160 мл [0,5] ТВЕ (0,045 М Трис, 0,045 М борат,1 мМ ЭДТА, pH 8,3) в микроволновой печи (4 мин) с последующим охлаждением до 50C на водяной бане. К агарозе добавляли бромистый этидий (10 мкл) из маточного раствора (10 мг/л бромистого этидия в стерильной воде) и расплавленный гель заливали горизонтально в пластиковый поддон (открытые края поддона запаяны) с гребенкой на 15 лунок или 20 лунок в аппарате для электрофореза (BioRad). Гель,погруженный в буфер ТВЕ [0,5], оставляли на 20 мин при комнатной температуре и гребенку и перемычки осторожно убирали. Приготовленные образцы и стандарт (см. выше) наносили в погруженные лунки геля (20 мкл образца и 10 мкл стандарта) и электрофорез проводили при постоянном напряжении (150 В) в течение 1,5-2 ч при комнатной температуре, Визуализацию геля осуществляли на УФ трансиллюминационном столике(BioRad). Гели фотографировали на черно-белую пленку Polaroid (время экспозиции 0,1-0,5 с) или на цифровую камеру (GelDoc, 2000, BioRad). 1.3.4.2. Препаративный электрофорез. Препаративный электрофорез в агарозном геле осуществляли в основном, как описано выше для аналитического подхода, за исключением того, что использовали легкоплавкую агарозу (Sigma). Агарозу (1,3 г) плавили в 160 мл [0,5] буфера ТВЕ или [1] буфера ТАЕ (0,04 М Трис-ацетат, pH 8,0; 1 мМ ЭДТА),раствор геля охлаждали до 35-50C, добавляли бромистый этидий, и получали горизонтальный гель, как описано выше, за исключением того, что температуру устанавливали на уровне 4-5C. Образцы наносили в соответствии с тем, как описано выше, и электрофорез проводили при постоянном напряжении 100 В в течение 1,5-2 ч. После электрофореза гели фотографировали и отобранные полосы ДНК вырезали из агарозы стерильным скальпелем и переносили в микроцентрифужные пробирки. Перед дополнительной обработкой вырезанные кусочки агарозы обрабатывали путем быстрого центрифугирования и плавили при 65C в течение 15 мин. Образцы поддерживали в расплавленном состоянии при 35-37C. 1.3.5. Саузерн-блоттинг и гибридизация. 1.3.5.1. Блоттинг. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР с саузерн-блоттингом осуществляли, как описано выше (аналитический подход), за исключением того, что в гель не добавляли бромистый этидий. ДНК переносили из геля на мембраны Hybond N+ (Amersham Pharmacia) путем диффундирующего блоттинга(diffusion blotting). После электрофореза гель замачивали в 10 объемах денатурирующего раствора (0,5 МNaOH, 1,5 М NaCl) на 220 мин (медленное перемешивание) с последующей нейтрализацией (1 М ацетат аммония) в течение 215 мин. Гель затем обрезали и помещали на стеклянную пластинку с хроматографической бумагой (3 мм Chr, Whatman, Maidstone, Великобритания), вымоченной в 1 М ацетате аммония. Концы хроматографической бумаги помещали в ванночку с буфером для переноса (0,2 М ацетат аммония). Гель окружали тонкой пластиковой пленкой ("GladPak") для предотвращения выпаривания буфера для переноса. Мембрану для переноса Hybond N+ вымачивали в 0,2 М ацетате аммония и помещали плотно на поверхность геля. Несколько слоев хроматографической бумаги (вымоченной в 0,2 М ацетате аммония) помещали на поверхность мембраны и стопку бумажных салфеток (5-8 см) помещали на поверхность хроматографических бумаг. Стеклянную чашку с грузом (300-400 г) помещали сверху бумажных салфеток. Перенос ДНК осуществляли в течение ночи (8-12 ч) при комнатной температуре и бумажные салфетки меняли, когда они становились влажными. Качество блоттинга контролировали путем окрашивания геля в ванночке с бромистым этидием (0,5 мкг/мл в воде) в течение 45 мин. После блоттинга ДНК фиксировали на мембране Hybond под УФ светом в течение 40 с. Мембраны немедленно гибридизовали или помещали в пластик и хранили в темноте при 4C. 1.3.5.2. Гибридизация. Перед гибридизацией фиксированные мембраны предварительно гибридизовали в растворе (10 мл) 3SSC (растворе хлорида и цитрата натрия), 0,1% SDS и 1,0% блокирующего агента (Roche MolecularBiochemicals) в течение 2 ч при выбранной температуре гибридизации для различных ДНК-зондов (см. выше) в гибридизаторе Roller-Blot HB-3D (Techne, Cambridge, Великобритания). Биотинилированные ДНК-зонды затем помещали во вращающиеся колбы в гибридизаторе и инкубировали в течение 16-20 ч при температурах, описанных для различных ДНК-зондов (см. выше). После гибридизации мембраны промывали в течение 10 мин в 50 мл 2SSC - 0,1% SDS, 10 мин в 50 мл 0,1SSC - 0,1% SDS и 10 мин физиологическим раствором с фосфатным буфером T (PBS-T) (все про- 13017608 мывки осуществляли при комнатной температуре). Мембраны инкубировали с экстравидинпероксидазой (Extravidin-Peroxydase; Sigma Chemical Co., St. Louis., MO), разбавленной PBS-T в отношении 1:2000, в течение 30 мин при комнатной температуре (перемешивание), промывали 210 мин PBS-T,10 мин PBS (комнатная температура) и окрашивали (10-20 мин) в 30 мл PBS с использованием 2 таблеток диаминобензидина (DAB; Sigma) и 24 мл 30% безводной H2O2. После окрашивания мембраны промывали водопроводной водой и фотографировали. 1.4. Денатурирующий электрофорез в градиенте концентрации геля (ДЭГГ). 1.4.1. Аналитический ДЭГГ. ДЭГГ подвергали продукты ПЦР, образованные с использованием общих праймеров, определяющих бактерий (341fBAC и 907rBAC) или Archea (21fARCH и 958rARCH). К праймерам 341fBAC и 21fARCH добавляли 40-членную GC-шпильку к 5'-концу (5'-CGC-CCG-CCG-CGC-GCG-GCG-GGCGGG-GCG-GGG-GCA-CGG-GGG-G-3'). ДЭГГ осуществляли с использованием 6% (мас./об.) полиакриламидных гелей (ПААГ) в [0,5] буфере ТАЕ (20 мМ Трис-ацетат, pH 7,4; 10 мМ ацетат, 0,5 мМ ЭДТА) с градиентом 20-70% денатурирующих агентов мочевины и формамида (100% денатурирующие агенты соответствуют 7 М мочевине и 40%(об.%) деионизированному формамиду) в универсальной системе для обнаружения мутаций DCode Universal Mutation Detection system (BioRad). Маточные растворы полиакриламида (ПАА)/бис-акриламида (БАА) (40%) состояли из 38,93 г акриламида и 1,07 г БАА, растворенных в деионизированной воде до конечного объема 100 мл, в то же время маточные растворы [50] буфера ТАЕ получали путем смешивания 242 г Трис, 57,1 г уксусной кислоты и 100 мл 0,5 М ЭДТА в общем объеме 1000 мл с деионизированной водой. Готовили гели с линейным градиентом концентрации (толщина 1 мм) путем смешивания ПАА и БАА с денатурирующими агентами до получения линейного градиента концентрации от 20 до 70% в системе для получения градиента концентрации (BioRad модель 475). Растворы с 20% или 70% денатурирующими агентами описаны в табл. 1 ниже: Таблица 1. Состав 20 и 70% денатурирующих растворов, используемых в ДЭГГ. Для приготовления одного геля 18 мл каждого раствора смешивали с 200 мл персульфата аммония(10% (мас./об.) в деионизированной воде) и 20 мкл N,N,N'N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED) (BioRad) и смеси немедленно переносили в один из двух шприцев на 30 мл, которые затем закрепляли в системе для получения градиента. Гель заливали как параллельный градиентный гель (1616 см) с толщиной 1 мм и оставляли полимеризоваться в течение приблизительно 1 ч с гребенкой на 15 лунок. Камеру для электрофореза заполняли (1) буфером ТАЕ, который нагревали до 60C в камере и 1-2 полимеризованные геля помещали вертикально в камере для электрофореза. Образец каждого продукта ПЦР (10 мкл) смешивали с 10 мкл буфера для образца (0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилолцианол, 70% глицерин, разведенный в деионизированной водой) и весь объем (20 мкл) наносили в каждую лунку. Вертикальный электрофорез осуществляли при постоянной температуре (60C) и напряжении (150 В) до тех пор, пока оба маркера не мигрировали к нижнему концу геля (приблизительно 4,5 ч). После электрофореза гели окрашивали в SYBR Gold (Molecular Probes, Leiden, Нидерланды), разведенном в [1] ТАЕ в отношении 1:10000, в течение 20-30 мин. Гели затем фотографировали с использованием системы GelDoc (BioRad). Картины полос на гелях сопоставляли в отношении сходства и индексов сходства, рассчитываемых в опции Quantity One программы GelDoc. Использовали способ с коэффициентом близости (dice coefficient), основанный на следующей формуле для оценки сходства: где S и T представляют собой векторы, представляющие собой две линии в одном и том же наборе полос, которые сравнивают. 1.4.2. Препаративный ДЭГГ.- 14017608 Препаративный ДЭГГ осуществляли в соответствии с тем, как описано для аналитического ДЭГГ,за исключением того, что вместо БАА в процессе приготовления геля использовали N,N'-бисакрилилцистеин (БАЦ; Sigma). БАЦ позволил остаться гелевому раствору годным после электрофореза(Muyzer et al., 1996). Образцы для ПЦР (300 мкл) осаждали с использованием 30 мкл 5 М NaCl и 750 мкл этанола при 80C в течение 1 ч, центрифугировали (20000g, 2 мин) в микроцентрифуге (Eppendorf Model 5417C, Eppendorf., Hamburg, Германия). Осадок промывали 70% этанолом, сушили на нагревающем блоке (35C,20 мин) и растворяли в 30 мкл стерильной воды. Гель заливали, образцы наносили и электрофорез проводили в соответствии с тем, как описано выше. Гель окрашивали после электрофореза SYBR Gold (см. выше) и избранные полосы вырезали при УФосвещении стерильным скальпелем. Каждый кусочек геля переносили в пробирку для микроцентрифуги,промывали 210 мин 100 мкл стерильной воды и воду удаляли. Добавляли -меркаптоэтанол (100 мкл;BioRad) и пробирки инкубировали в течение 16-20 ч при 37C. В каждую пробирку добавляли деионизированную воду (100 мкл), 0,1 объем 5 М NaCl и 2,5 объема ледяного этанола. Пробирки инкубировали при -80C в течение 2 ч, центрифугировали (10000g, 20 мин) в микроцентрифуге и супернатант осторожно удаляли. Пробирки сушили (35C, 20 мин) и осадок растворяли в 100 мкл стерильной воды. Содержание в образцах продуктов ПЦР оценивали в тех случаях, где ПЦР проводили с праймерами,определяющими бактерии, но без GC-шпильки. Продукты ПЦР затем очищали с использование препаративного электрофореза в агарозном геле с использованием низкоплавкой агарозы (см. выше). 1.5. Клонирование. 1.5.1 Клонирование TOPO ТА. Клонирование осуществляли с использованием набора для клонирования TOPO TA (Invitrogen,Carlsbad, CA, США) с плазмидным вектором pCR 2.1-TOPO и химически компетентных клеток Escherichia coli One Shot TOP10. ДНК амплифицировали с использованием ПЦР, используя праймеры 341fBAC и 907rBAC, определяющие бактерии. ПЦР осуществляли в соответствии с тем, как описано выше (см. раздел 3.4.3), за исключением того, что конечную остановку реакции при 72C продлевали до 10 мин для того, чтобы создать адениновые выступы на 3'-конце. Продукты ПЦР очищали путем препаративного электрофореза в агарозном геле с использованием легкоплавкой агарозы в соответствии с тем, как описано выше (см. раздел 3.4.4). Кусочки геля с продуктами ПЦР плавили в соответствии с тем, как описано (65C, 15 мин), и поддерживали в расплавленном состоянии при 37C до встраивания в вектор. Расплавленные кусочки агарозы (4 мкл) осторожно смешивали с 1 мкл солевого раствора (1,2 МNaCl, 0,06 М MgCl2) и 1 мкл вектора TOPO pCR 2.1. Лигирование осуществляли в течение 10 мин при 37C. Пробирки помещали на лед и на льду (15 мин) осуществляли трансформацию вектора (4 мкл) в химически компетентные клетки TOP10 (50 мкл) с последующим тепловым шоком (42C, 30 с), и немедленно переносили на лед (10 мин). Трансформирующую реакционную смесь разводили в 250 мкл средыSOC (2% триптон, 0,5% экстракт из дрожжей, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) и реакцию осуществляли в перемешивающем инкубаторе при горизонтальном перемешивании (200 об/мин) при 37C в течение 1 ч. Суспензии распределяли по чашке с агаровой средой Луриа-Бертани (LB) (1,5% агар, 1,0% триптон,0,5% экстракт из дрожжей, 1,0% NaCl, pH 7,0; Sigma), дополненной 50 мкг/мл антибиотика ампициллина или канамицина. Перед инокулированием на чашки наносили X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолилDгалактопиранозид; Sigma), 40 мкл 40 мг/мл X-gal в диметилформамиде. Суспензии (20 и 50 мкл) трансформантов распределяли на чашках с агаровой средой LB (20 мкл суспензии разбавляли 20 мкл среды SOC перед распределением на чашке для того, чтобы обеспечить равномерное распределение). Чашки инкубировали в течение 20-24 ч при 37C. Только трансформанты со встроенной плазмидой росли на среде вследствие наличия в плазмиде гена устойчивости. Колонии с продуктами ПЦР, встроенными в вектор, визуализировали в виде былых колоний в противоположность светло- или темно-синим колониям с векторами без встроенного продукта ПЦР. Отдельные белые колонии выделяли в жидкой среде LB, дополненной ампициллином или канамицином (50 мкг/мл). Среду распределяли по 24-луночным стерильным планшетам для тканевых культур (Corning Inc., Corning, NY,США) в количестве 2 мл среды/лунка. Клоны инкубировали в течение 20-24 ч на среде LB и плазмиды очищали. 1.5.2. Выделение плазмид. Плазмиды выделяли с использованием набора для выделения плазмид GenElute Plasmid Miniprep(Sigma) в соответствии с указаниями производителя. Клоны трансформантов (2 мл) собирали путем центрифугирования в микроцентрифуге (Eppendorf) при 14000g в течение 2 мин. Осадки ресуспендировали в растворе для ресуспендирования (200 мкл) путем перемешивания. Добавляли лизирующий раствор (200 мкл), смесь осторожно переворачивали до ее осветления (8-10 раз) и лизис нейтрализовали в течение 3-5 мин с использованием 350 мкл смеси ней- 15017608 трализующий буфер/связывающий буфер. Дебрис осаждали путем центрифугирования (14000g в течение 10 мин). Супернатанты переносили в связывающие колонки GenElute Miniprep, вмонтированные в микроцентрифужные пробирки, центрифугировали (14000g в течение 2 мин) и проточную жидкость удаляли. Связывающие колонки затем промывали 750 мкл промывающего раствора и центрифугировали(14000g в течение 2 мин), вытекающий раствор удаляли и колонки повторно центрифугировали(14000g в течение 2 мин) для удаления каких-либо дополнительных растворов. Связывающие колонки затем переносили в новые микроцентрифужные пробирки, добавляли 100 мкл стерильной воды и пробирки центрифугировали (14000g в течение 2 мин). Выделенные растворы с плазмидами хранили при 20C. 1.5.3. Контроль позитивного встраивания продуктов ПЦР. Позитивное встраивание продуктов ПЦР в трансформирующий вектор контролировали путем ПЦР с праймерами M13, определяющими последовательности вектора, фланкирующие вставленную последовательность. Последовательности праймера: Прямой праймер М 13 (-20): 5'-GTA-AAA-CGA-CGG-CCA-G-3' Обратный праймер М 13: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-AC-3' Сайты праймера соответствовали основаниям 391-406 (прямой праймер М 13 -20) и 205-221 (обратный праймер M13) фрагмента LacZa вектора. Плазмида без позитивной вставки продукта ПЦР приводила в результате к продукту ПЦР М 13 202 п.о., тогда как позитивный продукт ПЦР приводил в результате к продукту ПЦР 769 п.о. Смесь ПЦР получали в соответствии с тем, как описано выше (см. раздел 3.4.3) с набором праймеров M13 (50 мкМ маточные растворы). Плазмидную ДНК-матрицу (2 мкл) разводили в буфере для ПЦР и стерильной воде до конечного объема 90 мкл в соответствии с тем, как описано выше, смешивали со смесью ПЦР. ПЦР проводили в соответствии со следующей последовательностью циклов: Первичная денатурация: 94C в течение 2 мин. Денатурация: 95C в течение 1 мин. Отжиг праймеров: 55C в течение 1 мин. Синтез ДНК (удлинение праймеров): 72C в течение 1 мин. Число циклов: 30. ПЦР останавливали при 72C (7 мин) и охлаждении до 4C. 1.5.4 Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Продукты ПЦР М 13 с позитивной вставкой продуктов ПЦР анализировали с использованием рестриктаз EcoR1 (Sigma), HaeIII (Sigma) и RsaI (Sigma), Рестриктазы и соответствующие ферменты (предлагаемые производителем; Sigma) описаны в табл. 2. Таблица 2. Характеристики рестриктаз и их буферов. А) Одна единица активности каждого фермента расщепляет 1 мг ДНК в течение 1 ч при 37C. Плазмидную ДНК, амплифицированную путем ПЦР М 13 (1, 5 или 10 мкл), смешивали с рестриктазами: 1,0 мкл EcoRI (40 Ед), 2,0 мкл HaeIII (20 Ед) или 2,0 мкл RsaI (20 Ед). Каждую смесь разводили до общего объема 50 мкл соответствующими буферами для ферментов в концентрации [1] (см. табл. 2). Реакционные смеси инкубировали при 37C в течение 2,5 ч и помещали на лед для остановки реакции. Расщепление ферментами анализировали по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) путем- 16017608 аналитического электрофореза в агарозном геле. 1.6. Секвенирование плазмидной ДНК. Очищенные плазмиды для секвенирования представляли собой плазмиды, амплифицированные путем ПЦР с набором праймеров M13. ДНК оценивали с использованием способа с бромистым этидием и осаждали 60% этанолом и 0,1 М Na-ацетатным буфером (pH 4,6). Осажденные продукты ПЦР подвергали секвенированию ДНК (MedProbe). Последовательности плазмид были представлены на рассмотрение в Национальный Центр Биотехнологической Информации (National Centre for Biotechnology Information (NCBI с использованием программы BLAST базы данных NCBI (Altschul et al., 1997). Филогенетические деревья и матрицы длины (distance matrices) определяли с использованием программы Phylip interphase of the Ribosomal Database Project (RDP; Maidak et al., 1997). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ обработки углеводородной скважины, при котором внутрь ствола эксплуатационной углеводородной скважины вводят термофильные микроорганизмы, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для обработки указанной скважины, представляющего собой ингибитор образования твердого осадка, ингибитор образования гидратов, ингибитор образования асфальтеновых отложений, ингибитор образования парафиновых отложений или ингибитор коррозии, где химическое соединение является белком или пептидом, спиртом, глицерином, антифризом,биосурфактантом или органической кислотой. 2. Способ по п.1, где указанный термофильный микроорганизм также является галофильным и анаэробным. 3. Способ по п.1 или 2, где указанный термофильный микроорганизм является характерным для углеводородного месторождения, в котором расположена скважина, подлежащая обработке. 4. Способ по любому из пп.1-3, где по меньшей мере 50% всех аминокислот в указанном белке или пептиде имеют заряженные боковые цепи. 5. Способ по п.4, где указанные заряженные аминокислоты представляют собой аспарагиновую кислоту. 6. Способ по п.4, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер. 7. Способ по любому из пп.1-6, где указанный микроорганизм представляет собой термофильную архебактерию. 8. Способ по любому из пп.1-7, где указанное химическое соединение секретируется микроорганизмом. 9. Способ по любому из пп.1-8, где указанный микроорганизм вводят в ствол скважины с помощью пористой частицы. 10. Частицы, импрегнированные термофильными микроорганизмами, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, где химическое соединение представляет собой белок или пептид, спирт,глицерин, антифриз, биосурфактант или органическую кислоту. 11. Частицы по п.10, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер. 12. Композиция для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, включающая в себя жидкость-носитель, содержащую термофильные микроорганизмы, которые были генетически модифицированы для продуцирования химического соединения для указанной обработки, где химическое соединение представляет собой белок или пептид, спирт, глицерин, антифриз, биосурфактант или органическую кислоту. 13. Композиция по п.12, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер. 14. Термофильный микроорганизм, созданный путем генной инженерии для продуцирования химического соединения для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6. 15. Микроорганизм по п.14, который представляет собой архебактерию. 16. Микроорганизм по п.14 или 15, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер. 17. Способ трансформации микроорганизма с получением термофильного микроорганизма по любому из пп.14-16, при котором в указанный микроорганизм вводят молекулу нуклеиновой кислоты, экспрессия которой приводит к продуцированию химического соединения, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6. 18. Способ по п.17, где указанное химическое соединение представляет собой полиаспарагиновую кислоту или ее сополимер.- 17017608 19. Способ обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, при котором внутрь ствола скважины вводят химическое соединение, как оно определено в любом из пп.1 или 4-6, причем указанное химическое соединение было собрано из биореактора, содержащего микроорганизмы по любому из пп.14-16. 20. Способ по п.19, где указанное химическое соединение доставляют в ствол скважины с помощью пористых частиц.

МПК / Метки

МПК: C09K 8/58, C07K 14/00, C12N 15/00, C09K 8/582

Метки: углеводородной, эксплуатационной, термофильный, композиция, микроорганизмами, скважины, способ, способы, обработки, частицы, импрегнированные, микроорганизм, такими, получения, ствола

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/19-17608-sposoby-i-kompoziciya-dlya-obrabotki-stvola-ekspluatacionnojj-uglevodorodnojj-skvazhiny-termofilnyjj-mikroorganizm-sposob-ego-polucheniya-i-chasticy-impregnirovannye-takimi-mikroor.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способы и композиция для обработки ствола эксплуатационной углеводородной скважины, термофильный микроорганизм, способ его получения и частицы, импрегнированные такими микроорганизмами</a>

Похожие патенты