Трехмерный колориметрический набор проб

Номер патента: 409

Опубликовано: 24.06.1999

Авторы: Ричерт Анки, Черич Дебора

Есть еще 7 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Трехмерные полимерные многослойные наборы проб, которые изменяют цвет в присутствии аналита, включающие:

a) лиганды, имеющие прямое сродство к определяемому при анализе веществу-аналиту, или которые могут действовать как конкурентные связующие к аналиту,

b) линейные структурные линкеры, имеющие два терминальных конца, причем указанные линкеры на их первых терминальных концах прикреплены к указанным лигандным составляющим,

c) сопряженный полимерный каркас, к которому указанные структурные линкеры привязаны на их вторых терминальных концах, и

d) упорядочивающие головные группы, которые привязаны к поверхности сопряженного полимерного каркаса в местах, не занятых структурным линкером,

причем указанные наборы выполнены в виде липосом, имеющих форму двойной цепи; сплетенную, слоистую, спиральную, трубчатую или волокнистую форму.

2. Наборы по п.1, в которых лиганды со сродством к аналитам выбраны из группы, состоящей из биомедицинских тестовых проб, патогенов, лекарственных препаратов, радиоактивных металлов или промышленных материалов.

3. Наборы по п.2, в которых указанные биомедицинские тестовые пробы выбраны из группы, включающей патогены и инфицированные ими клетки, лекарственные препараты, гормоны, компоненты крови, индикаторы заболеваний, компоненты клеток, антитела, лектины, ферменты, генетический материал и их метаболические производные.

4. Наборы по п.2, в которых указанные патогены выбраны из группы, включающей вирусы, бактерии, паразиты.

5. Наборы по п.4, в которых указанные вирусы выбраны из группы, включающей вирусы гриппа, простуды, коревой краснухи, ветряной оспы, гепатита А и В, простого герпеса, полиомиелита, оспы, чумы, ВИЧ, коровьей оспы, бешенства, вирус Эпштейна-Барра, реовирус, риновирус, а также мутации, их элементы, распознаваемые лигандами.

6. Наборы по п.4, в которых указанные бактерии выбраны из группы, включающей кишечную палочку, бактерию туберкулеза, сальмонеллу, стрептококк, а также мутации, штаммы и элементы их распада.

7. Наборы по п.4, в которых указанные паразиты и другие патогены выбраны из группы, включающей возбудителей малярии, сонной болезни, речной слепоты и токсоплазмоза.

8. Наборы по п.1, в которых указанные трехмерные полимерные многослойные наборы проб включают лиганд со сродством к патогенному аналиту.

9. Наборы по п.8, в которых аналит является вирусом.

10. Наборы по п.8, в которых указанный лиганд выбран из группы, включающей фактор эпидермиального роста для аналита коровьей оспы, рецептор ацетилхолин для аналита бешенства, комплементный рецептор для аналита вируса Эпштейна-Барра, бета-адренергический рецептор для аналита реовируса, ICAM-1 для аналита риновируса, рецептор полиовирусов для аналита вируса полимиелита, аналит трисахарида для аналита холерного токсина, тетрасахарид для нейтрофильного аналита, а также их производные и аналоги, способные соединяться с аналитом.

11. Наборы по п.8, в которых указанный лиганд является сиаловой кислотой и ее производными и аналогами, которые будут привязываться к коронавирусам, вирусу гриппа, энцефаломиелита, chlamydia, sendi virus, свинки, болезни Ньюкастла, миксовирусу, вирусу энцефаломиокардита, менингита или малярии.

12. Наборы по п.8, в которых указанный лиганд выбран из группы, включающей тетрасахариды, пептиды клеточной адгезии, трисахариды и трансмембранные рецепторы.

13. Наборы по п.8, в которых лиганд, предназначенный для обнаружения ВИЧ аналитов, выбран из группы, включающей CD4, sCD4, CD26, вазоактивный интестинальный пептид, пептид Т, сиаловую кислоту, а также их производные и аналоги, способные соединяться с ВИЧ.

14. Наборы по п.1, в которых указанный полимер состоит из полимеризующихся липидных мономеров.

15. Наборы по п.14, в которых указанные мономеры выбраны из группы, включающей ацетилены, диацетилены, алкены, тиофены, имиды, акриламиды, метакрилаты, виниловый эфир, яблочный ангидрид, уретаны, аллиламины, силоксаны анилины, пиролы и винилпиридин.

16. Наборы по п.15, в которых указанный полимерный каркас состоит из мономеров диацетилена.

17. Наборы по п.1, в которых указанные упорядочивающие головные группы являются гидрофильными с возможностью взаимной водородной связи.

18. Наборы по п.17, в которых указанные упорядочивающие головные группы выбраны из группы, включающей: -СН2ОН,

-CH2OCONHPh, -CH2OCONHEt, -CH2CH(Et)OCONHPh, -(CH2)9OH,

-CH2OCOPh, -CH2OCONHMe, -CH2OTs, -CH(OH)Me,

-CH2OCOR2, где R2 является n-С5Н11, n-C7H15, n-C9H19, n-С11Н23, n-C13H27, n-C15H31, n-C17H35, Ph, PhO или о-(НO2С)С6Н4, -OSO2R2, где R2 является Ph, р-МеС6Н4, р-FС6Н4,

р-СlС6Н4, р-ВrС6Н4, р-МеОС6Н4, m-СF3С6Н4, 2-С10Н7 или Me -СO2М, где М является К, HNa или Ва/2,

-CH2OCONHR2 или - CH2CONHR2, где R2 является Et, n-Bu, n-С6Н13, n-C8H17, n- C12H25, цикло С6Н11, Ph, р-МеС6Н4, m-МеС6Н4,

о- СlС6Н4, m- СlС6Н4, р-СlС6Н4, о- МеОС6Н4, 3-Тиенил, Me, Et, Ph,

1-С10Н7, Et, Ph, Et OCOCH2, Bu OCOCH2, Me, Et, i-Pr, n-С6Н13,

Et OCOCH2, Bu OCOCH2, Ph, 2, 4 (NO2)2С6Н3ОСН2 или СН2СН2OН.

19. Наборы по п.17, в которых указанные упорядочивающие головные группы являются карбоновой кислотой.

20. Наборы по п.1, в которых несвязывающий терминал мономеров выбран из группы, включающей: СН3-, СН3О, nео-С5Н11О-, цикло-С6Н11О, PhCH2O-, р-АсС6Н4O-, р-ВZС6Н4О-, р-ВrС6Н4СОСН2O-, р-(РhСН=СНСО)С6Н4O-, р-(РhСОН=СН)С6Н4O-, oBzC6H4NH-, р-BzC6H4NH-, MeOCH2CH2NH-, n-С6Н13NН- и ЕtO-.

21. Наборы по п.20, в которых терминал является метиловой группой.

22. Наборы по п.1, в которых наборы привязаны к каркасу за счет взаимодействия химических групп наборов с поверхностью каркаса.

23. Наборы по п.22, в которых каркас выбран из группы: сефадекс, силикагель, сефароза, полиакринитрилы, фильтры, золото, кремниевые пластинки, силикагель.

24. Способ изготовления трехмерных полимерных многослойных наборов проб по п.1, включающий:

a) соединение диеновых мономеров с лигандами в органическом растворителе,

b) испарение растворителя с образованием сухого липидного продукта,

c) повторное получение суспензии указанного сухого продукта в жидкости, выбранной из группы, состоящей из воды и водного раствора, с образованием реакционного раствора,

d) нагрев реакционного раствора выше температуры основного фазового перехода диеновых мономеров,

e) перемешивание реакционного раствора и охлаждение его до, по крайней мере, 4шС, и

f) полимеризацию реакционного раствора.

25. Способ по п.24, в котором на этапе а) растворитель выбран из хлороформа, бензола, алкоголя, циклогексана, хлористого метилена, ацетонитрила и четыреххлористого углерода.

26. Способ по п.24, в котором водный раствор этапа с) выбран из группы, состоящей из буферного раствора, клеточэющ среды, физиологического раствора, физиологического раствора с фосфатным буфером, буфера Trizma, HEPES и MOPS.

27. Способ по п.24, в котором перед охлаждением на этапе е) раствор фильтруют.

28. Способ по п.24, в котором смесь диен - лиганд охлаждают при температуре между 4 и -20шС в течение времени между 5 мин и 5 ч.

29. Способ по п.28, в котором смесь охлаждают при температуре между 0 и -15шС в течение времени между 5 и 20 мин.

30. Способ по п.29, в котором смесь охлаждают при температуре между 0 и -5шС в течение времени между 5 и 12 мин.

31. Способ по п.24, в котором смесь диен - лиганд охлаждают во время полимеризации до температуры между 1 и 22шС.

32. Способ по п.31, в котором смесь диен - лиганд охлаждают во время полимеризации до температуры между 16 и 19шС.

33. Способ по п.24, в котором полимеризация достигается за счет ультрафиолетового облучения при использовании лампы с узким лучом или ручной лампы.

34. Способ по п.24, в котором полимеризация достигается за счет гамма-излучения, электронного пучка или рентгеновского излучения или другого ионизирующего источника низкой энергии.

35. Способ по п.24, в котором полимеризация выполняется с дозой энергии в 10-100 МДж/см2.

36. Способ для непосредственного обнаружения аналита в растворе, включающий:

a) контакт взвешенных наборов проб по п.1 с тестовой пробой, и

b) наблюдение за раствором на предмет изменения в цвете, указывающего на присутствие аналита

Евразийский патент действует на территории всех Договаривающихся государств, кроме AM и MD.

Текст

Смотреть все

1 Настоящая заявка является частичным продолжением поданных ранее заявок на патенты США 08/289384, поданной 11 августа 1994 г., и 08/328237, поданной 24 октября 1994 г., которые обе являются частичным продолжением заявки 08/159927, поданной 30 ноября 1993 г., являющейся частичным продолжением заявок на патенты США 07/982189,поданной 25 ноября 1992 г., и 07/976697, поданной 13 ноября 1992 г., причем обе последние связаны с заявкой на патент США 07/617988,поданной 26 ноября 1990 г. Это изобретение сделано при поддержке правительства по договоруDЕ-АС 0376SF00098 между Министерством Энергетики США и Университетом Калифорнии для проведения экспериментов в Лаборатории Лоуренса Беркли. Правительство имеет определенные права на это изобретение. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение относится к способу непосредственного обнаружения подвергаемых анализу веществ с использованием изменений цвета в трехмерных полимерных наборах, которые происходят в ответ на селективное связывание с их поверхностью подвергаемых анализу веществ (аналитов). Аналитическая химия. Приемы аналитической химии в течение многих лет использовались для определения таких медицинских параметров как гематокритные уровни. По праву считающиеся полезными методы аналитической химии ко многим биологическим параметрам,которые подлежат оценке, имеют ограниченную практическую применимость или не применимы. Если не используются дорогие и громоздкие способы газовой хроматографии, то для осуществления таких способов в общем требуются большие количества подвергаемых анализу веществ. Часто количественные результаты ограничены или недоступны. Однако такая техника использовалась для таких основных химических опытов, как пробы на креатинин. Методы микробиологии и патологии. Другим подходом к анализу медико-биологических систем являлось непосредственное микроскопическое обследование с использованием различных методов, основанных на окрашивании клеток, и методов классической патологии. Расширению этих возможностей способствовали хорошо распространенные микробиологические методы, например посев, снятие характеристик колоний и исследование метаболических и питательных ограничений. Большая часть медицинской науки получила развитие при использовании этого основного арсенала аналитических методов. Хотя методы посева и непосредственного наблюдения за тканями в течение многих лет служили оплотом процессов медицинских открытий, они имеют значительные ограничения. 2 Патологический анализ тканей пациентов с целью определения развития болезненного состояния и установления патогена, являющегося ее причиной, обычно требует инвазивной процедуры. С другой стороны, выращивание патогена из различных жидкостей тела или других проб требует времени и является дорогостоящим. Иммуноанализ. Прорыв в медицине произошел с открытием методов иммуноанализа. В этих способах получает развитие антитело, которое особым образом будет привязано к представляющей интерес мишени. Несмотря на высокую стоимость при их разработке и производстве, антитела от животных предоставили возможность очень точного анализа многих аналитов, которые прежде фактически не могли быть оценены при исследованиях и особенно в клинических ситуациях. Важным техническим достижением в иммуноанализе явилась разработка моноклональных антител. Вместо того, чтобы подвергать животное воздействию аналита и получать весь ряд его антител, в этих методах одну клетку селезенки животного, обладающую повышенной чувствительностью, делают бессмертной и размножают много раз. Получаемую в результате линию клеток затем культивируют с получением очень специфического и чистого продукта в виде антител. Вследствие того, что антитело само по себе является малой молекулой, оно должно быть каким-либо образом помечено так, чтобы событие связывания могло быть обнаружено. Это может быть выполнено красящей, флуоресцентной, радиоактивной или другой меткой. И наоборот, если происходит подавление связывания между известным количеством введенного помеченного определяемого при анализе вещества (аналита) и материалом, который должен быть проанализирован, то уменьшение сигнала будет указывать на присутствие тестового аналита. Если происходит значительная по объему и плотности агглютинация частиц антитела,то формирование осаждающего вещества (преципитанта) может также служить для того, чтобы сигнализировать о присутствии аналита. В последние годы сообщества исследователей и медиков с трудом пришли к уверенности в технике иммуноанализа в обнаружении и количественном определении биологических материалов. Несмотря на то, что во многих отношениях он является удачным, косвенная природа способов иммуноанализа, также как их зависимость от материалов антител, приводит к множеству трудностей, проблем и ограничений при проведении анализа. Коротко говоря, разработка и производство антител остается дорогостоящим и эти молекулы чувствительны к изменениям окружающей среды. Кроме того, этими системами могут быть обнаружены только те 3 материалы, для которых могут быть получены антитела. Анализ на пленках Лангмюра-Блодгета. Техника молекулярного самомонтажа такая, например, как описано Сваленом и др.(Langmuir, Vol. 3, page 932, 1987), также как осаждение по Лангмюру-Блодгету (ЛБ) (Roberts,Ed. Langmuir-Blodgett Films, Wiley, New York,1966), использовалась для покрытия поверхностей вполне определенным квази-двухмерным рядом молекул. Первоначальное использование этого нового усовершенствования предназначалось для применений в материаловедении, например смачивания (Whitesides, et al., Langmuir,Vol. 6, p. 87, 1990) и растирания (Novotny et al.,Langmuir. Vol. 5, p. 485, 1989). Эти двухслойные пленки также используют в качестве иммобилизующих каркасов для аналитических реакций. Биодатчики, основанные на ЛБ пленках, могут обнаруживать молекулы, важные для диагностики, например, глюкозы (Okahata, et al. Thin Solid Films, Vol. 180, p. 65, 1989) и мочевины (Arisawa, et al., Thin SolidFilms. Vol. 210, p. 443, 1992). В этих случаях системы классической аналитической химии иммобилизованы на пленках для того, чтобы улучшить считывание результатов опытов и другим образом упростить и улучшить чувствительность процедуры опыта. Обнаружение взаимодействия рецептор лиганд в общем выполняется косвенным анализом, например связанным с ферментом иммуносорбентом и пробой, проводимой лигандом с радиоактивной пометкой. Хотя биотехнологические пленки заданного назначения дали изящные примеры распознавания молекул на поверхности контакта, проблема преобразования события распознавания молекулы в поддающийся измерению сигнал представляла затруднения до появления рассматриваемого изобретения. В случае устройств с биодатчиками обнаружение в общем выполняется путем подсоединения ЛБ пленок ко вторичному устройству,например оптическому волокну (Beswick, Journal Colloid Interfase Science. Vol. 124, p. 146,1988), кварцевому генератору (Fukuki et al., ThinSolid Films, Vol. 210, p. 471, 1992) или поверхностям электродов (Miyasaka, et al., ChemicalLetters, p. 627, 1990). Некоторые из пленок для связывания аналитов предусматривают флуоресцентную пометку, где флуоресценция или ее погашенное состояние указывают на то, что произошло событие связывания (Beswick, Journal Colloid Interfase Science, Vol. 124, p. 146, 1988). В некоторых случаях эти материалы для обнаружения были внедрены в поверхность поддерживающего двухлипидного слоя (Tieke, Advanced Materials, Vol. 3, р. 532, 1991). Известно, что пленки из полидиацетилена меняют цвет с синего на красный при повыше 000409 4 нии температуры или изменении рН вследствие структурных изменений в сопряженном каркасеFilms. Vol. 210, p. 548, 1992). Липосомы заданного назначения. Неполимеризованные липосомы, обнаруживающие радикалы сиаловой кислоты, широко использовались в качестве опытных систем для изучения взаимодействия между вирусом гриппа и поверхностями клеток (Ott, et al., EuropeanJournal of Pharmacological Science, Vol. 6, p. 333,1994). Эти липосомы обычно получают из таких липидных материалов, как холестерин и яичный фосфатидилхолин (Kingery-Wood, et al., Journalof the American Chemical Society. Vol. 114, p. 7303, 1992). В публикации, служащей основой для заявки на патент США, зависимой от которой является рассматриваемая заявка, описана терапевтическая липосома заданного назначения,которую производят путем полимеризации. Нормой в этой области является развитие процедуры полимеризации до тех пор, пока материалы не становятся полностью красными, указывая, что полимеризация завершена. Эта процедура использовалась в публикациях, цитировавшихся выше. Хотя целью сообщества исследователей была разработка этой характеристики обнаружения событий связывания, исследователи,кроме того, должны были разработать способ,использующий это явление в практических приложениях. ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение дает возможность прямого обнаружения малых молекул, патогенов, бактерий, мембранных рецепторов и лекарственных препаратов путем наблюдения изменений цвета, которые происходят тогда, когда эти аналиты связываются с изобретенными трехмерными полимерными наборами. Этот технологический прогресс представляет собой разительное улучшение результатов в сравнении с предыдущей работой изобретателей, связанной с двухмерной однослойной пленкой, в котором интенсивность цвета улучшена разительным образом. Кроме того, настоящая работа обладает многими преимуществами, которые возникают тогда, когда тестовая система может быть взвешена в жидкости или привязана к различным каркасам. Целью настоящего изобретения является проведение анализа на присутствие биомолекул путем прямого обнаружения эффекта связывания тогда, когда происходит специфическое связывание аналитов с трехмерными полимерными наборами. Дополнительной целью настоящего изобретения является предоставление возможности 5 прямого обнаружения вирусов, бактерий, паразитов и других патогенов, лекарственных препаратов, гормонов, фрагментов стенок клеток,фрагментов мембран, мембранных рецепторов,ферментов и других относящихся к биологии материалов с использованием изобретенной системы проб. Другой целью настоящего изобретения является предоставление возможности развития и усовершенствования лекарственных препаратов путем наблюдения конкурентного торможения процессов естественного связывания между всеми поверхностями или связывающими участками (сайтами) и их естественным биоактивным лигандом. Еще одной целью изобретения является предоставление средств в виде тестовых библиотек материалов, так как можно наблюдать связывание, а соответствующая липосома с соответствующим ей лигандом может быть отделена от других путем выделения особой полимерной структуры. Настоящие обладающие признаками изобретения средства анализа и способ предусматривают прямое колориметрическое обнаружение взаимодействия рецептор - лиганд с использованием новой системы трехмерных полимерных проб. При использовании изобретенного способа получения этих оригинальных наборов лиганд или его производное приводится в полимерное состояние путем полимерного соединения лигандов через связывающую ветвь или через непосредственное внедрение в процессе полимеризации. Некоторые из этих аспектов настоящего изобретения описаны в недавно опубликованном сообщении изобретателей,включенном здесь как справочный материал (Reichert et al., J. Am.Chem. Soc., Vol. 117, p. 829, 1995). Присутствие аналита, который связывается с введенными лигандами, может быть обнаружено наблюдением изменений в спектральных характеристиках полимерных наборов. Набор полимер - лиганд, таким образом, охватывает участок распознавания молекул и участок детектирования - все внутри одного молекулярного набора. В одной реализации изобретения создают цветные полидиацетатные липосомы и помещают их в жидкость. Добавляют тестируемую пробу. Происходящее изменение цвета указывает на присутствие аналита, а интенсивность окраски позволяет количественно определить концентрацию аналита. В липосомной реализации настоящего изобретения изобретатели приготовили синтетические полимеризуемые липосомы, которые имеют сходство с устройством и функционированием клеточных мембран, и использовали их как простые колориметрические датчики. Липосомы были разработаны так, чтобы дать специфическое связывание с частицами вируса грип 000409 6 па и дополнительно сообщать о событии связывания за счет видимых изменений цвета. В сущности, эти молекулярные наборы имитируют распознавание молекул поверхностей клеток,также как и преобразование сигнала. Для того, чтобы придать липосомам функции распознавания молекул и обнаружения,изобретатели объединили известное взаимодействие лиганд-рецепторное с уникальными оптическими свойствами полидиацетиленов. Сопряженный каркас чередующихся двойных и тройных связей вызывает интенсивное поглощение в видимой области спектра. Известно, что в отдельных кристаллах или пленках ЛангмюраБлодгета эти материалы претерпевают цветовые переходы от синего к красному благодаря различным возмущениям окружающей среды,включая нагрев, механическое напряжение, рН и растворитель. В одной реализации рассматриваемого изобретения изобретатели продемонстрировали,что специфическое связывание вируса гриппа с полидиацетиленовыми липосомами заданного назначения дает аналогичный переход цвета. В более ранней работе изобретатели показали, что сходные эффекты могут быть получены с двухмерными полидиацетиленовыми пленками Лангмюра-Блодгета заданного назначения. (Charych, et al., Science, Vol. 261, p.585, 1993). Частицы вируса гриппа охвачены двойным липидным слоем, к которому прикреплен лектин гемагглютинин (ГА). ГА подсоединяется к терминальным альфа-гликозидам сиаловой кислоты на гликопротеинах и гликолипидах поверхности клетки, инициируя инфицирование клетки вирусом. Как описано в разделе рассматриваемой заявки, касающемся описания известного уровня техники, липосомы, обнаруживающие радикалы сиаловой кислоты, широко использовались в качестве опытных систем для изучения взаимодействия между вирусом гриппа и поверхностями клеток. Полимеризованные липосомы рассматриваемого изобретения, однако, состоят из молекул, которые позволяют непосредственную визуализацию этого специфического взаимодействия. Преимущества изобретения. Приемы аналитической химии. Приемы аналитической химии являются единственной системой проб, предшествующей появлению рассматриваемого изобретения, которые позволяют прямое обнаружение. К сожалению, аналитическая химия имеет ограниченные возможности применения ко многим потребностям анализа биологических систем. До тех пор, пока используются дорогие и громоздкие методы газовой хроматографии, требуются большие количества аналита. Получение количественных результатов такими методами часто ограничено или недоступно. Однако такая техника использовалась для таких тестов, как гематокритический анализ и пробы на креатинин. 7 Методы аналитической химии, в сущности, недоступны для большинства биологических молекул вследствие нарушения характеристик аналитов во время этапов приготовления и анализа и, обычно, малого количества аналита,присутствующего в тестовом образце. По этим причинам появление техники иммуноанализа было революционным шагом в биологической науке. Иммуноанализ. Многие малые биологические молекулы пользуются печальной славой как трудные для анализа непосредственным путем вследствие строгих ограничений диапазона параметров окружающих условий, которые они могут переносить без потери их специфических характеристик. Поэтому, среди прочих причин, иммуноанализ с трудом получил признание при количественном анализе этих классов материалов. Несмотря на удовлетворительные во многих отношениях результаты, косвенная природа методов иммуноанализа приводит ко множеству препятствий, сложностей, проблем и ограничений в применении количественного анализа. Требование, заключающееся в том, что для каждой возможной мишени должно быть разработано и получено антитело, ограничивает действенность методов иммуноанализа в таких применениях, как разработка лекарственных препаратов и тестирование. Ирония в том, что,позволяя тестирование в какой-то части диапазонов биологической среды, крупное гликопротеиновое антитело часто является сильно чувствительным к деградации вне малого диапазона условий среды для определяемых в опыте параметров. Таким образом, уязвимое место антител слишком жестко ограничивает диапазон условий среды опытов, доступных в этих системах анализа. Трудноуловимый недостаток для систем иммуноанализа встречается у быстро развивающихся патогенов, таких как вирус гриппа. В таких организмах, особенно в случае вирусов,внешнее покрытие, пригодное для иммунных реакций, стало постоянно изменяющимся в своих элементах распознавания антитела. Таким образом, несмотря на полную иммунную реакцию на культуру гриппа, в течение нескольких месяцев человек может опять заразиться гриппом, но от патогена с внешним покрытием, модифицированным таким образом, что он иммунологически нераспознаваем клетками памяти жертв. Это является причиной того, что люди могут заражаться гриппом год за годом. Настоящее изобретение обладает уникальными преимуществами над методами иммуноанализа и аналитической химии, заключающимися в прямом определении биологических аналитов. По контрасту с пробами, требующими привязки к иммуноглобулинам, в одной реализации настоящего изобретения участок (сайт) прикрепления носителя на патогене использует 000409 8 ся для функции распознавания. Этот участок,обычно в иммунологически недоступной впадине на поверхности патогена, хорошо сохраняется с течением времени. Минимальная изменчивость этого участка необходима для того,чтобы патоген поддерживал свою инфективность. В результате система моноанализа по настоящему изобретению будет обеспечивать эффективные пробы на защитное покрытие культур гриппа, многие из которых могут эволюционизировать совсем недавно. Существует много преимуществ генетически сохраненного участка прикрепления носителя, являющегося мишенью реализации настоящего изобретения. Определение заражения пациента гриппом будет безусловным и не ограниченным отдельной культурой. Это преимущество настоящего изобретения также устраняет необходимость большого числа иммунологических тестов, так как клиницист может основываться на моноанализе. Кроме того, могут быть идентифицированы даже недавно эволюционизировавшие культуры гриппа с неизвестными характеристиками, что в дальнейшем позволяет избежать неудачных отрицательных тестов. Аналогичное ограничение иммуноанализа встречается в хорошо адаптированных патогенах, например паразитах малярии. В этих организмах фазы жизненного цикла, которые дали бы возможность иммунной реакции, со временем были так ограничены, чтобы избежать иммунной реакции, или получили такой вид, что в клетках-хозяевах не происходит реакция антитела. Настоящее изобретение использует связывающий участок генетически консервативного хозяина для идентификации патогена. Даже в сравнительно больших паразитах связывающий сайт хозяина стремится сохраняться постоянным во времени во всех поколениях патогенов. Кроме того, паразиты обычно присутствуют в теле в большом количестве различных стадий жизни. В хорошо адаптированных паразитах иммунодоступные участки часто значительно отличаются от стадии к стадии, причем преимущество заключается в том, что организмхозяин не способен установить иммунологическую реакцию с существенной быстротой для того, чтобы избежать нарушения состояния паразита. Рассматриваемое изобретение представляет разительный прогресс в сравнении с обеими известными прямыми системами - химической и иммуноанализа, достигая преимуществ, которые, до настоящего изобретения, были доступны исключительно только в одном или другом из этих методов аналитической техники. Также как появление иммуноанализа революционизировало медицинские и исследовательскоаналитические возможности, рассматриваемое 9 изобретение представляет собой решающий успех в аналитической технике. Настоящее изобретение в одной системе дает достоинства иммуноанализа и химического анализа. Настоящее изобретение обладает достоинствами прямого анализа методов аналитической химии вместе со многими достоинствами, присущими таким системам. Изобретенная техника анализа также имеет существенный,определяемый условиями среды, диапазон тестирования в сравнении с иммуноанализом. Это дает удобства различных анализов при наиболее выгодных для них параметрах среды. Кроме того, настоящее изобретение позволяет строгий непосредственный анализ даже в очень узких диапазонах среды, до этого недоступных технике аналитической химии. Быстрота и простота индикатора цветовых изменений по рассматриваемому изобретению являются его отличительными достоинствами. Материалы мишени. Одно из уникальных преимуществ рассматриваемого изобретения заключается в широком диапазоне материалов мишени, событий связывания и биохимических реакций, подверженных анализу с использованием изобретенной техники. Многие из этих материалов ранее не могли быть обнаружены при использовании прямого практического анализа. Настоящее изобретение предоставляет многие преимущества систем иммуноанализа без усложнений,связанных с получением иммуноглобулина или косвенным анализом. В общем, настоящее изобретение не требует этапа очистки, предшествующего анализу. Этот признак рассматриваемого изобретения обусловлен высокой специфичности лигандов,введенных в обнаруживающий полимерный набор. Кроме того, система непосредственного анализа по изобретению избегает затрат, усложнений и повышенных неточностей, присущих косвенным системам, доступным в настоящее время. Чувствительные аналиты - условия мягкого тестирования. Полимерные наборы по изобретению могут использовать лиганды и аналиты, которые являются стабильными или обладают соответствующими характеристиками связывания в ограниченном диапазоне условий invitro (или окружающей среды). В условиях диапазона in vitro настоящее изобретение полезно тем, что строгие ограничения могут встретиться даже в этом узком диапазоне. Это позволяет,например, удерживать трехмерные структуры чувствительных биосоединений или биомолекул во время процедуры тестирования. Настоящее изобретение хорошо работает даже в тщательно ограниченных условиях. Так,условиями, такими как рН, физиологический раствор и температура, можно осторожно управлять с помощью обратной связи, титрова 000409 10 ния и других приемов без помех для точности и чувствительности анализа. Вследствие этого преимущества настоящего изобретения, заключающегося в широком экспериментальном диапазоне, могут подвергаться анализу целые клетки или чувствительные субклеточные включения без нарушения их структурной целостности. Изменение цвета,происходящее тогда, когда изобретенные наборы связываются с поверхностью, будет точно указывать место нахождения аналита, например, в пробе ткани. Настоящим изобретением можно осуществлять непрерывный контроль трудно различимых стадий развития клеток, например различных стадий малярийной инфекции. Кроме того,при использовании способа по настоящему изобретению может быть проверена или проконтролирована связь между различными факторами даже во время процессов взаимодействия. Аналиты со слабым связыванием - поливалентность. Поливалентность сцепленных с полимером лигандов по настоящему изобретению обеспечивает повышенную способность к связыванию в случае аналитов с естественной поливалентностью. Поливалентность может быть также обеспечена до процедуры опыта для аналитов с ограниченной валентностью с целью придания им этого достоинства настоящего изобретения. Использование мультивалентности по изобретению дает возможность усилить многократно специфическое, но слабое взаимодействие. Структурный линкер с достаточной длиной и приспособляемостью помогает обеспечить возможность связывания многочисленных участков на аналите даже тогда, когда они структурно разделены на искривленной поверхности. В результате этих особых признаков настоящее изобретение может обнаруживать многие лиганды, ранее непригодные для оценки в опыте. Главным критерием эффективной индикации присутствия аналита является то, что поверхность полимерных наборов должна быть достаточно возмущена для того, чтобы вызвать необходимое изменение спектра. Этой цели будет служить связывание аналита с иммобилизующей частицей, так как это концентрирует аналит в малой области и дополнительно обеспечивает трехмерный аспект на сравнительно большой зоне даже для слабого аналита. В рассматриваемом изобретении может быть применено множество лигандов, что дает гибкость при обнаружении поливалентной тестируемой мишени. Выбор лиганда может быть основан на наиболее выгодных характеристиках связывания и пространственных характеристиках, что предпочтительней, чем компромиссный выбор этих факторов для приспособления к тестовой системе. Так, наиболее выгодный лиганд может быть выбран на основе таких факторов, 11 как гидрофобность и гиброфильность, размер,положение связывающего участка и конфликтующие сродства. Лиганды, которые могут быть применены в рассматриваемом изобретении,могут включать карбогидраты, пептиды, нуклеотиды, гетероциклические соединения и другие органические молекулы. Распознавание аналитов. Точность и выдающиеся достоинства изобретенной системы анализа дает возможность обнаружения и количественной оценки материалов, которые ранее были недостижимы вследствие ограничений методов известного уровня техники. Устройство и способ по изобретению могут анализировать очень малые биологические или другие молекулы, для которых не могут быть получены антитела. Эти материалымишени могут включать органические растворы или загрязняющие агенты, присутствующие на очень низких уровнях. Существуют особые возможности, которые стали доступными благодаря успехам, достигнутым изобретателями, в области тестирования на лекарственные препараты в приложении к судебной медицине и в клиническом приложении. Приемы подавления,приложенные к рассматриваемому изобретению, могут дать возможность тестирования материалов, которые имеют крошечные размеры или имеют малое значение валентности или единичную валентность. Хотя заявители точно не уверены, у изобретателей есть гипотеза, что неожиданный спектральный сигнал, достигнутый настоящим изобретением, имеет место благодаря физическому возмущению полимерных наборов, которое происходит в результате события связывания. Это тот случай, когда поливалентные материалы, например вирусы и фрагменты клеточных мембран, могут быть очень легко обнаружены при использовании способа по рассматриваемому изобретению. Так, поливалентные материалы обычно вызывают особенно сильную реакцию в рассматриваемой системе. Так может быть вследствие структурных изменений, внедренных в липидный двойной слой в результате связывания, вызывающего физическую переконфигурацию структуры. Если теория заявителей истинна, то предварительное связывание с носителем более слабых материалов аналита, имеющих единичную валентность, может оказаться выгодным для повышения эффективности рассматриваемого изобретения в этих случаях. Например, аналит мог бы быть связан с полимером или поверхностью липосомы. Это сконцентрировало бы событие связывания на полимерных наборах по данному изобретению в особых точках, усиливая спектральную модификацию в каждой точке контакта. Кроме того, искривленная поверхность липосомы, к которой прикреплен аналит,вероятно, будет служить оттягиванию привязанного к периферии аналита от билипидной 12 поверхности и вытолкнет аналиты, расположенные на липосоме в центре, на билипидную поверхность. Этот этап предварительного связывания затем может привести к повышенному скручиванию, возмущению и генерированию сигнала на двухслойной поверхности. Наблюдение сигнала. Различные спектральные изменения в двойном слое могут быть использованы для обнаружения присутствия или отсутствия материала-мишени. Средства усиления спектрального сигнала, хорошо известные в технике, например сцинтилляторы, также могут быть применены тогда, когда присутствуют низкие уровни аналита. Вследствие эмпирической природы сигнала существует много возможностей для автоматизации снятия показаний системы анализа по настоящему изобретению. В одной частной реализации настоящего изобретения сдвиг цвета с синего на розовый специалист может просто наблюдать путем визуального наблюдения. Вследствие простоты наблюдения эта функция может быть с легкостью выполнена неподготовленным наблюдателем, например пользователем в домашних условиях. С другой стороны, оборудование для спектральных исследований, хорошо известное в технике, может быть применено для определения изменения спектральных свойств вне пределов простого визуального наблюдения, от оптической плотности до специфической длины волны излучаемого света включительно. Рассматриваемые наборы могут быть также оптимизированы при анализе путем привязывания их к любому из иммобилизующих материалов или объектов. Например, привязка к гранулам сефадекса дала бы возможность свободного протекания и промывок во время процедур анализа. Наборы по данному изобретению могли бы быть даже внедрены в гель с аналитом, диффундирующим через него,возможно с электрическим градиентом. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ: фиг. 1 показывает бифункциональную молекулу и пентакосадиноидную кислоту; фиг. 2 - цветная фотография, показывающая суспензию изобретенных липосом до и после введения аналита. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Изобретенные трехмерные полимерные наборы позволяют непосредственное определение присутствия широкой номенклатуры аналитов за счет изменений цвета. Результаты могут быть считаны неподготовленным наблюдателем, а опыт может быть проведен в условиях естественной среды. Возможны очень мягкие условия опыта, которые позволяют определяь малые биомолекулы в состоянии, близком к естественному, предоставляя информацию, касающуюся их взаимодействий, и устраняющие риск модификации или деградации аналита. 13 Изобретенные полимерные наборы составлены из трехмерной структуры, например липосомы или трубочки, чья поверхность содержит ориентирующие и детектирующие головные группы. Детектирующие головные группы составлены из специфичного к рассматриваемому аналиту лиганда, который привязан к одному терминальному концу линейного структурного линкера. Этот линкер, в свою очередь, привязан к полимерным наборам своим вторым терминальным концом. Поверхность полимерных наборов также снабжена липидом, упорядочивающим головные группы. Фиг. 1 представляет схематическое изображение одной реализации настоящего изобретения. Рецептор-лиганд 1 показан прикрепленным к одному терминальному концу молекулы спейсера. Второй терминальный конец молекулы спейсера затем прикреплен к одному из нескольких мономеров, которые были полимеризованы в элемент хроматического детектирования. Затем эти материалы, в то время, когда происходит полимеризация, перемешиваются,вызывая образование полимерных структур,например липосом и трубочек. Липидные упорядочивающие группы. Липиды выступают как важный элемент в структурном упорядочивании трехмерных полимерных наборов таким образом, что связывание аналита производит обнаруживаемое изменение цвета. Заявители предполагают, что эффект структурирования упорядочивающих групп служит соответствующей стабилизации физической структуры трехмерных полимерных наборов для того, чтобы способствовать стабильности цвета и полимеризации. В свою очередь привязывание аналита к лигандным группам распознавания молекул затем вызывает значительное пространственное возмущение или стресс структуры с результатом в виде изменения цвета. Может быть так, что стабильность и относительная жесткость, вызванные упорядочивающими липидами, таким образом объединяют двухслойную поверхность, что пространственное изменение в одной области запускает больший эффект на поверхности наборов в целом. Нет определенности в том, какие из многих результатов связывания приводят к наблюдаемым спектральным изменениям. Наиболее вероятно, что изменения вызваны стрессами,индуцированными связыванием, которое изменяет эффективную длину сопряжения полимерного каркаса. Трехмерные структуры по изобретению являются высоко чувствительными по цвету к ряду параметров окружающей среды,например нагреву, и эти факторы могут быть компонентом наблюдаемого явления в целом. Однако, заявители не привязаны к какой-либо из приведенных выше гипотез, которые являются просто попытками объяснить представляемое рассматриваемое изобретение. 14 Предшествующие исследования вызвали предположение, что переходы цвета в полидиацетиленах возникают из изменений эффективной длины сопряжения полидиацетиленового каркаса и что эффективный способ анализа электронной структуры полимерного каркаса строго связан со структурой боковой цепи. Изобретатели по этому поводу могут только делать предположения, что специфическое взаимодействие вирус - липосома может служить тому,чтобы изменять структуру боковой цепи,уменьшая эффективную длину сопряжения ферментного каркаса. Конечно, теоретические вычисления предполагают, что очень слабое вокруг С-С сцепление полимерного каркаса снижаетэлектронную делокализацию. Материалы для использования в качестве головных групп в настоящем изобретении включают-СH2OH,-CH2OCONHPh,-CH2OCONHEt,-CH2CH(Et)OCONHPh,-CH2OCOPh,-CH2OCONHMe,-(СH2)9 ОН,-CH2OTs, -CH(OH)Me, -CH2OCOR2, где R2 является n-С 5 Н 11, n-C7H15, n-C9H19, n-С 11 Н 23, nС 13 Н 27, n-С 15 Н 31, n-С 17H35, Ph, PhO или о(НO2 С)С 6 Н 4,-OSO2R2, где R2 является Ph, р-МеС 6 Н 4, рFС 6 Н 4, р-СlС 6 Н 4, р-ВrС 6 Н 4, р-МеОС 6 Н 4, mСF3 С 6 Н 4, 2-С 10 Н 7 или Me - СО 2 М, где М является К, HNa или Ва/2. Предпочтительными материалами, которые могут быть применены в качестве головных групп в настоящем изобретении являются:-CH2OCONHR2 или - CH2CONHR2, где R2 является Et, n-Bu, n-С 6 Н 13, n-C8H17, n-C12H25,цикло С 6 Н 11, Ph, р-МеС 6 Н 4, m-МеС 6 Н 4, оСlС 6 Н 4, m-СlС 6 Н 4, р-СlС 6 Н 4, о-МеОС 6 Н 4, 3 Тиенил, Me, Et, Ph, 1-С 10 Н 7, Et, Ph, EtOCOCH2,BuOCOCH2, Me, Et, i-Pr, n-С 6 Н 13, Et OCOCH2,BuOCOCH2, Ph, 2,4 (NO2)2 С 6 Н 3 ОСН 2 или СН 2 СН 2OН. Наиболее предпочтительные группы взяты из -СН 2 СОХ, где Х является ОН, МеО или любой их солью. Лигандная группа. Лигандная группа по настоящему изобретению может быть из широкого множества материалов. Главный критерий заключается в том, что лиганд имеет сродство для аналита по выбору. Лиганд может быть из широкого диапазона, например, когда должен быть проанализирован класс материала. Соответствующие лиганды включают пептиды, углеводы, нуклеиновые кислоты или любые органические молекулы,которые присоединяются к рецепторам. Например, все культуры гриппа присоединяют связывающие участки к молекуле рецептора хозяина. Таким образом, эта молекула может быть с успехом применена для тестирования на все культуры гриппа, включая те, которые еще не были описаны. Лиганды также могут быть использованы в настоящем изобретении тогда, когда они действуют как конкурентные связующие к аналиту. 15 Например, патоген мог бы быть введен с тестовым материалом на присутствие молекулы рецептора. В отсутствие этой молекулы патоген будет прикрепляться к трехмерной полимерной структуре и создавать цвет. Связывание будет уменьшено до такой степени, до какой поверхность патогена привязана к молекуле рецептора,введенной в тестовый материал. Этим путем может быть обнаружено и количественно определено присутствие молекулы рецептора. Рецепторные связывающие молекулы. Использование производных сиаловой кислоты в одной предпочтительной реализации, описанной ниже в примере, является примером использования рецепторных связывающих молекул в этом объеме. Рецепторные связывающие молекулы являются материалами на поверхности клетки-хозяина, к которым прикрепляется патоген в качестве вступления к событию инфицирования. Выбор этих молекул в лигандной группе в настоящем изобретении имеет многие преимущества над другими молекуламирецепторами. Участок распознавания для этих молекул стремится быть хорошо законсервированным в патогене вследствие его очевидной критичности к выживанию. Поэтому различные культуры одного и того же патогена в общем не будут давать неудачный отрицательный ответ тогда,когда такие молекулы выбраны в качестве лигандной группы в рассматриваемом изобретении. А также молекулы рецептора стремятся быть меньше и менее сложными и часто менее гидрофобными чем антитела к тому же аналиту. Возрастающее число рецепторных молекул распознается, идентифицируется, выделяется и синтезируется для большого числа патогенов. Многие были усовершенствованы для использования в различных системах анализа и обработки. Примером этой тенденции в исследованиях является производное сиаловой кислоты, используемое ниже в примере рассматриваемого изобретения. Примеры рецепторов для ряда патогенов приведены в приложении в виде табл. 1. Все из них, также как многие другие, могли бы быть применены в способе по рассматриваемому изобретению. Таблица 1 Рецепторная молекулаCD4; Вазоактивный интерстинальный пептид. Пептид Т. Сиаловая кислота. Коровья оспа Фактор эпидермальногоpocтa Бешенство Рецептор ацетилхолин Вирус Эпштейна- Комплементный рецептор Барра Рео Бета-адренергический рецептор РиновирусIСАМ-1, N-CAM, гликопро Патоген Вирус иммунодефицита человека 16 теин Mab, ассоциированный с миелином Вирусы полимие- Рецептор полиовирусов лита Грипп Сиаловая кислота Цитомегаловирус Гликопротеин (не сиаловая кислота) Коронавирусы Сиаловая кислота 9-ОАС и сиаловая кислота Энцефаломиелит Сиаловая кислота 9-ОАС Вирус коревой-краснухи Вирус кори Гликопротеин (не сиаловая кислота) Герпес Олигосахаридный гликопротеинChlamydia Сиаловая кислота Риновирус Гликозилированные протеины Ротавирус Сиаловая кислота 9-ОАС Вирус полиомы Сиаловая кислота Реовирус Сиаловая кислотаSendi Virus Сиаловая кислота Свинка Сиаловая кислота Вирус болезни Сиаловая кислота Ньюкастла Миксовирусы Сиаловая кислота Кишечная палочка Олигоманноза, галактоза 14 галактоза, сиаловая кислота 23 галактоза Вирус энцефало- Сиаловая кислота миокардита Холерный токсин GMI (ганглиозидная производная сиаловой кислоты,галактоза, глюкоза, N - ацетилгалактоза) Менингит Сиаловая кислота Группы полимеризации липидов. Многие полимеризующие группы были введены в липиды и показали свою эффективность в полимеризации монослоя. Такие добавки включают: ацетилены, диацетилены, алкены, тиофены, имиды,акриламиды, метакрилаты, виниловый эфир,яблочный ангидрид, уретаны, аллиламины, силоксаны или винилпиридин и т.д. Из липидов,содержащих эти группы, могут быть получены гомополимеры или смешанные полимеры. Предпочтительной группой для использования в этом изобретении является диацетилен вследствие его уникальных оптических свойств в полимеризованной форме: полидиацетилен. Однако и другие полимеризующие группы могли бы быть использованы тогда, когда они обеспечи 17 вают поддающееся наблюдению изменение в свойствах во время события связывания. Формы наборов. Трехмерные наборы по рассматриваемому изобретению могут быть получены в любом числе форм. Одной из наиболее важных форм, которые могут быть получены, являются липосомы. Несколько способов получения рассматриваемых наборов в этой особой форме полностью представлены в разделе примеры этой заявки. Липосомы по рассматриваемому изобретению могут быть образованы в некотором количестве различных размеров и типов. Например,возможно образовать липосомы в виде простых двухслойных структур. Кроме того, они могут быть многослойными в структуре типа лука. Их размер также можно менять. Могут быть получены также многочисленные другие формы. Среди других форм могут быть образованы двойные цепи (Kuo et al, Macromolecule, р. 3225, vol. 23 1990), пластинкиof the American Chemistry Society, Vol.116,1994). Когда эти наборы иммобилизованы, они могут совместно образовывать даже конструкции большего размера. Один пример успешного протокола для производства липосомной реализации рассматриваемого изобретения следующий:- смешивание в маленьком пузырьке соответствующих количеств растворов липидов (115 мМ) в хлороформе;- испарение хлороформа струей азота;- добавление соответствующего количества деионизированной воды (общая концентрация липидов 1-2 мМ);- нагрев раствора выше фазового перехода липидов (около 80 -90 С);- обработка раствора ультразвуком в течение 15 мин (зондовый ультразвуковой аппарат,звуковой дезинтегратор Фишера модель 300,максимальный выход 50%, микронаконечник);- фильтрация теплого непрозрачного раствора через нейлоновый фильтр с размером пор 0,8 мкм (Gelman) для удаления из раствора малых титановых частиц;- охлаждение раствора в течение от, по крайней мере, одного часа до одного дня в холодильнике (4 С);- удаление кислорода в растворе путем барботирования через пробу азота в течение 510 мин перед полимеризацией;- полимеризация размешанного раствора липосом в 1 см кварцевой кювете с малой 254 нанометровой ультрафиолетовой лампой (узкий луч, энергия 1600 мкВт/см 2) на расстоянии в 3 см в малой камере, которая очищается азотом за 20 мин до и во время полимеризации для удаления всего кислорода и для охлаждения пробы; время полимеризации меняется между 5 и 30 18 мин в зависимости от желаемых свойств (цвет,степень полимеризации) липосом. Пример 1. Как показано на фиг.1, использование бифункциональной молекулы 1 в одной реализации рассматриваемого изобретения включает лиганд сиаловой кислоты для вирусного связывания и диацетиленовую функциональность в углеводородной цепи для полимеризации. В этом соединении карбон-гликозид был предназначен для предотвращения гидролиза за счет вирусной нейраминидазы. Это соединение было смешано с 10-12-пентакосадиноидной кислотой 2 и гидратировано с образованием липосом. Хотя большинство природных липидов, которые образуют липосомы, состоят из двух алкильных цепей, также существуют синтетические липиды, образующие липосомы,с только одной алкильной цепью. См., например: Hunfer et al Phys. Lipids, pp. 355-374, vol.33 и Bader, Chem Int. Ed. Engl., pp.91-92, vol.20,1981. Предшествующие исследования показали,что оптимальное вирусное связывание происходит для смесей из 1-10 % соединения 1 в липосоме. Spevak et al. J. Am. Chem. Soc., 161, 115 р. 1146, 1993. Поэтому в этом исследовании по колориметрическому детектированию были использованы 5% и 10% смеси сиаловая кислота липид. Липосомы приготавливали с использованием способа ультразвукового зондирования[Liposomes: A Practical Approach; New, ed.; Oxford University Press; Oxford, pp. 33-104, 1990] и впоследствии полимеризовали в ультрафиолете путем облучения на длине волны 254 нм с использованием лампы в виде карандаша. Табл.2 демонстрирует колориметрическое детектирование липосом (5% вирус гриппа полимеризованным липидом 1 диацетилен сиаловой кислоты), включая видимые спектры поглощения: (А) синего раствора липосом (8 мин) и (В) пурпурного раствора липосом (24 мин ) без вируса(сплошная линия) и после инкубации с 60 гемагглютинирующими единицами вируса гриппа(прерывистая линия). Концентрация растворов липосом в физиологическом растворе с фосфатным буфером была 0,13 мМ, а время инкубации с вирусом было 1 ч. Облучение раствора липосом (1 мМ в деионизированной воде) в течение около 5-10 мин приводит к формированию липосом с глубоким синим цветом (табл.2 А, сплошная линия). Если время полимеризации больше (между 10 и 30 мин), то наблюдается пурпурный цвет (табл.2 В,сплошная линия). Когда к липосомам в физиологическом растворе с фосфатным буфером(ФРФБ) добавлен вирус гриппа, тогда раствор немедленно меняет цвет на розовый или оранжевый в зависимости от того, каким был первоначально приготовленный - синим или пурпурным, соответственно (табл.2 А и В, прерывистые кривые). Эти изменения цвета легко различимы невооруженным глазом и могут быть количест 19 венно оценены путем абсорбционной спектроскопии в видимой области. Таблица 2 Колориметрическая реакция (КР) количественно оценивается путем измерения процентного изменения поглощения на длине волны 626 нм (которая придает материалу синий цвет) относительно общего максимума поглощения. Для количественной оценки реакции раствора липосом на заданное количество вирусов видимый спектр поглощения раствора липосом без вирусов представлен какB0=I626/(I536+I626),где В 0 определяется как интенсивность поглощения на длине волны 626 нм, деленная на сумму интенсивностей поглощения на длинах волн 536 и 626 нм. Раствор липосом, который подвергался воздействию вируса гриппа, был таким же образом представлен какBV =I626/(I536+I626),где BV представляет собой новое соотношение интенсивностей поглощения после инкубации с вирусом гриппа. Колориметрическая реакция(КР) раствора липосом определяется как процентное изменение В под действием вируса КР= [В 0 - BV)/В 0] х 100%. Для того, чтобы согласовываться с более ранней работой изобретателей, максимумы поглощения на 626 и 536 нм были произвольно выбраны с целью вычисления процентного выражения поглощения синего цвета для растворов липосом. Использование второго максимума поглощения на 480 нм для вычислений не изменяет относительное общее направление показанных результатов. Как показано в табл.2, инкубация синих липосом (8 мин ультрафиолета) с 60 гемагглютинирующими единицами (ГАЕ) вируса приводит к КР в 47%; инкубация пурпурных липосом(24 мин ультрафиолета) с тем же количеством вируса приводит к КР в 87%. Гемагглютинирующая единица (ГАЕ) является мерой наибольшего разведения вирусного раствора, кото 000409 20 рый все же полностью агглютинирует (приводит к слипанию) 1% раствор красных кровяных клеток. Изобретатели предполагают, что повышенная чувствительность пурпурных липосом может быть благодаря возросшему содержанию полимера, как предполагается их более высокой оптической плотностью (данные не показаны). Изменения цвета не могло быть обнаружено, если к раствору липосом был добавлен чистый буфер ФРФБ или раствор альбумина бычьей сыворотки (АБС) в буфере ФРФБ (1 мг/мл)(КР 5% в течение 2 ч). Для того, чтобы непосредственно обратиться к эффектам неспецифического поглощения, липосомы приготавливали без липида 1 сиаловой кислоты на фиг.1. Результат был аналогичен, эти липосомы не изменяли цвет после воздействия вируса. Пример 2. Специфическая природа взаимодействия между вирусом гриппа и липосомами сиаловой кислоты была подтверждена сравнительным экспериментом по конкурентному торможению. Инкубация раствора липосом (10% липид 1 сиаловой кислоты) с 54 ГАЕ вируса гриппа дает КР в 31% для синих и 70% для пурпурных липосом. Выполнение того же эксперимента с добавкой-O-метилнейраминовой кислоты, известного ингибитора агглютинации вирусов гриппа, не приводит к изменению цвета. Кинетические эксперименты показывают,что изменение цвета, вызванное добавлением аликвотного количества вируса, достигает плоского участка после 30 мин, хотя изменение становится видимым в течение 5 мин. Для заданного времени полимеризации КР, как показано в табл.3, зависит от количества добавленных вирусов. Табл.3 является графиком зависимости колориметрической реакции раствора пурпурной липосомы (5% липид 1 сиаловой кислоты,24 мин ультрафиолета) от следующих одна за другой добавок вируса гриппа. Липосомы инкубировали в течение 30 мин вслед за каждым добавлением вируса, и видимый спектр поглощения регистрировался. КР для каждой концентрации вируса была получена в трех независимых экспериментах. Таблица 3 21 Если определено, что изменение цвета липосом в буфере без вируса составляет меньше 4%) в течение 2 ч, то КР в 5% или более в течение нескольких минут считается значительной. Поэтому количество вируса, требуемое для получения КР, едва превышающего это значение,определяет предел детектирующей способности(обнаружения) метода в этой частной реализации. Кривая титрования в табл.3 показывает,что могут быть обнаружены малые количества,равные 11 ГАЕ. Это соответствует приблизительно 11 х 107 частиц вируса при подсчете путем электронной микроскопии. Изобретатели продемонстрировали, что полимеризованные структуры, включающие липосомы, являются биомолекулярными материалами, которые обеспечивают функцию молекулярного распознавания (сиаловая кислота) и элемент детектирования (полидиацетиленовый каркас), и все в одном надмолекулярном наборе. Событие связывания преобразуется в видимое изменение цвета, легко различимое невооруженным глазом и оцениваемое количественно путем абсорбционной спектроскопии. Специфичность изменения цвета была продемонстрирована исследованиями по конкурентному торможению. Кроме того, неспецифическое поглощение, если оно происходит, не проявляет способности воздействовать на цвет растворов липосом. Пример 3. Иммобилизация липосом на субстратах. Прикрепление к мембранам из поли(эфирных уретанов) или полиакрилонитрила. Эти мембраны являются пористыми, гидрофильными и могут быть использованы для разделения по сродству или иммунодиагностики. Липосомы могут быть прикреплены к этим мембранам путем первого прикрепления к мембране активирующей группы, например имидизолил-карбонила, суксинимида, ФМП или изоцианата, которые быстро добавляются к нуклеофилам в липосомах, таким как -NH2, SH,-ОН. Таким образом, любой липосомный препарат, который содержит эти функционалы, может быть непосредственно прикреплен к мембране. Эта процедура аналогична присоединению протеинов к мембранам, последние образцы которых можно найти в литературе. (C.H. Bamford,K.G. Allamee, M.D. Purbrick, T.J. Wear, J. Chromatographv. 1992, 606, 19 или C.H.Bamfоrd, K.G.Allamee, Clinical Materials. 1992, 10, 243. В принципе, любая стратегия, разработанная ранее для иммобилизации протеинов, может быть использована для иммобилизации липосом. Липосомы, которые имеют функционал-SH, также могут быть иммобилизованы на золотых поверхностях, частицах или электродах посредством связи тиол-золото. В этом случае раствор липосом, содержащих группу -SH, инкубируют с чистой золотой поверхностью в во 000409 22 де в течение 12-24 ч с выдержкой при комнатной температуре. Липосомы можно иммобилизовать на кремниевых чешуйках или силикагеле (двуокись кремния) с использованием следующей процедуры. Гель или пластинки очищают кислотой в 1:1 растворе HCl-метанол, промывают в воде и помещают в концентрированную фосфорную кислоту. После тщательной промывки водой пластинки чешуек или гель кипятят в дважды деионизированной воде, дают остыть и высохнуть и затем подвергают воздействию кремневодородов в инертной атмосфере в 2% растворе 3-меркаптоопропил триметоксилана,приготовленного в осушенном толуоле. Затем,чешуйки или гели помещают в 2 мМ раствор либо ГМБС(Nсукцинимидил 6-малеимидокапроат), приготовленный 0,1 М фосфатном буфере (кросс-линкер сначала растворяется в минимальном количестве диметилформамида). После промывки фосфатным буфером пластинки помещают в 0,05 мг/мл раствор липосом, приготовленный в фосфатном буфере с рН 8,0. И, наконец, чешуйки или гели тщательно промывают буферным раствором и затем аккумулируют в нем перед их использованием. Липосомы для работы должны иметь функционал -NH2 для перекрестного сцепления с ГМБС или ЕМБС. Эта процедура является модификацией ранее разработанной процедуры, которая была использована для иммобилизации ферментов на кремниевых чешуйках или гелях. Она была модифицирована для иммобилизации липосом (из R.V. Rusin, N.L. Fare,I.Z. Stempe, Biosensors and Bioelectronics. 1992,7, 367). Липосомы с функционалом -NII2 также могут быть иммобилизованы на поверхности за счет использования стандартных реакций присоединения глутарового альдегида, например часто используемых при иммобилизации протеинов. Пример 4. Обнаружение и тестирование. Липосомы могут быть использованы для замены стандартных анализов с радиоизотопной пометкой в лигандно-рецепторном тестировании. Например, если лиганд является аналогом допамина (например, соединение спайперон),то лиганд может быть также введен в полимеризованные липосомы (полимеризованные наборы). Если мембранный рецептор для допамина,например рецептор допамина D-2, добавлен в липосомы, модифицированные в спайперон, то наблюдается изменение цвета из синего в розовый. Это может быть проверено с помощью спектроскопии способом, похожим на обнаружение вирусов и бактерий. Эффект может быть подавлен добавлением соединений, которые прикрепляются также прочно или прочнее, чем допамин или спайперон. Путем использования пластинчатой формы с 96 углублениями можно 23 протестировать в качестве потенциальных новых лекарственных препаратов 96 соединений,которые являются аналогами допамина. Это высокопроизводительное тестирование не требует использования дорогостоящих соединений с радиоактивной пометкой и не имеет проблем,связанных со здоровьем и безопасностью. Процедура: развести 20-50 частей раствора липосом, который содержит 0,5-20% лиганда спайперона, в 100-200 частях среды с соответствующим количеством буфера. Раствор будет иметь синий или пурпурный цвет. Видимый спектр поглощения образца может быть записан в этой точке. Для стадии детектирования: добавить препарат мембранного рецептора допаминаD2 следующими одна за другой добавками, начиная с 10-20 частей и до 100-200 частей. Изменение цвета можно наблюдать глазом или путем регистрации видимого спектра поглощения. Для исследований по тестированию лекарственных препаратов: добавить препарат мембранного рецептора допамина D2, смешанный с новым лигандом или новым лекарственным соединением. Дать возможность произойти связыванию путем инкубации при комнатной температуре или при 37 С в течение 5-60 мин. Добавить в разведенный раствор липосом ингибированный препарат мембранного рецептора. Если раствор становится розовым, то новый лиганд или лекарственный препарат не достиг результата. Если раствор остается синим, то новый лиганд или лекарственный препарат осуществил эффективное связывание с рецептором. Пример 5. Обнаружение радиоактивных металлов. Мономерные диены могут быть полимеризованы путем воздействия гамма-излучения. Путем введения лиганда, который является веществом, вызывающим образование хелатных соединений металлов, мономерная форма липосом подвергается воздействию раствора радиоактивных металлов. Во время связывания металла с лигандом-хелатором эмиттируемое гамма излучение помогает полимеризации липосом. Раствор изменяется от белесого непрозрачного раствора (неполимеризованные липосомы) до темно-синего или темно-красного раствора полимеров. Липосомы служат двум целям: 1) обнаружению присутствия радиоактивных металлов и 2) очистке раствора от радиоактивных металлов. Этап 2 выполняется простой фильтрацией или центрифугированием связавшихся с металлом липосом. Эта процедура может быть названа обнаружен и очищен, так как липосомы обнаруживают и вычищают радиоактивные металлы из окружающей среды. Процедура: приготовить липосомы как описано выше до пункта ультрафиолетового облучения. Мономерные липосомы будут иметь непрозрачный белесый вид. Для обнаружения: развести 10-20 частей липосом в 50-200 частях воды или соответствующем буфере. Липосомы 24 будут содержать 0,5-20% лиганда-хелатора. Это может быть выполнено в пластинчатой форме с 96 углублениями. Добавить пробу из окружающей среды, которую нужно протестировать, 50 100 частей. Следить за переходом от синего к красному цвету, указывающим на присутствие гамма-излучения и, следовательно, радиоактивного металла. Для целей очистки в большом масштабе липосомы могут быть иммобилизованы на больших фильтрующих устройствах вблизи зон истечения или обработки сточных вод, например на участках очистки Superfund или другом оборудовании. Обработанная вода проходит через фильтрующие устройства. Любые остающиеся в воде радиоактивные металлы будут обнаружены по синему или красному цвету фильтрующего устройства. В то же время эти металлы будут освобождены от обработанной воды так, что вода может быть возвращена в окружающую среду или подвергнута повторному тестированию. Пример 6. Датчик глюкозы. Липосомы чувствительны к рН. При высоких рН липосомы находятся в красном состоянии, а при низких рН липосомы находятся в синем состоянии. Эффект может быть сделан обратимым. Липосомы могут быть использованы для проведения анализа малых молекул, который в присутствии соответствующего фермента или другого метаболического клеточного процесса изменяет рН окружающей среды. Например, при обнаружении глюкозы. Липосомы добавляют к среде с достаточно высоким рН для приведения их в красное состояние. 10-50 частей липосом могут быть разбавлены 50-200 частями соответствующей среды. Добавляют тестируемую пробу 10-100 частей. Это может быть выполнено в пластинчатой форме с 96 углублениями. К тестируемой пробе добавляют 10-50 частей оксидазы глюкозы. Если глюкоза присутствует, то оксидаза клюкозы превратит глюкозу в глюкаровую кислоту. Это превращение понизит рН раствора, создавая синее состояние липосом. Это изменение от красного к синему цвету означает присутствие глюкозы в пробе. Тест может быть выполнен визуально или количественно, путем измерения видимого спектра поглощения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Трехмерные полимерные многослойные наборы проб, которые изменяют цвет в присутствии аналита, включающие:a) лиганды, имеющие прямое сродство к определяемому при анализе веществу-аналиту,или которые могут действовать как конкурентные связующие к аналиту,b) линейные структурные линкеры, имеющие два терминальных конца, причем указанные линкеры на их первых терминальных кон 25 цах прикреплены к указанным лигандным составляющим,c) сопряженный полимерный каркас, к которому указанные структурные линкеры привязаны на их вторых терминальных концах, иd) упорядочивающие головные группы,которые привязаны к поверхности сопряженного полимерного каркаса в местах, не занятых структурным линкером,причем указанные наборы выполнены в виде липосом, имеющих форму двойной цепи; сплетенную, слоистую, спиральную, трубчатую или волокнистую форму. 2. Наборы по п.1, в которых лиганды со сродством к аналитам выбраны из группы, состоящей из биомедицинских тестовых проб,патогенов, лекарственных препаратов, радиоактивных металлов или промышленных материалов. 3. Наборы по п.2, в которых указанные биомедицинские тестовые пробы выбраны из группы, включающей патогены и инфицированные ими клетки, лекарственные препараты,гормоны, компоненты крови, индикаторы заболеваний, компоненты клеток, антитела,лектины, ферменты, генетический материал и их метаболические производные. 4. Наборы по п.2, в которых указанные патогены выбраны из группы, включающей вирусы, бактерии, паразиты. 5. Наборы по п.4, в которых указанные вирусы выбраны из группы, включающей вирусы гриппа, простуды, коревой краснухи, ветряной оспы, гепатита А и В, простого герпеса, полиомиелита, оспы, чумы, ВИЧ, коровьей оспы, бешенства, вирус Эпштейна-Барра, реовирус, риновирус, а также мутации, их элементы, распознаваемые лигандами. 6. Наборы по п.4, в которых указанные бактерии выбраны из группы, включающей кишечную палочку, бактерию туберкулеза, сальмонеллу, стрептококк, а также мутации, штаммы и элементы их распада. 7. Наборы по п.4, в которых указанные паразиты и другие патогены выбраны из группы,включающей возбудителей малярии, сонной болезни, речной слепоты и токсоплазмоза. 8. Наборы по п.1, в которых указанные трехмерные полимерные многослойные наборы проб включают лиганд со сродством к патогенному аналиту. 9. Наборы по п.8, в которых аналит является вирусом. 10. Наборы по п.8, в которых указанный лиганд выбран из группы, включающей фактор эпидермиального роста для аналита коровьей оспы, рецептор ацетилхолин для аналита бешенства, комплементный рецептор для аналита вируса Эпштейна-Барра, бета-адренергический рецептор для аналита реовируса, ICAM-1 для аналита риновируса, рецептор полиовирусов для аналита вируса полимиелита, аналит триса 000409 26 харида для аналита холерного токсина, тетрасахарид для нейтрофильного аналита, а также их производные и аналоги, способные соединяться с аналитом. 11. Наборы по п.8, в которых указанный лиганд является сиаловой кислотой и ее производными и аналогами, которые будут привязываться к коронавирусам, вирусу гриппа, энцефаломиелита, chlamydia, sendi virus, свинки,болезни Ньюкастла, миксовирусу, вирусу энцефаломиокардита, менингита или малярии. 12. Наборы по п.8, в которых указанный лиганд выбран из группы, включающей тетрасахариды, пептиды клеточной адгезии, трисахариды и трансмембранные рецепторы. 13. Наборы по п.8, в которых лиганд,предназначенный для обнаружения ВИЧ аналитов, выбран из группы, включающей CD4,sCD4, CD26, вазоактивный интестинальный пептид, пептид Т, сиаловую кислоту, а также их производные и аналоги, способные соединяться с ВИЧ. 14. Наборы по п.1, в которых указанный полимер состоит из полимеризующихся липидных мономеров. 15. Наборы по п.14, в которых указанные мономеры выбраны из группы, включающей ацетилены, диацетилены, алкены, тиофены,имиды, акриламиды, метакрилаты, виниловый эфир, яблочный ангидрид, уретаны, аллиламины, силоксаны анилины, пиролы и винилпиридин. 16. Наборы по п.15, в которых указанный полимерный каркас состоит из мономеров диацетилена. 17. Наборы по п.1, в которых указанные упорядочивающие головные группы являются гидрофильными с возможностью взаимной водородной связи. 18. Наборы по п.17, в которых указанные упорядочивающие головные группы выбраны из группы, включающей: -СН 2 ОН,-CH2OCONHEt,-CH2OCONHPh,-CH2CH(Et)OCONHPh, -(CH2)9OH,-CH2OCOPh, -CH2OCONHMe, -CH2OTs,-CH(OH)Me,-CH2OCOR2, где R2 является n-С 5 Н 11, nC7H15, n-C9H19, n-С 11 Н 23, n-C13H27, n-C15H31, nC17H35, Ph, PhO или о-(НO2 С)С 6 Н 4, -OSO2R2, где 19. Наборы по п.17, в которых указанные упорядочивающие головные группы являются карбоновой кислотой. 20. Наборы по п.1, в которых несвязывающий терминал мономеров выбран из группы,включающей: СН 3-, СН 3 О, nео-С 5 Н 11 О-, циклоС 6 Н 11 О, PhCH2O-, р-АсС 6 Н 4O-, р-ВZС 6 Н 4 О-, рВrС 6 Н 4 СОСН 2O-, р-(РhСН=СНСО)С 6 Н 4O-, рoBzC6H4NH-,р(РhСОН=СН)С 6 Н 4O-,BzC6H4NH-, MeOCH2CH2NH-, n-С 6 Н 13NН- и ЕtO-. 21. Наборы по п.20, в которых терминал является метиловой группой. 22. Наборы по п.1, в которых наборы привязаны к каркасу за счет взаимодействия химических групп наборов с поверхностью каркаса. 23. Наборы по п.22, в которых каркас выбран из группы: сефадекс, силикагель, сефароза,полиакринитрилы, фильтры, золото, кремниевые пластинки, силикагель. 24. Способ изготовления трехмерных полимерных многослойных наборов проб по п.1,включающий:a) соединение диеновых мономеров с лигандами в органическом растворителе,b) испарение растворителя с образованием сухого липидного продукта,c) повторное получение суспензии указанного сухого продукта в жидкости, выбранной из группы, состоящей из воды и водного раствора,с образованием реакционного раствора,d) нагрев реакционного раствора выше температуры основного фазового перехода диеновых мономеров,e) перемешивание реакционного раствора и охлаждение его до, по крайней мере, 4 С, иf) полимеризацию реакционного раствора. 25. Способ по п.24, в котором на этапе а) растворитель выбран из хлороформа, бензола,алкоголя, циклогексана, хлористого метилена,ацетонитрила и четыреххлористого углерода. 26. Способ по п.24, в котором водный раствор этапа с) выбран из группы, состоящей из буферного раствора, клеточной среды, физиоло 28 гического раствора, физиологического раствора с фосфатным буфером, буфера Trizma, HEPES иMOPS. 27. Способ по п.24, в котором перед охлаждением на этапе е) раствор фильтруют. 28. Способ по п.24, в котором смесь диен лиганд охлаждают при температуре между 4 и-20 С в течение времени между 5 мин и 5 ч. 29. Способ по п.28, в котором смесь охлаждают при температуре между 0 и -15 С в течение времени между 5 и 20 мин. 30. Способ по п.29, в котором смесь охлаждают при температуре между 0 и -5 С в течение времени между 5 и 12 мин. 31. Способ по п.24, в котором смесь диен лиганд охлаждают во время полимеризации до температуры между 1 и 22 С. 32. Способ по п.31, в котором смесь диен лиганд охлаждают во время полимеризации до температуры между 16 и 19 С. 33. Способ по п.24, в котором полимеризация достигается за счет ультрафиолетового облучения при использовании лампы с узким лучом или ручной лампы. 34. Способ по п.24, в котором полимеризация достигается за счет гамма-излучения, электронного пучка или рентгеновского излучения или другого ионизирующего источника низкой энергии. 35. Способ по п.24, в котором полимеризация выполняется с дозой энергии в 10-100 МДж/см 2. 36. Способ для непосредственного обнаружения аналита в растворе, включающий:a) контакт взвешенных наборов проб по п.1 с тестовой пробой, иb) наблюдение за раствором на предмет изменения в цвете, указывающего на присутствие аналита Евразийский патент действует на территории всех Договаривающихся государств, кроме

МПК / Метки

МПК: G01N 33/53, B05D 3/00, C12Q 1/00, B01J 13/00, B32B 17/10

Метки: колориметрический, набор, проб, трехмерный

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/15-409-trehmernyjj-kolorimetricheskijj-nabor-prob.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Трехмерный колориметрический набор проб</a>

Похожие патенты