Способ обработки жизнеспособного биологического материала

Номер патента: 22779

Опубликовано: 31.03.2016

Авторы: Прибенски Чаба, Молнар Миклош, Хорват Андраш

Есть еще 7 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ обработки жизнеспособного биологического материала, представляющего собой овоциты или сперму, перед последующим хранением или манипуляциями, включающий стадии, на которых:

(а) прилагают к указанному биологическому материалу гидростатическое давление в диапазоне от 10 до 100 МПа;

(б) выдерживают указанный жизнеспособный биологический материал под указанным гидростатическим давлением в течение периода времени от 10 с до 150 мин;

(в) снимают гидростатическое давление,

где указанный биологический материал находится при температуре выше точки замерзания среды во время любой стадии хранения и манипуляции.

2. Способ по п.1, где величина гидростатического давления находится в диапазоне от 20 до 40 МПа.

3. Способ по любому из пп.1, 2, где гидростатическое давление прилагают в течение периода времени от 20 с до 90 мин.

4. Способ по любому из пп.1-3, где гидростатическое давление прилагают в течение периода времени от 30 до 60 мин.

Текст

Смотреть все

СПОСОБ ОБРАБОТКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Настоящее изобретение относится к способу повышения жизнеспособности и/или устойчивости к стрессу жизнеспособного биологического материала и использования этого материала,включающему приложение к биологическому материалу гидростатического давления; выдерживание биологического материала под гидростатическим давлением в течение предварительно определнного периода времени; снятие гидростатического давления и использование указанного материала для любой необходимой цели в соответствии с любым пригодным протоколом. Использование биологического материала включает применение любых методик и режимов, применимых в области методов вспомогательной репродукции,биотехнических и/или биотехнологических манипуляций.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭППЛАЙД СЭЛЛ ТЕКНОЛОДЖИ КОРЛАТОЛЬТ ФЕЛЕЛШШЕГЮ ТАРШАШАГ (HU) Область техники Настоящее изобретение относится к способу повышения жизнеспособности и/или устойчивости к стрессу жизнеспособного биологического материала и применения этого материала, включающему приложение к биологическому материалу гидростатического давления, выдерживание биологического материала под гидростатическим давлением, снятие гидростатического давления и использование материала для любой необходимой цели в соответствии с любым пригодным протоколом. Использование биологического материала включает любые методики и режимы, применимые в области методов вспомогательной репродукции, биотехнических и/или биотехнологических манипуляций. Предшествующий уровень техники Действие гидростатического давления как фактора стресса в связи с повышенной устойчивостью к стрессу и белками шока было исследовано для хондроцитов, дрожжей и бактерий, но пока не было исследовано для гамет и зародышей. Физиологические механизмы, с помощью которых микроорганизмы адаптируются к сублетальным стрессам, пока недостаточно понятны. В недавних исследованиях было описано, что нестабильности,вызванные сублетальным холодовым шоком в нормальном синтезе белка у бактерий, преодолеваются синтезом так называемых белков холодового шока (БХШ, англоязычное сокращение - CSP от "cold-shockprotein") (Phadtare et al., 1999). Полагают, что эти БХШ обладают многими функциями, такими как шапероны для РНК (Graumann and Marahiel, 1999) или активаторы транскрипции (LaTena et al., 1991); предполагают, что они также играют роль в защите от замерзания (Wouters et al., 1999). В дальнейших исследованиях было обнаружено, что продукция БХШ индуцируется не только холодовым шоком, но также и другими стрессами из окружающей среды. Например, в Escherichia coli определнный тип БХШ продуцируется под действием питательного стресса (Yamanaka et al., 1998). В другом исследовании было показано, что воздействие высокого гидростатического давления вызывает продукцию определнных индуцируемых холодом белков и белков теплового шока (Welch et al.,1993). Поскольку и холодовой шок, и воздействие высокого давления повышают уровни содержания БХШ, были проведены исследования, направленные на выяснение возможности перекрстной защиты.Wemekamp-Kamphuis et al. (2002) установили, что уровень жизнеспособности после воздействия давлением на подвергшиеся холодовому шоку Listeria monocytogenes был в 100 раз выше, чем таковой для клеток, выращенных при 37 С. Гидростатическое давление в диапазоне 30-50 МПа обычно ингибирует рост различных организмов: инициация репликации ДНК является одним из наиболее чувствительных к действию давления внутриклеточных процессов (Abe et al., 1999). Выраженность эффектов различна в зависимости от степени и длительности сжатия (Murakami and Zimmerman, 1973). Клеточная мембрана упоминается как первичное место повреждений под действием давления (Palou et al., 1997). Воздействие высокого гидростатического давления может изменять функциональные свойства мембран, такие как активный транспорт или пассивная проницаемость, и таким образом может нарушать физико-химический баланс клетки (Yager and Chang, 1983; Aldridge and Bruner, 1985; Macdonald, 1987; Schuster and Sleytr, 2002; Routray et al.,2002). Приложение давления может приводить к изменениям в структуре белков, в том числе к возникновению частично или полностью разврнутых конформаций. Давление может вызывать денатурацию белков (Schmid et al., 1975; Weber and Drickamer, 1983; Jaenicke, 1991; Gross and Jaenicke, 1994; Silva etal., 2001). В недавних исследованиях было установлено, что гидростатическое давление усиливает продукцию шоковых белков (Welch et al., 1993; Wemekamp-Kamphuis et al., 2002). Физические и биохимические процессы в условиях изменившегося давления определяются принципом Ле Шателье: значительно ускоряются все реакции, связанные с уменьшением объма (Murakamiand Zimmerman, 1973; Welch et al., 1993; Palou et al., 1997). Накопление эффектов давления летально после достижения определнного предела: в то время как необратимые изменения некоторых биомолекул происходят при более высоких давлениях, большинство бактерий и многоклеточных организмов погибают при 300 МПа. Однако медленно передвигающиеся животные (в свом активном состоянии они погибают при давлениях от 100 до 200 МПа) могут выживать при давлениях до 600 МПа, если они находятся в обезвоженном состоянии (Seki and Toyoshima, 1998). В ранних публикациях было отмечено, что биологические системы способны выдерживать высокие давления, если давление понижается медленноPribenszky et al. (2003, 2004) также исследовали возможность постепенного восстановления подвергнутых давлению эмбрионов и установили, что постепенное снятие давления значительно повышает выживаемость. В ответ на различные стрессовые воздействия гены теплового шока индуцируются, экспрессируя белки теплового шока (БТШ, англоязычное сокращение - HSP от "heat shock protein". В предыдущих исследованиях было установлено, что экспрессия генов теплового шока регулируется как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне, и быстрая индукция транскрипции генов теплового шока включает активацию специфического транскрипционного фактора - фактора теплового шока 1(HSF1). Более того, индукция транскрипции может значительно варьироваться в интенсивности и кинетике в зависимости от сигнала и типа клеток. Kaarniranta et al. (1998) установили, что механическая на-1 022779 грузка в виде гидростатического давления повышает экспрессию генов теплового шока в клетках, подобных хондроцитам человека. Реакция на длительное высокое гидростатическое давление (ВГД) характеризуется повышенными уровнями синтеза мРНК и белка для БТШ 70, без активации индукции HSFI и транскрипции гена hsp70. Повышенная экспрессия БТШ 70 происходит вследствие стабилизации молекул мРНК hsp70. Интересно, что в отличие от приложения статического давления, циклическое приложение давления не приводит к индукции генов теплового шока. Результаты работы Kaarniranta et al. (1998) показали, что при действии постоянного высокого гидростатического давления экспрессия гена hsp70 в клетках, подобных хондороцитам, регулируется на посттранскрипционном уровне без индукции транскрипции. Авторы предположили, что посттранскрипционная регуляция в виде стабилизации мРНК hsp70 обеспечивает дополнительный путь регуляции генов теплового шока, который, по-видимому, имеет важное значение при некоторых формах стресса. Ранее авторы настоящего изобретения установили, что сублетальный шок, высокое гидростатическое давление (ВГД) значительно повышает выживаемость после оттаивания замороженных мышиных бластоцист (Pribenszky et al., 2005a, WO 2005022996). Подобным же образом, при криоконсервации спермы средняя подвижность после оттаивания в каждой из партий бычьей спермы, предварительно подвергнутой давлению, была значительно повышена по сравнению с образцами, замороженными без предварительной обработки давлением. Этот результат отчтливо указывает на то, что предварительная обработка давлением полезным образом сказывается на подвижности после оттаивания криоконсервированной бычьей спермы (Pribenszky et al., 2005b). Дальнейшие исследования биологических основ и биохимических изменений для процесса ВГД позволят выяснить механизм его защитного действия. Однако эти исследования включают криоконсервирование биологического материала после обработки ВГД, что для различных биологических материалов, очевидно, невозможно или имеет низкую эффективность. Процесс охлаждения или хранения спермы при температурах выше 0 С был хорошо разработан для кратковременного хранения сперматозоидов (Hackett, et al., 1982; Pinto, 1999; O'Shea et al., 1964). При оптимальной обработке спермы (разбавлении) и хранении при оптимальных температурах осеменение такой спермой в пределах 1-2 дней после сбора может производиться с приемлемыми результатами по фертильности (но с очевидно сниженной эффективностью оплодотворения по сравнению с осеменением свежей спермой) (Gill et al., 1970; Goodman and Cain, 1993; Harrop, 1954; ljaz and Ducharme, 1995; Katila etal., 1997). Применяемые способы содержат очень похожие основные этапы: 1) сбор спермы,2) разбавление спермы при температуре тела,3) по усмотрению, центрифугирование разбавленной спермы. Повторное разведение спермы для получения е оптимальной концентрации,4) выдерживание разбавленной (заново разбавленной) спермы при комнатной температуре или при 4-5 С или при любой температуре выше точки замерзания образца,5) осеменение спермой. Подобно сперматозоидам, претерпевающим утрату жизнеспособности в ходе хранения, способность к выживанию эмбрионов или овоцитов также снижается, когда их удаляют из окружающего их физиологического материала (например, для культивирования in vitro, активации, переноса эмбриона,деления, определения пола, биопсии, созревания in vitro, введения сперматозоида в цитоплазму ооцита метод ICSI, от англ. Intra Cytoplasmic Sperm Injection, клонирования или биотехнологической процедуры любого типа). По этой причине огромное научное и экономическое значение имеет повышение жизнеспособности/выживаемости гамет и эмбрионов перед любой процедурой или после не, включая обычное хранение, осеменение или перенос, а также наиболее сложные биотехнологические процедуры. Подобным же образом, например, при консервировании микроорганизмов,таких как бактерии (например, при сушке из замороженного состояния), жизнеспособность микроорганизмов подвергается большому риску. Повышение эффективности любого процесса, осуществляемого вместе с повышенной жизнеспособностью, имеет огромное научное и экономическое значение. Как ясно из изложенного выше, в данной области существует необходимость в повышении жизнеспособности биологического материала, который широко используется в биотехнологических процедурах. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что применение гидростатического давления существенно повышает жизнеспособность биологических материалов, и применение данного способа может значительно повысить эффективность выполнения многих этапов биотехнологических процедур. Данное описание показывает широкий набор примеров этого открытия: после применения данного способа к переносу эмбрионов или осеменению повышалась эффективность оплодотворения и частота родов; применение данного способа к овоцитам значительно повышало их устойчивость к стрессу, результатом чего было повышение скорости деления и скорости образования бластоцист; при применении данного способа к сперме с последующими в данном способе этапами разбавления и хранения подвижность сперматозоидов сохранялась в течение значительно большего времени. Неожиданным было также то, что улучшения были существенными даже тогда, когда температуры ниже точки замерзания среды не применялись ни на одном из этапов хранения биологического материала и/или манипуляций с ним. Использование этого открытия имеет важное практическое значение для применимости данного и подобных методов ВГД. В этой связи следует подчеркнуть, что идея настоящего изобретения равно применима в любом биотехническом/биотехнологическом протоколе или в любой процедуре, используемым в методах вспомогательной репродукции (ТИР, английская аббревиатура ART, от "assisted reproductive technologies") и в других процедурах, и их выбор не ограничен настоящим изобретением. Единственным необходимым этапом, подлежащим включению в улучшенные протоколы, является этап приложения гидростатического давления, параметры которого может легко оптимизировать специалист в данной области, следующий рекомендациям настоящего изобретения. Поскольку замораживание спермы кабанов (а также лошадей) приводит к ухудшению выживаемости сперматозоидов после оттаивания, наиболее простым примом разведения этих видов является осеменение свежей, разбавленной, разбавленной и охлажднной или разбавленной и остуженной спермой. После использования предварительной обработки ВГД сперма существенно лучше сохраняется при данной температуре и, кроме того, существенно увеличивается время хранения с более высоким качеством. Подобно этому, при продукции эмбрионов in vitro и in vivo, культивировании эмбрионов in vitro,определении пола, делении, переносе генов, переносе эмбрионов, созревании овоцитов, активации, ICSI,клонировании или любой биотехнической/биотехнологической процедуре в эмбрионах, овоцитах или сперме значительно снижается их жизнеспособность/способность к выживанию. Как экстраполяция отмеченных выше особенностей, при применении предварительного воздействия ВГД гаметы и эмбрионы могут быть использованы в любом типе ТИР или биотехнической/биотехнологической процедуры при повышенной способности к выживанию. Сущность изобретения В соответствии с изложенным настоящее изобретение относится к способу повышения жизнеспособности и/или устойчивости к стрессу жизнеспособного биологического материала и использования указанного материала, включающему:(а) приложение к жизнеспособному биологическому материалу гидростатического давления;(б) выдерживание жизнеспособного биологического материала под гидростатическим давлением в течение предварительно определнного периода времени;(г) использование материала для любой необходимой цели в соответствии с любым полезным протоколом при условии, что использование не включает криоконсервирования. В одном из вариантов осуществления изобретения величина используемого в способе согласно настоящему изобретению давления находится в диапазоне от 1 до 200 МПа. В предпочтительных вариантах осуществления величина давления находится предпочтительно в диапазоне от 10 до 100 МПа, более предпочтительно от 20 до 75 МПа и наиболее предпочтительно от 30 до 60 МПа. В другом варианте осуществления изобретения используемое в способе согласно настоящему изобретению гидростатическое давление прилагается в течение периода времени от "мгновенного" до 300 мин. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения давление прилагают предпочтительно на период времени от 0,001 с до 600 мин, предпочтительно от 1 с до 300 мин, более предпочтительно от 10 с до 150 мин, ещ более предпочтительно от 20 с до 90 мин и наиболее предпочтительно от 30 с до 60 мин. В других вариантах осуществления изобретения длительность периода снятия давления составляет от 10 с до 2 ч или от 1 мин до 1 ч или в других случаях от 10 до 30 мин. Снятие давления может быть мгновенным. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу, в котором давление прилагается, поддерживается и снимается согласно предварительно определнному режиму приложения давления. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способу, в котором давление прилагается, поддерживается и снимается согласно предварительно определнному температурному режиму. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ согласно настоящему изобретению применяется в сочетании с гаметами и эмбрионами, выбранными из группы, состоящей из овоцитов,спермы, зигот, морул, бластоцист, эмбрионов, стволовых клеток позвоночного животного. Предпочтительные варианты осуществления изобретения относятся к способу, в котором позвоночное животное является рыбой, птицей или млекопитающим, предпочтительно принадлежащим к крупному рогатому скоту, лошадям, козам, овцам, свиньям, другим представителям домашнего скота,комнатным животным, приматам, в том числе может быть человеком. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, в котором биологический материал является культурой микроорганизмов. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения культура микроорганизмов является бактериальной культурой. Далее настоящее изобретение относится к любому способу, как он описан выше, причм использование биологического материала включает любые методики и режимы, применимые в области методов вспомогательной репродукции, биотехнических и/или биотехнологических манипуляций. В предпочтительном варианте осуществления изобретения используемым в способе согласно настоящему изобретению режимом является сушка из замороженного состояния. В дальнейшем аспекте способ согласно настоящему изобретению применяется для повышения устойчивости к стрессу жизнеспособного биологического материала, причм повышается устойчивость к повышенной температуре. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Настоящее изобретение описано более подробно в целях демонстрации идеи изобретения для случаев использования мышиных эмбрионов, сперматозоидов быка и хряка, овоцитов свиньи и двух видов бактерий. Должно быть очевидно, что раскрытая процедура одинаково применима для гамет и эмбрионов всех млекопитающих, птиц или рыб, которые являются кандидатами для любого типа ТИР, или в более общем виде - для любого типа жизнеспособного биологического материала, пригодного к использованию в биотехнических или биотехнологических процедурах. В качестве объектов подробного исследования были выбраны по причине более лгкого доступа и простоты манипуляций мышиные эмбрионы,сперма быка и хряка, овоциты свиньи и два вида бактерий. Также в целях лгкости интерпретации и экстраполяции были отобраны простые процедуры ТИР: перенос эмбриона, искусственное осеменение, активация овоцитов in vitro и хранение спермы in vitro. Что касается проведения принципиального опыта с микроорганизмами, для демонстрации полезного эффекта (предварительного) воздействия высокого гидростатического давления была выбрана сушка бактерий из замороженного состояния. Эти процедуры являются основными режимами в бактериологии, ТИР и родственных биотехнических или биотехнологических процедурах, что подчркивает их применение в промышленности, здравоохранении и науке. Однако в способе согласно настоящему изобретению и также в данном описании термины "мышиный эмбрион" или "сперма быка или хряка" могут использоваться как равнозначные терминам "гамета" или"эмбрион". Например, в настоящем способе могут быть равным образом применимы пред- и постимплантационные стадии эмбрионов, овоцитов и спермы позвоночных животных и человека. В связи с настоящим изобретением выражение "жизнеспособный биологический материал" относится, как правило, к части или исходной форме живого организма, способной при благоприятных условиях к выживанию, развитию или прорастанию. Без ограничения, жизнеспособным биологическим материалом может быть клетка, культура клеток, образец ткани, культура ткани, орган и тому подобное. Что касается микроорганизмов, термин относится к организму, который является микроскопическим, то есть слишком малым, чтобы быть видимым невооружнным глазом. Микроорганизмами могут быть бактерии, грибы, архебактерии (archaea) или эукариоты. Микроорганизмы часто описывают как одноклеточные организмы; однако некоторые одноклеточные простейшие видны невооружнным глазом, а некоторые многоклеточные виды являются микроскопическими. Как высокоразвитые эукариотные организмы, мышиные эмбрионы более восприимчивы к действию гидростатического давления, чем медленно передвигающиеся организмы и бактерии. Поэтому первой целью является установить основные особенности мышиных эмбрионов, касающиеся их морфологии и жизнеспособности, при действии давления. Для исследования устойчивости мышиных эмбрионов к давлению были проведены тщательно спланированные опыты. Выбор использованных давления и временной шкалы был таким, чтобы обеспечить наиболее широкий диапазон, применимый для последующих практических применений. Поэтому давление для использования в способе согласно настоящему изобретению было выбрано в диапазоне от 1 до 150 МПа. Более конкретно, гидростатическое давление, которое может быть применено к эмбрионам в стадии развивающихся бластоцист, составляет 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120,130, 140 или 150 МПа или имеет любое значение между этими промежуточными величинами. Подобным же образом, для выдерживания мышиных эмбрионов под высоким гидростатическим давлением может быть выбран широкий период времени. Более конкретно, мышиные эмбрионы выдерживают при выбранном давлении в течение периода времени между 1 с и 6 ч, точнее в течение 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 с,1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300 или 360 мин. С повышением давления уменьшается длительность выживания эмбрионов под давлением. Эмбрионы могут выживать при значительных давлениях без какого-либо видимого изменения их морфологии (например, при 90 МПа в течение 1 с или 30 МПа в течение 2 ч). Эмбрионы компактизовались в зависимости от величины и длительности приложенного давления. Без ограничения теорией области охвата настоящего изобретения авторы предполагают, что давление не может быть непосредственно ответственным за выдавливание воды из бластоцист. Цитируемые документы свидетельствуют, что компактизация эмбрионов была следствием индуцированных давлением продукции различных белков(белков холодового шока, БХШ), обратимых изменений в структуре белков и метаболических процессах. Компактизованные эмбрионы могли восстановить свою нормальную морфологию через 4-5 ч культивирования in vitro и возобновить развитие, подобное контролям (например, эмбрионы, подвергнутые дав-4 022779 лению 90 МПа в течение 30 мин или 30 МПа в течение 3 ч). Эмбрионы из указанного выше "сублетального диапазона" (например, компактизованные эмбрионы) могут предпочтительно быть отобраны для дальнейшего переноса или любой процедуры ТИР или биотехнологической процедуры. После обработки давлением расширенные бластоцисты компактизуются и остаются в этой форме в течение 3-4 ч, после чего расправляются. На основе этого явления могут быть отобраны эмбрионы, подвергнутые перед этим действию давления. Поскольку морфологические изменения эмбрионов и полезные эффекты предобработки давлением могут быть следствием изменнной структуры белков и/или особенностей и/или усиленной продукции различных индуцированных давлением белков, исследование этих белков может указывать на высокое гидростатическое давление, приложенное к биологическому материалу перед любым последующим процессом. Чем выше величина давления, тем короче время выживания эмбрионов. Приложение давления,превышающего определнную величину и длительность действия, приводило к необратимым изменениям: эмбрионы начинали разрушаться через 2 ч культивирования in vitro или уже были разрушены после декомпрессии (например, эмбрионы, подвергнутые давлению 90 МПа в течение 2 ч или 30 МПа в течение 5 ч). Специалист в данной области будет способен определить эти предельные давления и предельные времена с помощью обычных опытов, применимых к используемому конкретному биологическому материалу. Будет принято во внимание, что степень выживания подвергнутых давлению эмбрионов может быть повышена их постепенной декомпрессией. Исследования показали, что степень выживания подвергнутых действию давления эмбрионов разительно повышалась, если они освобождались от давления постепенно. В то время как выдерживание в течение 60 мин при 90 МПа было летально для всех эмбрионов, 80% из них выживали, если проводилась постепенная декомпрессия в течение 120 мин. Длительность декомпрессии также является особенностью настоящего изобретения, которую должен определить специалист в данной области в свете конкретного применения. Более конкретно, выдержанные при выбранном давлении мышиные эмбрионы подвергают декомпрессии в течение периода времени от 1 с до 4 ч, более конкретно в течение 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 с, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,120, 150, 180, 210 или 240 мин. Специалисту в данной области будет понятно, что обработку давлением согласно настоящему изобретению можно проводить в соответствии с любым необходимым режимом давления. Поэтому зависимость от времени давления в его приложении, поддержании и снятии может варьироваться в соответствии с различными кривыми зависимостей время-давление, включая все моменты времени воздействия давления, то есть в ходе приложения давления, в течение периода максимального давления и в течение фазы снятия давления. Очевидно, что уровень давления в каждый данный момент времени может быть оптимизирован и установлен согласно предварительным опытам, которые легко провести и которые основаны на данной доктрине без избыточного экспериментирования. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения способ согласно настоящему изобретению может быть осуществлн в соответствии с предварительно определнным температурным режимом. Термин "температурный режим" относится к зависимости температуры от времени, как она может быть измерена или установлена в течение обработки повышенным давлением, и она доступна независимому от приложенного давления контролю. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения обработка давлением проводится при определнной температуре, однако представляющий интерес биологический материал может определять применение различных температур на различных этапах или частях этапов обработки давлением. Установленной температурой может быть любая температура, например комнатная температура, температура окружающей среды, температура исходного цельного тела, откуда получен биологический материал, температура немного выше указанной температуры исходного тела и подобная этим значениям. Специалист в данной области легко определит применимость любого данного температурного режима, анализируя эффективность обработки давлением в сравнении с контрольным опытом. Без ограничения теорией, возможное объяснение этой особенности может состоять в том, что при приложении давления генерируется значительное количество СО 2 (Abe and Horikoshi 1995). Гидратация и ионизация СО 2(НСО 3- и Н+) усиливаются повышенным давлением, поскольку реакция сопровождается уменьшением объма (-0,26 мл/моль), характер которого зависит от величины приложенного давления(Palou at al. 1997, Welch at al. 1993). Возникающая внутри клеток двуокись углерода немедленно растворяется и затем диссоциирует, давая НСО 3- и Н+, понижая таким путм также внутриклеточный рН (Abeand Horikoshi 1995, 1997, 1998, Abe et al. 1999). Можно также предположить, что поддерживаемое повышенным давлением равновесие летально для эмбрионов при атмосферном давлении. Можно предположить также, что немедленное понижение давления вызывает повышенное высвобождение в цитоплазме СО 2 из е гидратированной и ионизированной формы, что приводит к немедленной гибели эмбрионов. В условиях определнной длительности декомпрессии белки плазматической мембраны (Н+-АТФаза)(Schmid et al. 1975, Pequeux and Gilles 1978), обратимо инактивированные повышенным давлением, начинают снова функционировать, постепенно сдвигая (вместе с пассивной диффузией) равновесие в сторону физиологического состояния. После обработки давлением с тщательно выбранными параметрами эмбрионы культивировали invitro, затем переносили в организм суррогатных матерей. Число родившихся детнышей после воздействия давления на эмбрионы было выше, чем без применения давления. Подобно обработке эмбрионов овоциты свиньи также подвергали воздействию давления, чтобы определить их устойчивость к давлению. Затем предварительно обработанные давлением с тщательно выбранными параметрами овоциты подвергали стрессу с помощью электрического импульса, превосходящего в 10 раз по величине оптимальное значение, и испытывали на восстановление и дальнейшее развитие до стадии бластоцисты. Число активированных in vitro овоцитов, которые восстанавливались и развивались далее, было выше в случае воздействия давления, чем без давления. Подобно обработке эмбрионов подвергали действию давления также сперму быков и хряков, чтобы оценить устойчивость сперматозоидов к давлению. Так, сперму предварительно обрабатывали при тщательно выбранных параметрах и выдерживали in vitro при различных температурах. Число подвижных сперматозоидов в различные моменты времени после сбора спермы было выше при обработке давлением, чем без давления. Осеменение обработанной давлением спермой хряков давало больший размер помта, чем обычно получалось в благоприятных условиях. Подобно указанным выше процедурам образцы Escherichia coli и Lactobacillus plantarum подвергали действию давления, чтобы определить, может ли повыситься выживаемость бактерий после сушки из замороженного состояния. Число жизнеспособных бактерий после сушки из замороженного состояния при выбранных параметрах давление/температура было выше при обработке давлением, чем без него. Настощяее описание демонстрирует повышение степени жизнеспособности/выживаемости биологического материала под действием гидростатического давления при использовании в качестве модельных систем мышиных бластоцист, овоцитов свиньи, спермы хряков и быков и двух видов бактерий. Это можно соответственно оценить, перенося эмбрионы после их обработки давлением в культуральную среду и/или в организм двух суррогатных матерей; или путм их активации in vitro; или путм осеменения обработанной спермой или путм подсчта выживших бактерий после сушки из замороженного состояния. Развитие in vitro, имплантация и последующее развитие в матке, деление и последующее развитие являются объективными свидетельствами жизнеспособности эмбрионов и овоцитов. Подобным же образом, хранение in vitro и осеменение спермой, дающие большее число подвижных сперматозоидов (invitro), и более высокая частота беременности подкрепляют применимость указанного способа. Обработка давлением может производиться с помощью любого устройства для подачи давления,которое может быть приспособлено к режимам согласно настоящему изобретению. Неограничивающими примерами таких инструментов являются, например, устройства, описанные в WO 2005/022996 или в данном документе. Далее настоящее изобретение иллюстрируют экспериментальные примеры, описанные ниже. Однако область охвата настоящего изобретения не будет никоим образом ограничиваться конкретными вариантами осуществления, описанными в примерах. Пример 1. Выживаемость мышиных эмбрионов при различных давлениях при комнатной температуре, действие обработки давлением на имплантацию и частоту рождений. Получение и культивирование эмбрионов. Мышиные эмбрионы на стадии единичной клетки брали у суперовулирующих доноров CB6F1 и культивировали при 37 С с 5% СО 2 и при максимальной влажности воздуха в средах G 1.2 и G 2.2 (Vitrolife, Goteborg) до стадии развитых бластоцист. Обработка давлением. Бластоцисты помещали в пластиковые трубочки объмом 0,08 мл (7-9 эмбрионов на трубочку) со средой М 2 (Sigma St. Louis, МО). Трубочки, заполненные средой М 2 как средой для обработки давлением, помещали в камеру со специальным сделанным на заказ устройством, способным создавать и точно детектировать гидростатическое давление вплоть до 150 МПа. Достижение необходимого значения давления занимало от 20 с до 5 мин (при давлении соответственно от 10 до 150 МПа); длительность снятия давления составляла 2-4 с. Перенос. Для обследования in vitro подвергнутые действию давления 600 бар в течение 30 мин эмбрионы культивировали в среде G 2.2 в течение 2 ч, как указано выше. Затем их переносили (7-12 эмбрионов на животное) реципиентам на стадии 3-го дня псевдобеременности. Необработанные бластоцисты переносили в качестве контроля. Количественная оценка и статистический анализ. Выводы были сделаны на основании морфологических изменений у эмбрионов, обследованных в ходе продолжающегося в течение 24 ч культивирования при увеличении 400 и на основании частот рождений для перенеснных эмбрионов. Микроскопически неизменнная морфология бластомеров, расправление бластоцели и выход из блестящей оболочки были признаками выживания (сохранения жизнеспособности) in vitro. Число плодов при вскрытии беременных самок на 18-й день или рождение здоровых детнышей были доказательством сохранения жизнеспособности эмбрионов in vivo. Степень сохра-6 022779 нения жизнеспособности сравнивали с контролем по критерию 2. В данных опытах эмбрионы подвергали различным гидростатическим давлениям от 10 до 150 МПа(с шагом 10 МПа) в течение различных промежутков времени, от 1 с до 300 мин, при комнатной температуре. Воздействие, превышающее определнное давление или длительность, вызывало обратимые морфологические изменения. Расправленные бластоцисты компактизовались внутри блестящей оболочки: бластоцель исчезала, размер бластомеров уменьшался, но изменений их структурной целостности не наблюдалось. После культивирования in vitro в течение 4-5 ч эти бластоцисты вновь расправлялись и выходили из блестящей оболочки в течение 24 ч (а). Получившие меньшее воздействие эмбрионы не обнаруживали морфологических изменений и выходили в пределах 24 ч культивирования in vitro (б), тогда как эмбрионы, подвергшиеся большему воздействию, не расправлялись из компактизованного состояния и разрушались в течение 2 ч или были уже разрушены после декомпрессии (в). Для оценки in vivo подвергнутые обработке эмбрионы оценивались как "выжившие" (а и б) или"мртвые" (в) через 2 ч культивирования in vitro после декомпрессии и переносились по отдельности реципиентам. Подвергнутые действию давления 29 эмбрионов были перенесены суррогатным матерям, и 28 из них родились. Это отношение было выше, чем отношение, полученное для эмбрионов, не подвергнутых воздействию. Это значительное улучшение по сравнению с обычными данными в этой области(около 85%) также показывает полезность предварительного воздействия давления. Если были применены оптимальные параметры давления и времени, повышение жизнеспособности биологического материала ещ могло быть достоверным даже при достаточно высоких и достаточных для промышленности контрольных значениях. Однако в области ТИР каждый процент улучшения может дать экономическую выгоду. Пример 2. Жизнеспособность бычьих сперматозоидов при различных давлениях при комнатной температуре, влияние обработки давлением на снижение подвижности спермы. Хотя бычью сперму обычно хранят в замороженном состоянии, осуществимость настоящего способа была дополнительно проверена в применимой в промышленности системе. Сперму 13 быков разбавляли до концентрации спермы 8107/мл разбавителем AndroMed extender(Minitb, Tiefenbach, Germany). Разбавленную сперму помещали в трубочки на 0,25 мл при 25 С. Трубочки разделяли на опытные группы и необработанную контрольную группу. Опытные группы подвергали действию давления с помощью контролируемого компьютером устройства для подачи давления(Cryo-Innovation, Budapest, Hungary) при 9 различных режимах. Для тестирования общей или прогрессирующей подвижности использовали установку CASA, Sperm Vision Version 3.0 (Minitb, Tiefenbach,Germany). Был сделан вывод, что обработка давлением ниже 600 бар не влияла негативно на жизнеспособность спермы. После хранения спермы при комнатной температуре в течение 8 ч подвижность в обработанных и необработанных образцах исследовали вновь: доля подвижных клеток была выше в подвергнутых давлению образцах. Пример 3. Жизнеспособность сперматозоидов хряка при различных давлениях при комнатной температуре, влияние обработки давлением на снижение подвижности спермы. Для дополнительной оценки применимости способа согласно настоящему изобретению исследовали жизнеспособность сперматозоидов хряка, причм хранение при комнатной температуре было ближе к промышленному стандарту. Сбор спермы. Сперму забирали у хряков дважды в неделю. Содержащую сперму фильтрованную фракцию собирали руками в перчатках в изолированную ваккумную бутылочку объемом 250 мл, затем оценивали качество спермы (Hancock and Hovell, 1959). Использовали богатые спермой фракции эякулятов с содержанием подвижных сперматозоидов более 70%. Приготовление спермы. Замороженные препараты спермы обрабатывали по методу, описанному ранее (Almlid and Johnson,1988; Maxwell and Johnson, 1997), с небольшими модификациями. Вкратце, сперму разбавляли в отношении 1:2 нагретым до 37 С раствором Beltsville Thawing Solution (BTS) в изолированной бутылочке, затем охлаждали при комнатной температуре (20-23 С) в течение 1 ч от момента сбора. После охлаждения сперму переносили в 10 мл пробирки, центрифугировали при комнатной температуре в течение 3 мин при 2400g, надосадочную жидкость отбрасывали. Осадки ресуспендировали в разбавителе с лактозой и яичным желтком при комнатной температуре. Затем к сперме добавляли разбавитель с глицерином (второй разбавитель) и Equex paste (Minitb, Tiefenbach, Germany) до конечной концентрации 6% глицерина и 0,5% Equex. Затем спермой заполняли минитрубочки Ministraws объмом 0,25 мл (IMV, L'Aigle, France) и герметизовали их. Концентрацию устанавливали так, чтобы получить 300106 сперматозоидов в 1 мл. Обработка давлением. Трубочки помещали в заполненную водой (в качестве среды для передачи давления) камеру для обработки давлением устройства для подачи давления. Был применн предварительно определнный ре-7 022779 жим давления. Сделанное на заказ устройство для подачи давления было способно обеспечивать точно регулируемое давление в диапазоне 10-1000 бар. Оно было изготовлено из нержавеющей стали (KO 33) с внутренним диаметром 20220 мм и было присоединено к вентилю для подачи давления. Гидростатическое давление создавалось поршнем, движущимся в камере для обработки давлением. Скорость подачи и снятия давления составляла 200 бар/мин. Образцы подвергали действию давления при комнатной температуре при давлении 200, 400 или 800 бар в течение 40, 80 или 120 мин. Не подвергавшиеся давлению образцы выдерживали при комнатной температуре соответственно такое же время. Количественная оценка. После инкубации в течение 20 мин две капли по 5 мкл переносили на предметные сткла и покрывали двумя покровными стклами 2222 мм. Образцы помещали под микроскоп (Olympus BX 30), оборудованный термостатированным столиком (37 С) и фазоконтрастной оптикой (2 ОХ, Olympus, Japan). Для каждой капли обследовали по 5 полей зрения с помощью аппарата CASA, Sperm Vision Version 3.0(Minitb, Tiefenbach, Germany). Поступательно подвижными считали сперматозоиды со скоростью прямолинейного движения VSL10 мкм/с и АОС 10. Результаты. После анализа параметров подвижности с помощью смешанной модели (факторы: время, давление,данные (усредннные было установлено, что разница вследствие приложения давления достоверна (р = 0,001 для общей подвижности, р = 0,0103 для поступательной подвижности). После многофакторного сопоставления режимов воздействия давления было установлено, что воздействие давления 800 бар достоверно (р 0,001 для общей подвижности, р 0,05 для поступательной подвижности) дат худшие результаты, чем другие уровни воздействия (табл. 1). Таблица 1 Параметры подвижности (средняя подвижность (стандартное отклонение после обработки различными давлениями ОП - общая подвижность; ПП - поступательная подвижность. Для каждой комбинации условий обработки делали 2 повтора. Затем определяли, воздействует ли приложение обработки давлением на скорости подвижности спермы после периода акклиматизации в холоде в течение 5 ч. Снова применяли смешанную модель с учтом давления, длительности и оценкой по двум уровням: до и после акклиматизации в течение 5 ч, с взаимодействием фиксированных факторов и данными как фактором рандомизации. Оказалось, что значимыми являются только давление и факторы оценки (табл. 2). Таблица 2 Параметры подвижности (средняя подвижность (стандартное отклонение после акклиматизации в холоде в течение 5 ч ОП - общая подвижность; ПП - поступательная подвижность. Для каждой обработки давлением в течение 40, 80 и 120 мин делали, соответственно, 4, 3 и 2 повтора. Общая подвижность не подвергнутых действию давления (атмосферное давление) образцов достоверно снижалась, тогда как после обработки давлением 200 и 400 бар подвижность после акклиматизации в холоде в течение 5 ч не снижалась по сравнению с исходной подвижностью. Пример 4. Действие обработки давлением на оплодотворяющую способность сперматозоидов хряка. Пять свиноматок, уже исключнных из воспроизводства, осеменяли обработанной давлением спер-8 022779 мой хряка, чтобы определить оплодотворяющую способность обработанных давлением сперматозоидов,а также чтобы исследовать любые нарушения развития плодов. Эякуляты 2 хряков разбавляли 1:3 коммерческим разбавителем при температуре тела, затем образцы оставляли на 30 мин охладиться до комнатной температуры, затем помещали разбавленную сперму в сосуды для инфузии. Сосуды для инфузии помещали в камеру для обработки давлением автоматического устройства для подачи давления (Cryo-Innovation Ltd., Budapest, Hungary) и осуществляли программу давления при комнатной температуре. Использовали обработку давлением 300 бар в течение 90 мин. После обработки образцы спермы дополнительно разбавляли тем же коммерческим разбавителем при комнатной температуре, затем в пределах 1 ч после обработки давлением осеменяли 5 свиноматок. Осеменение повторяли через 12 ч после первого осеменения спермой, выдержанной при 5 С в течение соответствующего времени. При ультразвуковом обследовании было установлено, что все 5 свиноматок беременны. После нормального развития родились 58 здоровых поросят. У поросят не было обнаружено никаких дефектов и отклонений. Был сделан вывод, что применнная обработка давлением сохраняет оплодотворяющую способность сперматозоидов хряков и не вызывает у потомства никаких дефектов или отклонений. Средний размер помта на ферме составлял 9,8 поросят на свиноматку, тогда как результатом применнной обработки давлением были 100% беременность и средний размер помта 11,6. Поэтому был сделан дополнительный вывод, что применнная обработка давлением увеличивает также средний достигаемый размер помта. Пример 5. Жизнеспособность (дробление после активации in vitro) свиных овоцитов при различных режимах обработки давлением. Созревшие in vitro свиные овоциты активировали методом электроактивации in vitro после обработки давлением при различных комбинациях условий, чтобы определить устойчивость овоцитов к давлению. 600 созревших in vitro овоцитов после обнажения (снятия оболочки) разделили на опытные группы(n = 15-20 овоцитов в группе) и контрольные группы. Группы подвергли в синтетических трубочках объмом 0,5 мл в среде TCM-HEPES (трубочки были герметично закрыты минеральным маслом и металлическим шариком) давлению 200-400 бар в течение 30-90 мин при 24 и при 38,5 С. Контроли без обработки давлением выдержали при тех же условиях, одну контрольную группу оставили в среде IVM в термостате на такое же время. После обработки давлением овоциты активировали in vitro и в культуральной среде помещали в термостат с температурой 38,5 С для дальнейшего развития. Дробление фиксировали в течение 48 ч после активации. В табл. 3 показано процентное содержание в различных группах овоцитов, которые обнажались после активации in vitro. Таблица 3 Процентное содержание обнажившихся овоцитов через 48 ч после активации in vitro после обработок давлением при 24 и 38,5 С Был сделан вывод, что обработка давлением 200-400 бар в течение 30-90 мин не опасна для зрелых свиных овоцитов. Кроме того, обработка давлением 400 бар в течение 30-60 мин при 24 С и давлением 200 бар в течение 30-60 мин при 38,5 С обеспечивает большую частоту обнажения, чем в контрольных группах. Производили также обработки давлением 600-800 бар в течение 30-90 мин. В этих группах овоциты не выживали после обработки; эти параметры давления были вредны. Пример 6. Жизнеспособность in vitro после обработки давлением при различных комбинациях условий зрелых свиных овоцитов, активированных электрическим импульсом, превышающим оптимальный в 10 раз. Созревшие in vitro свиные овоциты после обработки давлением при различных комбинациях условий активировали методом электроактивации in vitro с 10-кратно увеличенным значением амплитуды,чтобы определить, лучше ли переносят обработанные давлением овоциты опасный электрошок. 300-600 созревших in vitro овоцитов (суточных) разделяли на опытные группы (n = 15-20 овоцитов в группе) и контрольные группы. Группы со скоплением клеток обрабатывали в синтетических трубочках объмом 0,5 мл в среде TCM-HEPES (трубочки были герметизированы минеральным маслом и металлическим шариком) давлением 200-800 бар в течение 30-120 мин при 24 С. Контроли без обработки давлением выдерживали при тех же условиях, одну контрольную группу оставляли в среде IVM в термостате на такое же время. После обработки давлением овоциты обнажали в гомогенизаторе, затем активировали in vitro электрическим импульсом, превышавшим по величине оптимальный импульс в 10 раз, и затем помещали в культуральной среде в термостат с температурой 38,5 С для дальнейшего развития. Дробление фиксировали в течение 48 ч после активации, формирование бластоцист оценивали на 6-й день. Опыты повторили 3 раза. Таблица 4 Процентное содержание в различных группах овоцитов, дробящихся и развивающихся дальше после активации in vitro 10 электрическим импульсом Обработки давлением 200-400 бар в течение 30-60 мин дали достоверно более высокое число жизнеспособных овоцитов, чем в группах без обработки давлением или в группах с обработкой давлением 600 или 800 бар. Сделан вывод, что обработка давлением 200 бар в течение 30 или 60 мин обеспечивает значительно более высокую частоту обнажения и образования бластоцист по сравнению с контрольными и другими группами. Пример 7. Жизнеспособность бактерий после обработки давлением при различных комбинациях условий с последующей сушкой из замороженного состояния. Для опыта были использованы два вида микробов - Escherichia coli and Lactobacillus plantarum. Подсчт клеток вели соответственно на питательной среде с триптоном и глюкозой TGE (Tripton GlucoseExtract) (MERCK) и агаре MRS (MERCK). Число клеток (колониеобразующих единиц, c.f.u.) определяли перед приготовлением опытных групп, после обработки давлением и через 96 ч инкубации при 37 С после сушки из замороженного состояния. Обработки давлением производили одновременно в 9 установках для давления согласно следующей таблице: Образцами заполняли стерильные синтетические трубочки объмом 0,5 мл и герметизировали стерильным стальным шариком. Сушку из замороженного состояния проводили в установке Edwards. Опыты повторяли дважды. Результаты приведены в нижеследующих таблицах. Таблица 5 Число жизнеспособных клеток Lactobacillus plantarum (c.f.u./0,4 мл) до и после сушки из замороженого состояния (2 повтора)(исходное число клеток перед обработкой: 9,0106-1,1107 c.f.u./мл) Таблица 5 (продлжение) Число жизнеспособных клеток Escherichia coli (c.f.u./0,4 мл) до и после сушки из замороженого состояния (2 повтора)(исходное число клеток перед обработкой: 4,08108-4,10108 c.f.u./мл) В маркированных жирным шрифтом опытных группах число жизнеспособных клеток было достоверно выше, чем в контрольной группе. Среди опытных групп лидерство было в группах 2 и 4. Сделан вывод, что специфическая обработка высоким гидростатическим давлением перед сушкой из замороженного состояния значительно повышает жизнеспособность клеток после сушки из замороженного состояния. Пример 8. Жизнеспособность коровьих эмбрионов после биопсии эмбриона или определения пола с обработкой давлением и без не. Сбор и созревание овоцитов in vitro. Овоциты COCs (отобранные аспиратором из яичников на мясокомбинате) подвергали созреванию в среде ТСМ-199 Earl с добавками сыворотки коровьего плода FCS, LH (Sigma), FSH (Sigma), L-глутамина,пенициллина и стрептомицина, с покрытием минеральным маслом, в течение 22 ч в термостате при температуре 38 С в атмосфере 5,1% СО 2 и при максимальной влажности воздуха. Приготовление спермы, фертилизация in vitro и культивирование in vitro. Средой для фертилизации была TALP с добавкой BSA, пенициламина, гипотаурина, эпинефрина и гепарина, с покрытием минеральным маслом. Подвижные сперматозоиды получали центрифугированием подвергнутых замораживаниюоттаиванию сперматозоидов в ступенчатом градиенте Percoll (2 мл 45% Percoll поверх 2 мл 90% Percoll) в течение 20 мин при 700 g при комнатной температуре. После ресуспендирования сперматозоиды вносили в фертилизационные капли. Пластины инкубировали в течение 19 ч в атмосфере 5% СО 2 в увлажннном воздухе при 39 С. Предположительные зиготы затем культивировали in vitro в капельках SOF под минеральным маслом в увлажннной атмосфере 5% СО 2 при 39 С. Обработка давлением. Расправившиеся бластоцисты помещали в пластиковые трубочки объмом 0,25 мл без пузырьков воздуха (7-9 эмбрионов на трубочку) с средой для поддержания эмбрионов, затем трубочки герметизировали PVC. Трубочки помещали в устройство для подачи давления (Cryo-Innovation Ltd., Budapest, Hungary). Эмбрионы подвергали действию гидростатического давления различной величины от 60 до 90 МПа (с шагом 10 МПа) в течение различных промежутков времени (15, 30, 45, 50, 60, 90, 100 мин) при комнатной температуре. Результаты. Степень жизнеспособности эмбрионов с определением пола или эмбрионов после биопсии достоверно выше при обработке давлением со специально выбранными параметрами, чем без давления. Пример 9. Жизнеспособность коровьих эмбрионов после переноса гена при обработке давлением и без не. В данном опыте коровьи эмбрионы подвергали действию гидростатического давления, чтобы определить, подобно ли их поведение при условиях изменяющегося давления поведению мышиных эмбрионов. После воздействия гидростатического давления образцы подвергали процедуре переноса гена. После культивирования in vitro и переноса жизнеспособность образцов была выше, чем у образцов, не подвергнутых предварительному действию давления. Пример 10. Жизнеспособность человеческих эмбрионов после ICSI и биопсии эмбрионов при обработке давлением и без не. В данном опыте коровьи эмбрионы подвергали действию гидростатического давления, чтобы определить, подобно ли их поведение при условиях изменяющегося давления поведению мышиных эмбрионов. После воздействия гидростатического давления образцы подвергали процедуре ICSI или биопсии. После культивирования in vitro и переноса жизнеспособность образцов была выше, чем у образцов, не подвергнутых предварительному действию давления. Пример 11. Жизнеспособность овоцитов (человеческих, коровьих, козьих, свиных) после обработки давлением, хранения in vitro и созревания. Целью данного опыта было проверить, в большей ли степени устойчивы овоциты к любому процессу (включая хранение in vitro и созревание), если они подвергались предварительному воздействию гидростатического давления. Овоциты подвергали действию гидростатического давления и после снятия давления образцы выдерживали in vitro. Жизнеспособность овоцитов in vitro и in vivo повышалась по сравнению с образцами, которые не подвергались предварительному действию давления. Пример 12. Жизнеспособность эмбрионных стволовых клеток после воздействия давления и хранения in vitro. Целью данного опыта было убедиться, что жизнеспособность эмбрионных стволовых клеток повышается при предварительном воздействии давления. Мышиные эмбрионные стволовые клетки подвергали действию гидростатического давления, после снятия давления образцы хранили и обрабатывали. После этого жизнеспособность клеток in vitro и in vivo повышалась по сравнению с образцами, которые не подвергались предварительному действию давления. Приведнные в данных примерах результаты показывают, что обработка давлением, выполненная перед осуществлением метода вспомогательной репродукции или биотехнологической методики любого типа повышает жизнеспособность (устойчивость к стрессу) гамет и эмбрионов (и стволовых клеток). Кроме того, представленные данные, полученные для мышиных эмбрионов, сперматозоидов быка и хряка, свиных овоцитов и бактерий, указывают на широкую применимость идеи настоящего изобретения. Применение способа согласно настоящему изобретению может быть полезно для повышения частоты успеха во всех видах методов вспомогательной репродукции или биотехнологических методов, манипуляций с эмбрионами, в том числе у других видов млекопитающих, не исключая человека. Данный способ открывает также широкие возможности в других областях, где могут найти применение манипуляции с гаметами и эмбрионами. Поскольку жизнеспособность замороженной спермы хряков (а также коней) после размораживания низка, наиболее обычным примом разведения этих видов является осеменение свежей, разбавленной,разбавленной и охлажднной или разбавленной и остуженной спермой. При применении предварительного воздействия высокого гидростатического давления сперма значительно лучше сохраняется при данной температуре, а также существенно увеличивается длительность е хранения с повышенным качеством. Подобным же образом, продукция эмбрионов in vitro и in vivo, культивирование эмбрионов in vitro,определение пола, деление и применение любой биотехнической/биотехнологической процедуры, переноса эмбрионов, созревание ооцитов, ICSI или применение для овоцитов или спермы любой биотехнической/биотехнологической процедуры значительно снижает их жизнеспособность/частоту выживаемости. Как экстраполяция указанных выше особенностей, при применении предварительного воздействия ВГД к гаметам и эмбрионам могут быть применены любые типы методов вспомогательной репродукцииfor stress adaptation. Mol. Microbiol. 27, 247-255. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ обработки жизнеспособного биологического материала, представляющего собой овоциты или сперму, перед последующим хранением или манипуляциями, включающий стадии, на которых:(а) прилагают к указанному биологическому материалу гидростатическое давление в диапазоне от 10 до 100 МПа;(б) выдерживают указанный жизнеспособный биологический материал под указанным гидростатическим давлением в течение периода времени от 10 с до 150 мин;(в) снимают гидростатическое давление,где указанный биологический материал находится при температуре выше точки замерзания среды во время любой стадии хранения и манипуляции. 2. Способ по п.1, где величина гидростатического давления находится в диапазоне от 20 до 40 МПа. 3. Способ по любому из пп.1, 2, где гидростатическое давление прилагают в течение периода времени от 20 с до 90 мин. 4. Способ по любому из пп.1-3, где гидростатическое давление прилагают в течение периода времени от 30 до 60 мин.

МПК / Метки

МПК: A01N 1/02

Метки: биологического, жизнеспособного, материала, способ, обработки

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/15-22779-sposob-obrabotki-zhiznesposobnogo-biologicheskogo-materiala.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ обработки жизнеспособного биологического материала</a>

Похожие патенты