Способ получения гетерологичного секретируемого белка из клеток яичника китайского хомячка, выращиваемых на микроносителях

Номер патента: 5312

Опубликовано: 30.12.2004

Авторы: Айли Том, Каннингхэм Марк

Есть еще 2 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ получения гетерологичного секретируемого белка из клеток яичника китайского хомячка (CHO), выращиваемых на микроносителях, предусматривающий

инокуляцию клеточного биореактора, содержащего микроносители в качестве твердой подложки для роста прикрепленных клеток и содержащую сыворотку среду для культуры клеток, инокулятом хозяйских клеток CHO, трансформированных для экспрессии гетерологичного секретируемого белка, где инокулят получен путем выращивания трансформированных хозяйских клеток CHO в содержащей сыворотку среде для культуры клеток; и

культивирование инокулированных хозяйских клеток CHO в культуре прикрепленных клеток без перфузии среды для культуры клеток в течение периода приблизительно от одного до трех дней до инициации фидинга (подпитки);

введение усовершенствования, подразумевающего

инициацию фидинга бессывороточной среды для культуры клеток, дополненной инсулином, цитратом железа (III), селеном и микроэлементами, в клеточный биореактор путем непрерывной перфузии;

увеличение скорости подачи фидинга бессывороточной среды для культуры клеток, дополненной микроэлементами, в стадиях на протяжении приблизительно шести-десятидневного периода, пока не будет достигнута конечная скорость потока фидинга в диапазоне приблизительно 1-3,5 об./об./день, для получения и секреции гетерологичного белка из хозяйских клеток CHO в бессывороточную среду для культуры клеток; и

культивирование хозяйских клеток CHO в культуре прикрепленных клеток при конечной скорости потока фидинга.

2. Способ по п.1, где период культивирования инокулированных хозяйских клеток CHO составляет приблизительно два дня.

3. Способ по п.1, где стадия инициации фидинга начинается с фидинга при скорости потока в диапазоне приблизительно 0,1-0,4 объем/объем/день бессывороточной среды для культуры клеток, дополненной инсулином, цитратом железа(III), селеном и микроэлементами.

4. Способ по п.3, где фидинг инициируют при скорости потока фидинга в диапазоне приблизительно 0,2-0,3 об./об./день.

5. Способ по п.3, где фидинг инициируют при скорости потока фидинга приблизительно 0,2 об./об./день.

6. Способ по п.1, где скорость потока фидинга увеличивают от стадии к стадии на протяжении приблизительно семи-девятидневного периода.

7. Способ по п.1, где скорость потока фидинга увеличивают от стадии к стадии на протяжении приблизительно восьмидневного периода.

8. Способ по п.1, где конечная скорость потока фидинга заключена в диапазоне приблизительно 1,5-2,5 об./об./день.

9. Способ по п.1, где конечная скорость потока фидинга составляет приблизительно 2 об./об./день.

10. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий стадию извлечения гетерологичного белка из бессывороточной среды для культуры клеток.

11. Способ по п.1, где гетерологичный белок является растворимым рецептором интерферона a/b (sIFNAR2).

12. Способ по п.1, где микроносители представляют собой Cytopore 2.

13. Способ по п.1, где бессывороточной средой для культуры клеток является DMEM/F12.

 

Текст

Смотреть все

1 Предпосылки изобретения Область изобретения Данное изобретение относится к способу получения секретируемого белка в культуре прикрепленных клеток млекопитающего. Описание предыдущего уровня техники Большинство промышленных производственных процессов, которые используют в качестве клеток-хозяев клетки яичника китайского хомячка (СНО), применяют клеточные линии,адаптированные к росту в суспензии, например,t-PA (Werner et al., 1993 и Lubiniecki et al., 1994),для которых бессывороточные среды были доступны в течение последних 10 лет (Gorfien et al.,1991). Однако альтернативной стратегией для культуры клеток СНО является поддержание роста прикрепленных к субстрату клеток, где клетки прикрепляются к матриксу, например, к микроносителю (Kadouri, 1994). Клетки СНО могут расти успешно на таких носителях, и были разработаны промышленные процессы, использующие культуры микроносителей СНО,например, Puregona (Olijve et al., 1996). Рост прикрепленных клеток СНО на микроносителях обычно выполняют подачей сыворотки в культуру, в форме фетальной телячьей сыворотки (ФТС) (Xiao et al., 1994; Clark et al.,1981; Nikolai et al., 1992; Asselbergs et al., 1982;al., 1994). Эта комплексная добавка к культуральной среде содержит необходимые факторы прикрепления и роста, требуемые для стимуляции прикрепленного фенотипа, например, фибронектин, ламинин (Zaworski et al., 1993 и Nilsson, 1989). Сообщалось, что в отсутствие сыворотки некоторые клеточные линии не будут расти на микроносителях (Schmid et al., 1992) или что отсутствие сыворотки является вредным для образования продукта (Teige et al., 1994). Хотя бессывороточный прикрепленный рост клеток СНО достигался с использованием базальной среды, дополненной инсулином, трансферрином и селеном (Gasser et al., 1985), этот рост получали в условиях очень пассивной среды в Т-колбе,условиях среды, которые, как известно, существенно отличаются от условий среды в случае прикрепленного роста на микроносителях в биореакторе (Cherry et al., 1988). В промышленных процессах на основе микроносителей клетки обычно подпитывают(посредством непрерывной перфузии) культуральной средой, дополненной сывороткой, пока эти клетки не заполнят доступную площадь поверхности, обеспечиваемую микроносителем(фаза роста). Затем перфузируемую среду переключают на другую среду, обычно бессывороточную, так как клетки в этой точке не делятся и могут довольствоваться существующим внеклеточным матриксом для поддержания их прикрепления. Именно во время этой второй фазы(фазы образования продукта) кондиционированную фазу собирают для извлечения и очист 005312 2 ки рекомбинантного белка. Однако в такой двухфазной системе переключение от роста к образованию продукта может приводить к драматическому клеточному ответу, такому как потеря клеток и уменьшенная объемная продуктивность рекомбинантного белка (Cosgrove etal., 1995). Альтернативно, может иметь место лаг-фаза, когда клетки реагируют на это драматическое переключение в среде, которая затем приводит к периоду низкой продуктивности рекомбинантного белка, пока эти клетки не восстановятся до нормального состояния. Цитирование здесь любого документа не является признанием того, что такой документ является относящимся к данному вопросу документом предыдущего уровня техники или учитываемым материалом в отношении патентоспособности какого-либо пункта формулы изобретения данной заявки. Любое утверждение,например, относительно содержания или даты любого документа основывается на информации, доступной для заявителя во время подачи,и не является признанием, например, в отношении корректности такого утверждения. Сущность изобретения Целью данного изобретения является устранение проблем и трудностей, встречающихся в предыдущем уровне техники, обсуждаемых выше. Данное изобретение обеспечивает способ получения гетерологичного секретируемого белка из трансформированных клеток СНО, выращиваемых на микроносителях в бессывороточной среде для культуры клеток. Этот способ имеет преимущество, заключающееся в преодолении проблемы лаг-фазы в образовании продукта, наблюдаемой при переключении от содержащей сыворотку среды к бессывороточному окружению. Краткое описание рисунков На фиг. 1 показано схематическое представление рецептора р 40 IFN-/ в pCMV.PA4. На фиг. 2 показан рост клеток клона СНО 1-1-31 на микроносителях Cytopore 2, подпитаваемых либо содержащей сыворотку средойDMEM/F12, дополненной IFCSTE). На фиг. 3 показана кинетика образования растворимого рецептора интерферона / (sIFNAR2) в двухфазной системе, где имеет место переключение от содержащей сыворотку среды к бессывороточной среде, и в системе с единственной питательной средой и без переключения в среде. Эксплуатацию (режим) 4 реактора проводили в виде двухфазной системы с фазой роста DMEM/F12, дополненной 5% ФТС, и переключением на фазу образования продуктаDMEM/F12, дополненной IFCSTE. Переключе 3 ние представлено вертикальной пунктирной линией во время 0. В режиме эксплуатации 12 биореактора использовали единственную питательную среду DMEM/F12, дополненнуюIFCSTE. На фиг. 4 А-4 С показаны клетки СНО (клон 1-1-31), растущие на микроносителях Cytopore 2 в день 4 (фиг. 4 А), день 6 (фиг. 4 В) и день 10(фиг. 4 С) после фидинга (подпитки) сывороточной композицией DMEM/F12, дополненной 5% ФТС. Жизнеспособные клетки, выросшие на микроносителе, окрашиваются флуоресцентным красителем. Дни, указанные на фиг. 4 А-4 С, являются днями эксплуатации реактора, т.е. днями после инокуляции биореактора, но не днями образования продукта. На фиг. 5A-5D показаны клетки СНО(клон 1-1-31), растущие на микроносителях Cytopore 2 в день 1 (фиг. 5 А), день 3 (фиг. 5 В),день 6 (фиг. 5 С) и день 10 (фиг. 5D) после фидинга бессывороточной композициейDMEM/F12, дополненной IFCSTE. Жизнеспособные клетки, выросшие на микроносителе,окрашиваются флуоресцентным красителем. Дни, указанные на фиг. 5A-5D, являются днями эксплуатации реактора, т.е. днями после инокуляции биореактора, но не днями образования продукта. Подробное описние изобретения Данное изобретение основано на разработке стратегии бессывороточного фидинга (подпитки) для выращивания клеток СНО на микроносителях, которая дает возможность избежать потребности в сыворотке для стимуляции прикрепленного клеточного фенотипа. Эта стратегия бессывороточного фидинга в соответствии со способом данного изобретения значительно улучшает извлечение желаемого секретируемого белкового продукта посредством элиминации лаг-фазы, связанной с удалением сыворотки, т.е. переключением от содержащей сыворотку (сывороточной) к бессывороточной среде. Способ получения гетерологичного секретируемого белка из клеток СНО, выращиваемых на микроносителях, в соответствии с данным изобретением включает в себя инокуляцию клеточного биореактора, содержащего микроносители в качестве твердой подложки для роста прикрепленных клеток, инокулятом хозяйских клеток СНО, трансформированных для экспрессии гетерологичного секретируемого белка. Хотя это и не является абсолютно необходимым,инокулированные клетки выращивают предпочтительно без перфузии в сывороточной среде для культуры клеток, такой как DMEM/F12,дополненная 5% фетальной телячьей сывороткой (ФТС), в течение периода приблизительно одного-трех дней, предпочтительно приблизительно двух дней. Приблизительно через два дня, т.е. 48 ч, эти клетки затем подпитывают путем перфузии бессывороточной среды для 4 культуры клеток, которая является предпочтительно средой DMEM/F12 (номер по каталогу 1330-032, Gibco BRL, Gaithersburg, MD), дополненной IFCSTE (акроним для композиции инсулина, цитрата железа(III), селена и микроэлементов, состав которой показан в табл. 1 ниже),при начальной скорости потока фидинга в диапазоне приблизительно от 0,1 до 0,4 объем/объем/день (о/о/д) перед увеличением скорости фидинга бессывороточной среды для культуры клеток в стадиях на протяжении приблизительно шести-десятидневного периода, предпочтительно семи-девяти дней, пока не достигается скорость подачи фидинга приблизительно 1-3,5 о/о/д для образования и секреции желаемого гетерологичного секретируемого белка из культуры клеток СНО в культуральную среду. Образование и секреция желаемого гетерологичного секретируемого белка поддерживается, после того как достигается конечная скорость подачи среды, посредством непрерывной перфузии бессывороточной культуральной среды, дополненной IFCSTE. Желаемый гетерологичный белок,продуцируемый и секретируемый в бессывороточную культуральную среду, может быть легко извлечен и очищен с использованием общепринятых способов извлечения и очистки, хорошо известных специалистам в данной области. Таблица 1 Рабочая концентрация добавки IFCSTE в среде для культуры клеток 1) Инсулин 1 мг/л 2) Цитрат железа (III) 12,24 мг/л 3) Натрий/селен 68 мкг/л 4) Микроэлементы А 16, 1000 х (номер 99182 по каталогу Gibco BRL), разведенные 1:1000 для рабочей концентрации в микрограммах на литрZnSO47 Н 2O Селенит 2Na 17,30 Цитрат железа (III) 1155,10 5) Микроэлементы В 16, 1000 х (номер 99175 по каталогу Gibco BRL), разведенные 1:1000 для рабочей концентрации в микрограммах на литрSnCl2 (безводный) 0,12 6) Микроэлементы С 16, 1000 х (номер 99176 по каталогу Gibco BRL), разведенные 1:1000 для рабочей концентрации в микрограммах на литр АlСl36 Н 2O 1,20 АgNO3 0,17 Ва(С 4 Н 3O2)2 2,55 Специалистам в данной области будет понятно, что начальная скорость потока фидинга и период времени для увеличения скорости потока фидинга от стадии к стадии до конечной скорости потока фидинга может варьироваться в зависимости от размера инокулята. В предпочтительном варианте, инокулят приблизительно 2 х 105 клеток/мл используют для биореактора на 4,8 л, и клетки культивируют в течение приблизительно двух дней перед перфузией с начальным фидингом бессывороточной культуральной среды при начальной скорости потока фидинга около 0,2 о/о/д. Скорость потока фидинга для непрерывной перфузии культуры прикрепленных клеток в предпочтительном варианте увеличивают в день 3 приблизительно до 0,3 о/о/д, в день 4 - приблизительно до 0,5 о/о/д,в день 5 - приблизительно до 0,8 о/о/д, в день 6 приблизительно до 1,2 о/о/д, в день 7 - приблизительно до 1,5 о/о/д, пока конечная скорость потока 2,0 о/о/д не достигается в день 8. Как будет понятно специалистам с квалификацией в данной области, имеющим руководство, обеспеченное этим предпочтительным вариантом данного изобретения, если размер инокулята является большим, то может потребоваться более высокая начальная скорость потока фидинга, и может потребоваться соответствующее изменение периода времени для увеличения скорости потока. Конечная скорость потока фидинга может быть заключена между 1 и 3,5 о/о/д, но предпочтительно она составляет около 2 о/о/д, например, находится в диапазоне приблизительно от 1,5 до 2,5 о/о/д. Хотя способ согласно изобретению может быть обычно применим для образования и секреции гетерологичных секретируемых белков в клетках СНО, где термин "гетерологичный секретируемый белок" означает секретируемый белок, не являющийся эндогенным для клеток СНО, предпочтительным вариантом, приведенным в качестве примера в примерах, является растворимый рецептор интерферона / (sIFNAR2). Растворимый IFNAR2 человека является гликозилированным белком, который связывает как интерферон , так и интерферон , и его существование в виде растворимой формы рецептора IFN/ предоставляет возможность использования этого рецептора терапевтически в качестве антагониста IFN. 6 Твердой подложкой, на которой выращивают прикрепленные клетки СНО, являются предпочтительно микроносители Cytopore 2(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ),которые являются микроносителями со структурированным матриксом из целлюлозы хлопчатника, гидрофильным покрытием ДЭАЭ,плотностью заряда 1,8 мэкв/г и средним диаметром пор 30 мкм. Однако другие подходящие микроносители, известные в данной области для применения в культуре прикрепленных клеток,могут также служить в качестве альтернативной твердой подложки для прикрепленного роста клеток СНО. Предпочтительной бессывороточной средой для культуры клеток является DMEM/F12,дополненная IFCSTE. После описания данного изобретения в общем виде все описанное будет более легко понято со ссылкой на следующие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения данного изобретения каким-либо образом. Пример 1 Выделяли и характеризовали клональные линии клеток СНО, экспрессирующие рекомбинантный растворимый рецептор IFN/ человека (IFNAR2). Два потенциальных клона были отобраны для дальнейшей оценки в исследовании удвоения стабильности на 100 популяциях. На основании уровней экспрессии IFNAR2 и анализа мРНК, из панели клонов были выбраны следующие клоны. СНО-IFNAR1-1-50 имел наивысшую удельную продуктивность с pcd 34,48. CHO-IFNAR1-1-31 (клон СНО 1-1-31) имел наивысшую объемную продуктивность,экспрессируя 18,71 мкг/мл в колбе Т 75 на протяжении периода 24 ч. Оба клона обнаруживали единственный основной тип мРНК при испытании при помощи Нозерн-блот-анализа. Способы Конструирование вектора ДНК плазмиды pCEV9-QM27, содержащую кДНК растворимого рецептора IFN/ человека, полученную у доктора Рубинштейна,использовали в качестве матрицы для ПЦРамплификации. Пару ПЦР-праймеров использовали для амплификации кДНК рецептораIFN/ человека от стартового кодона ATG сигнального пептида до стоп-кодона TAG. Сайт ХbаI был включен в оба праймера. ПЦР проводили при стандартных условиях в течение 25 циклов. После очистки от геля и расщепленияXbaI и NdeI использовали для скрининга МС 1061-трансформантов. Клон 11 pCMV.PAhIFN / рецептор подтверждали расщеплением рестриктазами и анализом последовательности ДНК. В районе сигнального пептида был обна 7 ружен фенилаланин вместо валина в положении аминокислоты 10, что отличается от опубликованной последовательности (Rubinstein, 1994). Та же самая замена была обнаружена д-ром Рубинштейном в его исходной клонирующей конструкции растворимой формы. Трансфекция и отбор в клетках СНО Клетки CHO-DUKX котрансфицировали конструкцией hIFN/R-CMV.PA4 (50 мкг) и конструкцией D (10 мкг) в соотношении 5:1 рутинным способом СаРO4-преципитации. Экспрессирующий вектор D содержит ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), что делает возможными отбор и амплификацию с использованием лекарственного средства метотрексата (МТХ). Эта трансфекция была названа IFNR1. Среда для выращивания, используемая до и сразу же после трансфекции, состояла из среды альфаМЕМ (+) (с дезокси- и рибонуклеозидами GibcoBRL), дополненной 10% сертифицированной фетальной телячьей сывороткой (ФТС, GibcoBRL) и 1% L-глутамином (Gibco BRL). Спустя сорок восемь часов после трансфекции каждую чашку промывали забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР), при рН 7,0, и обрабатывали 2 мл раствора 0,05% трипсин - 0,53 мМ ЭДТА (Gibco BRL) в течение четырех минут при 37 С. Трипсин гасили добавлением 8 мл селективной среды, состоящей из среды альфаМЕМ (-) (без дезокси- и рибонуклеозидов, GibcoBRL), дополненной 10% диализованной фетальной телячьей сывороткой (дФТС, Gibco BRL),1% L-глутамином (Gibco BRL) и 0,02 мкМ МТХ(Sigma). Диссоциированные клетки ресуспендировали, распределяли в отношении 1:10 и высевали в десять культуральных чашек Р 100. В чашки подавали свежую селективную среду каждые 3-4 дня. Обычно после 10-14 дней во время отбора образуются большие колонии. Затем чашки трипсинизировали для перераспределения этих клеток в виде пулов, так, чтобы могла образоваться монослойная культура без избыточного роста локализованных зон. Как только чашки достигали 80% конфлюентности, им подавали свежую селективную среду. Спустя двадцать четыре часа брали пробу супернатанта для анализа экспрессии, клетки трипсинизировали и считали при помощи гемоцитометра. Два флакона, содержащие 1-3 миллиона клеток, криоконсервировали в селективной среде, содержащей 10% диметилсульфоксид (ДМСО, Sigma),для каждого из десяти пулов. Пробы в среде хранили при -20 С. Амплификация клеток CHO-IFNR1 Поскольку вектор D содержал ген DHFR,можно было попытаться амплифицировать экспрессию клеток CHO-IFNAR1. После отбора при 0,02 мкМ МТХ трансфицированные клетки амплифицировали в "пулах" в соответствии со стандартной схемой амплификации 0,1 мкМ 8 0,5 мкМ 1,0 мкМ 5,0 мкМ МТХ. После двадцати четырех часов экспрессии брали пробы при уровне 0,02 мкМ МТХ, остальные клетки использовали для амплификации. На каждой стадии амплификации одну чашку Р 100 для каждого пула засевали при 7 х 105 клеток в среде альфа-МЕМ (-), дополненной 10% диализованной фетальной телячьей сывороткой (дФТС,Gibco BRL), 1% L-глутамином (Gibco BRL) и подходящей концентрацией МТХ (Sigma). Клетки поддерживали на каждой из последовательных стадий амплификации по меньшей мере в течение семи-десяти дней. Определения 24-часовой экспрессии, где уровни экспрессии рассчитывали на клетку,проводили на каждой стадии амплификации следующим образом. Когда клетки достигали приблизительно 70-80% конфлюентности, в чашки подавали свежую культуральную среду(содержащую подходящую концентрацию МТХ). Спустя двадцать четыре часа брали пробы супернатантов, клетки трипсинизировали и определяли общее число клеток. После проведения определений экспрессии, на каждой стадии амплификации, 7 х 105 клеток использовали для засева Р 100 в среде, содержащей уровень МТХ для следующей стадии амплификации, а остальные клетки криоконсервировали в среде,содержащей подходящую концентрацию лекарственного средства для данной стадии амплификации и 10% ДМСО. Все количественные определения IFNAR2 выполняли с использованием ELISA для растворимого IFNAR2 человека. Протокол ELISA для растворимого рецептораIFN человека Планшеты Immulon IV из Dynatech покрывали асцитами с моноклональным антителом анти-IFNАR2 34.1, разведенными 1:5000 в 0,1% Твине 20 в ЗФР, рН 7,4 (ЗФР/Т) при 100 мкл на лунку, в течение 2 ч при 37 С. Планшеты промывали дважды ЗФР/Т. Все промывки проводили при комнатной температуре (RT) с использованием автоматического аспиратора/промывателя Ultrawash Plus из Dynatech. Планшеты блокировали в течение ночи при 4 С 200 мкл на лунку 1,0% БСА в ЗФР/Т. Планшеты могут храниться в холодном виде в блоках вплоть до семи дней. Их промывали три раза ЗФР/Т перед дальнейшим использованием. Стандарт и пробы разводили в ЗФР/Т. Стандартом был аффинно очищенный рецепторrhIFN /, хранящийся при -20 С или оттаянный и хранящийся при 0 С в течение периода,не превышающего одну неделю. Этот рецептор был нестабильным при низких концентрациях,так что его разбавляли до рабочей концентрации непосредственно перед использованием. Стандарт использовали при 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 нг/мл и при 100 мкл на лунку, причем каждую концентрацию использовали в трех повтор 9 ностях. Разведенные пробы также использовали при 100 мкл на лунку в двух повторностях (или трех повторностях, если позволяло пространство на планшете). Стандарты и пробы инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза в ЗФР/Т. Поликлональную кроличью сыворотку против IFNAR2 разводили 1:5000 в ЗФР/Т. 100 мкл на лунку использовали в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза с использованием ЗФР/Т. Биотинилированное антикроличье антитело (Вектор ВА-1000) разводили 1:10000 в ЗФР/Т. 100 мкл на лунку использовали в течение одного часа при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза ЗФР/Т. АВС-реагент (Vector ABC Elite kit) готовили следующим образом: 1 каплю реагента А добавляли к 10 мл ЗФР/Т и смешивали перевертыванием. К этому добавляли 1 каплю реагента В и смешивали перевертыванием. Эту смесь инкубировали как минимум 30 мин при комнатной температуре, затем разводили до конечного объема не более 50 мл непосредственно перед использованием. 100 мкл на лунку разведенного АВС давали инкубироваться тридцать минут при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза в ЗФР/Т. 100 мкл на лунку субстрата пероксидазы ТМВ Microwell (KirkegaardPerry Lab,Gaithersburg, MD) давали инкубироваться в темноте в течение пяти минут, затем добавляли 50 мкл на лунку 0,3 М серной кислоты для остановки развития окраски. Планшеты считывали при 450 нм с использованием устройства для считывания микропланшет UV max kinetic microplate reader изMolecular Devices. Клонирование CHO-IFNR1-1 С использованием IFNAR2-ELISA детектируемые уровни sIFNAR2 человека были обнаружены только при 0,5, 1,0 и 5,0 мкМ МТХ для небольшой части пулов IFNR1. На основании этих результатов IFNR1-1 при уровне 1 мкМ был отобран для клонирования. Один флакон пула IFNR1-1 оттаивали в колбу Т 75, содержащую среду с 1 мкМ МТХ. Клетки пассировали в колбы Т 75 в DMEM/F12, содержащей 5% ФТС,и проводили клонирование с использованием лимитирующего разведения. Пять 96-луночных планшетов инокулировали 0,25, 0,5 и 1 клеток/лунку. Клонирование выполняли в отсутствие лекарственного средства. Все лунки обследовали под микроскопом для гарантии одной клетки на лунку. Любые лунки, которые содержали многочисленные клетки, исключали. Спустя по меньшей мере 11 дней выращивания колонии из 82 лунок переносили в 24-луночные планшеты. Как только клетки достигали 50-70% конфлюентности, определяли объемные продуктивности с использованием IFNAR2-ELISA.(50% от всех клонов) переносили в колбы Т 25,где проводили определения 24-часовой объемной экспрессии. Два флакона каждого клона криоконсервировали в DMEM/F12, содержащей 5% ФТС, 1% L-глутамин и 10% ДМСО. Подтверждение экспрессии клонов после оттаивания Один флакон каждой из пятнадцати наивысших экспрессий оттаивали и использовали для инокуляции колбы Т 25. Затем клетки делили на две колбы Т 75, где проводили 24-часовые экспрессии в двух повторностях, а дополнительные десять флаконов криоконсервировали. Нозерн-анализ клонов Тотальную РНК выделяли непосредственно из клеток, выращиваемых в колбах Т-75, с использованием реагента TRIzol (Gibco BRL) согласно рекомендуемой изготовителем процедуре. Тотальную РНК, 5 мкг на дорожку, фракционировали по размеру в агарозных гелях, которые содержали формальдегид в качестве денатурирующего агента. Затем РНК переносили капиллярным блотом на найлоновые мембраныGENE SCREEN PLUS и гибридизовали с 32Pмеченным зондом hIFNAR2 из ПЦР-фрагмента кДНК. Сигналы полос определяли количественно на модели 603 Бетаскопа; размеры оценивали из радиоавтографов этих блотов. Результаты Амплификация Пробы анализировали при помощи ELISA на всех стадиях амплификации. Только два пула, IFNR1-1 и IFNR1-6 были детектируемыми при уровнях 0,5-5,0 и 1,0 и 5,0 мкМ МТХ, соответственно. Все остальные уровни экспрессии были слишком низкими для детектирования. Таблица 2 Суммированные результаты производительности (мкг/мл) объемного продуцирования во время амплификации Амплификация CHO-IFNR1 Пул Уровень МТХ (мкМ) мкг/млIFNR1-6 5,0 4,87 Пул IFNR1-1 при уровне 1 мкМ МТХ имел наивысшую объемную продуктивность, 9,40 мкг/мл, и был выбран для клонирования. Удельная продуктивность этого пула соответствовала 5,99 pcd. 11 Подтверждение экспрессии клонов после оттаивания Таблица 3 Подтверждение экспрессии клонов IFNR1-1 Клон мкг/млpcd. Продуцентом с наивысшей экспрессией в расчете на объемную экспрессию был клонIFNR1-1-31 (клон СНО 1-1-31) с уровнем экспрессии 18,71 мкг/мл. Пример 2 В этом примере SIFNAR2 является гетерологично секретируемым белком, который продуцируется и секретируется в культуре прикрепленных клеток СНО. IFNRA2 является бетасубъединицей рецептора интерферона типа I(IFNAR), который представляет собой гетеромультимерный рецепторный комплекс, состоящий по меньшей мере из двух различных полипептидных цепей, названных альфа и бета. Как и бета-субъединица, альфа-субъединица была переименована и известна также как IFNAR1.sIFNAR2 является растворимым и не мембраносвязанным, так как он лишен по меньшей мере трансмембранного домена IFNAR2. Два режима биореактора с клетками СНО, способными продуцировать и секретировать sIFNAR2,как представлено ниже, демонстрируют обычный "классический" подход (режим 4 биореактора) и новую стратегию фидинга сыворотки в соответствии с данным изобретением (режим 12 биореактора), использующую культуру прикрепленных клеток. Режим 4 биореактора (стратегия содержащего сыворотку фидинга) Клон СНО 1-1-31sIFNAR2) выращивали в DMEM/F12, дополненной 5% ФТС, в Т-колбах и роллерных флаконах до тех пор, пока не образовалось достаточно клеток для инокуляции биореактора на 4,8 л. Затем клетки трипсинизировали из роллерных флаконов и использовали для инокуляции реактора, содержащего 2 г/л микроносителей Cytopore 2 в 4,8 л DMEM/F12, дополненной 5% ФТС. После 24-часового периода начинали фи 005312 12 динг DMEM/F12, дополненной 5% ФТС, при скорости потока 0,3 объема среды фидинга/объем реактора/день (о/о/д). Эту скорость фидинга увеличивали постадийно на протяжении 8-дневного периода, пока не достигалась скорость потока 2 о/о/д (т.е. 9,6 л/день). В день 0 образования продукта (день 9 работы реактора) среду фидинга переключали на DMEM/F12, дополненную 1 мг/л рекомбинантного инсулина,приблизительно 12 мг/л цитрата железа(III),0,0068 мг/л селена и IX раствора микроэлементов (IFCSTE). Скорость потока фидинга около 2 о/о/д поддерживали на протяжении всего периода образования продукта. Рост клеток на микроносителях и образование SIFNAR2 подвергали мониторингу. Режим 12 биореактора (стратегия не содержащего сыворотку фидинга) Клон СНО 1-1-31sIFNAR2) выращивали в DMEM/F12, дополненной 5% ФТС, в Т-колбах и роллерных флаконах до тех пор, пока не образовалось достаточно клеток для инокуляции биореактора на 4,8 л. Затем клетки трипсинизировали из роллерных флаконов и использовали для инокуляции реактора, содержащего 2 г/л микроносителей Cytopore 2 в 4,8 л DMEM/F12, дополненной 5% ФТС. После 48-часового периода начинали фидинг не содержащей сыворотки DMEM/F12,дополненной IFCSTE, при скорости потока 0,2 объема среды фидинга/объем реактора/день(о/о/д). Эту скорость фидинга увеличивали постадийно на протяжении 8-дневного периода,пока не достигалась скорость потока 2 о/о/д."День образования продукта" в этой системе связывали с началом фидинга (день 2 работы биореактора), так как этот режим не был "классическим" двухфазным протоколом. Рост клеток на микроносителях и образование sIFNAR2 подвергали мониторингу. Результаты Как показано на фиг. 2, скорость клеточного деления и плотность насыщения в обоих режимах 4 и 12 биореактора были сравнимыми. Клетки, получающие подпитку (фидинг) содержащей сыворотку композицией (режим 4), увеличивались в количестве с 1,4 х 105 клеток/мл до 6,7 х 106 клеток/мл (5,5 генераций клеток), а клетки, получающие подпитку (фидинг) бессывороточной композицией, увеличивались в количестве с 2,5 х 105 клеток/мл до 5,1 х 106 клеток/мл (4,4 генераций клеток). Фиг. 3 иллюстрирует кинетику образования продукта sIFNAR2 в режимах 4 и 12 биореактора. Клетки с фидингом DMEM/F12,дополненной 5% ФТС, сначала демонстрировали объемную продуктивность приблизительно 80 мг/л/день. Однако при переключении на бессывороточную композицию DMEM/F12, дополненной IFCSTE, наблюдали лаг-фазу, в которой продуктивность падала менее чем до 40 мг/л/д,возвращаясь обратно к 80 мг/л/д после 10 13 дневного периода (день 20 работы биореактора). В противоположность этому, клетки, получающие с самого начала фидинг среды DMEM/F12,дополненной IFCSTE, не обнаруживали лагфазы и достигали 80 мг/л/д в день 14 работы биореактора. Рост клона СНО 1-1-31 на микроносителяхCytopore 2, с фидингом либо содержащей сыворотку, либо бессывороточной композицией среды, подвергали мониторингу, как показано на фиг. 4 А-4 С и фиг. 5A-5D, соответственно, где наблюдали жизнеспособные клетки, окрашенные зеленым флуоресцентным красителем. Фиг. 4 А-4 С и фиг. 5A-5D вместе иллюстрируют, что обе стратегии фидинга режимов 4 и 12 биореактора поддерживают рост клеток на микроносителях с увеличениями флуоресценции, наблюдаемой на протяжении времени. Теперь, после полного описания данного изобретения, специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что то же самое можно осуществлять в широком диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий, не отклоняясь от идеи и не выходя за рамки данного изобретения, и без чрезмерного экспериментирования. Хотя данное изобретение было описано в связи с его характерными вариантами, должно быть понятно, что его можно дополнительно модифицировать. Предполагается, что данная заявка охватывает любые вариации, применения или адаптации данного изобретения в соответствии, в общих чертах, с принципами данного изобретения и включает в себя такие отклонения от данного описания, которые находятся в пределах известной или общепринятой практики в области, к которой относится данное изобретение, и которые могут быть применены к существенным признакам, изложенным здесь выше, согласно объему прилагаемой формулы изобретения. Все цитируемые здесь ссылки, в том числе и опубликованные журнальные статьи или рефераты или соответствующие заявки США или других стран, патенты США или иностранные патенты, или другие ссылки, включены приводимыми здесь ссылками в полном виде, в том числе со всеми результатами, таблицами, фигурами и текстом, представленными в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, цитируемых в приводимых здесь ссылках, также в полном виде включено в качестве ссылок. Ссылки на известные стадии способов,общепринятые стадии способов, известные способы или общепринятые способы ни в коей мере не являются признанием того, что любой аспект, описание или вариант данного изобретения описывается, утверждается или предполагается в релевантной области. Предыдущее описание характерных вариантов полностью раскрывает общий характер 14 данного изобретения, который другие исследователи могут, с использованием знаний в пределах квалификации в данной области (в том числе содержания цитируемых здесь ссылок), легко модифицировать и/или приспособить для разнообразных применений таких характерных вариантов, без чрезмерного экспериментирования,без отклонения от общей концепции данного изобретения. Таким образом, предполагается,что такие адаптации и модификации находятся в пределах замысла и диапазона эквивалентов описанных вариантов осуществления и основаны на объяснении и руководстве, представленных здесь. Должно быть понятно, что фразеология или терминология в описании служит цели описания и не является ограничением, так что терминология или фразеология данного описания должна интерпретироваться квалифицированным специалистом в свете приведенных здесь указаний и руководства, в сочетании со знаниями специалиста с обычной квалификацией в данной области. СсылкиSelection in Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells,BioTechniques. 15 (5): 863-866 (1993). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения гетерологичного секретируемого белка из клеток яичника китайского хомячка (СНО), выращиваемых на микроносителях, предусматривающий инокуляцию клеточного биореактора, содержащего микроносители в качестве твердой подложки для роста прикрепленных клеток и содержащую сыворотку среду для культуры клеток, инокулятом хозяйских клеток СНО,трансформированных для экспрессии гетерологичного секретируемого белка, где инокулят получен путем выращивания трансформированных хозяйских клеток СНО в содержащей сыворотку среде для культуры клеток; и культивирование инокулированных хозяйских клеток СНО в культуре прикрепленных клеток без перфузии среды для культуры клеток в течение периода приблизительно от одного до трех дней до инициации фидинга (подпитки); введение усовершенствования, подразумевающего 16 инициацию фидинга бессывороточной среды для культуры клеток, дополненной инсулином, цитратом железа (III), селеном и микроэлементами, в клеточный биореактор путем непрерывной перфузии; увеличение скорости подачи фидинга бессывороточной среды для культуры клеток, дополненной микроэлементами, в стадиях на протяжении приблизительно шести-десятидневного периода, пока не будет достигнута конечная скорость потока фидинга в диапазоне приблизительно 1-3,5 об./об./день, для получения и секреции гетерологичного белка из хозяйских клеток СНО в бессывороточную среду для культуры клеток; и культивирование хозяйских клеток СНО в культуре прикрепленных клеток при конечной скорости потока фидинга. 2. Способ по п.1, где период культивирования инокулированных хозяйских клеток СНО составляет приблизительно два дня. 3. Способ по п.1, где стадия инициации фидинга начинается с фидинга при скорости потока в диапазоне приблизительно 0,1-0,4 об./об./день бессывороточной среды для культуры клеток, дополненной инсулином, цитратом железа(III), селеном и микроэлементами. 4. Способ по п.3, где фидинг инициируют при скорости потока фидинга в диапазоне приблизительно 0,2-0,3 об./об./день. 5. Способ по п.3, где фидинг инициируют при скорости потока фидинга приблизительно 0,2 об./об./день. 6. Способ по п.1, где скорость потока фидинга увеличивают от стадии к стадии на протяжении приблизительно семи-девятидневного периода. 7. Способ по п.1, где скорость потока фидинга увеличивают от стадии к стадии на протяжении приблизительно восьмидневного периода. 8. Способ по п.1, где конечная скорость потока фидинга заключена в диапазоне приблизительно 1,5-2,5 об./об./день. 9. Способ по п.1, где конечная скорость потока фидинга составляет приблизительно 2 об./об./день. 10. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий стадию извлечения гетерологичного белка из бессывороточной среды для культуры клеток. 11. Способ по п.1, где гетерологичный белок является растворимым рецептором интерферона / (sIFNAR2). 12. Способ по п.1, где микроносители представляют собой Cytopore 2. 13. Способ по п.1, где бессывороточной средой для культуры клеток является

МПК / Метки

МПК: C07K 14/715, C12N 5/06

Метки: китайского, гетерологичного, яичника, белка, способ, клеток, получения, микроносителях, выращиваемых, хомячка, секретируемого

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/10-5312-sposob-polucheniya-geterologichnogo-sekretiruemogo-belka-iz-kletok-yaichnika-kitajjskogo-homyachka-vyrashhivaemyh-na-mikronositelyah.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ получения гетерологичного секретируемого белка из клеток яичника китайского хомячка, выращиваемых на микроносителях</a>

Похожие патенты