Способ сохранения вирусов и микоплазмы

Номер патента: 4131

Опубликовано: 25.12.2003

Автор: Уорралл Эрик Эдвард

Есть еще 2 страницы.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Способ сохранения биологически активного материала, в том числе живого вируса и микоплазмы, который включает стадии

(i) смешивание водной суспензии биологически активного материала со стерильным водным раствором трегалозы с достижением концентрации трегалозы в смеси в пределах от 2,5 до 8% (мас./об.);

(ii) проведение первичного высушивания смеси в течение 30-60 мин при давлении ниже атмосферного и при температуре вначале не выше 37шC, которая контролируется так, что не падает до 0шC и ниже, а в конце не возрастает выше 40шC, так что формируется стеклянистый пористый матрикс, включающий стеклянистую трегалозу с содержанием остаточной влажности не выше 10% и содержащий внутри себя высушенный биологически активный материал; и

(iii) проведение вторичного высушивания стеклянистого пористого матрикса, полученного на стадии (ii), в течение 10-30 ч при давлении не выше 0,1 мбар и при температуре, которая в конце лежит в пределах от 40 до 45шC, так что формируется трегалозный матрикс с содержанием остаточной влажности не выше 2%, содержащий внутри себя высушенный биологически активный материал.

2. Способ по п.1, где вторичное высушивание на стадии (iii) проводят от 20 до 30 ч.

3. Способ по п.2, где вторичное высушивание проводят от 15 до 17 ч при температуре около 37шC и затем температуру постепенно повышают в течение оставшегося времени вторичного высушивания до конечной температуры от 40 до 45шC.

4. Способ по любому из пп.1-3, где первичное высушивание на стадии (ii) проводят под давлением не выше 800 мбар.

5. Способ по любому из пп.1-4, где содержание остаточной влажности стеклянистого трегалозного матрикса в конце первичного высушивания на стадии (ii) составляет около 10%.

6. Способ по любому из пп.1-5, где содержание остаточной влажности в конце первичного высушивания на стадии (iii) составляет 1,0% или меньше.

7. Способ по любому из пп.1-6, где живой вирус выбирают из вируса чумы рогатого скота, вируса чумы мелких грызунов, вируса кори, вируса свинки, вируса краснухи, вируса желтой лихорадки, вируса полиомиелита и вируса болезни Ньюкасла.

8. Способ по п.7, где живой вирус представляет собой вирус чумы рогатого скота или вирус чумы мелких грызунов.

9. Способ по любому из пп.1-8, где микоплазма представляет собой микоплазму инфекционной плевропневмонии крупного рогатого скота.

10. Регидратируемая композиция для приготовления вакцины, состоящей из трегалозы в форме метастабильного стеклянистого матрикса, характеризующегося содержанием остаточной влажности не выше 1%, содержащего внутри матрикса высушенный биологически активный материал, выбранный из высушенного живого вируса или живой микоплазмы.

11. Композиция по п.10, где биологически активный материал представляет собой живой вирус, выбранный из вируса чумы рогатого скота, вируса чумы мелких грызунов, вируса кори, вируса свинки, вируса краснухи, вируса желтой лихорадки, вируса полиомиелита и вируса болезни Ньюкасла.

12. Композиция по п.11, где биологически активный материал представляет собой вирус чумы рогатого скота или вирус чумы мелких грызунов.

13. Композиция по п.12, где биологически активный материал представляет собой микоплазму инфекционной плевропневмонии крупного рогатого скота.

14. Способ изготовления вакцины, включающий регидратацию композиции по любому из пп.11-13 в подходящей водной среде.

 

Текст

Смотреть все

1 Настоящее изобретение относится к сохранению вирусов и микоплазмы. В частности,оно относится к сверхбыстрому способу, посредством которого могут быть сохранены эти материалы с использованием дисахарида трегалозы. Этим методом можно добиться долгосрочного сохранения вирусов и/или микоплазмы и, особенно, можно получить живые аттенуированные вакцины. Сохранение подверженных биологическому разложению материалов путем обезвоживания и осмоконцентрации является обычным и классическим способом. Когда становится необходимым выполнение задачи сохранения чувствительных биомолекул, простая сушка не подходит, поскольку удаляется структурная вода, что приводит к денатурации и потере жизненной активности. Сохранение замораживанием в жидком азоте и лиофилизация стали принятыми способами долгосрочного сохранения чувствительных биомолекул, причем последний способ широко используется для сохранения живых аттенуированных вакцин. Улучшенная температурная устойчивость высушенной вымораживанием вакцины чумы рогатого скота была достигнута продлением второго цикла сушки для того, чтобы уменьшить уровень остаточной влажности (RM) примерно до 1-2%. Это повлекло за собой применение длинных и высокоэнергоемких циклов работы продолжительностью более 72 ч, как описано Mariner, J.C. et al., Vet. Microbiol., 1990, 21,195-209. Полученные данным способом вакцины известны под названием THERMOVAX и их отличают от стандартных вакцин. Как упоминалось выше, эти способы, используемые в настоящее время, отнимают много времени и включают применение высокой энергии. Более того, лиофилизация приводит лишь к небольшому уровню температурной устойчивости конечного продукта, и для снижения разрушения во время хранения по-прежнему требуется вымораживание. Особенно это является проблемой для живых вакцин, используемых в тропических странах, поскольку они теряют действенность, и это в результате, к несчастью, приводит к тому, что в ходе проведения полевых программ вакцинации в тропических странах,где трудно следить за соблюдением холодовой цепи, в конечном итоге пациентов вакцинируют субстандартной или, в некоторых случаях,бесполезной вакциной. В ходе эволюционного естественного отбора некоторые виды растений и животных приобрели замечательную и элегантную способность претерпевать крайнее обезвоживание,оставаясь в спячке во враждебных окружающих условиях в течение долгих периодов времени, и при этом будучи способными проявлять полную жизненную активность при регидратации. Примерами служат воскресающее растение Selaginella lepidophyla, артемия Artemia salina(Kinchin, I.M., Biologist, 1995, 42,4). Эти организмы называют криптобиотическими, а способ,благодаря которому они выживают, известен как ангидробиоз. Все виды животных и растений, проявляющие эту способность, содержат дисахарид трегалозу (-D-глюкопиранозилDглюкопиранозид). Его присутствие в большинстве криптобионтов, главным образом, в количествах порядка 0,2 г/г сухого веса, позволяет им противостоять крайнему обезвоживанию,высоким температурам, рентгеновскому излучению и также, для нескольких видов тихоходок, высокому давлению величиной 600 МПа.Colaco et al., Biotechnology, 1992, 10, 10071011, описывают преимущества быстрой сушки биологических материалов с использованием трегалозы. Этот способ большей частью относится к сушке ферментов рестрикции и иммуноглобулинов на предварительно подготовленных твердых матрицах, таких как волокна целлюлозы, или на поверхности пластиковых планшетов для диагностических целей, таких как ELISA или сходные диагностические лабораторные приложения. Однако, с этими способами возникают проблемы при переходе в масштаб промышленных способов применения,таких как широкомасштабная продукция коммерческих вакцин, когда много большее число единиц и объемов должно быть помещено в частично запечатанные пузырьки, с обязательным применением асептических методов. Чтобы соответствовать требованиям к процедуре широкомасштабной продукции вакцин, когда типичными являются объем единицы от 1 мл и выше и объемы производственного образца,равные 20 л, нужна другая стратегия, позволяющая удалить нужный объем воды за экономически приемлемое время. Сушка при атмосферном давлении даже при наивысшей физиологически переносимой температуре потребует неприемлемо длительного времени для достаточно быстрого удаления воды из частично закупоренных пузырьков для вакцины и неизбежно приведет к денатурации и потере действенности. Настоящее изобретение касается способа сохранения вирусов или микоплазмы с использованием трегалозы в условиях, приводящих к удалению воды и, в то же время, позволяющих поддерживать биологическую целостность материала. Соответственно настоящее изобретение описывает способ сохранения биологически активного материала, в том числе, живого вируса или микоплазмы, который включает стадии:(i) смешивание водной суспензии биологически активного материала со стерильным водным раствором трегалозы с достижением кон 3 центрации трегалозы в смеси в пределах от 0,2 до 10% (маc./об.);(ii) проведение первичной сушки смеси в течение 30-60 мин, при давлении ниже атмосферного и при температуре вначале не выше 37 С, которая контролируется так, что не падает до 0 С и ниже, а в конце не возрастает выше 40 С, так что формируется стеклянистый пористый матрикс, включающий стеклянистую трегалозу с содержанием остаточной влажности не выше 10% и содержащий внутри себя высушенный биологически активный материал; и(iii) проведение вторичной сушки стеклянистого пористого матрикса, полученного на стадии (ii), в течение 10-30 ч при давлении не выше 0,1 мбар и при температуре, которая в конце лежит в пределах от 40 до 45 С, так что формируется трегалозный матрикс с содержанием остаточной влажности не выше 2%, и содержащий внутри себя высушенный биологически активный материал. Используя способ изобретения, возможно производить живые вакцины с улучшенными биологическими характеристиками и особыми коммерческими преимуществами по сравнению со способами, ранее применяемыми в данной области. Вакцины, полученные с использованием способа по изобретению, высушиваются быстрее, чем таковые, полученные с использованием обычных процедур сушки вымораживанием. К примеру, способ по изобретению можно использовать для сушки смесей трегалоза/биологически активный материал до содержания влажности около 10% меньше чем за один час. Дальнейшего обезвоживания до содержания остаточной влажности около 1-2% можно достичь меньше чем за 30 ч, например примерно за 20 ч, по сравнению с периодом 50 ч при обычных процедурах сушки вымораживанием. Более того, согласно настоящему изобретению минимизируется повреждение, вызванное концентрацией раствора, и, в особенности, предотвращается повреждающая кристаллизация льда. Термостабильность биологически активного материала, сохраненного в трегалозном стеклянистом матриксе, выше, чем таковая у материалов, полученных способами, известными из предшествующего уровня техники, и, таким образом, минимизируется необходимость поддержания холодовой цепи, которая является серьезным ограничением для обычных,сушеных вымораживанием вакцин. Продукт по настоящему изобретению может подвергаться воздействию высоких температур окружающей среды, например, температур приблизительно до 45 С, в течение длительных периодов без какой-либо существенной потери биологической активности. В дополнение к этому и другим преимуществам настоящего изобретения,продукт способа проявляет немедленную мгновенную растворимость при регидратации. 4 Способ по настоящему изобретению применим для долгосрочного сохранения вирусов и микоплазмы. В частности, его можно использовать для сохранения высоколабильных живых аттенуированных вирусных компонентов и компонентов микоплазмы, которые можно подвергнуть регидратации с образованием вакцин. Примеры биологически активных материалов,которые можно сохранять согласно способу по изобретению,включают: Семейство: Paramyxoviridiae Подсемейство: Paramyxovirinae Роды: группа вирусов парагриппа, корь,чума рогатого скота, собачья чума, чума мелких грызунов (Peste des Petits Ruminants; PPR)(желтая лихорадка) Род: Rhabdovirus, Lyssaviridiae (вирус бешенства) Пикорнавирусы (вирус полиомиелита) Вирус болезни Ньюкасла Микоплазмы: Mycoplasma myсоides (инфекционная плевропневмония крупного рогатого скота)Brucella abortus: вакцина штамма 19 Хламидии: Chlamydia psittaci (энзоотический выкидыш) Кокцидии: Toxoplasma gondii (токсоплазмоз) Согласно способу по настоящему изобретению биологически активный материал, который подлежит сохранению, подготавливают в виде суспензии в соответствующей водной среде. В случае вируса может возникнуть потребность культивировать его, например, в клеткахvero, в соответствующей культуральной среде, и затем собрать перед получением суспензии,чтобы обеспечить подходящую концентрацию материала. В типичном случае, доводят рН водного раствора биологически активного материала до значения в интервале от 7,0 до 7,8, главным образом, около 7,4, добавлением, к примеру, щелочи. Трегалоза является одним из самых стабильных и химически инертных дисахаридов. Она имеет крайне низкую энергию связи, менее чем 1 ккал/моль, что делает структуру димера очень стабильной. Она не подвергается карамелизации, кроме как при сильном нагревании, а также не вступает в реакцию Мэйларда (Maillard) с белками и пептидами. Нативная дигидратная структура, в состав которой входят две молекулы воды, обеспечивает необычную подвижность вокруг дисахаридной связи, которая,возможно, позволяет происходить более тесной ассоциации третичным структурам биомолекул. Она не гигроскопична, но проявляет при гидратации мгновенную растворимость, свойство,особенно полезное для высушенных вакцин. 5 Водный раствор биологически активного материала смешивают со стерильным водным раствором трегалозы и смесь готовят, так что она будет содержать концентрацию трегалозы от 0,20 до 10% маc./об., предпочтительно от 2 до 10% и наиболее предпочтительно от 2,5 до 8%. Находясь в пределах интервала концентраций трегалозы, используемая рабочая концентрация, главным образом, будет зависеть от размера единицы биологически активного материала. Для мелких вирусных частиц требуется меньше трегалозы, чем для больших клеток. Стерильная водная смесь трегалоза/биологически активный материал подвергают процедуре вакуумной сушки, включающей стадию первичной сушки с последующей стадией вторичной сушки. В предпочтительном случае,для процедуры сушки используют обычные устройства для сушки вымораживанием (например, производства EDWARDS, CHRIST,USIFROID или SAVANT), чтобы обеспечить контролируемую среду на критических стадиях способа. Однако, следует подчеркнуть, что при использовании такого устройства условия сушки вымораживанием не применяются, и препарат не подвергают сушке вымораживанием. Процедура сушки включает две стадии сушки,стадию первичной сушки, на которой содержание остаточной влажности материала снижается до значения не выше 10%, и стадию вторичной сушки, на которой содержание остаточной влажности материала снижается далее до значения, не превышающего 2%. На стадии первичной сушки начальная температура устройства для сушки должна быть такой, чтобы обеспечить температуру трегалозной смеси не выше 37 С, и предпочтительно она должна быть 37 С, чтобы предотвратить какуюлибо потерю биологической активности на этой стадии способа. Когда из смеси испаряется вода,температура смеси падает. Однако сушку проводят так, чтобы не допустить вымораживания или сублимации из льда, как это происходит при обычных процедурах сушки вымораживанием; то есть температура продукта в течение этой стадии процедуры сушки контролируется так, чтобы она не падала до 0 С или ниже, и обычно она контролируется так, чтобы не падала ниже 4 С. Давление снижается ниже атмосферного, предпочтительно до значения от 800 до 300 мбар. Стадия первичной сушки продолжается некоторый период времени, от 30 до 60 мин, в течение которого температура трегалозной смеси вначале падает при испарении воды, а затем растет. Когда температура (при применяемом пониженном давлении) достигает во время этой процедуры 25 С, трегалоза образует стеклянистый матрикс, состоящий из стеклянистой трегалозы и содержащий биологически активный материал, находящийся в высушенном или частично высушенном состоянии. Стадия первич 004131 6 ной сушки заканчивается, когда содержание влаги в стеклянистом матриксе достигает 10% или ниже, и, что существенно на этой критической стадии процедуры, температуре не позволяют подниматься выше 40 С. Если температура в конце стадии первичной сушки превысит 40 С, биологически активный материал претерпит повреждение. Продукт, полученный на стадии первичной сушки, затем подвергают стадии вторичной сушки, предпочтительно не удаляя его с аппарата сушки, используемого на стадии первичной сушки. На стадии вторичной сушки стеклянистый матрикс, полученный на стадии первичной сушки, подвергается дальнейшему обезвоживанию при пониженном давлении, не превышающем 0,1 мбар. Доступные в настоящее время специализированные устройства способны работать при крайне низких давлениях, например,ниже 0,001 мбар. Однако очень хорошие результаты получают согласно настоящему изобретению с использованием на стадии вторичной сушки пониженных давлений в пределах от 0,001 до 0,1 мбар, обычно от 0,01 до 0,1 мбар. Стадия вторичной сушки продолжается в течение периода времени в пределах от 10 до 30 ч,предпочтительно от 20 до 30 ч. Как отмечалось ранее, температура стеклянистого матрикса в конце стадии первичной сушки не превышает 40 С. В течение стадии вторичной сушки температура матрикса может слегка подниматься до температуры в конце процедуры сушки в пределах от 40 до 45 С. Трегалозный матрикс в конце стадии вторичной сушки будет обладать содержанием остаточной влажности на уровне 2% или ниже, предпочтительно, 1% или ниже, чтобы обеспечить очень высокую степень термостабильности продукта. При таких содержаниях остаточной влажности конечная температура в процедуре сушки не должна быть выше 45 С, поскольку при температуре выше 45 С высушенный биологически активный материал в матриксе может до некоторой степени подвергнуться разрушению. Предпочтительно, чтобы температура продукта в конце стадии вторичной сушки не превышала 44 С. При экспериментировании было обнаружено, что имеется некоторое преимущество в таком контроле температуры матрикса в течение стадии вторичной сушки, чтобы поддерживать ее примерно на уровне 37 С в течение периода от 15 до 17 ч, и затем постепенно поднимать (например, по 0,5-1 С/ч) до конечной температуры, лежащей в пределах от 40 до 45 С, в течение оставшегося времени вторичной сушки. Стеклянистый трегалозный матрикс, полученный согласно этому способу, можно очень быстро регидратировать в соответствующий водной среде, обычно в стерильной дистиллированной воде, чтобы получить вакцину для 7 использования в течение очень короткого периода времени. В получении вакцины и рабочей процедуре с использованием морозильной сушки для сушки таких вирусов, как вирусы чумы рогатого скота и чумы мелких грызунов, и микоплазм без стадии лиофилизации, включающего сублимацию из льда, используют уникальное свойство дисахарида трегалозы защищать третичную структуру макромолекул во время сушки. В сравнении с обычными процедурами сушки вымораживанием способ по настоящему изобретению обладает следующими преимуществами. Он обеспечивает высокий уровень защиты вирусов при использовании относительно короткой, простой процедуры, например, цикла продукции длительностью 25 ч, таким образом уменьшая время цикла продукции и энергозатраты. Все, что требуется, представляет собой базовое оборудование для сушки, хотя также можно использовать морозильные сушки, контролируемые сложным микропроцессором, но это не является строго обязательным. Способ является нечувствительным к отключению электроэнергии, в отличие от лиофилизации, при которой даже краткое отключение энергии может вызвать плавление продукта, что ведет к неприемлемой потере вируса. В прошлом было трудно достичь пероральной вакцинации некоторыми аттенуированными штаммами вирусов из-за потери вирусом эпителиотропизма. Как пероральная, так и интраназальная вакцинация могла бы быть удобной и уместной во многих случаях применения,поскольку эти способы имитируют естественный воздушно-капельный путь инфекции, вызывая каскад защитного иммунитета в слизистой посредством IgA и гуморального IgG2aзависимого Т-хелперного ответа 1 типа. Было бы просто назначать вакцинацию такими способами, и это применялось бы в случае получения подходящей вакцины. Процедура вакцинации живыми аттенуированными штаммами, имитирующими естественные пути инфекции, вызывает более развернутый серозно-мукозный и клеточно-опосредованный иммунитет. В дальнейшем аспекте, настоящее изобретение относится к способу изготовления вакцины для перорального и интраназального использования,который включает приготовление стеклянистого матрикса трегалозы, содержащего высушенный согласно описанному выше способу вирус, в сочетании с подходящим положительно заряженным, биологически совместимым, водорастворимым адъювантом, и регидратирование стеклянистого матрикса соответствующим водным раствором. В предпочтительном осуществлении этого аспекта изобретения вакцина для пероральной или интраназальной вакцинации представляет собой MMR-вакцину. Поскольку 8 современную педиатрическую MMR-вакцину получают по обычной технологии сушки вымораживанием и вводят пациентам подкожно, пероральная или интраназальная вакцина дала бы большие преимущества. Примеры Пример 1. Штамм аттенуированной вакцины RBOK парамиксовируса чумы рогатого скота выращивали в клетках вторичной почки теленка в течение 10 суток при 37 С. Суспензию вируса собирали и очищали от осадка центрифугирование при 1000 об./мин в охлаждаемой центрифуге. Стерильный наполнитель, содержащий 10% мас./об. трегалозы и 5% гидролизата лактальбумина добавляли в соотношении 1:1 к очищенной жидкости, содержащей вирус, при 4 С. Смесь наполнитель/вирус разделяли на аликвоты объемом 1 мл, помещенные в пузырьки из нейтрального стекла объемом 10 мл, которые затем частично закупоривали стерильными сухими пробками из бутиловой резины. Пузырьки помещали на полку морозильной камеры сушки, и повышали температуру продукта до 37 С. Запускали конденсатор, и позволяли его температуре стабилизироваться на уровне-60 С. Запускали вакуумный насос, и помещали камеру, содержащую продукт, под давление 800 мбар; продукт осторожно дегазировали в течение 30 мин, чтобы избежать разбрызгивания, в то же время тщательно следя за температурой продукта, чтобы избежать вымораживание вследствие испарения. Поддерживая градиент давления между сушильной камерой и охлажденным конденсатором, за первые 30 мин отправляли 75% водяного пара в конденсатор. Затем понижали давление до 500 мбар, и образовывался структурированный метастабильный стеклянистый матрикс. Затем давление понижали далее, до 0,1 мбар и поддерживали его в течение 30 мин. Пробирки закупоривали и герметично закрывали при конечном давлении 0,01 мбар и снабжали их алюминиевыми крышками. Титр вируса до сушки: 104 ТСID/50/мл Титр вируса после сушки: 104 TCID/50/мл Матрикс продукта обладал мгновенной растворимостью в дистиллированной воде. Этот пример показывает, что действенность вируса не подвергается существенному влиянию обработки, проводимой на стадии первичной сушки способа изобретения. Дополнительно он иллюстрирует возможность обезвоживания вируса для приготовления вирусных вакцин в промышленном масштабе. Пример 2. Материалы и методы Получение культур для вакцин RP и PPR 9 Штаммы вируса чумы мелких грызунов(PPRV 75/1) и чумы рогатого скота (RBOK) вначале выращивали, используя клетки vero в среде Игла (Eagles) в модификации Глазго(Glasgow) (DMEM), дополненной 10% триптозофосфатным бульона (ТРВ, Difco) и 10% фетальной сыворотки теленка (FCS), следующим образом: Клетками vero засевали 5 пластиковых флаконов площадью 150 см 2 при концентрации 287000 клеток/мл, 60 мл на флакон. Два флакона инокулировали 0,5 мл суспензией вируса PPR при кратности инфекции 0,03 вирусных частицы/клетку. Два флакона сходным образом инокулировали вирусом RP. Один флакон оставляли неинокулированным в качестве контроля. Флаконы инкубировали при 37 С в 5%CО 2, и клетки ежедневно проверяли на предмет развития цитопатического эффекта (СРЕ). На 4 сутки заменяли среду GMEM лактальбуминовым дрожжевым экстрактом Хэнка (HanksLYE), содержащим 2% FCS и 0,1% дигидрата трегалозы. На 6 сутки СРЕ примерно равнялся 80%, и собранные суспензии вирусов объединяли, вымораживали и хранили при -20 С. Контрольный флакон оставляли в инкубаторе на 10 дней, и подтверждали то, что не произошла его контаминация и деградация клеток, и не наблюдалось очевидных следов побочных агентов. Процедура обезвоживания. Можно считать, что процедура обезвоживания, подобно лиофилизации, состоит из двух главных компонентов: первичной сушки и вторичной сушки. Фундаментальное отличие от лиофилизации состоит в том, что продукт не вымораживается, и сушка осуществляется простым обезвоживанием без сублимации из льда. Оттаявшие объединенные суспензии вирусов растворяли 1:1 стерильным 5% мас./об. водным раствором дигидрата трегалозы; таким образом, конечная концентрация трегалозы в смеси составляла 2,5% мас./об. Объем в один мл помещали в каждый из пузырьков для вакцины объемом 5 мл, и частично закрывали их сухими пробками из бутиловой резины с отверстием. Эту операцию проводили при комнатной температуре в шкафу с ламинарным воздушным потоком, с соблюдением строгих асептических мер предосторожности. Первичная сушка. Процесс обезвоживания проводили с использованием морозильной сушки Edwards Supermodulyo с точным контролем давления в камере, давления конденсатора, температур полки и продукта. Морозильную сушку подготавливали заранее, перед загрузкой камеры с полками пузырьками, содержащими продукт. Температуру полки повышали до 40 С, а температуре конденсатора позволяли достигать рабочего предела -40 С. Затем пузырьки помещали на полки, и содержимому позволяли нагреться до 35 С. Дверцу камеры закрывали, оставляя пол 004131 10 ностью открытыми большой и малый клапаны для доступа воздуха, и включали вакуумный насос при полном газовом балласте. Давление в камере доводили до 800 мбар осторожным закрытием большого клапана для доступа воздуха. Давление в конденсаторе поддерживали на уровне 500 мбар для получения градиента давления между камерой и конденсатором, что создавало движущую силу для оттока водяного пара от поверхности продукта к конденсору. То,что пузырьки были частично закрыты пробками,также обладало полезным эффектом сжатия отверстия, и так давление у поверхности продукта возрастало еще сильнее. Замечено, что материал в частично закрытых пузырьках высушивался быстрее, чем таковой в полностью открытых,содержащих термопары для записи температуры, пузырьках. Изменение температуры продукта в течение времени и изменение давления в камере в течение времени во время стадии первичной сушки показано на прилагаемой фигуре. Как можно видеть на фигуре, испарение начинается немедленно, что отражает падение температуры продукта. Вначале температуру продукта контролировали, осторожно закрывая большой клапан для доступа воздуха в течение первых 15 мин, а далее для этого манипулировали малым клапаном для доступа воздуха, чтобы не допустить вымораживания продукта. Поддержание температуры при испарительном охлаждении на уровне 1-2 С повышало интенсивность испарения так, что 90% воды испарялось за 1 ч, и температура продукта начинала повышаться, стремясь к температуре полки. Через 40 мин, когда произошло обезвоживание, была достигнута критическая точка, и при этом произошел внезапный подъем температуры до 25 С, с последовавшим через несколько секунд внезапным падением температуры продукта до 15 С. Это сопровождалось заметным вспениванием продукта. Вторичная сушка. Другую серию (серия 2) образцов штамма живого аттенуированного вируса чумы рогатого скота (RP) получали и подвергали первичной сушки в течение 1 ч, как описано выше. Затем его подвергали стадии вторичной сушки, во время которой температуру повышали за период дальнейших 17 ч до конечной температуры продукта, равной 42,4 С, а давление составляло 0,06 мбар при полностью закрытом газовом балласте. Это имело эффект снижения содержания остаточной влажности материала приблизительно до 0,72%. Другую серию (серия 2) образцов штамма живого аттенуированного вируса чумы мелких грызунов (PPR) получали и подвергали первичной сушки в течение 1 ч, как описано выше. Затем его подвергали стадии вторичной сушки. Вторичную сушку останавливали через 2 ч при температуре продукта 42,8 С и давлении в ка 11 мере 0,06 мбар. После этой краткой процедуры вторичной сушки продукт характеризовался содержанием остаточной влажности, равным 5,36%. Тест на термостабильность. Образцы из серий 2 PPR и PR, полученные как описано выше, хранили при 4, 25, 37 и 45 С. Три пузырька из каждой температуры хранения отбирали для титрования вируса на 0, 3, 7, 10 и 14 сутки инкубации. Среднее геометрическое значение титра из трех пузырьков считали соответствующим значению остаточного титра вируса для каждой серии, каждой температуры хранения и определенного времени инкубации(табл. 3 и 4). Титрование вируса. Эту процедуру проводили для определения эффективности сверхбыстрого обезвоживания в течение 1 ч, что оценивалось степенью защиты,обеспеченной стеклянистым состоянием трегалозы. Титрование вируса проводили по стандартной рабочей процедуре для вакцины против чумы рогатого скота, описанной Mark, M.Nations). Внимание: основным органом регуляции и координации качества вакцин для животных является The Office International Epizootics(OIE). Стандарту OIE для действенности RP соответствует 102.5 TCID50 s/дозу, а для PPR 103 TCID50 s/дозу (где TCID представляет собой инфекционную дозу культуры ткани). В приведенных ниже табл. 1, 2, 3 и 4 вирусные титры выражены как Х log10 TCID50/мл, где X представляет собой цифру, показанную в столбцах тест 1, тест 2 и тест 3 в каждой из таблиц. Результаты и обсуждение. Результаты, полученные от парных образцов вакцин RP и PPR, высушенных в течение одного часа по способу, описанному выше, в сравнении с контрольным образцом лиофилизованной вакцины и также с родительскими необработанными объединенными образцами вируса, содержащими 2,5% трегалозы, соответствовали приведенным в табл. 1 и 2. Наполнитель,содержащий 2,5% трегалозы, характеризовался хорошей защитой вируса RP после быстрого обезвоживания при 37 С в условиях пониженного до 800 мбар давления, и потери после сушки составили 0,45 log10 TCID50/мл. Таблица 1 Титрование вируса чумы рогатого скота после первичной сушки Тестируемое вещество Объединенные образцы вируса+2,5% трегалоза Объединенные образцы вируса 12 Вирус PPR в том же наполнителе был отлично защищен с потерей при сушки только 0,15 log10 TCID50/мл. Таблица 2 Титрование вируса чумы мелких грызунов Тестируемое вещество Объединенные образцы вируса Введение вторичной фазы в процесс обезвоживания оказывает заметное действие на термическую устойчивость продукта. Это демонстрирует тот факт, что серия 2 RP, образцы которой подвергали 17 ч вторичной сушки, характеризовалась после 2 недель при 45 С потерями лишь на log 1,9 TCID/50/мл. Таблица 3 Тест на термостабильность серии 2 чумы рогатого скота День инкубации 0 3 7 10 14 Титр вируса после хранения при paзличных температурах 25 С 37 С 4,97 4,97 4,70 4,10 4,63 4,17 4,57 4,10 4,30 3,83 С другой стороны, в образцах серия 2 PPR,которую подвергали лишь 2 ч вторичной сушки,не выявляли содержания вируса через 14 суток инкубации при 45 С. Таблица 4 Тест на термостабильность серии 2 PPR День инкубации 0 3 7 10 14 Титр вируса после хранения при paзличных температурах 25 С 37 С 5,40 5,40 4,80 4,57 4,77 4,40 4,77 3,97 4,50 3,60 При обезвоживании вирусов чумы рогатого скота и PPR с использованием описанной ангидробиотической процедуры за 1 ч получают стекловидную, ячеистую структуру, имеющую примерно 10% остаточной влажности. Предполагается, что наблюдаемый после 40 мин сушки выброс теплоты может означать температуру перехода в стеклянистое состояние трегалозного наполнителя при пониженном давлении, при котором трегалоза перестает быть жидкой и образует метастабильное стекло (см. Robert J.corn embryos, Plant. Physiol., 1989, 89, 977-981). Продукт в этом состоянии с содержанием остаточной емкости около 10% имеет микрокристаллическую структуру и проявляет заметную мгновенную растворимость при дегидратации растворителем. Ускоренные тесты на термоста 13 бильность продукта с 5,36% остаточной влажностью приводили к неприемлемому разрушению, что подтверждалось наличием очень большого уменьшения титра вируса (табл. 4). Наполнителя, содержащего разбавленный вдвое Hanks LYE, 1% FCS и 2,5% мас./об. трегалозы, было достаточно для защиты вирусовRP и PPR во время сверхбыстрого обезвоживания длительностью один час, при котором содержание остаточной влажности быстро снижалось до 10% (табл. 1 и 2). Инкубация препарата 5,26% влажности при 45 С в течение 14 суток приводила к разрушению вируса (табл. 4). Однако продление вторичного обезвоживания до 17 ч производило ожидаемый эффект дальнейшего снижения остаточной влажности (менее чем до 1%), таким образом приводя к повышению термостабильности (табл. 3). Снижение титра после 14-суточной инкубации при 45 С на log 1,9 TCID/50/мл при наличии минимального титра на уровне Log10 3,03TCID50/мл является предпочтительным по сравнению с ожидаемым падением титра, обнаруженным в современных лиофилизованных термостабильных вакцинах (Thermovax). Полная утрата вируса в серии 2 PPR, образцы которой подвергали лишь 2-часовой вторичной сушки и затем сходным образом инкубировали при 45 С, проясняет повреждающее действие высокого содержания остаточной влажности и подчеркивает необходимость продления вторичной сушки до получения низкого содержания остаточной влажности. Пример 3. Вирус чумы мелких грызунов (PPR) культивировали в клетках vero в среде GMEM(Sigma No. G6148), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 10% триптозо-фосфатного бульона (Difco). Клетки культивировали во флаконах площадью 150 см 2 при концентрации 26 х 104-28 х 104 клеток на мл, добавляя 80 мл суспензии клеток на флакон. Каждый флакон площадью 150 см 2 инокулировали достаточным количеством вируса PPR для посева при кратности инфекции (MOI) 10-3 вирусных частиц/клетку. На 4 сутки после инокуляции, когда был замечен ранний цитопатический эффект (СРЕ),среду заменяли лактальбуминовым дрожжевым экстрактом Хэнка, содержащим 2% фетальной сыворотки теленка и 0,1% дигидрата трегалозы(вместо глюкозы). Это проводили для того, чтобы уменьшить концентрацию раствора и минимизировать осмотический стресс во время последующей процедуры обезвоживания, а также удалить восстанавливающие сахара, такие как глюкоза, способные вступить в реакцию Мэйларда (Maillard), что может денатурировать нуклеопротеины во время обезвоживания. На 6 сутки после инокуляции СРЕ примерно равнялся 80-90%, и собранные суспензии 14 вирусов вымораживали в течение ночи. Замерзшую жидкость оттаивали для освобождения эндогенного вируса и хранили при -20 С. Оттаявшую жидкость, содержащую вирус,смешивали в соотношении 1:1 со стерильным 16% мас./об. водным раствором дигидрата трегалозы (DFC Ltd) с получением конечной концентрации трегалозы в смеси вирусного наполнителя 8% мас./об. Объемы в один мл смеси вирусного наполнителя распределяли по стерильным пузырькам для вакцины объемом 5 мл (1 мл жидкости в каждый из пузырьков) и частично закупоривали их сухими пробками из бутиловой резины с отверстием (высушенными при 130 С в течение 3 ч непосредственно перед использованием). Обезвоживание проводили с использованием морозильной сушки Edwards Super Modulyo. Морозильную сушку подготавливали заранее, перед загрузкой полки пузырьками. Включали конденсатор, и его температуре позволяли достигать рабочего предела -40 С. Включали нагрев полки, и ее температуру устанавливали на уровне 40 С. Закрывали дверцу конденсора и отводный клапан, оставляя полностью открытыми большой и малый клапаны для доступа воздуха, и включали вакуумный насос при полном газовом балласте. Когда температура полки достигала 40 С, пузырьки помещали на полку, и в пузырек на каждой полке вставляли температурную термопару; закрывали дверцу камеры,оставляя полностью открытыми большой и малый клапаны для доступа воздуха. Когда температура содержимого пузырьков достигала 35 С, частично закрывали большой клапан для доступа воздуха, чтобы получить давление 800-900 мбар. В течение первых 15 мин наполнитель пузырьков, содержащий растворенный СО 2 из бикарбоната среды, осторожно дегазировали. Во время этой фазы происходило проникновение трегалозы в липидную мембрану вируса. Большой клапан для доступа воздуха закрывали далее, чтобы понизить давление до 500 мбар. Температуре наполнителя пузырьков позволяли опускаться примерно до 4,0 С, что выявляло наличие испарительного охлаждения. Осторожно закрывали малый клапан для доступа воздуха, следя в это время за температурой наполнителя, чтобы стабилизировать ее на уровне около 4,0 С. Эта фаза является наиболее критической во всей операции, и ее проводят с осторожностью, чтобы предотвратить разбрызгивание и/или слишком быстрое испарение, что может привести к вымораживанию продукта. К камере подводили стерильный воздух, чтобы обеспечить градиент давления и способствовать потоку водяного пара к конденсатору. Все это время поддерживали температуру на уровне 4 С осторожным управлением малым клапаном для доступа воздуха. После поддержания температуры продукта на уровне около 4 С от 20 до 30 15 мин малый клапан для доступа воздуха медленно закрывали, обеспечивая поддержание температуры продукта около 4 С и давления в камере 300 мбар. На этой стадии объем продукта заметно уменьшался до консистенции сиропа. В это время малый клапан для доступа воздуха был полностью закрыт. Примерно через 40 мин от начала процедуры первичной сушки обнаруживали возрастание температуры продукта. Через 45 мин масса воды из наполнителя испарялась и продукт переходил в микрокристаллическую ячеистую структуру, что сопровождалось внезапным выделением теплоты примерно до 15 С, тогда так трегалоза превращалась в метастабильный губчатый стеклянистый матрикс. После этого температура продукта падала, в то время как влага далее испарялась из продукта с получением конечного содержания влажности на уровне 10%. Сушку продолжали в течение ночи при закрытых большом и малом клапанах для доступа воздуха, а также закрытом клапане газового балласте вакуумного насоса, при давлении в камере 0,1 мбар, в то время как температура продукта достигала температуры полки в камере, равной 40 С. Сушку продолжали, чтобы выдержать общее время сушки, равное 24 ч, когда температура полки в камере повышалась на 1 С каждый час в течение последних 4 ч времени сушки, достигая конечной температуры (полки и продукта), равной 44 С. В то время как давление в камере поддерживалось на уровне 0,06 мбар, пузырьки закрывали и снабжали алюминиевыми крышками. Полученные согласно этому примеру образцы обезвоженного продукта хранили при 45С в течение 14 дней, и определяли титр вируса, как описано выше в примере 2. Определенное содержание остаточной влажности в продукта, обезвоженном согласно описанной выше процедуре, составляло приблизительно 1,0%. Обнаружено, что после хранения при 45 С в течение 14 дней образцы продукта теряли вирусную активность лишь в небольшой степени и были приемлемы в отношении получения применимого материала вакцины. Пример 4. Описанную выше в примере 3 процедуру проводили, следуя процедуре получения стабилизированного RP с использованием культуры вируса RP вместо культуры PPR, описанной в примере 3. Процедура сушки сходным образом приводила к получению стабилизированного RP с относительно малой потерей титра после хранения при 45 С в течение 14 дней. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ сохранения биологически активного материала, в том числе живого вируса и микоплазмы, который включает стадии(i) смешивание водной суспензии биологически активного материала со стерильным водным раствором трегалозы с достижением концентрации трегалозы в смеси в пределах от 2,5 до 8% (мас./об.);(ii) проведение первичного высушивания смеси в течение 30-60 мин при давлении ниже атмосферного и при температуре вначале не выше 37 С, которая контролируется так, что не падает до 0 С и ниже, а в конце не возрастает выше 40 С, так что формируется стеклянистый пористый матрикс, включающий стеклянистую трегалозу с содержанием остаточной влажности не выше 10% и содержащий внутри себя высушенный биологически активный материал; и(iii) проведение вторичного высушивания стеклянистого пористого матрикса, полученного на стадии (ii), в течение 10-30 ч при давлении не выше 0,1 мбар и при температуре, которая в конце лежит в пределах от 40 до 45 С, так что формируется трегалозный матрикс с содержанием остаточной влажности не выше 2%, содержащий внутри себя высушенный биологически активный материал. 2. Способ по п.1, где вторичное высушивание на стадии (iii) проводят от 20 до 30 ч. 3. Способ по п.2, где вторичное высушивание проводят от 15 до 17 ч при температуре около 37 С и затем температуру постепенно повышают в течение оставшегося времени вторичного высушивания до конечной температуры от 40 до 45 С. 4. Способ по любому из пп.1-3, где первичное высушивание на стадии (ii) проводят под давлением не выше 800 мбар. 5. Способ по любому из пп.1-4, где содержание остаточной влажности стеклянистого трегалозного матрикса в конце первичного высушивания на стадии (ii) составляет около 10%. 6. Способ по любому из пп.1-5, где содержание остаточной влажности в конце первичного высушивания на стадии (iii) составляет 1,0% или меньше. 7. Способ по любому из пп.1-6, где живой вирус выбирают из вируса чумы рогатого скота,вируса чумы мелких грызунов, вируса кори,вируса свинки, вируса краснухи, вируса желтой лихорадки, вируса полиомиелита и вируса болезни Ньюкасла. 8. Способ по п.7, где живой вирус представляет собой вирус чумы рогатого скота или вирус чумы мелких грызунов. 9. Способ по любому из пп.1-8, где микоплазма представляет собой микоплазму инфекционной плевропневмонии крупного рогатого скота. 10. Регидратируемая композиция для приготовления вакцины, состоящей из трегалозы в форме метастабильного стеклянистого матрикса, характеризующегося содержанием остаточной влажности не выше 1%, содержащего внутри матрикса высушенный биологически актив 17 ный материал, выбранный из высушенного живого вируса или живой микоплазмы. 11. Композиция по п.10, где биологически активный материал представляет собой живой вирус, выбранный из вируса чумы рогатого скота, вируса чумы мелких грызунов, вируса кори,вируса свинки, вируса краснухи, вируса желтой лихорадки, вируса полиомиелита и вируса болезни Ньюкасла. 12. Композиция по п.11, где биологически активный материал представляет собой вирус чумы рогатого скота или вирус чумы мелких грызунов. 13. Композиция по п.12, где биологически активный материал представляет собой микоплазму инфекционной плевропневмонии крупного рогатого скота. 18 14. Способ изготовления вакцины, включающий регидратацию композиции по любому из пп.11-13 в подходящей водной среде. График процесса первичной сушки

МПК / Метки

МПК: C12N 1/04, A61K 39/155

Метки: вирусов, микоплазмы, сохранения, способ

Код ссылки

<a href="http://easpatents.com/10-4131-sposob-sohraneniya-virusov-i-mikoplazmy.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ сохранения вирусов и микоплазмы</a>

Похожие патенты