Ферментативный гидролиз биомасс, имеющих высокое содержание сухого вещества

Номер патента: 14759

Опубликовано: 28.02.2011

Авторы: Йергенсен Хеннинг, Вибе-Педерсен Якоб, Ларсен Ян, Фелбю Клаус

Есть еще 5 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, включая лигноцеллюлозную биомассу, отличающийся тем, что указанную биомассу подвергают ферментативному гидролизу с использованием по меньшей мере одной целлюлазы либо в нативной форме, либо в форме микроорганизмов, вызывающих накопление таких ферментов, в сочетании с перемешиванием в смесителе, использующем принцип свободного падения, таком как барабанный смеситель, которые обеспечивают механическую обработку и/или разрушение биомассы, причем указанная биомасса имеет содержание сухого вещества более 20% в начале перемешивания/гидролиза.

2. Способ по п.1, в котором указанная содержащая полисахариды биомасса представляет собой лигноцеллюлозную биомассу, полученную из сельскохозяйственных культур, состоящую, например, из стеблей кукурузы, жмыха, соломы, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса и сорго; клубней, например свеклы, картофеля; зерна, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса, сорго; древесины, состоящей из мягкой древесины, например Pinus sylvestris, Pinus radiata, твердой древесины, например Salix spp., Eucalyptus spp., или твердых бытовых отходов, макулатуры, фракции волокон от переработки биогаза, компоста и подобных биомасс.

3. Способ по п.1, в котором указанная содержащая полисахариды биомасса представляет собой крахмал, например содержащее крахмал зерно или очищенный крахмал.

4. Способ по п.1, в котором указанная содержащая полисахариды биомасса представляет собой смесь крахмала, например содержащего крахмал зерна или очищенного крахмала, и лигноцеллюлозных биомасс, полученных из сельскохозяйственных культур, состоящих, например, из стеблей кукурузы, соломы, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса и сорго; клубней, например свеклы, картофеля; зерна, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса, сорго; древесины, состоящей из мягкой древесины, например Pinus sylvestris, Pinus radiata, твердой древесины, например Salix spp., Eucalyptus spp.; твердых бытовых отходов, макулатуры и подобных биомасс.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором содержание сухого вещества в содержащей полисахариды биомассе составляет от 25 до 80%.

6. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, в котором по меньшей мере 20% (мас./мас.) лигноцеллюлозной биомассы имеет размер волокон более 26 мм.

7. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, в котором лигноцеллюлозная биомасса подвергается предварительной тепловой обработке от 110 до 250°С.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором ферментативный гидролиз осуществляют с использованием комбинации гидролитических ферментов, включающей в себя фермент, лизирующий углеводы, и окислительный фермент.

9. Способ по любому из пп.1, 3 или 4, в котором ферментативный гидролиз содержащего крахмал зерна осуществляют с использованием комбинации гидролитических ферментов и протеолитических ферментов.

10. Способ по любому из пп.1-9, в котором ферментативный гидролиз осуществляют при 0-105°С.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором время обработки для ферментативного гидролиза составляет 1-72 ч.

12. Способ по любому из пп.1-11, который осуществляют в виде периодического способа, способа с подпиткой, непрерывного способа.

Рисунок 1


Текст

Смотреть все

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ БИОМАСС, ИМЕЮЩИХ ВЫСОКОЕ СОДЕРЖАНИЕ СУХОГО ВЕЩЕСТВА(57) Настоящее изобретение относится к способу разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, имеющих относительно высокое содержание сухого вещества. В настоящем изобретении ферментативный гидролиз комбинируют перемешиванием, основанным на принципе действия силы тяжести, обеспечивающим приложение к биомассам механических сил, главным образом усилия сдвига и силы разрыва. Кроме того, настоящее изобретение относится к дополнительной утилизации таких обработанных биомасс, например, для последующей ферментации в биоэтанол, биогаз, специализированные углеводы для продуктов питания и кормов, а также углеродсодержащее сырье для переработки в пластмассу и химические продукты. 014759 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу разжижения и осахаривания биомасс, содержащих полисахариды, имеющих высокое содержание сухого вещества и предпочтительно содержащих волокна и частицы с большими средними размерами. Кроме того, настоящее изобретение относится к дополнительной утилизации таких обработанных биомасс, например, для последующей ферментации в биоэтанол, специализированные углеводы для продуктов питания и кормов, а также углеродсодержащее сырье для переработки в пластмассу и химические продукты. Уровень техники В многочисленных промышленных и сельскохозяйственных процессах, например в коммунальном хозяйстве, при обработке продуктов питания и кормов и в лесном хозяйстве, образуются биомассы, отходы и побочные продукты, содержащие полимерные сахара, например в форме крахмала, целлюлозы и гемицеллюлозы. Сельскохозяйственный бизнес и химическая промышленность, а также общественные организации проявляют значительный интерес к разработке способов превращения таких биомасс в более ценные материалы. Таким образом, в качестве примера, такие биомассы потенциально могут быть превращены в биоэтанол, биогаз или химические продукты с использованием микроорганизмов и/или гидролитических ферментов. Однако большинство способов, известных в настоящее время, еще не достигло крупномасштабного коммерческого практического применения вследствие их высокой энергоемкости, и, следовательно, их осуществление проблематично с экономической точки зрения. Кроме того что углеводы, полученные из биомассы, имеют важное значение в качестве продуктов питания и кормов, они могут быть использованы в качестве сырья для ряда промышленных способов. В форме полимеров хорошо известным продуктом является бумага, в которой основным компонентом является целлюлоза. Однако и в случае преобразования в олигомеры и мономеры углеводы являются важным сырьем для ряда промышленных способов. Как будет подробно описано, они необходимы для ряда микробиологических процессов, но, кроме того, они могут быть использованы в качестве сырья, например, для ферментативной переработки в специализированные углеводы для продуктов питания и кормов,например трегалозу. Также олигомеры и мономеры углеводов могут заменять продукты нефтехимии для переработки в пластмассу и органические химические вещества. Кроме того, углеводы могут быть использованы в качестве носителей водорода при каталитической гидрогенизации. Поэтому очевидно, что, если дешевый и распространенный ресурс обработанных углеводов можно сделать доступным для промышленной переработки, это может иметь значительный экономический эффект. Крахмал является наиболее широко распространенным запасным углеводом у растений и встречается в форме гранул, которые заметно отличаются по размеру и физическим характеристикам у разных видов. Гранулы крахмала, как правило, довольно устойчивы к проникновению в них и воды, и гидролитических ферментов благодаря образованию водородных связей внутри одной молекулы и между соседними молекулами. Однако такие внутримолекулярные и межмолекулярные водородные связи могут ослабевать с повышением температуры суспензии. В случае нагревания водной суспензии крахмала водородные связи ослабевают, абсорбируется вода и гранулы крахмала набухают. Указанный процесс обычно называют желатинизацией, так как образуемый раствор имеет гелеобразную, очень вязкую консистенцию. Химически крахмал представляет собой природный полимер глюкозы, который обычно нерастворим, но может быть диспергирован в воде при комнатной температуре, и состоит из повторяющейся единицы, сходной с единицей целлюлозы, при этом единицы связаны вместе -1,4- и -1,6-глюкозидными связями в отличие от -1,4-глюкозидных связей в случае целлюлозы. Единицы образуют либо компонент с неразветвленной цепью, называемый амилозой, либо компонент с разветвленной цепью, называемый амилопектином. Большинство семян, зерен и клубней растений содержат примерно 20-25% амилозы. Но некоторые, например крахмал гороха, содержат 60% амилозы, а некоторые виды зерновых содержат 80% амилозы. Восковидные разновидности зерновых, такие как рис, имеют низкое содержание амилозы. Кроме крахмала тремя основными составляющими растительной биомассы являются целлюлоза,гемицеллюлоза и лигнин, которые обычно называют общим термином лигноцеллюлоза. Общий термин"содержащие полисахариды биомассы" включает как содержащие крахмал биомассы, так и содержащие лигноцеллюлозу биомассы. Целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин присутствуют в разных количествах в различных растениях и в разных частях растения, и они тесно связаны с образованием структурного каркаса растения. Целлюлоза является гомополисахаридом, полностью состоящим из D-глюкозы, связанной вместе 1,4-глюкозидными связями, и имеющим степень полимеризации до 10000. Линейная структура целлюлозы обеспечивает возможность образования внутри- и межмолекулярных водородных связей, которые приводят к агрегации цепей целлюлозы в микрофибриллы. Высокоупорядоченные области в микрофибриллах называют кристаллическими, а менее упорядоченные области называют аморфными. Микрофибриллы подвергаются сборке в фибриллы, которые затем образуют волокна целлюлозы. Частично кристаллическая структура целлюлозы наряду с микрофибриллярной структурой придает целлюлозе высокую прочность при растяжении, такая структура делает целлюлозу нерастворимой в большинстве рас-1 014759 творителей и частично ответственна за устойчивость целлюлозы к разрушению микроорганизмами, т.е. к ферментативному гидролизу. Гемицеллюлоза является сложным гетерогенным полисахаридом, состоящим из нескольких мономерных остатков: D-глюкозы, D-галактозы, D-маннозы, D-ксилозы, L-арабинозы, D-глюкуроновой кислоты и 4-O-метил-D-глюкуроновой кислоты. Гемицеллюлоза имеет степень полимеризации ниже 200,имеет боковые цепи и может быть ацетилирована. В древесине мягких пород, подобных пихте, сосне и ели, основными фракциями гемицеллюлозы являются галактоглюкоманнан и арабино-4-Ометилглюкуроноксилан. В древесине твердых пород, подобных березе, тополю, осине или дубу, основными составляющими гемицеллюлозы являются 4-O-ацетил-4-метилглюкуроноксилан и глюкоманнан. Травянистые растения, подобные рису, пшенице, овсу и просу, имеют гемицеллюлозу, главным образом состоящую из глюкуроноарабиноксилана. Лигнин представляет собой сложную сеть, образованную полимеризацией единиц фенилпропана, и он составляет наиболее обильную неполисахаридную фракцию в лигноцеллюлозе. Три мономера в лигнине представляют собой пара-кумариловый спирт, конифериловый спирт и синапиловый спирт, и они чаще всего связаны посредством арилглицерил-пара-ариловых эфирных связей. Лигнин связан с гемицеллюлозой и внедряется в углеводы, тем самым обеспечивая защиту против разрушения микроорганизмами и химического разрушения. Как указано выше, обработанные биомассы потенциально могут быть превращены в биоэтанол или химикаты с использованием микроорганизмов и/или гидролитических ферментов, или углеводы из обработанных биомасс могут быть использованы в качестве сырья в ряде промышленных процессов, например для ферментативной переработки в специализированные углеводы для продуктов питания и кормов или в качестве заменителей нефтехимических продуктов для получения пластмассы и органических химических веществ. Дополнительно обработку углеводов в биомассе согласно настоящему изобретению можно комбинировать с разделением и фракционированием неуглеводных компонентов. Особенно предпочтительное применение способа согласно настоящему изобретению представляет собой интегрированную часть способа получения биоэтанола. Получение биоэтанола из содержащих полисахариды биомасс можно разделить на три стадии: 1) предварительная обработка, 2) гидролиз полисахаридов до ферментируемых углеводов и 3) ферментация углеводов. Предварительная обработка требуется в том случае, если последующий гидролиз (например, ферментативный гидролиз) полисахаридов требует разрушения другой защитной структуры (например, лигнина) растительных материалов. Известно несколько методик предварительной обработки. В случае злаковых и зерновых такая предварительная обработка может быть в форме простого сухого помола для того, чтобы сделать поверхности доступными, но в случае лигноцеллюлозных биомасс также необходимы термические и/или химические способы. Содержащая полисахариды биомасса, состоящая, например,из очищенного крахмала, не требует указанных способов предварительной обработки перед ферментативной обработкой. Способы предварительной обработки могут быть основаны на кислотном гидролизе,паровом взрыве, окислении, экстракции щелочью или этанолом и т.д. Общим признаком методик предварительной обработки является то, что при комбинировании с действием возможных добавляемых реагентов в них используют размягчение и разрыхление растительных материалов, которое происходит при температурах выше 100 С. После предварительной обработки следующей стадией утилизации содержащих полисахариды биомасс для получения биоэтанола или других биохимических продуктов является гидролиз высвобождаемого крахмала, целлюлозы и гемицеллюлозы до ферментируемых сахаров. Если гидролиз осуществляют ферментативно, то это требует большого количества различных ферментов с разными способами действия. Ферменты могут быть добавлены извне, или их могут обеспечить микроорганизмы, растущие на биомассе. Целлюлозу гидролизуют до глюкозы гидролизующими углеводы ферментами целлюлазами. Общепринятое представление о системе лизиса целлюлозы основано на делении целлюлаз на три класса: экзо 1,4D-глюканазы или целлобиогидролазы (СВН) (ЕС 3.2.1.91), которые отщепляют единицы целлобиозы от концов цепей целлюлозы; эндо-1,4D-глюканазы (EG) (EC 3.2.1.4), которые случайным образом гидролизуют внутренние -1,4-глюкозидные связи в цепи целлюлозы; 1,4D-глюкозидаза (ЕС 3.2.1.21),которая гидролизует целлобиозу до глюкозы, а также отщепляет единицы глюкозы от целлоолигосахаридов. Различные сахара, входящие в гемицеллюлозу, высвобождают гемицеллюлазами. Система лизиса гемицеллюлозы является более сложной, чем система лизиса целлюлозы из-за гетерологичной природы гемицеллюлозы. Система включает в себя наряду с другими ферментами эндо-1,4D-ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), которые гидролизуют внутренние связи в цепи ксилана; 1,4D-ксилозидазы (ЕС 3.2.1.37), которые атакуют ксилоолигосахариды от невосстанавливающего конца и высвобождают ксилозу; эндо-1,4-D-маннаназы (ЕС 3.2.1.78), которые расщепляют внутренние связи; 1,4D-маннозидазы (ЕС 3.2.1.25),которые расщепляют манноолигосахариды до маннозы. Боковые группы удаляют рядом ферментов: -D-2 014759 галактозидазами (ЕС 3.2.1.22), -L-арабинофуранозидазами (ЕС 3.2.1.55), -D-глюкуронидазами (ЕС 3.2.1.139), циннамоилэстеразами (ЕС 3.1.1.-), ацетилксиланэстеразами (ЕС 3.1.1.6) и ферулоилэстеразами(ЕС 3.1.1.73). Наиболее важными ферментами для применения в гидролизе крахмала являются альфа-амилазы(1,4D-глюканглюканогидролазы (ЕС 3.2.1.1. Они представляют собой эндо-действующие гидролазы,которые расщепляют 1,4D-глюкозидные связи и могут обходить, но не могут гидролизовать 1,6 альфа-D-глюкозидные точки ветвления. Однако для гидролиза крахмала также можно использовать экзогенно действующие гликоамилазы, такие как бета-амилаза (ЕС 3.2.1.2) и пуллуланаза (ЕС 3.2.1.41). Результатом гидролиза крахмала главным образом являются глюкоза, мальтоза, мальтотриоза, -декстрин и различные количества олигосахаридов. В том случае, когда основанный на крахмале гидролизат используют для ферментации, предпочтительным может быть добавление протеолитических ферментов. Такие ферменты могут предотвращать флокуляцию микроорганизмов и могут создавать аминокислоты,доступные для микроорганизма. Было обнаружено, что применение окислительных ферментов в комбинации с предварительной обработкой и ферментативным гидролизом содержащих лигноцеллюлозу биомасс может оказывать положительное влияние на общий гидролиз, а также на жизнеспособность микроорганизмов, используемых,например, для последующей ферментации. Причиной такого влияния является окислительное поперечное сшивание лигнинов и других фенольных ингибиторов, которое вызвано окислительными ферментами. Обычно используют лакказу (ЕС 1.10.3.2) или пероксидазу (ЕС 1.11.1.7) либо извне, либо посредством включения гена лакказы в используемый микроорганизм. Ранее был описан ферментативный гидролиз биомассы. Однако в случае биомасс, содержащих лигноцеллюлозу, таким способом успешно гидролизовали только материал, состоящий из волокон и частиц со средним размером менее 1 дюйма (25,4 мм) и, кроме того, имеющий относительно низкое содержание сухого вещества, т.е. ниже 20% (мас./мас.). В US 4409329 описан гидролиз твердого целлюлозного материала до сахара, при этом целлюлозу гидролизовали до простых сахаров обработкой взвеси гранул 3-20% (мас./мас.) твердого сырья, содержащего 30-80% (мас./мас.) целлюлозы, ферментативным комплексом целлюлазы. Исходное сырье, содержащее твердую целлюлозу, имело средний размер частиц от 0,01 до 1 дюйма (0,0254-25,4 мм) в диаметре. Для перемешивания использовали перфорированные вращающиеся лопатки. В US 2002117167 A описан ферментативный гидролиз гемицеллюлозы в материале биомассы,включающий в себя солюбилизацию по меньшей мере части гемицеллюлозы и гидролиз солюбилизированной гемицеллюлозы с получением по меньшей мере одного моносахарида. Используемая биомасса предпочтительно представляет собой взвесь в воде сырого или предварительно обработанного материала. Материал биомассы может представлять собой любой целлюлозный материал, который содержит гемицеллюлозу. Описано, что способ является особенно эффективным в случае волокон зерновых культур, таких как кукуруза, пшеница, рис, овес или ячмень. В US 2004005674 A описан способ ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы. Разрушение лигноцеллюлозы до сахаров включает в себя контактирование лигноцеллюлозы по меньшей мере с одним вспомогательным ферментом и по меньшей мере одной целлюлазой. Содержащий лигноцеллюлозу материал размалывали (средний размер волокон материала дополнительно не указан) и он имел низкое содержание сухого вещества (0,2 г размолотого материала соломы в 10 мл раствора фермента). Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к способу разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, имеющих относительно высокое содержание сухого вещества, предпочтительно выше 20%,и предпочтительно состоящих из относительно крупных волокон и частиц, предпочтительно с таким распределением размера волокон и частиц, при котором по меньшей мере 20% (мас./мас.) биомассы находится в диапазоне 26-70 мм. Кроме того, способ особенно применим для разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, главным образом состоящих из крахмала, очищенного крахмала,целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина, например зерна или пшеничной соломы. В случае лигноцеллюлозных биомасс их предпочтительно предварительно обрабатывают, подвергая воздействию температур от 110 до 250 С в течение 1-60 мин таким образом, который обеспечивает доступность целлюлозы для ферментов и в то же время обеспечивает ограниченное содержание ингибиторов ферментации в предварительно обработанной биомассе. В настоящем изобретении объединяют ферментативный гидролиз,основанный на комбинации гидролитических ферментов, включая фермент, вызывающий гидролиз углеводов, и окислительный фермент, с перемешиванием, основанным на принципе действия силы тяжести,обеспечивающим приложение к биомассам механических сил, главным образом усилия сдвига и силы разрыва. Предпочтительными типами перемешивания являются, например, перемешивание в смесителях,работающих по принципу свободного падения, таких как смесители барабанного типа, смесители на основе опрокидывания или сходные смешивающие устройства.-3 014759 Описание изобретения Получение концентрированных растворов сахаров выгодно в связи с последующей ферментацией или другими микробиологическими процессами благодаря повышенной объемной продуктивности и пониженной себестоимости последующей обработки. В случае получения биоэтанола потребности в энергии для перегонки существенно снижаются, если бульон для ферментации содержит более 4% этанола (Galbe and Zacchi, 2002). Для этого требуется концентрация сахара выше 8%, что в случае большинства типов лигноцеллюлозных биомасс соответствует начальному содержанию сухого вещества выше 20%. Другими словами, желательно подвергать ферментативному гидролизу содержащие полисахариды биомассы с высоким содержанием сухого вещества, предпочтительно выше 20%, чтобы затем было можно получать содержащие биоэтанол бульоны для ферментации, подходящие для перегонки этанола. Способы согласно настоящему изобретению обычно обеспечивают степень ферментативного гидролиза 30-50%. Однако в оптимизированных условиях можно получить еще более высокую степень ферментативного гидролиза. Поэтому разжиженная и осахаренная биомасса будет содержать относительно большие количества глюкозы, ксилозы, целлобиозы, лигнина, неразрушенной целлюлозы и гемицеллюлозы и, кроме того, активные ферменты, подходящие для последующей обработки, т.е. процессов ферментации (этанол, молочная кислота и т.д.). Разжиженные биомассы также будут применимы для газификации, гидрогенизации, органического синтеза или получения биогаза и кормов. Если содержащие полисахариды биомассы являются лигноцеллюлозными, то предварительная обработка должна привести к тому, чтобы структура лигноцеллюлозного содержимого стала более доступной для ферментов, и в то же время концентрации вредных ингибирующих побочных продуктов, таких как уксусная кислота, фурфураль и гидроксиметилфурфураль, в основном оставались низкими. Существует несколько методик достижения указанного, при которых лигноцеллюлозный материал подвергают воздействию температур от 110 до 250 С в течение 1-60 мин, например экстракция горячей водой; многоступенчатый гидролиз разбавленной кислотой, при котором растворенное вещество удаляется до образования ингибирующих веществ; гидролиз разбавленной кислотой в условиях относительно низкой жесткости; щелочное влажное окисление; паровой взрыв; практически любая предварительная обработка с последующей детоксикацией. Содержащие полисахариды биомассы согласно настоящему изобретению включают любой материал, содержащий полимерные сахара, например в форме крахмала, а также очищенного крахмала, целлюлозы и гемицеллюлозы. Предпочтительны биомассы, имеющие содержание сухого вещества более 20%. Соответствующие типы биомасс для ферментативного гидролиза и перемешивания согласно настоящему изобретению могут включать биомассы, полученные из сельскохозяйственных культур, например такие как крахмал, например содержащее крахмал зерно и очищенный крахмал; кукурузные стебли; жмых; солома, например солома риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса, сорго; мягкая древесина, например Pinus sylvestris, Pinus radiata; твердая древесина, например Salix spp. Eucalyptus spp.; клубни, например свекла, картофель; зерно, например рис, пшеница, рожь, овес, ячмень, рапс, сорго и кукуруза; макулатура, волокнистые фракции от переработки биогаза, компост, остатки после обработки масличной пальмы, твердые бытовые отходы или т.п. со сходным содержанием сухого вещества. Если содержащие полисахариды биомассы являются лигноцеллюлозными, то материал до предварительной обработки может быть нарезан на куски, при этом 20% (мас./мас.) биомассы предпочтительно имеет размер в диапазоне 26-70 мм. Предварительно обработанный материал предпочтительно имеет содержание сухого вещества более 20% перед поступлением в смешивающее устройство. Кроме высвобождения из биомасс углеводов, в процессе предварительной обработки стерилизуют и частично растворяют биомассу и в то же время вымывают хлорид калия из фракции лигнина. Перемешивание, осуществляемое в способе согласно настоящему изобретению, служит по меньшей мере четырем целям. Во-первых, перемешивание обеспечивает тесный контакт между используемыми ферментами и содержащей полисахариды биомассой (субстратом), так как в большинстве случаев биомасса будет нерастворима или только очень плохо растворима. Во-вторых, механическая работа, осуществляемая по отношению к материалу во время перемешивания, помогает разорвать большее количество волокон биомассы и частиц и поэтому будет способствовать увеличению площади поверхности материала. Это увеличит доступность, например, целлюлозы и гемицеллюлозы для используемых ферментов. Чтобы дополнительно увеличить механическую работу,совершаемую по отношению к материалу, в барабан могут быть добавлены стальные шарики или подоб-4 014759 ные средства, которые будут сталкиваться с материалом. В-третьих, перемешивание материала предотвращает локальное накопление высокой концентрации целлюлозы, которое - как хорошо известно специалистам в данной области - может, например, ингибировать ферменты целлюлазы, особенно целлобиогидролазы. В-четвертых, важным свойством ферментов целлюлаз является влияние связывающих целлюлозу доменов (CBD) на эффективность фермента. CBD являются функциональными частями разрушающих целлюлозу ферментов. CBD обеспечивает адгезию водорастворимого фермента на поверхности нерастворимого субстрата (целлюлозы). Тесная связь между ферментом и целлюлозой, обеспечиваемая CBD,увеличивает скорость катализа и стабильность фермента. Чтобы гидролизовать целлюлозу, фермент должен изменить положение CBD на цепи целлюлозы. Предполагается, что механическое действие, т.е. перемешивание, важно для перемещения CBD и, следовательно, для ферментативного действия ферментов вдоль цепи целлюлозы. В дополнение к вышесказанному следует отметить, что ферментативный гидролиз биомассы традиционно проводили в реакторах с мешалками, оборудованных лопастным колесом (например, турбиной Раштона или лопастным колесом Intemig), смонтированным на центрально расположенном вале лопастного колеса, подобных реактору, который используют при промышленной ферментации. Из-за такого оборудования растворы с высокой вязкостью, очень липкого или содержащего большое количество сухого вещества материала не могут быть эффективно перемешаны, и в результате создаются зоны с очень плохим перемешиванием или не перемешанные зоны. Кроме того, перемешивание таких растворов требует очень большого потребления энергии, что убыточно с точки зрения экономичности процесса. Ранее при работе с содержащими полисахариды биомассами ограничивались возможным верхним пределом примерно 20%. Принцип перемешивания на основе действия силы тяжести согласно настоящему изобретению преодолевает указанную проблему и может быть использован в случае содержащих полисахариды биомасс с содержанием сухого вещества до 80%, предпочтительно 20-50%. Принцип перемешивания на основе действия силы тяжести согласно настоящему изобретению легко можно осуществлять в более крупном масштабе и применять по отношению ко всем видам биомасс, кроме очищенного крахмала, содержащим до более чем 80% целлюлозы. В отличие от обычных реакторов с мешалками, традиционно используемых для ферментативного гидролиза, принцип перемешивания, основанный на действии силы тяжести, т.е. применение барабанного смесителя, смесителя с подниманием биомассы посредством вращения или сходного устройства для перемешивания, использующего принцип свободного падения, одновременно обеспечивает эффективное перемешивание даже при небольшой подводимой мощности и высоком содержании сухого вещества и,кроме того, осуществляет механическую обработку/разрушение посредством силы тяжести, включая усилия сдвига и силы разрыва, действующие между материалом и барабаном, а также сил, возникающих в результате столкновения между падающим материалом и дном барабана, и одновременно положительно сказывается на влиянии связывающих целлюлозу доменов (CBD) на эффективность фермента. Хотя известна обработка несмешиваемых растительных материалов, таких как содержащая полисахариды биомасса с относительно высоким содержанием сухого вещества и большим средним размером волокон и частиц, в результате ферментации в твердом состоянии или в биореакторах, в которых для перемешивания используют смесители барабанного типа (Giovanozzi et al. 2002), такой принцип ранее не был реализован в специализированном способе разжижения/осахаривания или в процессе ферментации для получения биоэтанола. Настоящее изобретение относится к способу обработки биомасс с относительно высоким содержанием сухого вещества, например содержанием сухого вещества от 20 до 80%, предпочтительно от 20 до 50%. Кроме того, способ согласно настоящему изобретению обеспечивает эффективное разжижение и осахаривание, что создает возможность, например, для прямого использования конечного продукта в ферментерах. Ферменты, способные осуществлять превращение крахмала, целлюлозы и гемицеллюлозы или их частей в глюкозу, ксилозу и целлобиозу, добавляют к биомассе либо в нативной форме, либо в форме микроорганизмов, вызывающих накопление таких ферментов. рН и температуру биомассы корректируют в соответствии с оптимумом рН и оптимумом температуры для применяемых ферментов. В зависимости от загрузки фермента биомасса будет разжижена и осахарена до жидкого состояния без какого-либо остатка крупных волокон и частиц или только с небольшим остатком крупных волокон или частиц в течение 3-24 ч. Добавление метаболизирующего глюкозу микроорганизма в любое заданное время в течение гидролиза и разжижения может повысить степень ферментативного гидролиза, так как при этом удаляются ингибирующие ферментативные продукты. Подробное описание изобретения Способ согласно настоящему изобретению можно осуществить с использованием следующих предпочтительных технических параметров. Содержание сухого вещества: 20-80%, предпочтительно 25-70%, более предпочтительно 25-60%,еще более предпочтительно 25-50% или 25-40% и наиболее предпочтительно 25-35%. Распределение размеров волокон и частиц лигноцеллюлозной биомассы: 0-150 мм, предпочтитель-5 014759 но 5-125 мм, более предпочтительно 10-100 мм, еще более предпочтительно 15-90 мм или 20-80 мм и наиболее предпочтительно 26-70 мм. Предпочтительное распределение размеров волокон и частиц определяют как наличие по меньшей мере 20% (мас./мас.) лигноцеллюлозной биомассы с размерами в пределах предпочтительного интервала. Если содержащая полисахариды биомасса является лигноцеллюлозной, то ее необходимо предварительно обрабатывать, например, посредством экстракции горячей водой. В том случае если выбрана гидротермическая предварительная обработка, предпочтительными являются следующие технические параметры. Температура предварительной обработки: 110-250 С, предпочтительно 120-240 С, более предпочтительно 130-230 С, более предпочтительно 140-220 С, более предпочтительно 150-210 С, более предпочтительно 160-200 С, еще более предпочтительно 170-200 С или наиболее предпочтительно 180200 С. Время предварительной обработки: 1-60 мин, предпочтительно 2-55 мин, более предпочтительно 350 мин, более предпочтительно 4-45 мин, более предпочтительно 5-40 мин, более предпочтительно 5-35 мин, более предпочтительно 5-30 мин, более предпочтительно 5-25 мин, более предпочтительно 520 мин и наиболее предпочтительно 5-15 мин. Содержание сухого вещества после предварительной обработки составляет по меньшей мере 20% (мас./мас.). Ферментативная обработка содержащих полисахариды биомасс в смесителе, работающем на основе действия силы тяжести. Если используют сосуд, основанный на принципе смешивания при свободном падении, в форме реактора с горизонтально размещенным валом смесителя, поднимающего биомассу, или сходное смешивающее устройство, то предпочтительными являются следующие технические параметры. Скорость вращения: 0-30 об/мин, предпочтительно 0-20 об/мин, более предпочтительно 0-15 об/мин, еще более предпочтительно 0-10 об/мин и наиболее предпочтительно 0-5 об/мин. Вращение с периодически меняющимся направлением вращения. Вращение с предварительно определяемыми интервалами. Оптимальная скорость вращения будет зависеть от объема сосуда, таким образом предпочтительная скорость вращения может быть относительно высокой, когда процесс осуществляют в относительно небольшом сосуде, а также она может быть относительно небольшой, когда процесс осуществляют в относительно большом сосуде. Ферменты для лигноцеллюлозной биомассы: целлобиаза (например, Novozym 188),целлюлаза (например, Celluclast 1.5 FG L). Загрузка фермента в единицах фильтровальной бумаги (FPU)/г СВ. 1 FPU равна количеству фермента, необходимого для того, чтобы гидролизовать 1 мкмоль/мин гликозидных связей на фильтровальной бумаге Whatmann1 в конкретных условиях, хорошо известных специалисту в данной области. Однако ферментативная активность в принципе может быть обеспечена в любой возможной форме,включая добавление микроорганизмов, приводящих к требуемой ферментативной активности, соответствующей 0,001-15 FPU/г сухого вещества, предпочтительно 0,01-10 FPU/г сухого вещества, более предпочтительно 0,1-8 FPU/г сухого вещества, более предпочтительно 1-7 FPU/г сухого вещества и наиболее предпочтительно меньше 6 FPU/г. Ферменты для биомассы, содержащей крахмал. Ферменты для обработки крахмала: альфа-амилазы и глюкоамилазы. Время обработки в случае ферментативного гидролиза: 0-72 ч, предпочтительно 1-60 ч, более предпочтительно 2-48 ч и более предпочтительно 3-24 ч, например 4-24 ч, например 6-24 ч, например 8-24 ч,например 10-24 ч, например 12-24 ч, например 18-24 ч или 22 ч. Температура для ферментативного гидролиза. Корректируется в соответствии с оптимальными температурами для применяемых ферментативных активностей: 0-105 С, предпочтительно 10-100 С,более предпочтительно 15-90 С, более предпочтительно 20-80 С, более предпочтительно 25-70 С и наиболее предпочтительно 30-70 С, например 40-45 С или комнатная температура. рН биомассы. Корректируется в соответствии с оптимумом рН для применяемых ферментативных активностей: 3-12, например 5-10, например 6-9, например 7-8 и предпочтительно 4-11. Ферментативная обработка может быть проведена в виде периодического процесса, процесса с подпиткой или непрерывного процесса. Пример 1. Ферментативный гидролиз в лабораторном масштабе. Прессованную предварительно обработанную пшеничную солому со средним размером примерно 40 мм (противоточная водная экстракция при 180-200 С в течение 5-10 мин, относительный расход воды и сухого вещества 5:1), соответствующую 25 г сухой массы (=67,0 г предварительно обработанной соломы) помещали в полиэтиленовый пакет. Смешивали 0,75 мл Novozym 188, 3,75 мл Celluclast 1.5 FG L и 11,9 мл 50 мМ натрий-цитратного буфера, рН 5,0, и спрыскивали солому. Это приводило к конечному содержанию сухого вещества 30%. Загрузка ферментов соответствовала 10 единицам фильтровальной-6 014759 бумаги (FPU)/г СВ. Смеситель состоял из барабана (1,0 м длиной и 0,78 м в диаметре) с 5 внутренними ребрами вдоль длинной оси, чтобы обеспечить надлежащее перемешивание материала. Барабан вращался в направлении горизонтальной оси со скоростью 26 об/мин. Перемешивание/гидролиз материала осуществляли в течение 18-24 ч при комнатной температуре. Это приводило к получению густой пасты, не содержащей никаких остатков крупных волокон. В контрольном пакете с такой же загрузкой ферментов, но без перемешивания не наблюдали признаков разложения соломы. Часть материала, полученного после ферментативного гидролиза в течение 24 ч (количество, соответствующее 29 г сухого вещества), разбавляли до 15% сухого вещества в бутылку Blu cap и добавляли дрожжи (пекарские дрожжи, De Danske Spritfabrikker). Бутылку закрывали с воздушной пробой и помещали на 72 ч при 30 С с перемешиванием при 500 об/мин. Полученная в результате жидкость содержала 33 г/л этанола, 10 г/л ксилозы. Глюкозу не обнаруживали, что свидетельствует о том, что дрожжи были способны утилизировать всю глюкозу, образуемую во время гидролиза. При условии, что выход этанола по отношению к глюкозе составляет 0,5 г этанола на 1 г глюкозы, это соответствовало превращению 70% исходной целлюлозы. Пример 2. Ферментативный гидролиз в пилотном масштабе. Прессованную предварительно обработанную пшеничную солому со средним размером примерно 40 мм (предварительно обработанную противоточной водной экстракцией при 180-200 С в течение 5-10 мин с относительным расходом воды и сухого вещества 5:1), соответствующую 7 кг сухой массы(=20 кг предварительно обработанной соломы), помещали в обычную бетономешалку с вращающимся барабаном с горизонтальной осью, наклоненной примерно на 10. Мешалка имела 2 внутренних ребра вдоль длинной оси, чтобы гарантировать перемешивание материала. На отверстие устанавливали крышку, чтобы избежать испарения из мешалки. Барабан мешалки вращался в направлении горизонтальной оси со скоростью 29 об/мин. К соломе добавляли 200-1150 мл Celluclast 1.5 FG L и 40-225 мл Novozym 188. Это приводило к получению конечного содержания сухого вещества 30%. Загрузка ферментов соответствовала 3-15 FPU/г СВ. рН доводили до 4,8-5,0 добавлением карбоната натрия. Бетономешалку нагревали до 40-45 С, используя тепловентилятор. Перемешивание/гидролиз материала осуществляли в течение 22 ч. В зависимости от загрузки ферментов это приводило к получению более или менее вязкой жидкости, не содержащей никаких остатков крупных волокон. Предварительно обработанную солому разрушали до образования пасты примерно за 3-5 ч. После 5-24 ч перемешивания паста превращалась в вязкую жидкость. В контрольных экспериментах только с предварительно обработанной пшеничной соломой или с пшеничной соломой, предварительно обработанной только при 160 С,но с использованием такой же загрузки фермента, не наблюдали признаков разжижения соломы. Одновременное осахаривание и ферментацию осуществляли, добавляя в бетономешалку дрожжи после 24 ч гидролиза при 40-45 С с использованием загрузки ферментов 10-15 FPU/г СВ. Температуре давали возможность снизиться ниже 35 С и добавляли прессованные пекарские дрожжи (De DanskeSpritfabrikker) до концентрации примерно 1% (мас./мас.), исходя из начальной сухой массы соломы. Осахаривание и ферментацию продолжали в течение 48 ч при 25 С. Полученный в результате материал центрифугировали в течение 15 мин при 2500 об/мин. Надосадок фильтровали через 0,45 мкм-фильтр и анализировали в отношении сахаров, используя ВЭЖХ. При загрузке ферментов 15 FPU/г СВ надосадок содержал 70 г/л глюкозы, 30 г/л ксилозы через 24 ч гидролиза. Это соответствовало 50% гидролизу целлюлозы и гемицеллюлозы, исходно присутствующей в соломе. Одновременное осахаривание и ферментация с использованием загрузки фермента 10 FPU/г СВ приводили к получению 42 г/л этанола и 30 г/л ксилозы. Пример 3. Разжижение, гидролиз и ферментация. Конструировали реактор для гидролиза, чтобы осуществить эксперименты по разжижению и гидролизу твердого вещества с концентрациями более 20% СВ (фиг. 1). Реактор состоял из горизонтально размещенного барабана, разделенного на 5 отдельных камер, каждая из которых имела ширину 20 см и диаметр 60 см. Горизонтальный вращающийся вал, оборудованный тремя лопатками в каждой камере,использовали для перемешивания/взбалтывания. В качестве привода использовали мотор 1,1 кВт и скорость вращения регулировали в диапазоне от 2,5 до 16,5 об/мин. Направление вращения программировали так, чтобы оно менялось дважды за минуту: по часовой стрелке и против часовой стрелки. Заполненная водой нагревательная рубашка с наружной стороны обеспечивала контроль температуры до 80 С. Камеры заполняли прессованной предварительно обработанной пшеничной соломой со средним размером примером 40 мм (предварительно обработанной противоточной водной экстракцией при 180200 С в течение 5-10 мин с относительным расходом воды и сухого вещества 5:1) и водой, получая исходное содержание СВ от 20 до 40%. Добавляли Celluclast 1.5 FG L и Novozym 188 в соотношении 5:1,получая загрузку ферментов 7 FPU на 1 г СВ. Разжижение и гидролиз осуществляли при 50 С и рН от 4,8 до 5,0. Скорость перемешивания составляла 6,6 об/мин. Эксперименты по одновременному осахариванию и ферментации (SSF) осуществляли, снижая температуру до 32 С после 8-часового разжижения и гидролиза и после добавления 15 г прессованных пекарских дрожжей (De Danske Spritfabrikker) на 1 кг-7 014759 исходного СВ. Разжижение и гидролиз были возможны при исходном содержании СВ до 40% СВ (фиг. 2 и 3). В случае исходного содержания 40% СВ можно было достичь концентраций глюкозы 80 гкг-1 через 96 ч. Также можно было осуществлять процесс в виде SSF (фиг. 3), уменьшая при этом ингибирование целлюлаз продуктами, вызванное накоплением глюкозы. Можно было ферментировать гидролизаты, содержащие до 40% исходного СВ, используя обычные пекарские дрожжи. В частично анаэробных условиях выход этанола составлял 80, 79, 76, 73 и 68% от теоретически возможного при 20, 25, 30, 35 и 40% СВ соответственно. Пример 4. Разжижение, осахаривание и ферментация сельскохозяйственных культур. Лигноцеллюлозную и содержащую крахмал биомассу можно обрабатывать одновременно, используя перемешивание на основе действия силы тяжести и смесь целлюлаз, гемицеллюлаз и амилаз. Лигноцеллюлозные биомассы могут быть получены из сельскохозяйственных культур, состоящих, например,из стеблей кукурузы, соломы, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса и сорго; клубней, например свеклы, картофеля; зерна, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса, сорго; древесины,состоящей из древесины мягких пород, например Pinus sylvestris, Pinus radiata, древесины твердых пород,например Salix spp., Eucalyptus spp., твердых бытовых отходов, макулатуры и подобных биомасс. В экспериментах использовали реактор для гидролиза, описанный в примере 3. Пшеничную солому(главным образом источник лигноцеллюлозы) предварительно обрабатывали, используя противоточную водную экстракцию при 180-200 С в течение 5-10 мин при относительном расходе воды и сухого вещества 5:1. Зерно пшеницы (главным образом источник крахмала) подвергали сухому помолу, используя вальцовую мельницу Kongskilde. Зерно пшеницы и предварительно обработанную солому со средним размером примерно 40 мм смешивали в соотношении 1:1 в расчете на сухое вещество. Содержание СВ доводили до 30-40% добавлением воды. Добавляли Celluclast 1.5 FG L и Novozym 188 в соотношении 5:1, получая загрузку ферментов 7 FPU на 1 г СВ соломы. Гидролиз крахмала осуществляли, используя фермент для приготовления холодного затора NS50033 (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) с загрузкой 3,5 г на 1 кг зерна пшеницы. Разжижение и гидролиз осуществляли при 50 С и рН от 4,8 до 5,0. Через 8 ч температуру снижали до 34 С и добавляли 15 г прессованных пекарских дрожжей (De Danske Spritfabrikker) на 1 кг исходного СВ. В параллели проводили эксперимент только с соломой при 30% СВ. Перемешивание соломы с зерном приводило к быстрому начальному накоплению глюкозы на стадии разжижения и гидролиза по сравнению с применением одной соломы (фиг. 4). После 96-часового разжижения и SSF концентрация этанола составляла 41 гкг-1 при использовании только пшеничной соломы в качестве единственного субстрата (фиг. 4). В эксперименте с соломой и зерном концентрация этанола достигала 68 гкг-1. Пример 5. Низкотемпературное разжижение крахмала или содержащих крахмал материалов. Способ согласно настоящему изобретению также можно применять для низкотемпературной обработки очищенного крахмала или содержащих крахмал материалов (например, свеклы, картофеля, зерновых: риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, сорго). Согласно примеру 4 предварительная обработка зерна не требуется для разжижения и гидролиза крахмала. С другой стороны, обычно применяют сухой помол для предварительной обработки содержащего крахмал зерна. Зерно сухого помола с содержанием сухого вещества 20-60% загружают в смеситель, работающий по принципу действия силы тяжести. Одновременно добавляют фермент для получения холодного затора NS50033 (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) или альфа-амилазу и глюкоамилазы. В таком случае возможно полное разжижение и осахаривание крахмала в процессе, осуществляемом в одном реакторе. Диапазоны температур и рН в ходе процесса ферментативного гидролиза определяются ферментами и будут составлять от 25 до 60 С, предпочтительно 40-55 С, и рН 3-12, предпочтительно рН 3-8 соответственно. Способ можно комбинировать с SSF. Цитированная литература. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, включая лигноцеллюлозную биомассу, отличающийся тем, что указанную биомассу подвергают ферментативному гидролизу с использованием по меньшей мере одной целлюлазы либо в нативной форме, либо в форме микроорганизмов, вызывающих накопление таких ферментов, в сочетании с перемешиванием в смесителе, использующем принцип свободного падения, таком как барабанный смеситель, которые обеспечивают механическую обработку и/или разрушение биомассы, причем указанная биомасса имеет содержание сухого вещества более 20% в начале перемешивания/гидролиза. 2. Способ по п.1, в котором указанная содержащая полисахариды биомасса представляет собой лигноцеллюлозную биомассу, полученную из сельскохозяйственных культур, состоящую, например, из стеблей кукурузы, жмыха, соломы, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса и сорго; клубней,например свеклы, картофеля; зерна, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса, сорго; древесины, состоящей из мягкой древесины, например Pinus sylvestris, Pinus radiata, твердой древесины, например Salix spp., Eucalyptus spp., или твердых бытовых отходов, макулатуры, фракции волокон от переработки биогаза, компоста и подобных биомасс. 3. Способ по п.1, в котором указанная содержащая полисахариды биомасса представляет собой крахмал, например содержащее крахмал зерно или очищенный крахмал. 4. Способ по п.1, в котором указанная содержащая полисахариды биомасса представляет собой смесь крахмала, например содержащего крахмал зерна или очищенного крахмала, и лигноцеллюлозных биомасс, полученных из сельскохозяйственных культур, состоящих, например, из стеблей кукурузы, соломы, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса и сорго; клубней, например свеклы, картофеля; зерна, например риса, пшеницы, ржи, овса, ячменя, рапса, сорго; древесины, состоящей из мягкой древесины, например Pinus sylvestris, Pinus radiata, твердой древесины, например Salix spp., Eucalyptus spp.; твердых бытовых отходов,макулатуры и подобных биомасс. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором содержание сухого вещества в содержащей полисахариды биомассе составляет от 25 до 80%. 6. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, в котором по меньшей мере 20% (мас./мас.) лигноцеллюлозной биомассы имеет размер волокон более 26 мм. 7. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, в котором лигноцеллюлозная биомасса подвергается предварительной тепловой обработке от 110 до 250 С. 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором ферментативный гидролиз осуществляют с использованием комбинации гидролитических ферментов, включающей в себя фермент, лизирующий углеводы, и окислительный фермент. 9. Способ по любому из пп.1, 3 или 4, в котором ферментативный гидролиз содержащего крахмал зерна осуществляют с использованием комбинации гидролитических ферментов и протеолитических ферментов. 10. Способ по любому из пп.1-9, в котором ферментативный гидролиз осуществляют при 0-105 С. 11. Способ по любому из пп.1-10, в котором время обработки для ферментативного гидролиза составляет 1-72 ч. 12. Способ по любому из пп.1-11, который осуществляют в виде периодического способа, способа с подпиткой, непрерывного способа.

МПК / Метки

МПК: C12P 19/14, C12P 19/12, C12M 1/02, C12P 19/00, C12P 7/10, C12M 1/10, C12M 1/16

Метки: имеющих, биомасс, гидролиз, сухого, ферментативный, вещества, высокое, содержание

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/13-14759-fermentativnyjj-gidroliz-biomass-imeyushhih-vysokoe-soderzhanie-suhogo-veshhestva.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Ферментативный гидролиз биомасс, имеющих высокое содержание сухого вещества</a>

Похожие патенты